CAPÍTULO 2.3.7.

ANAPLASMOSIS BOVINA

RESUMEN

La anaplasmosis bovina es consecuencia de la infección con Anaplasma marginale. Se conoce

desde hace tiempo una segunda especie, A. centrale. No está claro si representa una verdadera
especie separada. Anaplasma marginale es responsable de casi todos los brotes de la enfermedad
clínica. El microorganismo se clasifica en el género Anaplasma, que pertenece a la familia
Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Genéticamente, A. marginale encaja dentro del
genogrupo II de las Ehrlichiae.

Los signos característicos de la anaplasmosis son anemia e ictericia, pero la enfermedad clínica
solo se puede confirmar por identificación del organismo. Una vez infectado, el ganado puede
permanecer toda la vida como portador, y la identificación de estos animales depende de la
detección de anticuerpos específicos mediante pruebas serológicas o del ADN de las rickettsias
mediante técnicas de amplificación.

Identificación del agente: El examen microscópico de sangre o de frotis de órganos con tinción
de Giemsa es el método más común para identificar Anaplasma en animales con infección clínica.
En estos frotis, A. marginale aparece dentro de los eritrocitos como cuerpos densos y redondeados
de 0.3-1.0 µm de diámetro, la mayor parte de ellos situados en la zona marginal del eritrocito o en
su proximidad. Anaplasma centrale es aparentemente similar, pero la mayor parte de los
microorganismos se sitúan lejos del margen del eritrocito. En algunos países existen colorantes
comerciales que permiten una tinción rápida de Anaplasma.

Es importante que los frotis se hagan bien y estén exentos de material extraño. Los frotis de
material de ganado vivo deberían prepararse, con preferencia, de sangre obtenida de la vena
yugular o de algún otro gran vaso. En el caso de diagnosis post-mortem, los frotis deben proceder
de órganos internos (incluyendo hígado, riñón, corazón y pulmones) y de la sangre retenida en
vasos periféricos. Esto último es particularmente deseable si el estado de descomposición,
después de la muerte, es avanzado.

Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas más utilizadas han sido la fijación del
complemento (FC) y las pruebas de aglutinación en placa. Sin embargo, datos recientes confirman
que la prueba FC presenta una sensibilidad baja (20%) que resulta inaceptable para la
identificación de ganado con infección persistente. Por consiguiente la prueba FC debe
considerarse como una prueba poco fiable para certificar el estado de animales individuales. Para
la detección de animales portadores se ha demostrado que un enzimoinmunoensayo competitivo
(C-ELISA), disponible comercialmente, presenta una sensibilidad muy mejorada (96%). También
pueden utilizarse pruebas ELISA indirectas, ELISA puntuales y de inmunofluorescencia indirecta.

Se han utilizado pruebas experimentales basadas en el ácido nucleico, que son capaces de
detectar la presencia de una infección de bajo nivel en ganado portador y en las garrapatas que
actúan como vectores. Cuando se utilizan para el diagnóstico pruebas basadas en la reacción en
cadena de la polimerasa está justificada una cierta precaución, ya que se necesita una reacción
combinada para identificar portadores de bajo nivel y puede tener lugar una amplificación
inespecífica.

Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En varios países se usan
vacunas vivas para proteger el ganado contra la infección por A. marginale. La vacuna que
contiene A. centrale es de uso más amplio y confiere protección contra cepas virulentas de A.
marginale.

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Se dispone de vacuna contra Anaplasma centrale en forma refrigerada y congelada. El control de

calidad es muy importante ya que pueden estar presentes en el ganado donador otros agentes
transmisibles por la sangre que pueden contaminar las vacunas y tener una diseminación amplia.
Por esta razón se recomienda la vacuna congelada que permite un control de calidad posterior a la
producción, lo que limita el riesgo de contaminación con otros patógenos.

Las vacunas contra Anaplasma centrale no son completamente seguras. Una recomendación
práctica es limitar su uso, en la medida de lo posible, a terneros, pues la inmunidad inespecífica
reducirá el riesgo de algunas reacciones vacunales que pueden requerir tratamiento con
tetracicilina o imidocarb. La inmunidad parcial se desarrolla en 6-8 semanas y dura varios años
después de una única vacunación.

A. INTRODUCCIÓN
Los brotes de anaplasmosis bovina se deben normalmente a la infección por Anaplasma marginale. Anaplasma
centrale produce una anemia moderada, pero los brotes en el campo son muy raros. En algunos aislamientos de
A. marginale se han descrito estructuras adicionales asociadas con los cuerpos de Anaplasma (17); aunque este
parásito se ha denominado A. caudatum, no se considera como una especie separada.

Anaplasma marginale se presenta en la mayor parte de los países tropicales y subtropicales, y en algunas
regiones más templadas. Anaplasma centrale se describió por vez primera vez en Sudáfrica. Desde entonces el
organismo ha sido importado en otros países –incluyendo Australia y algunos países de Sudamérica, Sudeste
asiático y Oriente Medio- para ser utilizado como vacuna contra A. marginale.

Las especies de Anaplasma se consideraron en principio como protozoos parásitos, pero la investigación
posterior reveló que no poseían atributos que justificaran esta descripción. Desde 1957 se han clasificado en la
familia Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Recientemente se ha propuesto una reorganización de la
familia, que en el pasado incluía los géneros Anaplasma, Aegyptianella, Haemobartonella y Eperythrozoon (31),
basándose en una combinación del análisis de secuencias del ARN ribosómico 16 S, de groesI, y del gen de la
proteína superficial (6,37). En la familia Anaplasmataceae reorganizada se incluye toda la subdivisión alfa de
Proteobacterias que pertenecen a los géneros Ehrlichia, Anaplasma, Cowdria, Wolbachia y Neorickettsia,
reteniendo provisionalmente a Aegyptianella. Además, el género Anaplasma se ha ampliado hasta incluir
Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia bovis y Ehrlichia platys, con la nueva designación de Anaplasma
phagocytophila que incluye tanto Ehrlichia equi como la Ehrlichia del “agente HGE”. Los géneros
Haemobartonella y Eperythrozoon se consideran en la actualidad más próximos a los micoplasmas.

Las especies de Anaplasma se trasmiten mecánica o biológicamente por insectos vectores. Una revisión basada
en un estudio cuidadoso de experimentos de transmisión presenta una lista de 14 garrapatas diferentes que han
sido descritas como capaces de transmitir experimentalmente A. marginale (13). Éstas son: Argas persicus,
Ornithodoros lahorensis, Boophilus annulatus, B. decoloratus, B. microplus, Dermacentor albipictus,
D. andersoni, D. occidentalis, D. variabilis, Hyalomma excavatum, Ixodes ricinus, Rhipicephalus bursa,
R. sanguineus and R. simus. Los autores concluyeron que algunos de estos resultados, como los de R. bursa,
H. excavatum y O. lahorensis no son muy convincentes y que las garrapatas identificadas como A. persicus eran
probablemente A. sanchezi o A. radiatus. Además, Rhipicephalus e. evertsi y Hyaloma m. rufipes se han descrito
como vectores experimentales en Sudáfrica (28). La transmisión intra o interespecífica es común, incluso en las
especies de Boophilus de un solo hospedador. Las garrapatas macho pueden ser particularmente importantes
como vectores .La demostración experimental de la implicación de un vector no implica necesariamente que
tenga un papel en la transmisión en condiciones de campo. Sin embargo, las especies de Boophilus son
claramente vectores importantes de la anaplasmosis en países tales como Australia o Sudáfrica, y algunas
especies de Dermacentor son vectores eficaces en los Estados Unidos de América (USA).

Otros artrópodos picadores muy diversos se han considerado como vectores mecánicos, particularmente en
USA. Se ha demostrado la transmisión experimental con ciertas especies de Tabanus (mosca del caballo) y con
mosquitos del género Psorophora (30). La importancia de los insectos picadores en la transmisión natural de la
anaplasmosis no está bien documentada y parece variar mucho de una región a otra. Anaplasma marginale
puede transmitirse también con facilidad durante la vacunación contra otras enfermedades, a menos que se
utilice una aguja nueva o esterilizada para inyectar a cada animal. Se ha descrito una transmisión similar por
medio de instrumentos quirúrgicos no esterilizados.

Los principales vectores de A. centrale parecen ser garrapatas de hospedadores múltiples, propias de África,
como R. rimus. No se ha demostrado que la garrapata común de los bóvidos (B. microplus) sea un vector. Esto
es importante porque A. centrale se utiliza como vacuna en regiones infestadas por B. microplus.

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B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Los síntomas clínicos más marcados de la anaplasmosis son anemia e ictericia, la última con aparición tardía en
la enfermedad. No se presenta hemoglobinemia ni hemoglobinuria, lo que puede ayudar al diagnóstico
diferencial entre anaplasmosis y babesiosis, que a menudo es endémica en las mismas regiones. No obstante, la
enfermedad solo se puede confirmar por identificación del microorganismo causante.

1. Identificación del agente

Las muestras obtenidas a partir de ganado vivo deben incluir frotis finos de sangre y sangre recogida con
anticoagulante. Los frotis finos de sangre, secados con aire, se mantienen de modo satisfactorio a temperatura
ambiente por lo menos 1 semana. Las muestras de sangre con coagulante deberían mantenerse a 4ºC a menos
que se lleve al laboratorio en unas pocas horas. Esta muestra es útil para preparar frotis frescos si los anteriores
no fueran satisfactorios. Además un cierto volumen pequeño de células y/o un recuento de eritrocitos puede
ayudar a poner de manifiesto la implicación de Anaplasma cuando en los frotis se detecta solo un número
pequeño de parásitos, como puede ocurrir en la fase de recuperación de la enfermedad.

En contraste con Babesia bovis, Anaplasma no se acumula en los capilares, de modo que es apropiada la
sangre de la yugular u otro gran vaso. Debido a la morfología poco diferencial de Anaplasma, es esencial que los
frotis estén bien preparados y libres de substancias extrañas, pues las partículas de restos pueden confundir la el
diagnóstico. Las extensiones gruesas de sangre, que se utilizan en el diagnóstico de la babesiosis, no son
apropiadas para el diagnóstico de la anaplasmosis, porque Anaplasma es difícil de identificar una vez que se
separa de los eritrocitos.

Las muestras obtenidas de animales muertos deben ser frotis finos, secados al aire, del hígado, riñón, corazón y
pulmones y de un vaso sanguíneo periférico. Éste último se recomienda, en particular, si hay un retraso notable
antes del examen post-mortem porque, en tales circunstancias, la contaminación bacteriana en los frotis de los
órganos puede conducir a una identificación equívoca de Anaplasma. Los frotis de cerebro, que son útiles en el
diagnostico de algunas formas de babesiosis, no tienen valor directo en el diagnóstico de la anaplasmosis (14),
aunque deberían incluirse para el diagnóstico diferencial cuando sea pertinente.

Para la preparación de frotis se requiere la sangre de órganos, mejor que los tejidos de los órganos per se,
porque el objetivo es ser capaz de examinar microscópicamente eritrocitos intactos para la presencia de
Anaplasma. Los frotis derivados de sangre de órganos se mantienen satisfactoriamente durante varios días a
temperatura ambiente (14).

Los frotis de sangre y de los órganos se fijan 1 minuto con metanol absoluto y se tiñen con 10% de colorante de
Giemsa durante 30 minutos. Después de la tinción, los frotis se lavan tres o cuatro veces con agua de grifo para
eliminar el colorante adherido y luego se secan al aire. Los frotis se examinan con aceite de inmersión a un
aumento de 700-1.000 x.

En los frotis teñidos con Giemsa, A. marginale aparece como cuerpos densos, redondeados y muy coloreados
dentro de los eritrocitos, de aproximadamente 0,3-1,0 µm de diámetro. La mayor parte de estos cuerpos se
localizan en el margen del eritrocito o en su proximidad. Esta característica diferencia A. marginale de
A. centrale, presentando en este último caso los microorganismos una localización más centrada en el eritrocito.
En algunos países1, se dispone de colorantes comerciales para tinción rápida de Anaplasma.

El porcentaje de eritrocitos infectados varía según la fase y la gravedad de la enfermedad. Con A. marginale
pueden presentarse parasitemias máximas que superan el 50%. Durante los períodos de alta parasitemia, son
comunes las infecciones múltiples de eritrocitos individuales.

La infección se hace microscópicamente visible en 2-6 semanas después de la transmisión. Durante la

enfermedad clínica, la parasitemia se duplica aproximadamente cada día hasta los 10 días, y luego decrece a
una velocidad similar. Puede persistir durante algunas semanas una anemia muy fuerte después de que los
parásitos lleguen a ser virtualmente indetectables en los frotis. Después de la recuperación de la infección inicial,
la mayor parte del ganado permanece con infección latente durante el resto de su vida.

Para detectar Anaplasma en frotis realizados post-mortem se puede utilizar la tinción con anticuerpos
fluorescentes como una técnica alternativa. Johnston et al. (14) han descrito un procedimiento de
inmunofluorescencia directa para el diagnóstico post-mortem de anaplasmosis. Aunque parece ser más sensible
que la tinción con Giemsa, la fluorescencia inespecífica es un problema importante.

1
Los colorantes rápidos incluyen Camco-Quick y Diff-Quick, Baxter Scientific Products, McGaw Park, Illinois, USA y Hema
3 y Hema-Quick, Curtin-Matheson, Houston, Texas, USA.

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Un procedimiento costoso, pero en ocasiones justificable para confirmar la infección, particularmente en ganado
con infección latente, consiste en inocular sangre del animal sospechoso en un ternero esplenectomizado (sin
bazo). Se inocula intravenosamente una cantidad (hasta 500 ml) de la sangre del donador con anticoagulante en
el ternero esplenectomizado, y luego se examinan frotis de sangre al menos cada 2-3 días. Si el donador está
infectado, se observará Anaplasma en los frotis del ternero esplenectomizado, por lo general, en 4 semanas,
aunque este período puede prolongarse a 8 semanas.

Las pruebas basadas en los ácidos nucléicos para detectar A. marginale en ganado portador son de desarrollo
reciente (8, 9, 11, 12, 33). Se ha descrito una sonda radiactiva de ARN que detectó parasitemias tan bajas como
0,000025% (8). Las garrapatas infectadas también se han identificado utilizando una sonda para ADN clonado
(13). La sensibilidad analítica de métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha
estimado en 0,0001% de eritrocitos infectados, pero a este nivel solo se detectaría una parte del ganado portador
(9, 11). Recientemente se ha utilizado una técnica PCR combinada que es sensible y potencialmente específica
para identificar ganado portador de A. marginale (33). Esta técnica es capaz de identificar niveles de menos de
30 eritrocitos infectados por ml de sangre, lo que equivale a una parasitemia de aproximadamente 0,000001%,
que está bien por debajo de los niveles más bajos en los portadores (33). No obstante, la PCR combinada
plantea serios problemas de control de calidad para un uso rutinario (33). Los laboratorios que emplean esta
prueba deberían reconocer los problemas de especificidad debidos a amplificación inespecífica.

Un paso adicional, como el análisis con enzimas de restricción, la hibridación tipo Southern, o la secuenciación,
puede confirmar la especificidad de lo que resulte amplificado.

Por lo general, excepto con animales que han sido tratados o se encuentran en una fase muy inicial de la
infección (<14 días), el método preferido para identificar animales infectados es el enzimoinmunoensayo
competitivo (C-ELISA) o la prueba de hemaglutinación en placa (CAT) (ver más adelante).

2. Pruebas serológicas

Las infecciones por Anaplasma persisten normalmente durante toda la vida del animal. Sin embargo, excepto en
pequeños recrudecimientos ocasionales, no se puede detectar fácilmente Anaplasma en frotis de sangre
después de un episodio de parasitemia. Por tanto, se han desarrollado varias pruebas serológicas con objeto de
detectar los animales con infección latente.

Una característica del diagnóstico serológico de la anaplasmosis son los resultados tan variables que se han
descrito por distintos laboratorios en muchas pruebas respecto a la sensibilidad y la especificidad. Esto se debe,
al menos en parte, a la inadecuada evaluación de las pruebas que usan un número significativo de animales
positivos y negativos conocidos. En especial, hay que destacar que la capacidad de algunos ensayos para
detectar infecciones conocidas de larga duración raramente se ha enfocado de un modo adecuado. Una
excepción es la técnica C-ELISA descrita recientemente (ver más adelante), que ha sido validada utilizando
animales verdaderamente positivos y negativos, definidos por PCR combinada (33). Por consiguiente, aunque la
mayor parte de las pruebas descritas en esta sección son útiles para obtener datos epidemiológicos de una base
amplia, se debe tener precaución en lo que respecta a su uso para la certificación de la enfermedad.

Debe advertirse que en las pruebas serológicas existe un grado alto de reacciones cruzadas entre A. marginale y
A. centrale. Aunque las especies patógenas se pueden identificar a veces con antígenos de la especie homóloga
o heteróloga, en muchas ocasiones se obtienen resultados equívocos.

a) Enzimoinmunoensayo competitivo

Una técnica C-ELISA, que utiliza un antígeno recombinante denominado rMSP5 y un anticuerpo
monoclonal (Mab) específico para MSP5, ha resultado muy sensible y específica para detectar animales
infectados por Anaplasma (16, 23, 33, 36). Todas las cepas probadas de A. marginale, A. ovis y A. centrale,
expresan el antígeno MSP5 e inducen anticuerpos contra el epítopo inmunodominante reconocido por el
Mab específico de MSP5. La prueba resultó específica al 100% utilizando 261 sueros negativos conocidos
de una región no endémica, detectando perfectamente a los 16 días de la infección experimental por
garrapata o por inoculación de sangre el ganado infectado. Además, se demostró capaz de detectar ganado
que había sido infectado experimentalmente 6 años antes (16). En la detección de ganado con infección
persistente en una región endémica de anaplasmosis, donde los verdaderos positivos o negativos se
definieron mediante un procedimiento de PCR combinada, la C-ELISA con rMSP5 tuvo una sensibilidad del
96% y una especificidad del 95% (33). Un estudio independiente mediante el uso de ELISA indirecto (I-
ELISA) validó el uso de rMPS5 como antígeno de diagnóstico (29), Sin embargo, los estudios iniciales
sugieren que en su formato actual la técnica de ELISA indirecto con rMPS5 es menos sensible que C-
ELISA (29).

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Los resultados de la prueba C-ELISA con el rMSP5 se pueden obtener en menos de 2,5 horas. Una prueba
2
comercializada contiene las instrucciones específicas. En general, sin embargo, se realiza del modo
siguiente.

• Reactivos del equipo

Una placa de microtitulación con 96 pocillos recubiertos con el antígeno rMSP5,
Una placa de adsorción/transferencia con 96 pocillos recubiertos para la adsorción de suero y
reducción de la unión de fondo,
Conjugado MaAb/peroxidasa, 100 x,
Solución de lavado y tampón preparado para dilución del conjugado, 10 x,
Substrato para usar y soluciones para detener las reacciones,
Controles positivos y negativos

• Procedimiento de la prueba
i) Añadir 70 µl de suero sin diluir a la placa de adsorción/transferencia recubierta e incubar 30 minutos a
temperatura ambiente.

ii) Transferir 50 µl del suero adsorbido por pocillo a la placa recubierta de rMSP5 e incubar 60 minutos a
temperatura ambiente.

iii) Eliminar el suero y lavar dos veces la placa utilizando la solución de lavado, diluida.

iv) Añadir 50 µl por pocillo del conjugado Mab/peroxidasa diluido a la placa recubierta de rMSP5, e
incubar 20 minutos a temperatura ambiente.

v) Eliminar el conjugado Mab/peroxidasa diluido y lavar la placa cuatro veces utilizando la solución de
lavado diluida.

vi) Añadir 50 µl por pocillo, de la solución de substrato, cubrir la placa con papel de aluminio, e incubar
20 minutos a temperatura ambiente.

vii) Añadir 50 µl por pocillo de la solución para detener las reacciones a la solución de substrato que se
encuentra en los pocillos y golpear ligeramente por los lados de la placa para mezclar el contenido de
los pocillos.

viii) Leer las placas en el equipo de lectura a 620 nm.

• Validación de la prueba
La densidad óptica media (OD) del control negativo debe estar entre 0.40 y 2.10. El porcentaje de inhibición
del control negativo debe ser > 30%.

• Interpretación de los resultados

El porcentaje de inhibición se calcula del siguiente modo:

100 – OD de la muestra x 100/ OD media del control negativo = Porcentaje de inhibición.

Las muestras con <30% de inhibición son negativas: Las muestras con >30% de inhibición son positivas.

b) Prueba de aglutinación en placa

La ventaja de la CAT es que es una técnica sensible, que puede realizarse en el laboratorio o en el campo,
y que proporciona el resultado en unos pocos minutos. Las reacciones inespecíficas pueden ser un
problema. El antígeno para CAT es una suspensión de partículas de A. marginale. Se infectan terneros
esplenectomizados por inoculación intravenosa con sangre que contenga eritrocitos infectados por
Anaplasma. Cuando la parasitemia excede 50%, el animal se sangra, los eritrocitos infectados se lavan, se
lisan, y las membranas de los eritrocitos y las partículas de Anaplasma se centrifugan. Los sedimentos se
sonican, se lavan, y luego se resuspenden en una solución de colorante para producir la solución de
antígeno.

2
VMRD, Inc., 4641 Pullman_Albion Rd., P.O. Box 502, Pullman, Washington 99163, USA. Tel.: (1.509) 334.58.15; Fax:
(1.509) 332.53.56; http://www.vmrd.com

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Un procedimiento con ligeras modificaciones del descrito originalmente (1,2) es el siguiente:

i) Comprobar antes de su uso que todos los componentes de la prueba están a una temperatura de 25-
26ºC (esta temperatura constante es un factor crítico en la prueba).

ii) En cada círculo de la placa de ensayo (un plástico claro tipo perspex o una placa de cristal con
círculos marcados de 18 mm de diámetro), colocar juntos, pero sin tocarse, 10 µl de factor de suero
bovino (BSF), 10 µl del suero de ensayo, y 5 µl del antígeno CAT3. En cada placa se deben probar
sueros negativos y débilmente positivos.

iii) BSF es suero de un animal seleccionado con un alto nivel de conglutinina. Si se desconoce el nivel de
conglutininas, se puede utilizar suero fresco de un animal que esté libre de Anaplasma. La raza Jersey
es adecuada, habitualmente. El BSF se debe guardar a –70ºC en pequeñas alícuotas, y cada vez que
se realizan las pruebas se utiliza una alícuota fresca. La inclusión de BSF mejora la sensibilidad de la
prueba.

Mezclar bien con una varilla de vidrio. Después de mezclar cada prueba, limpiar la varilla de vidrio con
un papel limpio para evitar la contaminación cruzada.

iv) Colocar la placa de prueba en una cámara húmeda y agitar a 100-110 rpm durante 7 minutos.

v) Leer inmediatamente contra una luz. Una aglutinación característica del antígeno (valorada de +1 a
+3) se considera un resultado positivo. Se considera que la prueba da un resultado negativo cuando
no existe esa aglutinación característica.

c) Prueba de fijación de complemento

Se han publicado manuales detallados para realizar tanto la versión estándar (34) como la versión en
microtítulo (35) de la prueba FC para anaplasmosis. Aunque la prueba de FC se ha empleado ampliamente
durante muchos años usando ambas técnicas, datos recientes confirman que carece de sensibilidad y falla
en la detección de una proporción importante de ganado portador (3). Por consiguiente, la prueba FC no
puede ser recomendada como ensayo fiable para detectar animales infectados.

d) Enzimoinmunoensayo indirecto

Se ha encontrado un método I-ELISA, basado en el uso de un antígeno normal de eritrocitos (antígeno

negativo) y de un antígeno de eritrocitos infectados por A. marginale (antígeno positivo), que es fiable para
la detección de sueros positivos frente a A. marginale (7). Aunque más lento que las pruebas que utilizan un
solo antígeno, esta prueba elimina los sueros con niveles de actividad inespecífica debidos a los iso-
anticuerpos para los componentes de los eritrocitos normales. La prueba identificó correctamente los 100
sueros positivos conocidos tomados de ganado bovino hasta después de 3 años de la infección, mientras
que el 3% de sueros negativos, el 2% de sueros de Babesia bovis y el 4% de sueros de B. bigemina dieron
falsos resultados positivos.

La prueba con los dos antígenos se realiza como se indica.

• Antígeno negativo
La sangre de un ternero esplenectomizado se recoge en etilén diamino tetra-acético sódico (EDTA). Las
células se lavan tres veces son solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugan 10 minutos a
5.000 g a 5ºC. Después de la centrifugación, se extraen los glóbulos blancos diluyendo las células diez
veces en PBS y pasándolas a través de una columna de celulosa Whatman CFI1. Después de otra
centrifugación, se diluye un volumen de las células en dos volúmenes de PBS y se guardan en alícuotas de
2.5 ml en la fase de vapor de nitrógeno líquido. Cuando se necesita, se descongela una alícuota a
temperatura ambiente y se sonica 30 segundos a 100 W con una pequeña sonda a 0ºC. El producto
sonicado se diluye luego, según se necesite, para utilizar en la prueba ELISA.

• Antígeno positivo
Un ternero que se ha utilizado previamente para producir antígeno negativo se infecta con A. marginale por
inoculación sanguínea. Cuando la parasitemia alcanza el 80-85%, se toman 500-1.000 ml de sangre, se
procesan y se almacenan como se ha descrito antes. Cuando se necesitan, se sonican alícuotas, como
antes, y se diluyen convenientemente.

3
En EE.UU. y México la prueba se realiza con volúmenes mayores de reactivos: antígeno (15 µl), suero (30 µl), y factor de
suero bovino (30 µl) en un tiempo de reacción de 4 minutos (ver paso iv).

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 Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

• Procedimiento de la prueba
Se utilizan placas de micro-ELISA, con 96 pocillos, de fondo plano. Con cada lote nuevo de antígeno se
realizan las titulaciones estándar del antígeno, tanto positivo como negativo, por el sistema del tablero de
ajedrez, para determinar el rango de trabajo, que normalmente es 1/400 (150-200 µg de proteína/ml). A
cada pocillo de la placa se añade el antígeno diluido (200 µl) , una mitad de la placa con antígeno positivo, y
la otra mitad con antígeno negativo. Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban toda la noche a
4ºC. Después de la incubación, se extrae la solución de antígeno y las placas se lavan tres veces con PBS
que contenga 0.1% de Tween 20 (PBST), y luego se bloquean con una solución de suero normal de caballo
al 1% en PBS durante 60 minutos a 37ºC.

Después dell bloqueo, las placas se lavan cinco veces con PBST antes de añadir 200 µl de los sueros de
prueba. (Los sueros de prueba se diluyen de 1/400 a 1/800 con PBST que contenga 1% de suero de
caballo). Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban 2 horas a 37ºC. Luego se lavan los pocillos
cinco veces con PBST y se añaden 200 µl del segundo anticuerpo conjugado (IgG anti-bovina obtenida de
cabra conjugada con peroxidasa de rábano), a una dilución 1/400 en PBS con 1% de suero de caballo. Las
placas se cierran con sus tapaderas y se incuban 2 horas a 37ºC. Después de la incubación, se extrae el
conjugado y los pocillos se lavan cinco veces con PBS antes de la adición de 200 µl de substrato, de
preparación reciente.

El substrato se prepara así; se disuelve ácido 5-amino salicílico recristalizado a concentración de 1 mg/ml
en tampón fosfato, pH 6.8, a 32ºC; por cada ml de solución se añaden luego 2 µl de peróxido de hidrógeno
al 30%. Después de la adición del substrato se cierran las placas y se agitan suavemente 30 minutos a
22ºC. A continuación, inmediatamente, se leen las placas a 492 nm con un lector de placas. La columna
uno de cada placa se usa siempre como blanco.

Para cada muestra las lecturas netas se calculan restando el resultado del antígeno negativo del resultado
del antígeno positivo. En cada lote de ensayos, se prueba rutinariamente un grupo de 20 sueros negativos y
un suero estándar positivo para A. marginale. Se calcula un “umbral” como la lectura de la absorbancia neta
media (más dos desviaciones estándar) de los 20 sueros negativos estándar. La relación de todas las otras
absorbancias netas se determina usando como unidad el “umbral”. El suero positivo se utiliza para
determinar que cada lote de prueba se realiza con normalidad.

e) Enzimoinmunoensayo de punto

Comparado con I-ELISA, la prueba ELISA de punto tiene las ventajas potenciales de ser rápida, barata, y
sencilla de realizar. Se ha descrito que el método de ELISA de punto descrito a continuación presenta una
sensibilidad del 93% y una especificidad del 96% (21).

• Preparación del antígeno

i) Recoger sangre con parasitemia elevada en EDTA.

ii) Eliminar el plasma y lavar los eritrocitos con tampón glicina 0,1 M, pH 3,0.

iii) Lavar los eritrocitos con PBS, pH 7,4, en presencia de inhibidores de proteasas (tetrationato sódico
3,5 mM) y 0,01% de timerosal.

iv) Eliminar la capa de leucocitos después de cada lavado.

v) Resuspender los eritrocitos en PBS a dilución 1/5, sonicar, someter a tres ciclos de congelación y
descongelación, y volver a sonicar el lisado.

vi) Mezclar el material con un volumen igual de Nonidet P-40 en PBS, e incubar 3 minutos a 25ºC.

vii) Recoger los cuerpos de Anaplasma por centrifugación diferencial.

viii) Lavar el precipitado tres veces con tampón frío (cloruro de colina 155 mM, HEPES [N-2-
hidroxietilpiperazina, ácido N-2-etanesulfónico] 5 mM, pH 7,4).

ix) Resuspender el precipitado en PBS y medir la concentración de proteína.

