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Curso 2009
Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires
Sumario
Clonacin
Animales transgnicos
Recombinacin homloga
Aplicaciones
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Referencias
Clonacin
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
En los animales, la clonacin se basa en el uso de la tcnica de transplante nuclear. Mediante esta tcnica, una clula donante . del individuo a clonar se transfiere a un . ovocito previamente enucleado.
clula donante ovocito embrin sinttico
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Enucleacin
Electrofusin
TRANSPLANTE NUCLEAR
Clulas donantes
Clulas adultas Clulas fetales
- La vida media es de 20 divisiones celulares. - La tasa de divisiones de 0,8 divisiones por da. - Son muy sensibles a la inhibicin por contacto. - Se desarrollan en menor proporcin.
- La vida media es de 35 divisiones celulares. Ello permite su manipulacin gentica. - La tasa de divisiones de 1,3 divisiones por da. - Son muy sensibles a la inhibicin por contacto. - Se desarrollan en mayor proporcin.
cortar el tejido
explanto
Ovocito recipiente
24 hs
OVOCITOS INMADUROS
Primer cuerpo polar
OVOCITOS MADUROS Los ovocitos obtenidos de ovarios de animales sacrificados para consumo deben ser madurados in vitro. La maduracin consiste en el avance de la divisin meitica hasta la metafase II. En este estado se observa la extrusin del primer cuerpo polar.
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Transplante nuclear
Para implementar la tcnica de transplante nuclear se requiere disponer de micromanipuladores y de un microscopio con accesorios para visualizar fluorescencia.
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Gentileza de Biosidus S.A.
Transplante nuclear
Gentileza de Biosidus S.A.
Ovocito en MII
Enucleacin
Clula donante
Transplante nuclear
Fusin celular
Activacin
Post-fusin
Post-activacin
Aplicaciones de la clonacin
La clonacin reproductiva tiene distintas aplicaciones en biotecnologa animal. - Clonado con fines agropecuarios - Clonado de animales de zoolgicos y mascotas - Clonado para introducir modificaciones genticas La clonacin teraputica se aplica en medicina humana.
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Clonacin en ovinos
El primer mamfero clonado a partir de una clula somtica fue una oveja, la ahora mundialmente conocida Dolly.
Clonacin de bovinos
Uno de los primeros bovinos clonados fue Second chance
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Tomado de: Hill et al., Biol. Reprod., 2000.
Clonacin de bovinos
Pampa fue la primera ternera nacida por clonacin a partir de fibroblastos fetales en Argentina
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Gentileza de Biosidus S.A.
Clonacin de mascotas
A pesar de que su dueo invirti ms de 3 millones de dlares en ello, Missy muri en 2002 sin haber sido clonada.
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
http://www.missyplicity.com
Clonacin de mascotas
Clon de Rainbow
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
http://www.savingsandclone.com/clients/our_latest_clones.html
Cerdos clonados obtenidos por transferencia nuclear de clulas somticas de un animal adulto
Clonacin de primates
Neti y Ditto
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Tomado de: Meng et al., Biol. Reprod.,1997.
Clonacin de humanos?
La clonacin reproductiva carece de justificacin mdica. Su aplicacin masiva es totalmente improbable en las condiciones actuales
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Clonacin teraputica
La denominada clonacin teraputica permite generar tejidos de reemplazo a partir de clulas del paciente.
Autotransplante
Transplante nuclear
Embrin (?) sinttico Clulas precursoras del Ovocito (donado) Clulas embrionarias (pluri o totipotenciales) tejido daado
Animales transgnicos
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Animales transgnicos
Un animal transgnico es aquel que tiene una porcin de ADN forneo en su genoma.
- Los primeros animales transgnicos producidos fueron . ratones, obtenidos mediante microinyeccin de cigotas
Macho frtil
X
Hembra superovulada
Colecta de embriones
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Extraccin del ADN y deteccin de la presencia del transgen
Cras
ADN genmico
intrones
ARN mensajero
ADN copia
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Gen recombinante
Promotor regulable o tejido especfico intrn
Eficiencia en la produccin de animales Eficiencia en la produccin de animales Transgnicos por microinyeccin Transgnicos por microinyeccin
Cigotas microinyectadas Sobreviven la microinyeccin
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Clonacin y transgnesis
La introduccin de genes por transfeccin y posterior seleccin de clulas totipotenciales permite producir animales transgnicos con muy alta eficiencia.
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Recombinacin homloga
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Recombinacin homloga
contruccin conteniendo un gen de resistencia a antibitico flanqueado por secuencias homlogas al exn a eliminar secuencias homlogas
Neo
intrones
recombinacin
Neo
Neo
Recombinacin homloga
La recombinacin homloga elimina un alelo por vez. Los animales resultantes son heterocigotas.
linea celular de partida
recombinacin homloga
Neo
transferencia nuclear
Recombinacin homloga
Para obtener homocigotas (que no expresen la protena) es necesario el cruzamiento de machos y hembras genticamente modificados.
