Animales libres de patógenos específicos (página 2)

Enviado por Layna Riera Ojeda

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Categoría II: Animal Miroxénico.

Son comparables a los animalesconvencionales mantenidos bajo condiciones
sanitarias estrictas y estándares. Los mismos albergan una fracción inoculada
de microorganismos no patógenos tomadas de la microbiota de un haloxénico;
deben mantener o ser del mismo status de la Categoría I y además estar libres
de:
 Listeria monocytogenes
 Bacillus piliformis (Clostridium piliformis)
 Estadíos intermedios de Céstodos y de Artrópodos parásitos obligados.
 Especies determinadas demandan la ausencia de los Virus: Ectromelia
(Ratón) y Myxomatosis(Conejo).

Categoría III: "Animal Gnotobiótico con microbiota definida "

Son comparables a los animales derivados de cesárea (Axénicos) a los que se les
introducen voluntariamente especies microbianas conocidas. Deben ser del
mismo status de la Categoría II y además estar libres de:
 Bordetella bronchiseptica
 Toda Pasteurella
 Todas las Coccidias (Eimerias spp) y Helmintos patógenos

Además especies determinadas demandan la ausencia de:

 Streptobacillus moniliformis (Ratones y Ratas)
 Corynebacterium kutscheri (C. murium) (Ratones)
 Streptococcus pneumoniae (Cobayo y Conejo)
 Todas las especies de Mycoplasma (Ratones y Ratas)
 Treponema cuniculi (Sífilis del conejo/Conejo)

Categoría IV: Animal Heteroxénico (Libre de gérmenes patógenos,

SPF)
Son comparables a los animales descritos como libres de gérmenes patógenos
específicos ( Specific Pathogens Free, SPF). Estos son derivados de un Axénico
o Gnotobiótico que adquiere una microbiota proveniente de su medio, son
mantenidos en Zonas Protegidas (sistemas cerrados). Deben ser del mismo
status de la Categoría III y además estar libres de:
 Estreptococos (excepto Grupo D)
 Neumococos
 Helmintos
 Protozoos patógenos
 Virus que afectan estas especies

Además especies determinadas demandan la ausencia de:

 Todas las especies de Mycoplasma (Hamster y Cobayo)
 Fusiformis necrophorus (Conejos)

Categoría V: Animal Axénico (Libre de gérmenes, GF)

Son animales que no albergan ninguna especie microbiana viviente detectable.
Los mismos son el resultado del uso de sistemas cerrados estériles y son libres
de todo organismo demostrable (virus, bacterias, hongos, parásitos y
organismos saprófitos). Son conocidos como animales " Germ Free" o
"Axénicos", los cuales son derivados por histerotomía (cesárea) o histerectomía
aséptica, criados y mantenidos en un aislador mediante técnicas
"Gnotobióticas". Estos animales no siempre se obtienen en la práctica, debido a
los agentes transmitidos verticalmente.
Este esquema de clasificación por categorías ha sido sujeto a revisiones
regulares y a pesar de algunos cambios menores en cuanto al establecimiento y
definición de las entidades microbianas (bacterias, hongos, parásitos y virus)
que deben o no estar presentes según la categoría específica, el mismo ha
resistido la prueba del tiempo (Laboratory Animals Information, 1987; Poole,
1987; Charles River Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).
· Reseña histórica de los animales gnotobióticos
Los términos "Gnotobiología" y "Gnotobiótico"son derivados de las
palabras griegas "gnotos": conocimiento y "bio": vida ; significa "vida
conocida".
La Gnotobiología es la ciencia de la producción de organismos (animales,
plantas y humanos) colonizados con especies de microorganismos beneficiosos
o dañinos que son conocidos tanto como puedan ser detectados por modernas
técnicas de diagnóstico (Charles River Laboratory, 1962; Coates, Cooper, Heine,
Kraft, Hedrich, 1992).
Animales gnotobióticos
Los animales gnotobióticosson libres de gérmenes, exceptuando la
microbiota específica identificada que ha sido introducida intencionalmente.
Son conocidos también como animales de microbiota definida, ya que han sido
inoculados con una mezcla bien definida de microorganismos y mantenidos en
aisladores para prevenir la contaminaciónpor patógenos. Por tanto, un animal
gnotobiótico es un sistema positivamente biológico definido, que comprende el
huésped y los co-vecinos. Es una asociación de especies conocidas.
Estos animales son mantenidos en sistemas de aisladores, que han sido
químicamente o físicamente esterilizados previo al uso. Igualmente el aire, el
agua, el alimento y el encamado deben ser libres de gérmenes al entrar al
aislador. Varios aisladores son utilizados en estos procesos.
Los animales gnotobióticos se usan para investigaciones específicas o como un
núcleo para las colonias de reproducción, lo cual se conoce como Banco
Genético (CCAC, 1984 a; Charles River Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).
El término animal libre de gérmenes ("Germ-Free", en terminología
inglesa) es comúnmente usado para designar un animal con ausencia de
microorganismos, lo cual implica libres de bacterias, hongos, parásitos y virus.
Las limitaciones de esta terminología son obviamente dependientes de la
validez de las pruebasusadas (Fuller, 1968). Son conocidos también como
Animales Axénicos. Este último fue el primer término científico usado para
designar individuos de una especie libres de cualquier vida demostrable (Coates
& Gustafsson, 1984; Trexler, 1987; Besselsen, 2002).