Depositar el antígeno (1,0 µl/disco; 25 µg de proteína/ml) sobre discos (de 6 mm de diámetro) de

nitrocelulosa cortados con una taladradora de papel. Secar al aire los discos recubiertos con el
antígeno. En estos discos el antígeno permanece estable durante más de 2 años si se mantienen a -
20ºC o a 4ºC, y por al menos 3 meses cuando se conservan a 25ºC.

540 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

 Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

• Procedimiento de la prueba
i) Colocar los discos con el antígeno en pocillos con el fondo plano de placas de microtitulación.

ii) Todos los procedimientos se realizan a 25ºC y utilizando reacciones de 200 µl de volumen.

iii) Incluir sueros positivos y negativos conocidos y controles de antígeno.

iv) Para el bloqueo, añadir PBS que contenga 0,5% de Tween 20 a cada pocillo, incubando luego
15 minutos.

v) Probar los sueros a una concentración inicial de 1/200 en PBS que contenga 0,05% de Tween 20, e
incubar 1 hora.

vi) Lavar tres veces, 10 minutos cada vez, con PBS que contenga 0,1% de Tween 20.

vii) Añadir el conjugado de fosfatasa alcalina/ proteína A, diluido 1/500 en PBS que contenga 0,5% de
Tween 80, e incubar los pocillos 30 minutos, lavando después como antes, excepto que el último
lavado se hace con PBS solo.

viii) Añadir nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4-cloro-indoxil fosfato en tampón Tris 0,1 M, pH 9,5, y permitir
que el color aparezca por 10-20 minutos.

ix) La aparición de un punto de color púrpura, de intensidad variable, indica una reacción positiva; no se
ve color en los discos con reacciones negativas.

f) Prueba de inmunofluoresencia indirecta con anticuerpo

Debido al número limitado de pruebas de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo (IFI) que puede
realizar diariamente un operador, se suelen preferir otras pruebas serológicas. La prueba IFI se realiza
como se describe para la babesiosis bovina en el Capítulo 2.3.8., excepto que para la preparación de frotis
de antígeno se utiliza sangre infectada por A. marginale. Un problema serio de esta prueba es la
fluorescencia inespecífica. Es muy probable que el antígeno obtenido de sangre recogida tan pronto como
aparezca una parasitemia adecuada (5-10%) resulte idóneo. La fluorescencia inespecífica debida a
anticuerpos que se adhieren a eritrocitos infectados puede reducirse lavando los eritrocitos en un tampón
glicina ácido antes de que se preparen los frotis de antígeno (22). Los eritrocitos infectados se lavan dos
veces en tampón glicina 0.1 M (pH 3,0, centrifugado a 1.000 g por 15 minutos a 4ºC) y luego una vez en
PBS, pH 7,4.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO

Se han utilizado varios procedimientos de inmunización para proteger al ganado bovino contra la anaplasmosis
en países donde la enfermedad es endémica, pero ninguno es ideal (19). El uso de la especie menos patógena
A. centrale, que proporciona una protección parcial cruzada frente a A. marginale, es el método aceptado más
ampliamente, aunque no se utiliza en América del Norte. Otro método implica el uso de una cepa de A. marginale
atenuada por pases en hospedadores no bovinos, como el ciervo o la oveja (32).

En esta sección, se describe la producción de vacuna viva de A. centrale. Incluye la infección de un ternero
esplenectomizado susceptible y el uso de su sangre como vacuna. Existen descripciones detalladas del
procedimiento de producción y se debe hacer referencia a estas publicaciones para detalles de los
procedimientos que se resumen aquí (4, 10,25).

Las directrices para la producción de vacunas se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de la producción de
vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7. intentan ser de naturaleza general y pueden
completarse con requisitos nacionales y regionales.

La vacuna para Anaplasma centrale puede suministrarse en forma congelada o refrigerada dependiendo de la
demanda, redes de transporte y la disponibilidad de servicios de nitrógeno líquido o de hielo seco. En la mayor
parte de los casos se recomienda la vacuna congelada, ya que permite un control de calidad de cada lote
después de la producción. Sin embargo, es más costosa de producir y más difícil de transportar que la vacuna
refrigerada. El riesgo de contaminación hace que el control después de la producción sea esencial, pero puede
ser prohibitivamente costoso.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 541

 Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

1. Control del inóculo

a) Características del inóculo

Anaplasma centrale se aisló por primera vez en 1911 en Sudáfrica y se ha utilizado como vacuna en
Sudamérica, Australia, África, Oriente Medio, y Sudeste Asiático. Solo suministra protección parcial, pero
adecuada, en regiones donde las cepas que provocan la enfermedad son de una virulencia moderada
(como Australia) (10). En los trópicos húmedos, donde A. marginale parece ser un parásito muy virulento, la
protección suministrada por A. centrale puede ser inadecuada para evitar la enfermedad en algunos
animales.

Normalmente, Anaplasma centrale causa infecciones benignas, especialmente en terneros menores de

9 meses de edad. Se han descrito reacciones graves después de la vacunación cuando se inocula ganado
adulto.

El pase rápido de A. centrale por terneros esplenectomizados parece reducir su virulencia (10).

b) Preparación y conservación de los estabilizados

El material infeccioso se conserva fácilmente en nitrógeno líquido o en hielo seco como estabilizados
congelados de la sangre infectada. El crioconservante recomendado es dimetil sulfóxido (DMSO), ya que
permite la administración intravenosa del estabilizado después de la descongelación. En otra parte (10) se
describe con detalle la técnica de congelación pero, en resumen, se basa en lo siguiente: se recoge sangre
infectada, se enfría a 4ºC, y se añade, lentamente y con agitación, crioconservante frío (4 M DMSO en
PBS) en una proporción final sangre/conservante de 1:1, para dar una concentración final 2 M de DMSO.
Todo el proceso de dilución se realiza en un baño de hielo y la sangre diluida se distribuye en recipientes
adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml), que se congelan tan pronto como sea posible en la fase de
vapor de un contenedor de nitrógeno líquido.

c) Validación como vacuna

La idoneidad de un aislamiento de A. centrale como vacuna se determina inoculando ganado susceptible,
observando las reacciones posteriores, y estimulando luego a los animales y a controles susceptibles con
una cepa virulenta local de A. marginale. Tanto la seguridad como la eficacia se pueden estimar
observando las parasitemias en extensiones de sangre teñida y el descenso volumétrico de células
empaquetadas de ganado vacuno durante la vacunación y durante los períodos de reacción estimulante. Se
puede determinar la pureza del aislamiento, para posibles contaminantes presentes, mediante un estudio
serológico de sueros en parejas del ganado bovino utilizado en la prueba de seguridad (26).