Neo
X
Neo
Neo Neo
Neo Neo
Homocigota
Recombinacin homloga
Cupido y Diana, primeros corderos producidos por la tcnica de gene targeting
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
X
Recombinacin homloga
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
ARNm
Transcripcin
ADN
Silenciamiento gnico
La introduccin de secuencias cortas (22pb) de ARNs homlogos de doble cadena desencadena un proceso que degrada al ARNm blanco y conduce a la supresin de la protena respectiva
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Transcripcin
ADN
Recombinacin homloga
- Afecta al ADN (suprime el gen) - Requiere dos generaciones para obtener el fenotipo deseado - La supresin es total - Protenas candidatas: PrP, lactoglobulina
Aplicaciones
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Aplicaciones
-- Incremento en la velocidad de crecimiento y/o masa muscular en cerdos y peces Incremento en la velocidad de crecimiento y/o masa muscular en cerdos y peces -- Introduccin de genes de resistencia a enfermedades Introduccin de genes de resistencia a enfermedades -- Produccin protenas humanas que bloquean la accin del complemento en cerdos Produccin protenas humanas que bloquean la accin del complemento en cerdos (ejemplo, CD59) (ejemplo, CD59) -- Transplantes temporaros de corazn o hgado hasta la obtener donantes compatibles Transplantes temporaros de corazn o hgado hasta la obtener donantes compatibles -- Peces que expresan proteinas fluorescentes Peces que expresan proteinas fluorescentes -- Produccin de protenas recombinantes humanas en leche y suero Produccin de protenas recombinantes humanas en leche y suero -- Efectos de sobreexpresin de genes Efectos de sobreexpresin de genes -- Eliminacin de genes (knock out) Eliminacin de genes (knock out)
Produccin de frmacos (molecular pharming) Produccin de frmacos (molecular pharming) Modelos animales para patologas humanas Modelos animales para patologas humanas
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
http://www.glofish.com/photos.asp
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Tomado de: Wittbrodt et al., Nat. Rev. Genet., 2002.
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Tomado de: Tomita et al., Nat. Biotechnol., 2003.
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Larvas de mosquitos transgnicos (izquierde y centro) que expresan el gen de la protena GFP. Panel de la izquierda: luz UV; panel de la derecha: luz blanca
Transgnesis en aves
La expresin de protenas en la clara de huevo tiene un enorme potencial. La transgnesis en aves se enfrenta todava con notables dificultades tcnicas derivadas de los problemas del aislamiento de ovocitos y cigotas y el posterior cultivo embrionario. Se ha logrado expresar enzimas en la clara del huevo y se obtuvieron quimeras que expresan genes marcadores. La heredabilidad de estos caracteres es baja.
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Transgnesis en cabras
La empresa Nexia (Canad) ha logrado producir cabras que expresan fibrona (protena de la tela de araa) en su leche.
Agrobiotecnologa
Tomado de: Keefer et al., Biol. Reprod., 2001.
Animales transgnicos
Transgnesis en cerdos
Se han transformado cerdos con el gen de la Green Fluorescent Protein mediante transfeccin de clulas somticas en cultivo y posterior clonado. Xenotransplante:
- La eliminacin de genes para la alfa 1-3 galactosil transferasa permitira obtener cerdos que no posean el residuo galactosa en su endotelio y, por lo tanto, sean menos proclives al rechazo agudo.
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Universidad de Missouri-Colombia Immerge BioTherapeutics Inc
Capacidad de produccin de protenas Capacidad de produccin de protenas recombinantes en la leche en distintas especies recombinantes en la leche en distintas especies Litros/ao Cerdo Cabra Oveja Vaca 250 400 500 10.000 Protena 250 400 500 10.000
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Volumen del mercado mundial en protenas humanas: Volumen del mercado mundial en protenas humanas: - U$S 20.000 millones - U$S 20.000 millones Ejemplos: Ejemplos: - Antitrombina 3: U$S 200 millones - Antitrombina 3: U$S 200 millones - Albmina srica: U$S 1.500 millones - Albmina srica: U$S 1.500 millones
Requerimientos mundiales de protenas humanas y nmero de animales transgnicos necesarios para satisfacerlo
Factor VIII Alfa-1-antitripsina Factor IX 120 g 5.000 kg 2 kg 1000 kg 75 kg 2 vacas 10-25 ovejas 33.000 ovejas 42.000 cabras 13 ovejas 22 cerdos 300 vacas 8.300 cabras 600 cabras
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
U$S 15.000/da
Aplicaciones
El uso de animales transgnicos como bioreactores permitira suplir la demanda de protenas recombinantes, en particular de aquellas que requieren produccin masiva. Demanda de capacidad productiva instalada (datos a nivel mundial)
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Aplicaciones
Produccin de protenas recombinantes en leche de animales transgnicos: Productividad de 1 animal transgnico: 1,5 kg de protena teraputica/ao = equivalente a 200.000 L de fermentacin o sea 1 animal transgnico = 4 fermentadores de 500 L
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Referencias
1. Palma, G.A. Biotecnologa de la Reproduccin. Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA, Argentina), 2001. 2. Hwang, W.S., Ryu, Y.J., Park, J.H., Park, E.S., Lee, E.G., Koo, J.M., Jeon, H.Y., Lee, B.C., Kang, S.K., Kim, S.J., Ahn, C., Hwang, J.H., Park, K.Y., Cibelli, J.B., Moon, S.Y. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science, 303:1669-74, 2004. 3. Cristophides, G.K. Transgenic mosquitoes and malaria transmission. Cellular Microbiology, 7:325-333, 2005. 4. Wilmut, I. Cloning for Medicine. Scientific American, 279:58-63, 1998. 5. Sitios relacionados con clonacin animal: http://ag.arizona.edu/ANS/courses/cloning2/ http://www.infigen.com/ http://www.advancedcell.com/ http://www.emtran.com/ http://gslc.genetics.utah.edu/units/cloning/whyclone
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos