Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza

Preparación de Medios de Cultivo

Christopher Andrés Corcuera Zabarburú

Práctica 01

Preparación de Medios de Cultivo

Introducción:

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su

crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento
de los microorganismos es el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie
de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como
un grado correcto de acidez o alcalinidad.

Materiales de prácticas en general:

Placas petri Tubos de algodón Matraz de pipetas Baguetas Fosforo

Ensayo Erlenmeye
r
Gradilla Balanza Matraz 1 frasco de Cocina Mechero Cucharita
mecánica con LIA Caldo de eléctrica de para
brila alcohol tomar
muestras

1. Procedimiento para la preparación de caldo Brila:

a) Para comenzar el proceso del caldo brila (caldo verde brillante), primero
se leen las especificaciones del frasco donde nos dice que se utiliza 40g.
Para 1L. De caldo, basándonos en esta medida nosotros obtendremos la
cantidad deseada mediante una regla de 3 simple.

40g _________________ 1000Ml X = 40 x 400 = 16g.

x _________________ 400Ml 1000

b) Ponemos los 16g. de caldo brila sobre un papel cualquiera cortado en

forma de rectángulo (esto se hace para poder guardar la muestra, ya que el
caldo brila es HIDROSCOPICO, es decir que reacciona con el ambiente por
humedad y aire); llevamos el papel sobre una balanza, esta ocasión usamos
una balanza mecánica pero se recomienda una balanza analítica para
mejores resultados.

c) Ahora pasaremos a medir nuestra cantidad de agua destilada, para eso

nos ayudaremos de una probeta, y medimos 400ml exactamente, luego
trasvasamos nuestro contenido a una fiola (ayudándonos de un embudo), ya
con el agua dentro tomamos nuestro paquetito de caldo brila y lo volteamos
en el agua, moviendo con una bagueta en sentido horario hasta que se
disuelva completamente.
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d) Luego con ayuda de unas pinzas y una estufa calentamos nuestra

solución en sentido horario por un periodo de 5 a 10 minutos, en este
transcurso de tiempo el caldo brila cambiara de color amarillo claro a color
verde oscuro o verde claro (depende de la marca)

e) Se deja enfriar por unos minutos y con ayuda de una pipeta trasvasamos
11ml de nuestro caldo a cada uno de los tubos de ensayo que ya tendremos
preparados (estos llevan dentro unos tubos aun más pequeños), al hacer
esto tenemos que procurar que el tubo más pequeño este lleno y el caldo
brila llegue hasta la tapita de este, para esto movemos la muestra de arriba
hacia abajo tapando con el dedo pulgar la entrada del tubo de ensayo.

f) Ya hecho esto deberíamos tener nuestros tubos completos (ya tapados con
el algodón), ahora tomamos todos nuestros tubos de ensayo y los colocamos
en un envase más grande, le colocamos un capuchón (algodón y un papel),
procurando que esté completamente cerrado y para mejores resultados lo
amarramos con un trozo de hilo, luego lo rotulamos y se envía al autoclave
por 121°C a 1ATM. de presión.

4. Procedimiento para la preparación de TSI (Triple Sugar Iron)

a) (Tsi Un medio para la diferenciación de enterobacteriaceae basado en la producción de sulfuro

de hidrogeno y fermentación de lactosa, y dextrosa) Tomamos el TSI, el cual está contenido en un
matraz y se encuentra solidificado, esta sustancia paso por casi los mismos pasos que el caldo
brila para llegar a estar así como esta

b) Para fundirlo utilizaremos una cocina eléctrica. Con la ayuda de una pinza
se coge el matraz con TSI, se coloca y se retira de la cocina sin dejar de
agitarlo levemente, con la finalidad de que el material no se sobrecaliente y
cause prejuicios. Al cabo de unos minutos se tendrá el TSI líquido.
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c) Se deja enfriar el matraz por unos minutos, mientras eso se prepara los
tubos de ensayo en los cuales se depositará el TSI, también el mechero con
alcohol. Una vez que el matraz se encuentra relativamente frío se procede a
depositar el TSI en los tubos de ensayo, pero para mantener nuestros
materiales esterilizados y mientras se realiza el intercambio de depósito del TSI
se hace uso del calor del mechero (calor seco-fuego directo). Luego
raudamente se tapan los tubos de ensayo con algodón de igual forma con el
matraz.

d) Luego de verter el TSI en los tubos de ensayo se colocan con una leve
inclinación. Una vez que estos se solidifican se colocan en la gradilla.

 DATO: Tanto el TSI, como el LIA y el Citrato tienen los mismos pasos

5. Procedimiento para preparación Mc Conckey

a) (Mc Conckey: Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram

.
negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos) Primero se
funde el sólido Mc Conckey

Se deja enfriar luego se vierte en las placas petri con una relación de 1/3
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Luego se esparce de forma uniforme (se gira hasta q se esparza) se

tapa y rotula

 DATO: El extracto de levadura tiene el mismo procedimiento

que el Mc Conckey

Resultados:

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas
sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian
sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios
contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero
no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente.

En esta práctica usamos los siguientes y estos fueron nuestros resultados:

CALDO BRILA LIA TSI CITRATO

Mc Conckey Extracto de Levadura

Discusiones:

a) ¿Qué es un medio de cultivo?

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R: Son sustancias nutritivas que permiten el crecimiento óptimo de los microorganismos, estas
tiene aminoácidos, proteínas, vitaminas, tienen un pH adecuado de 6.8–7.2 para que todos los
microorganismos puedan crecer (hongos, bacterias, etc.)

b) ¿Cómo se prepara?

R: MEDIOS ENRIQUECIDOS: Algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en

medios de cultivo normales. Para cultivarlos necesitamos añadir sustancias altamente nutritivas
como sangre, suero, extractos de tejidos animales... Estos medios son los medios enriquecidos, y
los microorganismos que crecen en ellos son microorganismos exigentes o fastidiosos. Ejemplo:
agar-sangre.

MEDIOS SELECTIVOS: Contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un

determinado tipo de microorganismos y no afectan a otros tipos. Ej: El cristal violeta inhibe las gram
+. Otra manera es modificar la fuente de carbono; si sustituimos la glucosa por maltosa,
seleccionamos aquellos microorganismos capaces de digerirla.

MEDIOS DIFERENCIALES: Contienen distintos compuestos químicos o indicadores sobre los que
determinados microorganismos adquiere coloraciones específicas o reaccionan de una manera
determinada.

Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul de metileno) que nos permiten
diferenciar a las colonias que viven en el medio. Escherichia coli forma colonias de color verde
claro, mientras que enterobacter forma colonias de color rosa salmón.

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES: Ejemplo: Agar Mc Conkey tiene cristal violeta y sales
biliares. Es un medio específico para enterobacterias. Cristal violeta inhibe a las gram +. Las sales
biliares hace que sólo se desarrollen las gram - que puedan tolerar estas sales; las enterobacterias.
El indicador es el rojo neutro, que es rojo a pH ácido e incoloro a pH básico. Como fuente de
carbono se utilizan peptona y lactosa.

Se usa para detectar E. Coli y Salmonella. E. Coli es tolerante a la lactosa. Al digerirla, libera
ácidos, por lo que se crea un medio ácido y el indicador se pone rojo. Salmonella no tolera la
lactosa, por lo que no formará ácidos y formará colonias incoloras.

CULTIVOS PUROS: MEDIOS DE OBTENCIÓN: Los microorganismos en estado natural crecen de

forma heterogénea o mixta. Cuando queremos estudiar un microorganismo dado, debemos
aislarlo.

Un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener estos
cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola célula (son clones). Hay
diferentes métodos para obtenerlas:

MÉTODO DE SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O EN ESTRÍA: Necesitamos:

 Placa petri con medio de cultivo

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 Muestra (sólida o líquida)

 Asa de siembra de platino

Con el asa estéril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar
el asa de siembra y extendemos parte de la extensión anterior en otra dirección. Volvemos a
esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensión en otra
dirección. Esterilizamos y repetimos la operación.

Incubamos a 37 º durante 24 horas y, en la primera zona, habrá un amasijo de células. En la

segunda, parte de la primera zona estará mejor extendida, y en la tercera y en la 4ª mejor aún.

Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro.

MÉTODO DE LAS DILUCIONES SUCESIVAS: Consiste en diluir una muestra hasta conseguir
muy pocas células que, tras inocularse en un medio de cultivo, generen colonias aisladas.
Metodología:

Ahora tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa petri con medio de cultivo. Con
un asa de vidrio se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubamos a 37 ºC durante 24 horas.

En la primera dilución habrá un amasijo de colonias. En la siguiente habrá diez veces menos
número de colonias, y así sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas.

Este método nos permite calcular el número de microorganismos viables que existen en la muestra
que estamos analizando:

N=C · 1/D · 1/i donde:

N es el número de microorganismos presentes en la muestra

C es el número de colonias contadas UFC (unidades formadoras de colonias)

D es la dilución

I es el inoculó

Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede tratarse de una
contaminación) y, si hay más, no están aisladas.

c) Características principales de los medios de cultivo

R: A) Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese Microorganismo. Como

fuentes de energía tenemos:
 Fuente de carbono: otras azucares simples y complejos, otros gas carbónico,
hidrocarburos o incluso hidrocarbonados diferentes.
 Fuente de nitrógeno: Esta fuente de energía la van a formar las proteínas, péptidos o
aminoácidos. Otros requerimientos no energéticos de los microorganismos son:
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a) Fuentes de azufre: Lo hacen mayoritariamente en forma de sulfatos.

b) Fuente de fósforo: En forma de fosfatos
c) Iones metálicos: A concentraciones muy bajas (cinc, manganeso, cobre, cobalto,
molibdeno)
d) Factores de crecimiento: Corresponden a algún tipo de aminoácido (cisteína), factores
específicos (F. X o F. V) o incluso vitaminas o bases púricas, pirimídicas,…
e) Factores de arranque: Son sustancias que van a permitir a la bacteria salir de su fase de
latencia. Esto se consigue con glucosa o iones que estimulen su crecimiento.
f) Factores inhibidores: Son componentes que van a impedir el crecimiento como la azida
sódica (gran-), los antibióticos, la eosina azul de metileno (gram +)
B) Condiciones físico-químicas apropiadas:
a. Temperatura óptima: Hay tres tipos de bacterias dependiendo del grado de temperatura a
las que crezcan:

 Psicrófilas: < 20ºC

 Mesófilas: 18-45ºC
 Termófilas: > 45ºC

b. Grado de humedad: La cantidad de agua que va a necesitar el microorganismo para su

desarrollo. La liofilización o cualquier método de deshidratación es un buen medio de
conservación.
c. pH: Los buffers o tampones son los encargados de estabilizar el pH del medio a un pH
cercano a la neutralidad que es el pH óptimo, aunque hay m.o que crecen mejor en pH
ácidos (tiobacilos) o pH alcalinos (Proteus o Vibrio cholerae)
d. Presión osmótica: En condiciones de isotonía (300 miliosmoles), aunque hay bacterias
halófilas en las cuales su crecimiento se produce en concentraciones muy altas de cloruro
sódico (10%) como el Género Staphylococcus; o en condiciones osmófilas en las que
requieren un 70% de azúcar
e. Presencia o ausencia de oxígeno

d) ¿Cómo se clasifican?

R: Los medios de cultivo se clasifican en:

1) Sólidos
2) Líquidos
3) Semisólidos

1) Sólidos: Los básicos y elementales son el agar simple y la gelatina. El agar o gelosa
simple resulta de la adición de agar al 1.5% (15g/1000ml). Para el medio gelatina se
agrega 12% de gelatina (120g/1000ml). El medio más usado es el agar simple, no así la
gelatina que presenta el inconveniente de licuarse a los 22°C.(Huamán García Flor 2003).
2) Líquidos: Los elementales y básicos de este tipo son: el agua peptonada de Koch, el
caldo simple y el caldo de infusión de carne. (Huamán García Flor 2003).
3) Semisólidos: Estos se consiguen agregando una menor cantidad de agar al medio base
2g a 3g por 1000ml. (Huamán García Flor 2003)
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Bibliografía:

 Chávez Ch. Tito, 2008, Biología curso básico, 4ta reimpresión, cobra 2000, Lima-Perú.
 Mblgo. Huamán García Flor Teresa; Blgo. Jorge Torres Delgado, 2003, Manual de
laboratorio de microbiología, I edición, Sevillano SAC, Trujillo-Perú.
 Schlegel G. Hans, 1997, Microbiología General, nueva edición, editorial OMEGA,
Barcelona
 Madigan T. Michael; Martinko M. Jhon; Parker Jack, 2002, BROCK biología de los
microorganismos, 10ª ed, Pearson edit, Madrid-España.
 D. Robertis, 1968, citología general, I edición, edit. El ateneo, Barcelona.