2. Método de fabricación

a) Producción de vacuna congelada

Se descongelan las cantidades del estabilizado congelado (5-10 ml) por inmersión de los viales en agua
precalentada a 40ºC. El material descongelado se mantiene en hielo y se usa tan pronto como sea posible
(en 30 minutos) para infectar un ternero susceptible esplenectomizado por inoculación intravenosa.

La parasitemia del ternero donante de analiza diariamente examinando extensiones de sangre teñida de la
yugular, y se recoge la sangre para producción de la vacuna cuando se alcanza una parasitemia adecuada.
El mínimo requerido para producción de la vacuna es una parasitemia de 1 x 108/ml (aproximadamente 2%
de parasitemia en la sangre de la yugular). Si no se obtiene una parasitemia adecuada, puede ser
necesario realizar un pase de la cepa mediante subinoculación de 100-200 ml de sangre a un segundo
ternero esplenectomizado.

La sangre del donante se recoge mediante canulación aséptica de la yugular o la carótida, utilizando
heparina como anticoagulante (5 Unidades Internacionales [UI] de heparina/ml de sangre).

En el laboratorio, la sangre parasitada se mezcla a 37ºC con un mismo volumen de glicerol 3M en PBS,
suplementado con 5mM de glucosa (concentración final de glicerol 1,5 M). La mezcla se equilibra a 37ºC
durante 30 minutos y se distribuye en recipientes adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml). Los viales
se enfrían en la fase de vapor de nitrógeno líquido a una velocidad aproximada de 10ºC/minuto y, cuando
están congelados, se guardan en la fase líquida (5).

En lugar de glicerol se puede utilizar DMSO como crioconservante. En este caso se lleva a cabo del mismo
modo que para la preparación del estabilizado (20,24).

542 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

 Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

Si se tiene que diluir la vacuna preparada en glicerol, el diluyente debe ser PBS con 1.5 M de glicerol y
5 mM de glucosa (15). Las vacunas crioconservadas con DMSO deben diluirse con diluyente que contenga
la misma concentración de DMSO que la sangre original crioconservada (27).

b) Producción de vacuna refrigerada

El material infeccioso para vacunas refrigeradas se preparara como para las vacunas congeladas, pero
debe ser procesado y utilizado tan pronto como sea posible después de su recogida. La sangre infecciosa
7
se puede diluir para lograr 1 x 10 parásitos por dosis de vacuna. Un diluyente adecuado es 10% de suero
bovino estéril en una solución de glucosa/solución salina equilibrada que contenga las
siguientes cantidades por litro: NaCl (7,00 g), MgCl2.6H2O (0,34 g), glucosa (1,00 g), Na2HPO4 (2,52 g),
KH2PO4 (0,90 g), y NaHCO3 (0,52 g).

Si no se dispone de diluyente, se debería utilizar como anticoagulante dextrosa citrato ácido (20% [v/v]) o
dextrosa citrato fosfato (20% [v/v]) para suministrar la glucosa necesaria para la supervivencia de los
organismos.

c) Utilización de la vacuna
En el caso de las vacunas congeladas, los viales se descongelan por inmersión en agua precalentada a
40ºC, y el contenido se mezcla con un diluyente adecuado hasta la dilución requerida. Si se preparan
vacunas con glicerol, deben mantenerse frías y utilizarlas en un tiempo de 8 horas después de la
preparación (5). Si se utiliza DMSO como crioconservante, las vacunas preparadas deben mantenerse en
hielo y utilizarse en 15-30 minutos (24). El modo más común de administración de la vacuna es por vía
subcutánea.

Las vacunas refrigeradas se deben mantener en frío y utilizarse dentro de los 6 días siguientes a su
preparación.

La cepa de A. centrale que se usa en las vacunas es de virulencia reducida, pero no es por completo
segura. En consecuencia, un consejo práctico es limitar el uso de las vacunas a terneros, en los que la
inmunidad inespecífica reducirá el riesgo de reacciones debidas a la vacunación. Cuando se tienen que
vacunar animales de mayor edad, existe el riesgo de reacciones graves. Estas reacciones no son
frecuentes, pero la presencia de animales de reproducción valiosos o en estado de gravidez merece
atención, y deberían observarse los animales entre las 4 y 6 semanas después de la vacunación. Los
animales clínicamente enfermos deben tratarse con tetraciclina o imidocarb a dosis recomendadas por los
fabricantes.

La inmunidad de protección se desarrolla en 6-8 semanas y por lo general persiste varios años.

A menudo se utilizan en paralelo las vacunas contra la anaplasmosis y la babesiosis, pero no es

recomendable utilizar simultáneamente otras vacunas.

3. Control interno

a) Origen y mantenimiento de los donantes de vacuna

Debe identificarse una fuente de terneros exentos de infección natural por Anaplasma y de otras
enfermedades transmitidas por garrapatas. Si no se dispone de ellos, puede ser necesario criar los terneros
bajo condiciones libres de garrapatas con el propósito específico de producción de vacunas.