Principales hechos relacionados con la historia de los

animales gnotobióticos
Históricamente, el mérito de la primera experimentación en el tema de libres de
gérmenes debe dársele a E. Duclaux (1885), quien intentó cultivar frijoles y
chícharos en un cultivo puro en un medio estéril. Pasteur al ver los resultados
de su discípulo plantea: … "de haber tenido tiempo me hubiera gustado seguir
los experimentospara saber si la vida sería posible en esas condiciones" , no
obstante dirigió toda su atenciónal problema de la vida libres de gérmenes, fue
con Pasteur que se inicia el debatesobre la posibilidad de la vida o no, sin
microbios. En la búsqueda de una respuesta los científicos comenzaron a
relacionarse con la tecnología Gnotobiotécnica de libre de gérmenes. Al año
siguiente (1886) su discípulo Nencki estimó que las bacterias no eran
indispensables para la vida, ya que estas producían sustancias tóxicas y que los
animales sin gérmenes debían vivir más tiempo que los contaminados
(Laboratory Animals Information, 1987; Heinecke, 1990).
No fue hasta 1895 en que Nuttal y Thierfelder obtuvieron por primera vez dos
curieles por cesárea mantenidos en una campana estéril durante 2 semanas sin
contaminación. En 1899 Schothelius busca otro camino en sus investigaciones
con gallinas libre de gérmenes y construye en su laboratorioun local cerrado con
cristales a una presiónde aire de 9m3 aproximadamente, del cual utiliza 0,5 m3
para crear un espacio donde pueda introducirse una persona y realizar el
cambio de ropa. Esta descripciónse conoce hoy en día con el nombre de "
CUARTO LIMPIO" (Heinecke, 1990).
De aquí en adelante y hasta las tres primeras décadas del siglo XX el propósito
primario de todas las investigaciones era dar respuestas a la interrogante de: "
sí la vida era posible en ausencia completa de microorganismos " (Laboratory
Animals Information, 1987).
A principios del siglo XX Eli Metchnikoff (1901-1903), director del Instituto
Pasteur de París, plantea con relación a este tema: …"que la flora no sólo era
innecesaria, sino que además era dañina al hospedero". Uno de los estudiantes
de Metchnikoff, M. Cohendy (1908) es enviado a aprender las técnicas de la vida
libre de gérmenes y en 1912 tiene éxitos en criar pollos libres de gérmenes,
conjuntamente con Wollman (1914) en producir curieles libres de gérmenes.
Por otro lado, un estudiante de Cohend, el investigador alemán E. Küster en
1915 empleando un equipamiento especial diseñado por él, mantuvo cabras
libres de gérmenes por 35 días contribuyendo de esta manera al establecimiento
de la experimentación libres de gérmenes.
Este fue el primer aparato capaz de mantener un ambiente definitivamente
estéril permitiendo la manipulación a través de mangas con guantes de goma y
la salida y entrada de materiales; a este aparato más tarde se le denominó
"AISLADOR" y es similar al equipamiento usado hoy para la obtención de
animales gnotobióticos. Su trabajotambién es importante al establecer los
animales libres de gérmenes como un instrumento valioso en el estudio de la
nutrición y las defensas del cuerpo (Laboratory Animals Information, 1987;
Heinecke, 1990).
Este primer período sobre la vida libre de gérmenes denominado período
Metodológico por Luckey, finaliza con los aportes de Cohendy, Kuster y
Guyenot, este último obtuvo moscas libres de gérmenes. Ellos demostraron que
la vida sin gérmenes era posible en las moscas, cabras y pollos (Heinecke,
1990).
De 1915 a 1934, existe un período de relativa inactividad, donde se plantea una
nueva interrogante: ¿Vale la pena proseguir las investigaciones sobre la vida
libre de todo germen demostrable?. Pero es con Küster que el campo de las
investigaciones gnotobióticas entra en la era contemporánea.
Gustafsson en Suiza (1948), Miyakawa en Japón (1951, 1953-1958) y Reyniers
(1932, 1933), Trexler (1957, 1959) en Estados Unidos, contribuyeron
grandemente a la expansión de esta disciplina, con la confección de aisladores o
cámaras de paredes rígidas elaborados particularmente con planchas de acero
inoxidables, los cuales fueron usados para proteger espacios estériles de trabajo,
en muchas de las primeras investigaciones con animales gnotobióticos.
Posteriormente grandes progresos se han obtenido en la lactanciaartificial,
reproducción y crianza de ratones y ratas libres de gérmenes (Reyniers, Trexler,
Ervin, 1946; Gustafsson, 1959) y el establecimiento de técnicas libres de
gérmenes utilizando aisladores de Cloruro de Polivinilo (PVC) por Trexler y
Reynolds (1957), siendo los mismos muy efectivos y donde su visibilidad e
iluminación pueden ser controlada desde el exterior (Charles River Laboratory,
1962; Laboratory Animals Information, 1987).
El desarrollode los experimentos sobre animales libres de gérmenes a partir de
la tercera década del siglo XX estuvo decididamente influenciada por los
avances tecnológicos sobre los sistemas de aislamiento. El sistema de simple
cajas o campanas herméticas fue modificado por compartimentos más
resistentes (de metal) y se comenzó a diseñar cilindros de acero inoxidable que
eran posibles someterlo a la esterilización por vapor y por tanto, impenetrable a
los microbios. Ya entre los años 1945-1960 se comienza la reproducción y
utilización de los animales gnotobióticos y en 1961 comienza su
comercialización (Laboratory Animals Information, 1987).
Desde esos tiempos una gran variedad de mamíferos, incluyendo las más
comunes especies de laboratorio, los roedores, animales de granja y el hombre,
han sido criado libres de gérmenes. Dentro de especies obtenidas, los cobayos
son comparativamente fáciles de criar libre de gérmenes porque son bastante
maduros al nacer y requieren poca o ninguna alimentación a mano. Son
reportados pobres niveles de supervivencia para el conejo, otras especies como
el perro, peces, monos, gatos, aves, carneros, chiva, cerdos y otras especies de
granja han sido obtenidas libre de gérmenes pero por su gran tamaño son
difíciles de mantener en aisladores por un largo período de tiempo (Coates et al,
1992).
Un importante uso de estos animales es el proveer el núcleo para las colonias
libres de patógenos específicos (SPF) así como en el desarrollo de
investigaciones toxicológicas y en la cienciamédica en general. Los animales
libres de gérmenes se crían con el propósito de investigar el papel que juegan
los microorganismos en la fisiologíadel organismo, es decir para estudiar al
animal por sí, sin la interferencia de su microbiota (Coates & Gustafsson, 1984).

Animales libres de patógenos específicos

Los animales libres de patógenos específicos (Specific Pathogens Free,
SPF, en terminología inglesa) se han convertido rápidamente en el estándar
mínimo aceptado para la investigación y además están comenzando a ser
exigidos por autoridades reguladoras como el status de los animales utilizados
en las pruebas de evaluación de productos destinados para uso humano y
veterinario (OMS/SIT/823, 1992; Institute of Laboratory Animal Resources
[ILAR], 1996; Consejo Canadiense de Protección Animal [CCPA], 1998).
Los animales SPF son colonizados por una variedad desconocida de especies de
microorganismos Sin embargo, son definido como libres de uno o varios
microorganismos (patógenos) específicos. Por tanto, un animal SPF es un
sistema negativamente biológico definido, que comprende el huésped e
inquilinos (microorganismos). Es una asociación biológica de una gran variedad
de especies microbianas, pero con la explícita seguridad de que una o varias
especies patógenas definidas no están presentes (CCAC, 1984 a; Charles River
Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).
Los animales libres de microorganismos patógenos específicos (LPE o SPF) se
caracterizan por poseer una microbiota asociada no patógena y específica para
la especie animal en cuestión. Se obtienen por cesárea o histerectomía aséptica,
a partir de un animal axénico o gnotobiótico con microbiota definida y son
transferidos a un aislador o a un sistema de barreras o zona protegida.
Ya una vez establecidos en una barrera libre de patógenos (Zonas Protegidas),
los animales son reproducidos normalmente y una poblaciónlibre de patógenos
es constituida entonces; las nuevas generaciones de animales pueden estar
libres de patógenos y mantenidos por sus padres (Charles River Laboratory,
1966; Lane-Petter, 1963 a; Arrington, 1972; Bailly, Bupont, Laroche, Raynaud,
1979; CCAC, 1984 a).
El concepto de LPE o SPF ha revolucionado indudablemente la producción de
animales libres de enfermedades, sin embargo, este término no es específico y
puede representar una variación en el status muy considerable pudiendo ser
desde colonias con una microbiota definida a colonias las cuales han sido libres
sólo de uno o dos patógenos conocidos. La designación LPE es en consecuencia
de mayor valor en tanto se obtenga una informacióncompleta de cual o cuales
patógenos la colonia estará libre (Perrot, Richard, Veillet, 1993).
En estudios realizados por Nelson (1960) en animales SPF encontraron que los
cambios más favorables son: el aumento del vigor y una mayor tasa
reproductiva al compararlos con los animales convencionales. Los ratones SPF
son conocidos por ser superiores en experimentos de largos períodos de tiempo,
ocurriendo pocas muertes inexplicables (Poole, 1987).

Principales aspectos relacionados con las barreras

utilizadas en la cría y mantenimiento de los animales
SPF.
Las barreras utilizadas en la cría y mantenimiento de los animales SPF pueden
tomar cualquier forma, pudiendo ir desde una lámina plástica flexible
(Aislador) hasta un sistema completo de paredes, equipamiento y otros (Zonas
Protegidas). La magnitud de esta barrera o zona protegida puede variar, siendo
desde un simple local con visor y autoclave hasta un sistema complejo con
múltiples locales y pasillos (Brick, 1968; ILAR, 1973; Mahouy, 1978).
Los sistemas de barreras para mantener una colonia SPF son una combinación
de factores constructivos, tecnológicos y métodosoperacionales que se
estabilizan en un ambiente cerrado donde se minimiza la presencia de
patógenos o de microorganismos no deseados infectando la población animal
(ILAR, 1976).
La producción a gran escalade animales SPF es factible llevarla a cabo en un
sistema de barreras. El término general de barrera o zona protegida abarca uno
de los mejores métodos para controlar el ambiente en un espacio determinado y
para esto se hace necesario contar con diferentes aspectos que deben
mantenerse controlados, estos son:
 Temperatura, humedad relativa y luz
 Filtración del aire con presión, lo cual está dado por la inyección del
mismo a través de un filtro HEPA con una eficiencia de un 99,9 %. Esta
sobrepresión de aire se ajusta en la instalación para prevenir la
contaminación (diferencias de presiones / Presión (+)).
 Sistemas de autoclaves, baños germicidas, cilindros de transferencias
(Transfer) y taquillas filtros.
 Esterilización del agua (usualmente por filtración, aunque el tratamiento
con ozono, la acidificación o halogenización pueden ser empleados o
combinaciones de diferentes métodos).
 Esterilización del alimento, encamado y otros insumos (usualmente
pasándolos por una autoclave de doble puerta atravesando una pared
barrera).
 Esterilización de ciertos utensilios (regularmente realizado por
desinfección químicaempleando potentes desinfectantes, pasándolos o
transfiriéndolos hacia el interior de la instalación a través de cilindros de
transferencias (transfer) o baños germicidas).
 El personaldebe ser altamente calificado y responsable. Sus movimientos
dentro de la instalación deben ser pausados y controlados, entrando una vez
al día a través de tres entradas. En la primera se quitarán la ropa de calle,
realizarán algunos lavados y necesidades fisiológicas (Taquilla Sucia), en la
segunda se bañarán de forma completa con agua esterilizada y jabón
bacteriostático (Ducha) y en la tercera se vestirán con ropa adecuada de
trabajo esterilizada (Taquilla Limpia). La ropa debe cambiarse cada vez que
se utilice debiendo ser esterilizada antes de su uso, se emplearán cubiertas
de cuello y cabeza, mangas largas, máscaras para cubrir nariz y boca y se
utilizarán botas y guantes. La higiene del personal es obligatoria y existirá un
programa de salud que incluye: examen médico, análisis de laboratorio
microbiológicos y clínicos y vacunaciones periódicas contra enfermedades
infecto-contagiosas transmisibles.

(ILAR, 1968, 1973; Veterinary Resources Branch [VRB], 1976; FELASA, 1995,
1999, 2000).
Un último aspecto que se debe tener en cuenta y no por ello menos importante
es que debe existir un cuidadoso y persistente monitoreo microbiológico para
verificar el estado de salud del animal mantenido en los sistemas de barreras
(CCPA, 1998).

III) Control microbiológico a los animales de

laboratorio.
La salud de un animal está siempre en riesgode adquirir una variedad de
infecciones, tales pueden ser inaparentes o no por lesiones macroscópicas u
obvias. La clínica de una infección puede no ser observada hasta que el animal
es estresado, por ejemplo un procedimiento experimental (Kraft et al, 1992,
1993). La mayoría de las infecciones en roedores son subclínicas y a menudo
ocurren modificaciones en los resultados de una investigación debido a
infecciones naturales en ausencia de infecciones clínicas. Por eso, la ausencia de
manifestaciones clínicas de una infección tiene un limitado valor diagnóstico.
De ahí que sea imprescindible la prevención de la infección y no solamente la
prevención de enfermedades clínicas (Rehbinder et al, 1996, Niclas et al, 2002).
Además de las consideraciones de bienestar, el principal objetivode un control
de salud antes y durante los experimentos, es definir el estado biológico de los
animales para tener en cuenta la presencia o ausencia de ciertos
microorganismos, lesiones y otras alteraciones como variables experimentales
(Rehbinder et al, 1996).
El control microbiológico a los animales de laboratorio se recomienda para
detectar la presencia de microorganismos no deseados o para conocer los
cambios microbiológicos en el ambiente y así poder evaluar los procedimientos
rutinarios de desinfección. El monitoreo periódicoa los animales de laboratorio
para determinar la presencia de su microbiota no patógena definida implantada
voluntariamente o su microbiota no patógena para la especie obtenida
espontáneamente o accidentalmente en contacto con el hombre es de gran
importancia (Charles River Laboratory, 1966, 1990; ILAR, 1973; Rehbinder &
Hansen, 1993).
Existen cuatro razones básicas para incluir un microorganismo particular en un
monitoreo de salud:
1. Los microorganismos pueden influir en los resultados de la prueba en los
cuales los animales son usados.
2. Los microorganismos tienen una influencia negativa en el status de los
animales.
3. Los microorganismos pueden infectar otras especies, incluyendo al
hombre.
4. Los microorganismos tienen una influencia negativa en el resultado de la
producción de los animales.

(Hansen, 1989).
En un monitoreo biológico para organismos específicos no deseados, existen
consideraciones generales, así como aspectos a tener en cuenta como es la
frecuencia de los muestreos, el tamaño de la muestra (número de animales a
muestrear), el tipo de muestras, el métodode examen o el procedimiento para
detectar e identificar los organismos específicos, el conocimiento de la
sensibilidad y especificidad de los métodos o test usados y el conocimiento de la
prevalencia de los microorganismos (Charles River UK. Limited, 1985; Bondy et
al, 1987, Armand Frappier, 1990; Gnotobiotes Standards, 1990; IFFA CREDO,
1990; HARLAN OLAC Limited, 1990/1998; HARLAN OLAC UK. Limited, 1998;
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1994; Kraft et al, 1994; Thomann, Wyss-Spillmann, Homberger, 1994; UC
Davis, 2004).
Por tanto, todo sistema de control, de monitoreo y de regulaciones que se
establezca para la prevención de infecciones y para el control y mantenimiento
del status higiénico sanitario de los animales es un aspecto fundamental y debe
ser llevado a cabo con gran rigor técnico.

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Biografía del autor

Nombre y Apellidos Layna de las Mercedes Riera Ojeda

Fecha y Lugar de
24/09/1963 Ciudad de la Habana, Cuba
nacimiento

E-mail , nivian[arroba]censa.edu.cu

Graduado, Fecha y Licenciatura en Universidad de la Habana

1986
Lugar Microbiología (U.H)

Calle 3era e/ 4ta y 6ta Edif. 2 apto 8 Rpto La Unión. Boyeros.

Dirección particular
Ciudad de la Habana. Cuba

Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio

Centro Trabajo
(CENPALAB). La Habana. Cuba

Fecha incorporación 1986 (más de 20 años de trabajo en el sector)

Otros Títulos

Grado científico Master en Microbiología Clínica Fecha: 2001 Lugar: U.H

Categoría Docente - Fecha: - Lugar: -

Categoría
Científica o Tecnólogo de 1er Nivel Fecha: 2004 Lugar: CITMA. Cuba
Tecnológica

Labor que Especialista Integral en Microbiología.

desempeña Jefa del Grupo de Mejora Continua de la Calidad

Líneas de Investigación que desarrolla y las investigaciones más importantes realizadas

en los últimos 5 años.

Año Líneas de trabajo e Investigaciones realizadas

1986-1990 Obtención y control microbiológico de diferentes especies de animales de

 laboratorio en condiciones gnotobióticas

Estudios de la incidencia de entidades microbianas en animales

1986-Actualidad
laboratorio

Normalización de sistemas inmunoenzimáticos ELISA para el diagnóstico

1990-Actualidad
bacteriológico en animales de laboratorio

1995, 1999 y Obtención y evaluación de vacunas bacterianas en animales de

2004-Actualidad laboratorio

Especialista principal en microbiología en la producción de animales

gnotobióticos.
2000-Actualidad
Implantación del Sistema de Aseguramiento y Control de la Calidad en el
CENPALAB

Evaluación y Mejora del Sistema de Aseguramiento y Control de la

2005-Actualidad
Calidad en el CENPALAB

 
MSc. Layna Riera Ojeda
Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB).
La Habana. Cuba
Diciembre 2006

Animales libres de patógenos específicos (página 2)

Enviado por Layna Riera Ojeda
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 Partes: 1, 2

Categoría II: Animal Miroxénico.

Son comparables a los animalesconvencionales mantenidos bajo condiciones
sanitarias estrictas y estándares. Los mismos albergan una fracción inoculada
de microorganismos no patógenos tomadas de la microbiota de un haloxénico;
deben mantener o ser del mismo status de la Categoría I y además estar libres
de:
 Listeria monocytogenes
 Bacillus piliformis (Clostridium piliformis)
 Estadíos intermedios de Céstodos y de Artrópodos parásitos obligados.
 Especies determinadas demandan la ausencia de los Virus: Ectromelia
(Ratón) y Myxomatosis(Conejo).

Categoría III: "Animal Gnotobiótico con microbiota definida "

Son comparables a los animales derivados de cesárea (Axénicos) a los que se les
introducen voluntariamente especies microbianas conocidas. Deben ser del
mismo status de la Categoría II y además estar libres de:
 Bordetella bronchiseptica
 Toda Pasteurella
 Todas las Coccidias (Eimerias spp) y Helmintos patógenos

Además especies determinadas demandan la ausencia de:

 Streptobacillus moniliformis (Ratones y Ratas)
 Corynebacterium kutscheri (C. murium) (Ratones)
 Streptococcus pneumoniae (Cobayo y Conejo)
 Todas las especies de Mycoplasma (Ratones y Ratas)
 Treponema cuniculi (Sífilis del conejo/Conejo)

Categoría IV: Animal Heteroxénico (Libre de gérmenes patógenos,

SPF)
Son comparables a los animales descritos como libres de gérmenes patógenos
específicos ( Specific Pathogens Free, SPF). Estos son derivados de un Axénico
o Gnotobiótico que adquiere una microbiota proveniente de su medio, son
mantenidos en Zonas Protegidas (sistemas cerrados). Deben ser del mismo
status de la Categoría III y además estar libres de:
 Estreptococos (excepto Grupo D)
 Neumococos
 Helmintos
 Protozoos patógenos
 Virus que afectan estas especies

Además especies determinadas demandan la ausencia de:

 Todas las especies de Mycoplasma (Hamster y Cobayo)
 Fusiformis necrophorus (Conejos)

Categoría V: Animal Axénico (Libre de gérmenes, GF)

Son animales que no albergan ninguna especie microbiana viviente detectable.
Los mismos son el resultado del uso de sistemas cerrados estériles y son libres
de todo organismo demostrable (virus, bacterias, hongos, parásitos y
organismos saprófitos). Son conocidos como animales " Germ Free" o
"Axénicos", los cuales son derivados por histerotomía (cesárea) o histerectomía
aséptica, criados y mantenidos en un aislador mediante técnicas
"Gnotobióticas". Estos animales no siempre se obtienen en la práctica, debido a
los agentes transmitidos verticalmente.
Este esquema de clasificación por categorías ha sido sujeto a revisiones
regulares y a pesar de algunos cambios menores en cuanto al establecimiento y
definición de las entidades microbianas (bacterias, hongos, parásitos y virus)
que deben o no estar presentes según la categoría específica, el mismo ha
resistido la prueba del tiempo (Laboratory Animals Information, 1987; Poole,
1987; Charles River Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).
· Reseña histórica de los animales gnotobióticos
Los términos "Gnotobiología" y "Gnotobiótico"son derivados de las
palabras griegas "gnotos": conocimiento y "bio": vida ; significa "vida
conocida".
La Gnotobiología es la ciencia de la producción de organismos (animales,
plantas y humanos) colonizados con especies de microorganismos beneficiosos
o dañinos que son conocidos tanto como puedan ser detectados por modernas
técnicas de diagnóstico (Charles River Laboratory, 1962; Coates, Cooper, Heine,
Kraft, Hedrich, 1992).
Animales gnotobióticos
Los animales gnotobióticosson libres de gérmenes, exceptuando la
microbiota específica identificada que ha sido introducida intencionalmente.
Son conocidos también como animales de microbiota definida, ya que han sido
inoculados con una mezcla bien definida de microorganismos y mantenidos en
aisladores para prevenir la contaminaciónpor patógenos. Por tanto, un animal
gnotobiótico es un sistema positivamente biológico definido, que comprende el
huésped y los co-vecinos. Es una asociación de especies conocidas.
Estos animales son mantenidos en sistemas de aisladores, que han sido
químicamente o físicamente esterilizados previo al uso. Igualmente el aire, el
agua, el alimento y el encamado deben ser libres de gérmenes al entrar al
aislador. Varios aisladores son utilizados en estos procesos.
Los animales gnotobióticos se usan para investigaciones específicas o como un
núcleo para las colonias de reproducción, lo cual se conoce como Banco
Genético (CCAC, 1984 a; Charles River Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).
El término animal libre de gérmenes ("Germ-Free", en terminología
inglesa) es comúnmente usado para designar un animal con ausencia de
microorganismos, lo cual implica libres de bacterias, hongos, parásitos y virus.
Las limitaciones de esta terminología son obviamente dependientes de la
validez de las pruebasusadas (Fuller, 1968). Son conocidos también como
Animales Axénicos. Este último fue el primer término científico usado para
designar individuos de una especie libres de cualquier vida demostrable (Coates
& Gustafsson, 1984; Trexler, 1987; Besselsen, 2002).

Principales hechos relacionados con la historia de los

animales gnotobióticos
Históricamente, el mérito de la primera experimentación en el tema de libres de
gérmenes debe dársele a E. Duclaux (1885), quien intentó cultivar frijoles y
chícharos en un cultivo puro en un medio estéril. Pasteur al ver los resultados
de su discípulo plantea: … "de haber tenido tiempo me hubiera gustado seguir
los experimentospara saber si la vida sería posible en esas condiciones" , no
obstante dirigió toda su atenciónal problema de la vida libres de gérmenes, fue
con Pasteur que se inicia el debatesobre la posibilidad de la vida o no, sin
microbios. En la búsqueda de una respuesta los científicos comenzaron a
relacionarse con la tecnología Gnotobiotécnica de libre de gérmenes. Al año
siguiente (1886) su discípulo Nencki estimó que las bacterias no eran
indispensables para la vida, ya que estas producían sustancias tóxicas y que los
animales sin gérmenes debían vivir más tiempo que los contaminados
(Laboratory Animals Information, 1987; Heinecke, 1990).
No fue hasta 1895 en que Nuttal y Thierfelder obtuvieron por primera vez dos
curieles por cesárea mantenidos en una campana estéril durante 2 semanas sin
contaminación. En 1899 Schothelius busca otro camino en sus investigaciones
con gallinas libre de gérmenes y construye en su laboratorioun local cerrado con
cristales a una presiónde aire de 9m3 aproximadamente, del cual utiliza 0,5 m3
para crear un espacio donde pueda introducirse una persona y realizar el
cambio de ropa. Esta descripciónse conoce hoy en día con el nombre de "
CUARTO LIMPIO" (Heinecke, 1990).
De aquí en adelante y hasta las tres primeras décadas del siglo XX el propósito
primario de todas las investigaciones era dar respuestas a la interrogante de: "
sí la vida era posible en ausencia completa de microorganismos " (Laboratory
Animals Information, 1987).
A principios del siglo XX Eli Metchnikoff (1901-1903), director del Instituto
Pasteur de París, plantea con relación a este tema: …"que la flora no sólo era
innecesaria, sino que además era dañina al hospedero". Uno de los estudiantes
de Metchnikoff, M. Cohendy (1908) es enviado a aprender las técnicas de la vida
libre de gérmenes y en 1912 tiene éxitos en criar pollos libres de gérmenes,
conjuntamente con Wollman (1914) en producir curieles libres de gérmenes.
Por otro lado, un estudiante de Cohend, el investigador alemán E. Küster en
1915 empleando un equipamiento especial diseñado por él, mantuvo cabras
libres de gérmenes por 35 días contribuyendo de esta manera al establecimiento
de la experimentación libres de gérmenes.
Este fue el primer aparato capaz de mantener un ambiente definitivamente
estéril permitiendo la manipulación a través de mangas con guantes de goma y
la salida y entrada de materiales; a este aparato más tarde se le denominó
"AISLADOR" y es similar al equipamiento usado hoy para la obtención de
animales gnotobióticos. Su trabajotambién es importante al establecer los
animales libres de gérmenes como un instrumento valioso en el estudio de la
nutrición y las defensas del cuerpo (Laboratory Animals Information, 1987;
Heinecke, 1990).
Este primer período sobre la vida libre de gérmenes denominado período
Metodológico por Luckey, finaliza con los aportes de Cohendy, Kuster y
Guyenot, este último obtuvo moscas libres de gérmenes. Ellos demostraron que
la vida sin gérmenes era posible en las moscas, cabras y pollos (Heinecke,
1990).
De 1915 a 1934, existe un período de relativa inactividad, donde se plantea una
nueva interrogante: ¿Vale la pena proseguir las investigaciones sobre la vida
libre de todo germen demostrable?. Pero es con Küster que el campo de las
investigaciones gnotobióticas entra en la era contemporánea.
Gustafsson en Suiza (1948), Miyakawa en Japón (1951, 1953-1958) y Reyniers
(1932, 1933), Trexler (1957, 1959) en Estados Unidos, contribuyeron
grandemente a la expansión de esta disciplina, con la confección de aisladores o
cámaras de paredes rígidas elaborados particularmente con planchas de acero
inoxidables, los cuales fueron usados para proteger espacios estériles de trabajo,
en muchas de las primeras investigaciones con animales gnotobióticos.
Posteriormente grandes progresos se han obtenido en la lactanciaartificial,
reproducción y crianza de ratones y ratas libres de gérmenes (Reyniers, Trexler,
Ervin, 1946; Gustafsson, 1959) y el establecimiento de técnicas libres de
gérmenes utilizando aisladores de Cloruro de Polivinilo (PVC) por Trexler y
Reynolds (1957), siendo los mismos muy efectivos y donde su visibilidad e
iluminación pueden ser controlada desde el exterior (Charles River Laboratory,
1962; Laboratory Animals Information, 1987).
El desarrollode los experimentos sobre animales libres de gérmenes a partir de
la tercera década del siglo XX estuvo decididamente influenciada por los
avances tecnológicos sobre los sistemas de aislamiento. El sistema de simple
cajas o campanas herméticas fue modificado por compartimentos más
resistentes (de metal) y se comenzó a diseñar cilindros de acero inoxidable que
eran posibles someterlo a la esterilización por vapor y por tanto, impenetrable a
los microbios. Ya entre los años 1945-1960 se comienza la reproducción y
utilización de los animales gnotobióticos y en 1961 comienza su
comercialización (Laboratory Animals Information, 1987).
Desde esos tiempos una gran variedad de mamíferos, incluyendo las más
comunes especies de laboratorio, los roedores, animales de granja y el hombre,
han sido criado libres de gérmenes. Dentro de especies obtenidas, los cobayos
son comparativamente fáciles de criar libre de gérmenes porque son bastante
maduros al nacer y requieren poca o ninguna alimentación a mano. Son
reportados pobres niveles de supervivencia para el conejo, otras especies como
el perro, peces, monos, gatos, aves, carneros, chiva, cerdos y otras especies de
granja han sido obtenidas libre de gérmenes pero por su gran tamaño son
difíciles de mantener en aisladores por un largo período de tiempo (Coates et al,
1992).
Un importante uso de estos animales es el proveer el núcleo para las colonias
libres de patógenos específicos (SPF) así como en el desarrollo de
investigaciones toxicológicas y en la cienciamédica en general. Los animales
libres de gérmenes se crían con el propósito de investigar el papel que juegan
los microorganismos en la fisiologíadel organismo, es decir para estudiar al
animal por sí, sin la interferencia de su microbiota (Coates & Gustafsson, 1984).

Animales libres de patógenos específicos

Los animales libres de patógenos específicos (Specific Pathogens Free,
SPF, en terminología inglesa) se han convertido rápidamente en el estándar
mínimo aceptado para la investigación y además están comenzando a ser
exigidos por autoridades reguladoras como el status de los animales utilizados
en las pruebas de evaluación de productos destinados para uso humano y
veterinario (OMS/SIT/823, 1992; Institute of Laboratory Animal Resources
[ILAR], 1996; Consejo Canadiense de Protección Animal [CCPA], 1998).
Los animales SPF son colonizados por una variedad desconocida de especies de
microorganismos Sin embargo, son definido como libres de uno o varios
microorganismos (patógenos) específicos. Por tanto, un animal SPF es un
sistema negativamente biológico definido, que comprende el huésped e
inquilinos (microorganismos). Es una asociación biológica de una gran variedad
de especies microbianas, pero con la explícita seguridad de que una o varias
especies patógenas definidas no están presentes (CCAC, 1984 a; Charles River
Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).
Los animales libres de microorganismos patógenos específicos (LPE o SPF) se
caracterizan por poseer una microbiota asociada no patógena y específica para
la especie animal en cuestión. Se obtienen por cesárea o histerectomía aséptica,
a partir de un animal axénico o gnotobiótico con microbiota definida y son
transferidos a un aislador o a un sistema de barreras o zona protegida.
Ya una vez establecidos en una barrera libre de patógenos (Zonas Protegidas),
los animales son reproducidos normalmente y una poblaciónlibre de patógenos
es constituida entonces; las nuevas generaciones de animales pueden estar
libres de patógenos y mantenidos por sus padres (Charles River Laboratory,
1966; Lane-Petter, 1963 a; Arrington, 1972; Bailly, Bupont, Laroche, Raynaud,
1979; CCAC, 1984 a).
El concepto de LPE o SPF ha revolucionado indudablemente la producción de
animales libres de enfermedades, sin embargo, este término no es específico y
puede representar una variación en el status muy considerable pudiendo ser
desde colonias con una microbiota definida a colonias las cuales han sido libres
sólo de uno o dos patógenos conocidos. La designación LPE es en consecuencia
de mayor valor en tanto se obtenga una informacióncompleta de cual o cuales
patógenos la colonia estará libre (Perrot, Richard, Veillet, 1993).
En estudios realizados por Nelson (1960) en animales SPF encontraron que los
cambios más favorables son: el aumento del vigor y una mayor tasa
reproductiva al compararlos con los animales convencionales. Los ratones SPF
son conocidos por ser superiores en experimentos de largos períodos de tiempo,
ocurriendo pocas muertes inexplicables (Poole, 1987).
Principales aspectos relacionados con las barreras
utilizadas en la cría y mantenimiento de los animales
SPF.
Las barreras utilizadas en la cría y mantenimiento de los animales SPF pueden
tomar cualquier forma, pudiendo ir desde una lámina plástica flexible
(Aislador) hasta un sistema completo de paredes, equipamiento y otros (Zonas
Protegidas). La magnitud de esta barrera o zona protegida puede variar, siendo
desde un simple local con visor y autoclave hasta un sistema complejo con
múltiples locales y pasillos (Brick, 1968; ILAR, 1973; Mahouy, 1978).
Los sistemas de barreras para mantener una colonia SPF son una combinación
de factores constructivos, tecnológicos y métodosoperacionales que se
estabilizan en un ambiente cerrado donde se minimiza la presencia de
patógenos o de microorganismos no deseados infectando la población animal
(ILAR, 1976).
La producción a gran escalade animales SPF es factible llevarla a cabo en un
sistema de barreras. El término general de barrera o zona protegida abarca uno
de los mejores métodos para controlar el ambiente en un espacio determinado y
para esto se hace necesario contar con diferentes aspectos que deben
mantenerse controlados, estos son:
 Temperatura, humedad relativa y luz
 Filtración del aire con presión, lo cual está dado por la inyección del
mismo a través de un filtro HEPA con una eficiencia de un 99,9 %. Esta
sobrepresión de aire se ajusta en la instalación para prevenir la
contaminación (diferencias de presiones / Presión (+)).
 Sistemas de autoclaves, baños germicidas, cilindros de transferencias
(Transfer) y taquillas filtros.
 Esterilización del agua (usualmente por filtración, aunque el tratamiento
con ozono, la acidificación o halogenización pueden ser empleados o
combinaciones de diferentes métodos).
 Esterilización del alimento, encamado y otros insumos (usualmente
pasándolos por una autoclave de doble puerta atravesando una pared
barrera).
 Esterilización de ciertos utensilios (regularmente realizado por
desinfección químicaempleando potentes desinfectantes, pasándolos o
transfiriéndolos hacia el interior de la instalación a través de cilindros de
transferencias (transfer) o baños germicidas).
 El personaldebe ser altamente calificado y responsable. Sus movimientos
dentro de la instalación deben ser pausados y controlados, entrando una vez
 al día a través de tres entradas. En la primera se quitarán la ropa de calle,
realizarán algunos lavados y necesidades fisiológicas (Taquilla Sucia), en la
segunda se bañarán de forma completa con agua esterilizada y jabón
bacteriostático (Ducha) y en la tercera se vestirán con ropa adecuada de
trabajo esterilizada (Taquilla Limpia). La ropa debe cambiarse cada vez que
se utilice debiendo ser esterilizada antes de su uso, se emplearán cubiertas
de cuello y cabeza, mangas largas, máscaras para cubrir nariz y boca y se
utilizarán botas y guantes. La higiene del personal es obligatoria y existirá un
programa de salud que incluye: examen médico, análisis de laboratorio
microbiológicos y clínicos y vacunaciones periódicas contra enfermedades
infecto-contagiosas transmisibles.

(ILAR, 1968, 1973; Veterinary Resources Branch [VRB], 1976; FELASA, 1995,
1999, 2000).
Un último aspecto que se debe tener en cuenta y no por ello menos importante
es que debe existir un cuidadoso y persistente monitoreo microbiológico para
verificar el estado de salud del animal mantenido en los sistemas de barreras
(CCPA, 1998).

III) Control microbiológico a los animales de

laboratorio.
La salud de un animal está siempre en riesgode adquirir una variedad de
infecciones, tales pueden ser inaparentes o no por lesiones macroscópicas u
obvias. La clínica de una infección puede no ser observada hasta que el animal
es estresado, por ejemplo un procedimiento experimental (Kraft et al, 1992,
1993). La mayoría de las infecciones en roedores son subclínicas y a menudo
ocurren modificaciones en los resultados de una investigación debido a
infecciones naturales en ausencia de infecciones clínicas. Por eso, la ausencia de
manifestaciones clínicas de una infección tiene un limitado valor diagnóstico.
De ahí que sea imprescindible la prevención de la infección y no solamente la
prevención de enfermedades clínicas (Rehbinder et al, 1996, Niclas et al, 2002).
Además de las consideraciones de bienestar, el principal objetivode un control
de salud antes y durante los experimentos, es definir el estado biológico de los
animales para tener en cuenta la presencia o ausencia de ciertos
microorganismos, lesiones y otras alteraciones como variables experimentales
(Rehbinder et al, 1996).
El control microbiológico a los animales de laboratorio se recomienda para
detectar la presencia de microorganismos no deseados o para conocer los
cambios microbiológicos en el ambiente y así poder evaluar los procedimientos
rutinarios de desinfección. El monitoreo periódicoa los animales de laboratorio
para determinar la presencia de su microbiota no patógena definida implantada
voluntariamente o su microbiota no patógena para la especie obtenida
espontáneamente o accidentalmente en contacto con el hombre es de gran
importancia (Charles River Laboratory, 1966, 1990; ILAR, 1973; Rehbinder &
Hansen, 1993).
Existen cuatro razones básicas para incluir un microorganismo particular en un
monitoreo de salud:
1. Los microorganismos pueden influir en los resultados de la prueba en los
cuales los animales son usados.
2. Los microorganismos tienen una influencia negativa en el status de los
animales.
3. Los microorganismos pueden infectar otras especies, incluyendo al
hombre.
4. Los microorganismos tienen una influencia negativa en el resultado de la
producción de los animales.

(Hansen, 1989).
En un monitoreo biológico para organismos específicos no deseados, existen
consideraciones generales, así como aspectos a tener en cuenta como es la
frecuencia de los muestreos, el tamaño de la muestra (número de animales a
muestrear), el tipo de muestras, el métodode examen o el procedimiento para
detectar e identificar los organismos específicos, el conocimiento de la
sensibilidad y especificidad de los métodos o test usados y el conocimiento de la
prevalencia de los microorganismos (Charles River UK. Limited, 1985; Bondy et
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Davis, 2004).
Por tanto, todo sistema de control, de monitoreo y de regulaciones que se
establezca para la prevención de infecciones y para el control y mantenimiento
del status higiénico sanitario de los animales es un aspecto fundamental y debe
ser llevado a cabo con gran rigor técnico.

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Biografía del autor

Nombre y Apellidos Layna de las Mercedes Riera Ojeda

Fecha y Lugar de
24/09/1963 Ciudad de la Habana, Cuba
nacimiento

E-mail , nivian[arroba]censa.edu.cu

Graduado, Fecha y Licenciatura en Universidad de la Habana

1986
Lugar Microbiología (U.H)

Calle 3era e/ 4ta y 6ta Edif. 2 apto 8 Rpto La Unión. Boyeros.

Dirección particular
Ciudad de la Habana. Cuba

Centro Trabajo Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio

 (CENPALAB). La Habana. Cuba

Fecha incorporación 1986 (más de 20 años de trabajo en el sector)

Otros Títulos

Grado científico Master en Microbiología Clínica Fecha: 2001 Lugar: U.H

Categoría Docente - Fecha: - Lugar: -

Categoría
Científica o Tecnólogo de 1er Nivel Fecha: 2004 Lugar: CITMA. Cuba
Tecnológica

Labor que Especialista Integral en Microbiología.

desempeña Jefa del Grupo de Mejora Continua de la Calidad

Líneas de Investigación que desarrolla y las investigaciones más importantes realizadas

en los últimos 5 años.

Año Líneas de trabajo e Investigaciones realizadas

Obtención y control microbiológico de diferentes especies de animales de

1986-1990
laboratorio en condiciones gnotobióticas

Estudios de la incidencia de entidades microbianas en animales

1986-Actualidad
laboratorio

Normalización de sistemas inmunoenzimáticos ELISA para el diagnóstico

1990-Actualidad
bacteriológico en animales de laboratorio

1995, 1999 y Obtención y evaluación de vacunas bacterianas en animales de

2004-Actualidad laboratorio

2000-Actualidad Especialista principal en microbiología en la producción de animales

gnotobióticos.

Implantación del Siste Animales libres de

patógenos específicos (página 2)
Enviado por Layna Riera Ojeda
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Partes: 1, 2

Categoría II: Animal Miroxénico.

Son comparables a los animalesconvencionales mantenidos
bajo condiciones sanitarias estrictas y estándares. Los mismos
albergan una fracción inoculada de microorganismos no
patógenos tomadas de la microbiota de un haloxénico; deben
mantener o ser del mismo status de la Categoría I y además
estar libres de:
 Listeria monocytogenes
 Bacillus piliformis (Clostridium piliformis)
 Estadíos intermedios de Céstodos y de Artrópodos
parásitos obligados.
 Especies determinadas demandan la ausencia de los
Virus: Ectromelia (Ratón) y Myxomatosis(Conejo).

Categoría III: "Animal Gnotobiótico con microbiota

definida "
Son comparables a los animales derivados de cesárea
(Axénicos) a los que se les introducen voluntariamente especies
microbianas conocidas. Deben ser del mismo status de la
Categoría II y además estar libres de:
 Bordetella bronchiseptica
 Toda Pasteurella
 Todas las Coccidias (Eimerias spp) y Helmintos
patógenos

Además especies determinadas demandan la ausencia de:

 Streptobacillus moniliformis (Ratones y Ratas)
 Corynebacterium kutscheri (C. murium) (Ratones)
 Streptococcus pneumoniae (Cobayo y Conejo)
 Todas las especies de Mycoplasma (Ratones y Ratas)
 Treponema cuniculi (Sífilis del conejo/Conejo)

Categoría IV: Animal Heteroxénico (Libre de

gérmenes patógenos, SPF)
Son comparables a los animales descritos como libres de
gérmenes patógenos específicos ( Specific Pathogens Free,
SPF). Estos son derivados de un Axénico o Gnotobiótico que
adquiere una microbiota proveniente de su medio, son
mantenidos en Zonas Protegidas (sistemas cerrados). Deben
ser del mismo status de la Categoría III y además estar libres
de:
 Estreptococos (excepto Grupo D)
 Neumococos
 Helmintos
 Protozoos patógenos
 Virus que afectan estas especies

Además especies determinadas demandan la ausencia de:

 Todas las especies de Mycoplasma (Hamster y Cobayo)
 Fusiformis necrophorus (Conejos)

Categoría V: Animal Axénico (Libre de gérmenes, GF)

Son animales que no albergan ninguna especie microbiana
viviente detectable. Los mismos son el resultado del uso de
sistemas cerrados estériles y son libres de todo organismo
demostrable (virus, bacterias, hongos, parásitos y organismos
saprófitos). Son conocidos como animales " Germ Free" o
"Axénicos", los cuales son derivados por histerotomía (cesárea)
o histerectomía aséptica, criados y mantenidos en un aislador
mediante técnicas "Gnotobióticas". Estos animales no siempre
se obtienen en la práctica, debido a los agentes transmitidos
verticalmente.
Este esquema de clasificación por categorías ha sido sujeto a
revisiones regulares y a pesar de algunos cambios menores en
cuanto al establecimiento y definición de las entidades
microbianas (bacterias, hongos, parásitos y virus) que deben o
no estar presentes según la categoría específica, el mismo ha
resistido la prueba del tiempo (Laboratory Animals
Information, 1987; Poole, 1987; Charles River Laboratory,
1990; Besselsen, 2002).
· Reseña histórica de los animales gnotobióticos
Los términos "Gnotobiología" y "Gnotobiótico"son
derivados de las palabras griegas "gnotos": conocimiento y
"bio": vida ; significa "vida conocida".
La Gnotobiología es la ciencia de la producción de organismos
(animales, plantas y humanos) colonizados con especies de
microorganismos beneficiosos o dañinos que son conocidos
tanto como puedan ser detectados por modernas técnicas de
diagnóstico (Charles River Laboratory, 1962; Coates, Cooper,
Heine, Kraft, Hedrich, 1992).
Animales gnotobióticos
Los animales gnotobióticosson libres de gérmenes,
exceptuando la microbiota específica identificada que ha sido
introducida intencionalmente. Son conocidos también como
animales de microbiota definida, ya que han sido inoculados
con una mezcla bien definida de microorganismos y
mantenidos en aisladores para prevenir la contaminaciónpor
patógenos. Por tanto, un animal gnotobiótico es un sistema
positivamente biológico definido, que comprende el huésped y
los co-vecinos. Es una asociación de especies conocidas.
Estos animales son mantenidos en sistemas de aisladores, que
han sido químicamente o físicamente esterilizados previo al
uso. Igualmente el aire, el agua, el alimento y el encamado
deben ser libres de gérmenes al entrar al aislador. Varios
aisladores son utilizados en estos procesos.
Los animales gnotobióticos se usan para investigaciones
específicas o como un núcleo para las colonias de
reproducción, lo cual se conoce como Banco Genético (CCAC,
1984 a; Charles River Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).
El término animal libre de gérmenes ("Germ-Free", en
terminología inglesa) es comúnmente usado para designar un
animal con ausencia de microorganismos, lo cual implica libres
de bacterias, hongos, parásitos y virus. Las limitaciones de esta
terminología son obviamente dependientes de la validez de las
pruebasusadas (Fuller, 1968). Son conocidos también como
Animales Axénicos. Este último fue el primer término científico
usado para designar individuos de una especie libres de
cualquier vida demostrable (Coates & Gustafsson, 1984;
Trexler, 1987; Besselsen, 2002).

