Manejo Ecdgico de Sudos/

Estudio de la asociacin simbitica Rhizobium leguminosa - hongo micorrtico para la produccin de inoculante doble de uso agrcola en Arequipa
Guillermo Zvietcovich M.; Gloria Nieves C. Alcides Claveri Q.; Luis Miguel C.

Introduccin

El actual sistema de agricultura basado en el uso intensivo de agroqumicos, en vez de solucionar los problemas del hambre y la pobreza, viene produciendo desequilibrio econmico en los medianos y pequeos agricultores, sumndose a esto la carencia de capitales, desembocando en la disminucin de los ingresos de los pequeos productores, jornaleros y comunidades campesinas que trabajan en la agricultura de subsistencia. Con el propsito de promover el desarrollo de la agricultura sostenible adoptando alternativas tecnolgicas que estn al alcance de todos los agricultores, que mantengan y10 recuperen la capacidad productiva de la tierra, es conveniente utilizar al mximo los mecanismos de la fertilizacin biolgica promovida por la doble asociacin simbitica Rhizobium - leguminosa -hongo micorrtico, a travs de la cual es posible obtener un buen suministro de nitrgeno, notable absorcin del fsforo en suelos pobres utilizados para cultivos de leguminosas y para mejorar el uso del suelo.

Una importante cualidad de las leguminosas es su capacidad para fijar nitrgeno atn~osfrico asociarse con bacterias del gnero Rhizohiurn, raal zn por la cual se las incluye en rotacin con cultivos de cereales y otras no leguminosas como recuperadoras de fertilidad. Adems de esta cualidad, las leguminosas tambin se asocian en forma simbitica con las micorrizas; son asociaciones simbiticas entre hongos Zygomycetes y races de las leguminosas. Permiten a stas una mayor absorcin de fsforo, agua y otros nutrientes, adems el hongo libera hormonas de crecimiento, colabora en la formacin de agregados del suelo, etc. En el presente trabajo se realiza una recopilacin de los resultados inherentes a este tema. Los mismos comprenden la observacin cualitativa y cuantitativa de micorrizas nativas en distintas zonas de nuestro pas que presenten deficiencias de fsforo y la experimentacin en condiciones controladas y de campo sobre el comportamiento de los hongos micorrticos frente a su co-simbionte, el Rhizobium en leguminosas.

Materiales y mtodos
Se realizaron ensayos en laboratorio, invernadero y campo de agricultores durante la campaa 1993/94. Para la preparacin del inoculante doble (Rhizobium-hongo micorrtico) s e utilizaron tres componentes: turba, la bacteria de la leguminosa y el hongo micorrtico vesculo-arbuscular (HMAV). Estos componentes fueron manejados primero separadamente, para luego combinarlos. La turba procedi de las alturas del distrito de Chivay, con las siguientes caractersticas: materia orgnica 30%, la capacidad de absorcin de agua es cerca del 100% y el pH es de 5,8. Para utilizarla fue secada al aire y neutralizada hasta un pH de 6,3 con carbonato de calcio al 3%. La turba neutralizada es molida, cernida y fraccionada en cantidades de 200 g de polvo seco por bolsa de polietileno; fue esterilizada en un autoclave a 121C durante dos horas.

La seleccin de cepas de Rhizobium es llevada a cabo en tres fases. En la primera se estudi la infectividad de las cepas en plantas crecidas en sistemas estriles en jarras Leonard en solario. En la segunda, la nodulacin y fijacin de nitrgeno fue determinada en el invernadero mediante el contenido de nitrgeno en la parte area de las plantas crecidas en macetas de PVC con suelo (Silvester-Bradley, 1987). Con los resultados de la fase 1 y la fase 2, se realiz una pre-seleccin de cepas para finalmente validarlas en ensayos de campo en Arequipa, Cusco y Puno; con alfalfa, frijol y haba durante varias campaas. En base a estos resultados, fueron seleccionados las mejores cepas SEMIA 135 (Brasil) para alfalfa, CIAL 652 (Colombia) para frijol y USDA 2488 (USA) para haba, tomando en cuenta su eficiencia, virulencia y efectividad. Para determinar la presencia del hongo micorrtico se aislaron las esporas presentes en el suelo adyacente a las plantas de alfalfa, frijol y haba. Por la tcnica de separacin y flotacin se clasific y enumer por sus caractersticas morfolgicas y pigmentarias, siguiendo la clave de Mosse y Bowen (1968). Para cuantificar la colonizacin micorrtica, las races de las plantas (tres por cabecera de parcela) de 1 - 1,5 g de peso fresco, se cortaron en trozos de 1 cm de longitud. Se le realiz una decoloracin de contenidos celulares vegetales y coloracin diferencial de las estructuras del hongo hospedado. Luego se calcul el porcentaje de raz colonizada mediante la tcnica de interseccin de lnea. Mediante ensayos en invernadero y campo se determin que las esporas vacuolada amarilla y castaa rojiza laminada micorrizaban naturalmente y aparecieron con ms frecuencia. La multiplicacin de las cepas de Rhizobium seleccionadas se efectu en un medio conteniendo glicerol como fuente de azcar en un fermentador adaptado para 25 litros de volumen y conteniendo biol (bioabono lquido) que estimula el desarrollo y crecimiento de las plantas. Para inocular la cepa madre se le precultiv durante 5 das, en un Erlenmeyer con medio Balatti modificado, a 150 rotaciones por minuto. Con 150 m1 de esta suspensin madre se inocula el fermentador y se deja de 15 a 20 das.

La multiplicacin de los hongos micorrticos se hizo en un medio nutritivo en Agar Czapek modificado, en placas Petri, incubadas a una temperatura de 20 a 25C por un perodo de ocho a quince das. Al cabo de este tiempo se observ el crecimiento de colonias claras blanco amarillentas y castao rojizas. De las placas anteriores, con la escuadra de Kolle se extrajeron colonias de hongos y se transfirieron a matraces Erlenmeyer de medio litro, que contenan 300 m1 de medio de cultivo lquido de Watson; en este medio se colocaron granos de trigo esterilizados y cocinados para que los hongos infesten en un perodo de doce das a una temperatura de 25C y agitndolos diariamente a fin de asegurar su fraccionamiento y aireado adecuado. En estas condiciones los Erlenmeyer fueron guardados a temperatura ambiente, asegurndose un inculo con hongos especficos de comprobada eficiencia y completamente puros que servirn para realizar los estudios de interaccin con las cepas de Rhizobium sp. La preparacin del inoculante doble se inici cuando las cepas de Rhizobium alcanzaron la fase estacionaria de su crecimiento (15 dias de fermentacin, con una concentracin de 1O' clulas por m1 de caldo), la turba previamente esterilizada y preparada fue colocada en bolsas de polietileno de 0,002 mm de porosidad por 200 gramos e inmediatamente inyectada con 20 m1 de caldo fermentado con rizobias especficas y mezclado con el medio lquido de Watson que contiene las colonias de los hongos micorrticos vesculoarbusculares, impregnacin suficiente por cada bolsa de inoculante slido. En estas condiciones el inoculante fue dejado madurar a temperatura ambiental de 7 a 10 das. El producto final fue almacenado en una cmara fra a 10C para tener una mayor sobrevivencia del Rhizobium como de los hongos micorrticos (Royughley, 1967). Para obtener resultados ms precisos, se evalu el inculo doble en invernadero con los suelos del campo de agricultores, sin poblacin natural de Rhizobium y cuyas caractersticas se observan en el Cuadro 1. Esta tierra fue mezclada con arena de ro lavada y previamente esterilizada en autoclave, en una relacin volumtrica de 5:2. Con este substrato se llenaron

macetas en las cuales se sembraron separadamente semillas de alfalfa, fijo1 y haba; desinfectadas previamente con bicloruro de mercurio al 0,l %. En el momento de la siembra se distribuy el inculo fungo-rizobial, 20gpor maceta, suspendido en biol. Se evaluaron 5 tratamientos: 1- testigo sin inocular; 2-3-4-5 y 6 con semilla inoculada con hongo micorrtico vesculo-arbuscular y rizobia especfica para cada leguminosa. El riego se realiz diariamente y semanalmente con 10 m1 de biol al mismo pH del suelo por maceta. A los 60 das se hicieron observaciones de nodulacin. Las plntulas se llevaron a 105C hasta peso constante para obtener datos de peso seco. Al mismo tiempo se determin el nmero y tipo de esporas como el porcentaje de colonizacin micorrtica.

Cuadro 1.- Caractersticas de los suelos empleados en los diferentes ensayos.

Node
rtnEstm

Lqpr

Tdma

fl

MO.

N. total
(O?)

e 4

P. disponible(Olsen) @P~I

Finalmente, se llevaron a cabo ensayos de campo en las tres zonas de donde provenan las bacterias y los hongos micorrticos seleccionados. Se emple un diseo de bloques al azar distribuido en parcelas de 100 metros cuadrados, con cinco lneas de 6 metros de largo distanciadas 0,70 m en caso de frijol y haba; para alfalfa se sembr en pozas. El cultivar y los tratamientos fueron iguales a los sealados en el ensayo en invernadero.

:es de establecer el cultivo y despus de la cosecha se obtuvieron muestras ,~ielo para determinar la presencia de los Rhizobium especficos, el numero ipo de esporas presentes. Se tomaron tres sistemas radicales completos de d a parcela para determinar el porcentaje de colonizacin.

Resultados y discusin
En el cuadro 2 se puede observar que existe un paralelismo entre el ciclo de vida del hospedante y del endofito, de manera tal que las sucesivas estructuras fngicas observadas: micelios enrollados, arbsculos y vesculas, aparecen como una respuesta a los estmulos recibidos de la planta hospedante y del medio.

Cuadro 2.- Colonizacin micorrtica de los cultivares de leguminosas.

Cultivar Lugar Estado reproductivo Estructuras observadas l * 2* 3* Colonizacin %

Aresuipa: Alfalfa Frijol Haha

Cusco:

Majes La Boya SanCamilo Humcondo Calca H m Ichu AsUuni

Alfalta Frijol Haba Puno: Alfalfa Fnjd

--

Haba

1 * Micelios enrollados 2 * Arl>sculos 3 * Vesculas

Si observamos los estados reproductivos menos avanzados (R2 y R3) existe mayor porcentaje de vesculas que son rganos de almacenamiento fngico, en tanto que en estados reproductivos ms avanzados (R5 y R6) los arbsculos estn en su mximo desarrollo, proporcionando al vegetal una mayor superficie de intercambio. Como resultados de la interaccin Rhizobium-leguminosa-hongo micorrtico, bajo ciertas condiciones, es posible aumentar el nmero de esporas mediante una seleccin y manejo de cultivares y cepas de rizobios. Esto es til debido a que los HMAV reproducidos "in vitro" son relativamente costosos, pero tambin muy efectivos. Se ha comprobado que existe una estimulacin por parte de los rizobios especficos sobre los HMAV debido a la liberacin de sustancias extra celulares (Gaillard, 1984). Esta caracterstica puede emplearse para seleccionar especies de HMAV mediante la aplicacin de inoculantes rizobiales especficos.

Cuadro 3.- Resultados del ensayo en invernadero.

Tratamiento

Peso seco
(g)

Colonizacin
(%)

Nmero de esporas en 100 m1 de suelo 42 a 102 a 76 a 43 a

Nodulacin

Sin inocular inoculado con SEMIA 135 inoculadocon CIAT 652 inocuiado con USDA2488

2,31 a 4,30 b 3,34 ab 3,25 ab

25 46 35 38

a b a b

Nula Excelente

Excelente
Muy Buena

En el cuadro 3 se observa los diferentes parmetros evaluados para determinar diferencias entre las cepas de rizobios usados en la inoculacin. Los tratamientos con igual letra no presentan diferencia significativa entre s (P < 0,05). Los tratamientos con las cepas son en trminos generales, quienes ms favore-

Mari*EcvI@iw de Suelos /

cen a la colonizacin y reproduccin micorrtica. La nodulacin y el peso seco total tambin se vieron favorecidos. Respecto al tipo de esporas predominantes, fueron nuevamente castaa rojiza laminada y vacuolada amarilla, observndose adems otro tipo, ssil y mucilaginoso, que no fue hallado antes de la seleccin del HMAV.

Cuadro 4.- Porcentaje de esporas obtenidas en el ensayo en invernadero bajo condiciones controladas.

Tipo de espora

Sin inocular

Inoculado con las cepas Semia 135 CiAT 652 USDA 2488

Vacuolas amarillas Vacuolas bulbosas Reticuladas blancas Reticuladas bulbosas Castaarojiza lamuiada Pedicelo bulboso Crenada Embudifonne Ssil mucilaginoso No clasificada

Los resultados en el campo, mostrados en el cuadro 5 , fueron similares. Nuevamente las cepas de Rhizobiun? aparecen como estimulantes de la colonizacin radicular y la multiplicacin del HMAV en conjunto con las races, mientras la planta adquiere un aumento en la tasa de asimilacin de fsforo, nitrgeno y otros nutrientes inorgnicos.

Cuadro 5.- Resultados del ensayo en campo.

Tratamiento

Nmero de esporas despus de la cosecha

Colonizacin radical (%)

Sin inocular SEMIA 135 CIAT 652 USDA 2488

Conclusiones
Los cultivos de alfalfa, fiijol y haba son susceptibles de ser miconizados en condiciones naturales en los suelos deficientes en fsforo disponible, siendo el rango de colonizacin entre 55 y 77 %. Se comprob una estimulacin de la colonizacin y multiplicacin micorrtica por cepas de Rhizobium como las estudiadas en este trabajo de investigacin (R. meliloti, R. phaseoli y R. leguminosarum). Con el inoculante doble Rhizobium - hongo micorrtico vesculoarbuscular es posible mejorar la disponibilidad de nitrgeno, fsforo, potasio, azufre, zinc y otras sales inorgnicas. Adems, los micelios de los hongos protegen a la raz contra las infecciones provocadas por una gran variedad de agentes patgenos originados en el suelo. Por su bajo costo y por ser un producto garantizado, es una buena altemativa para los pequeos y medianos agricultores que pueden utilizarlo para cultivar leguminosas en terrenos pobres en nitrgeno y fsforo.

Bibliografa

Gaillard, J. 1984. IFS Work, Mycorrhiza and Forestation. International Foundation for Science - IES Sibyllegatan.47, S- 11442. Stockholm. Sweden. Gonzles, S.; Pacheco B.,J.C.; Piantanida N. 1983. Actas VI1 Reunin Tcnica Nacional de Soja. E29-E35, 1983.INTA-Castelar. Mosse y Bowen. 1968. Tcnica de separacin y flotacin de esporas en hongos micomticos para reconocimiento taxonmico. Roughley, R.J.; Vincent, J.M. 1967. Growth and survival of Thizobium spp in peat culture. J. Appl. Bact. 30,362-376. Sylvester-Bradley, R.; Kipe-Nolt, J. 1987. Simbiosis Leguminosa Rhizobio; Manual de Mtodos de Evaluacin, Seleccin y Manejo. CIAT. Cali, Colombia. Watdyanatha, U.,P. 1987. Effect of endomycorrhiza on growth and nutrient uptake in rubber and leguminous ground covers. Rubber Research Institute. Dartonfield, Agalawatta. Sri Lanka.