Los terneros deben mantenerse en condiciones que eviten su exposición a enfermedades infecciosas y a
garrapatas e insectos picadores. En ausencia de servicios adecuados, debe valorarse el riesgo de
contaminación con agentes de enfermedades infecciosas que estén presentes en el país concreto, y se
deben comparar los beneficios derivados de la producción local de vacunas frente a las posibles
consecuencias adversas de difundir enfermedades (10).

b) Cirugía
Para permitir el máximo rendimiento de obtención de organismos para producción de vacunas, los terneros
donantes deben ser esplenectomizados. Esto se lleva a cabo con preferencia en terneros jóvenes con
anestesia general. Los detalles de esta técnica, incluyendo los procedimientos pre- y post-operatorios, se
describen en otra parte (10).

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 543

 Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

c) Selección de donantes para vacunas antes de la inoculación

Los terneros donantes deben examinarse en cuanto a todas las infecciones sanguíneas que sean
prevalentes en el país productor de la vacuna, incluyendo Babesia, Anaplasma, Cowdria, Theileria y
Trypanosoma. Esto se lleva a cabo mediante examen rutinario de extensiones de sangre teñidas después
de la esplenectomía, y preferiblemente también por serología. Cualquier ternero que muestre evidencias de
infecciones naturales debe ser rechazado. También debe confirmarse la ausencia de otros agentes
infecciosos. Estos pueden incluir a los agentes de la leucosis enzoótica bovina, enfermedad de las
mucosas, rinotraqueitis bovina infecciosa, fiebre efímera, enfermedad de Akabane, lengua azul, glosopeda
o fiebre aftosa y peste bovina. Las pruebas dependerán de las enfermedades prevalentes en el país y de la
disponibilidad de ensayos, pero en último término deberían contemplar la serología de sueros pareados y,
en algunos casos, el aislamiento del agente (5, 24, 26).

d) Observación de parasitemias después de la inoculación

Es necesario determinar la concentración de parásitos en la sangre recogida para vacunas. Existen
técnicas cuidadosas para determinar el contaje de los parásitos (10), pero, en ausencia de éstas, la
concentración de parásitos se puede calcular a partir del contaje de eritrocitos y de la parasitemia
(porcentaje de eritrocitos infectados).

e) Recolección de sangre para vacunas

Antes del uso, debe esterilizarse todo el equipo (por ejemplo, en autoclave). Una vez alcanzada la
parasitemia deseada, la sangre se recoge con heparina utilizando técnicas asépticas estrictas. Esto se
realiza más fácilmente si se seda al ternero y se usa un circuito cerrado de recolección.

Se pueden extraer hasta 3 litros de sangre con niveles de infección elevados de un ternero de 6 meses. Si
el ternero va a permanecer vivo, es adecuada la transfusión de una cantidad similar de sangre de un
donante apropiado. Alternativamente, el ternero debe ser sacrificado inmediatamente después de la
extracción de la sangre.

f) Distribución de las vacunas

Todo el proceso se realiza en un ambiente apropiado, como en una cabina de flujo laminar, utilizando
técnicas estériles estándar. El uso de un agitador mecánico o magnético asegura una buena mezcla de la
sangre y del diluyente a través de todo el proceso de distribución.

4. Control de lotes

En el caso de las vacunas refrigeradas, la potencia, seguridad y esterilidad de los lotes de vacuna no se puede
determinar, y para las vacunas congeladas las especificaciones dependen del país concreto. Las siguientes
indicaciones se aplican a las vacunas congeladas producidas en Australia.

a) Esterilidad y ausencia de contaminantes

Para cada lote de vacuna y diluyente se emplean técnicas estándar de esterilidad (ver Capítulo I.1.5).

La ausencia de contaminantes se confirma inoculando ganado y observándolo serológicamente en cuanto a

agentes infecciosos que potencialmente podrían contaminar la vacuna. El ganado inoculado durante la
prueba de potencia (ver sección C.4.c) es adecuado para este fin. Dependiendo del país de origen de la
vacuna, estos agentes incluyen los microorganismos que causan la leucosis enzoótica bovina, rinotraqueitis
bovina infecciosa, enfermedad de las mucosas, fiebre efímera, enfermedad de Akabane, virus Aino, lengua
azul, parainfluenza, glosopeda o fiebre aftosa, enfermedad nodular, rabia, fiebre del Valle del Rift, peste
bovina, pleuroneumonía bovina contagiosa, enfermedad de Jembrana, cowdriosis, especies patógenas de
Theileria y Trypanosoma, Brucella abortus, Coxiella y Leptospira (5).

b) Seguridad
Las reacciones vacunales del ganado inoculado en la prueba de potencia (ver sección C.4.c) se observan
mediante la medición de la parasitemia y el descenso volumétrico en células empaquetadas. Solo se ponen
en circulación para uso los lotes con niveles de patogenicidad iguales o inferiores a un estándar
predeterminado.

c) Potencia
La vacuna se descongela y se diluye 1/50 con un diluyente adecuado (15). La vacuna diluida se incuba
luego 8 horas a 30ºC, y se inoculan subcutáneamente cinco cabezas de ganado con dosis de 2 ml. Los

544 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

 Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

animales inoculados se observan para presencia de infecciones examinando frotis de sangre, teñidos. Para
que un lote sea aceptable todos deberían estar infectados. Un lote que sea infeccioso al 1/50 se
recomienda para uso a una dilución 1/5 con diluyente isotónico.

d) Duración de la inmunidad
Después de una inoculación se logra inmunidad parcial, pero duradera. No existe evidencia de que la
vacunación repetida tenga un efecto estimulante.

e) Estabilidad
Cuando se almacena en nitrógeno líquido, la vacuna se puede mantener durante 5 años. Una vez que se
descongela, pierde rápidamente su potencia. La vacuna descongelada no puede congelarse de nuevo.

f) Conservantes
No se añaden conservantes. En la fase de distribución, se añade a la vacuna penicilina (500.000 UI/litro) y
estreptomicina (370.000 UI/litro).

g) Precauciones (riesgos)
La vacuna no es infecciosa para humanos. Cuando el producto se almacena en nitrógeno líquido, se
aplican las precauciones normales en cuanto a conservación, transporte y manejo del material
ultracongelado.

5. Pruebas sobre el producto final

a) Inocuidad
Ver Sección C.4.b

b) Potencia
Ver Sección C.4.c

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