CUARTA PARTE

ANALISIS DE COMUNIDAD: EXTRACCION Y DERIVATIZACION DE ACIDOS GRASOS TOTALES

PERFILES DE ACIDOS GRASOS derivados de los fosfolpidos de membranas celulares de microorganismos pueden ser utilizados para estimar biomasa microbiana (Figura 1). Adems, estos perfiles proveen informacin sobre la estructura taxonmica, diversidad funcional y estatus nutricional de comunidades microbianas. Por ejemplo, perfiles de cidos grasos han sido usados para distinguir entre comunidades microbianas de suelos sujetos a diferentes tratamientos agrcolas. Finalmente, extraccin y anlisis de cidos grasos de organismos puros cultivados bajo condiciones estndares proveen informacin suficiente para el reconocimiento e identificacin a nivel de especies o subespecies (Figura 2). Materiales & Equipos: Tubos de ensayo Pipetas Pasteur y de 1 ml Viales para GC Baos de agua a 80 y 100 oC Bloque trmico Vortex Cromatgrafo de gas Centrfuga

ACIDOS GRASOS TOTALES

Reactivo 1.

45 g NaOH 150 ml metanol 150 ml agua destilada 325 ml 6N HCl 275 ml alcohol metlico 200 ml hexano 200 ml metil ter-butil eter 10.8 g NaOH 900 ml agua destilada encontrados en las

Reactivo 2. Reactivo 3. Reactivo 4.

Figura 1:

Ejemplo de cidos grasos tpicos membranas de microorganismos.

C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C Acido Graso 18:0 O C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C 18:0 metil ster

= = = = = = OH-CH3 O OH

C-C-C-C-C-C-C-C-C=C-C-C-C-C-C-C-C-C 18:1 cis 9 ( trans 9)

O C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C C OH 19:0 ciclopropano O C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C C-C-C OH 19:0 anteiso O C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C C-C-C OH OH 19:0 iso 3OH OH C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C H 16:0 aldehdo O-CH3 C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C O-CH3 16:0 dimetil acetal

O OH

ACIDOS GRASOS TOTALES

METODOLOGIA
1. Colecte aspticamente muestras de suelo de varios lugares. Tambien, podra utilizar muestras de suelo provenientes de su experimento de mineralizacin de hidrocarburos. Aade 2.0 g de suelo (5.0 g de suelo bajo en materia orgnica) o biomasa bacteriana (de una placa de cultivo) a un tubo con tapa revestida de tefln. 2. Aade 2.0 ml de reactivo de saponificacin (Reactivo 1). 3. Vortex brevemente y saponifica a 100 oC por 30 minutos. Permite que los tubos se enfrien a temperatura ambiente. 4. Metila cidos grasos aadiendo 4.0 ml de Reactivo 2. 5. Vortex brevemente e incuba a 80oC por 10 minutos en bao de agua. Inmediatamente enfra los tubos a temperatura ambiente despus de incubacin. 6. Los cidos grasos se extraen aadiendo 1.25 ml de 1:1 hexano:metil-ter butil eter (Reactivo 3). Mezcla invirtiendo los tubos por 10 minutos. La fase orgnica (sobrenadante) es removida con una pipeta Pasteur a un tubo limpio (13 X 100 mm). 7. Repite la extraccin (paso #6) y combina fases orgnicas en el mismo tubo. 8. Lava extracto orgnico aadiendo 3.0 ml de Reactivo 4. Mezcla gentilmente por 5 minutos. Centrifuga a 4,000 rpm por 5 minutos para obtener una buena interfase. Transfiere la fase orgnica a un nuevo tubo. 9. Repite el lavado (paso #8). Transfiere la fase orgnica al vial de cromatografa. 10. Anlisis de cidos grasos metilados por cromatografa de gas. Figura 2: Perfil tpico de cidos grasos observados por cromatografa de gas
4 7 3 Staphylococcus aureus 1. C14:0 2. C14:0 3. C15:0 4. C15:0 5. C16:0 6. C17:0 7. C17:0 8. C18:0 9. C19:0 10. C20:0 Nombre ISO ISO ANTEISO ISO ANTEISO ANTEISO Area% 4.52 2.10 9.96 37.97 3.05 6.33 20.02 1.48 5.70 0.70

1 2 5

6 8

9 10

10 MINUTOS

20

ACIDOS GRASOS TOTALES

Figura 3:

Representacin esquemtica de los pasos envueltos en la extraccin y derivatizacin de cidos grasos.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA COSECHA

Cultivo Fresco (Transfiere del tercer cuadrante)

Cuatro Transferencias a Tubo de Ensayo

SAPONIFICACION

Aade 1.0 ml Reactivo #1

Vortex 5-10 seg

100o C 5 min

Vortex 5-10 seg

100o C 20 min

METILACION

Aade 2.0 ml Reactivo #2

Vortex 5-10 seg

80o C 10 min Retenga Fase de Arriba

EXTRACCION

Aade 1.25 ml Reactivo #3

10 min

Remueva Fase Inferior Transfiera a Vial de Cromatografa de Gas

LAVADO
10 min

Aade 3.0 ml Reactivo #4

Remueve 2/3 Partes de la Fase Superior

Selle

ACIDOS GRASOS TOTALES

Datos & Anlisis: Hbitat: Fecha coleccin de muestras: Observaciones (tipo y abundancia relativa de los cidos grasos presentes en la muestra):

PREGUNTAS...
1. Por qu es importante crecer los cultivos puros bajo condiciones estndares para propsitos de identificacin? 2. Por qu se metilan los cidos grasos antes de su anlisis por cromatografa de gas?