Principales hechos relacionados con la

historia de los animales gnotobióticos
Históricamente, el mérito de la primera experimentación en el
tema de libres de gérmenes debe dársele a E. Duclaux (1885),
quien intentó cultivar frijoles y chícharos en un cultivo puro en
un medio estéril. Pasteur al ver los resultados de su discípulo
plantea: … "de haber tenido tiempo me hubiera gustado seguir
los experimentospara saber si la vida sería posible en esas
condiciones" , no obstante dirigió toda su atenciónal problema
de la vida libres de gérmenes, fue con Pasteur que se inicia el
debatesobre la posibilidad de la vida o no, sin microbios. En la
búsqueda de una respuesta los científicos comenzaron a
relacionarse con la tecnología Gnotobiotécnica de libre de
gérmenes. Al año siguiente (1886) su discípulo Nencki estimó
que las bacterias no eran indispensables para la vida, ya que
estas producían sustancias tóxicas y que los animales sin
gérmenes debían vivir más tiempo que los contaminados
(Laboratory Animals Information, 1987; Heinecke, 1990).
No fue hasta 1895 en que Nuttal y Thierfelder obtuvieron por
primera vez dos curieles por cesárea mantenidos en una
campana estéril durante 2 semanas sin contaminación. En
1899 Schothelius busca otro camino en sus investigaciones con
gallinas libre de gérmenes y construye en su laboratorioun
local cerrado con cristales a una presiónde aire de 9m3
aproximadamente, del cual utiliza 0,5 m3 para crear un espacio
donde pueda introducirse una persona y realizar el cambio de
ropa. Esta descripciónse conoce hoy en día con el nombre de "
CUARTO LIMPIO" (Heinecke, 1990).
De aquí en adelante y hasta las tres primeras décadas del siglo
XX el propósito primario de todas las investigaciones era dar
respuestas a la interrogante de: " sí la vida era posible en
ausencia completa de microorganismos " (Laboratory Animals
Information, 1987).
A principios del siglo XX Eli Metchnikoff (1901-1903), director
del Instituto Pasteur de París, plantea con relación a este tema:
…"que la flora no sólo era innecesaria, sino que además era
dañina al hospedero". Uno de los estudiantes de Metchnikoff,
M. Cohendy (1908) es enviado a aprender las técnicas de la
vida libre de gérmenes y en 1912 tiene éxitos en criar pollos
libres de gérmenes, conjuntamente con Wollman (1914) en
producir curieles libres de gérmenes.
Por otro lado, un estudiante de Cohend, el investigador alemán
E. Küster en 1915 empleando un equipamiento especial
diseñado por él, mantuvo cabras libres de gérmenes por 35 días
contribuyendo de esta manera al establecimiento de la
experimentación libres de gérmenes.
Este fue el primer aparato capaz de mantener un ambiente
definitivamente estéril permitiendo la manipulación a través
de mangas con guantes de goma y la salida y entrada de
materiales; a este aparato más tarde se le denominó
"AISLADOR" y es similar al equipamiento usado hoy para la
obtención de animales gnotobióticos. Su trabajotambién es
importante al establecer los animales libres de gérmenes como
un instrumento valioso en el estudio de la nutrición y las
defensas del cuerpo (Laboratory Animals Information, 1987;
Heinecke, 1990).
Este primer período sobre la vida libre de gérmenes
denominado período Metodológico por Luckey, finaliza con los
aportes de Cohendy, Kuster y Guyenot, este último obtuvo
moscas libres de gérmenes. Ellos demostraron que la vida sin
gérmenes era posible en las moscas, cabras y pollos (Heinecke,
1990).
De 1915 a 1934, existe un período de relativa inactividad, donde
se plantea una nueva interrogante: ¿Vale la pena proseguir las
investigaciones sobre la vida libre de todo germen
demostrable?. Pero es con Küster que el campo de las
investigaciones gnotobióticas entra en la era contemporánea.
Gustafsson en Suiza (1948), Miyakawa en Japón (1951, 1953-
1958) y Reyniers (1932, 1933), Trexler (1957, 1959) en Estados
Unidos, contribuyeron grandemente a la expansión de esta
disciplina, con la confección de aisladores o cámaras de
paredes rígidas elaborados particularmente con planchas de
acero inoxidables, los cuales fueron usados para proteger
espacios estériles de trabajo, en muchas de las primeras
investigaciones con animales gnotobióticos. Posteriormente
grandes progresos se han obtenido en la lactanciaartificial,
reproducción y crianza de ratones y ratas libres de gérmenes
(Reyniers, Trexler, Ervin, 1946; Gustafsson, 1959) y el
establecimiento de técnicas libres de gérmenes utilizando
aisladores de Cloruro de Polivinilo (PVC) por Trexler y
Reynolds (1957), siendo los mismos muy efectivos y donde su
visibilidad e iluminación pueden ser controlada desde el
exterior (Charles River Laboratory, 1962; Laboratory Animals
Information, 1987).
El desarrollode los experimentos sobre animales libres de
gérmenes a partir de la tercera década del siglo XX estuvo
decididamente influenciada por los avances tecnológicos sobre
los sistemas de aislamiento. El sistema de simple cajas o
campanas herméticas fue modificado por compartimentos más
resistentes (de metal) y se comenzó a diseñar cilindros de acero
inoxidable que eran posibles someterlo a la esterilización por
vapor y por tanto, impenetrable a los microbios. Ya entre los
años 1945-1960 se comienza la reproducción y utilización de
los animales gnotobióticos y en 1961 comienza su
comercialización (Laboratory Animals Information, 1987).
Desde esos tiempos una gran variedad de mamíferos,
incluyendo las más comunes especies de laboratorio, los
roedores, animales de granja y el hombre, han sido criado
libres de gérmenes. Dentro de especies obtenidas, los cobayos
son comparativamente fáciles de criar libre de gérmenes
porque son bastante maduros al nacer y requieren poca o
ninguna alimentación a mano. Son reportados pobres niveles
de supervivencia para el conejo, otras especies como el perro,
peces, monos, gatos, aves, carneros, chiva, cerdos y otras
especies de granja han sido obtenidas libre de gérmenes pero
por su gran tamaño son difíciles de mantener en aisladores por
un largo período de tiempo (Coates et al, 1992).
Un importante uso de estos animales es el proveer el núcleo
para las colonias libres de patógenos específicos (SPF) así
como en el desarrollo de investigaciones toxicológicas y en la
cienciamédica en general. Los animales libres de gérmenes se
crían con el propósito de investigar el papel que juegan los
microorganismos en la fisiologíadel organismo, es decir para
estudiar al animal por sí, sin la interferencia de su microbiota
(Coates & Gustafsson, 1984).

Animales libres de patógenos específicos

Los animales libres de patógenos específicos (Specific
Pathogens Free, SPF, en terminología inglesa) se han
convertido rápidamente en el estándar mínimo aceptado para
la investigación y además están comenzando a ser exigidos por
autoridades reguladoras como el status de los animales
utilizados en las pruebas de evaluación de productos
destinados para uso humano y veterinario (OMS/SIT/823,
1992; Institute of Laboratory Animal Resources [ILAR], 1996;
Consejo Canadiense de Protección Animal [CCPA], 1998).
Los animales SPF son colonizados por una variedad
desconocida de especies de microorganismos Sin embargo, son
definido como libres de uno o varios microorganismos
(patógenos) específicos. Por tanto, un animal SPF es un
sistema negativamente biológico definido, que comprende el
huésped e inquilinos (microorganismos). Es una asociación
biológica de una gran variedad de especies microbianas, pero
con la explícita seguridad de que una o varias especies
patógenas definidas no están presentes (CCAC, 1984 a; Charles
River Laboratory, 1990; Besselsen, 2002).
Los animales libres de microorganismos patógenos específicos
(LPE o SPF) se caracterizan por poseer una microbiota
asociada no patógena y específica para la especie animal en
cuestión. Se obtienen por cesárea o histerectomía aséptica, a
partir de un animal axénico o gnotobiótico con microbiota
definida y son transferidos a un aislador o a un sistema de
barreras o zona protegida.
Ya una vez establecidos en una barrera libre de patógenos
(Zonas Protegidas), los animales son reproducidos
normalmente y una poblaciónlibre de patógenos es constituida
entonces; las nuevas generaciones de animales pueden estar
libres de patógenos y mantenidos por sus padres (Charles
River Laboratory, 1966; Lane-Petter, 1963 a; Arrington, 1972;
Bailly, Bupont, Laroche, Raynaud, 1979; CCAC, 1984 a).
El concepto de LPE o SPF ha revolucionado indudablemente la
producción de animales libres de enfermedades, sin embargo,
este término no es específico y puede representar una variación
en el status muy considerable pudiendo ser desde colonias con
una microbiota definida a colonias las cuales han sido libres
sólo de uno o dos patógenos conocidos. La designación LPE es
en consecuencia de mayor valor en tanto se obtenga una
informacióncompleta de cual o cuales patógenos la colonia
estará libre (Perrot, Richard, Veillet, 1993).
En estudios realizados por Nelson (1960) en animales SPF
encontraron que los cambios más favorables son: el aumento
del vigor y una mayor tasa reproductiva al compararlos con los
animales convencionales. Los ratones SPF son conocidos por
ser superiores en experimentos de largos períodos de tiempo,
ocurriendo pocas muertes inexplicables (Poole, 1987).

Principales aspectos relacionados con las

barreras utilizadas en la cría y
mantenimiento de los animales SPF.
Las barreras utilizadas en la cría y mantenimiento de los
animales SPF pueden tomar cualquier forma, pudiendo ir
desde una lámina plástica flexible (Aislador) hasta un sistema
completo de paredes, equipamiento y otros (Zonas Protegidas).
La magnitud de esta barrera o zona protegida puede variar,
siendo desde un simple local con visor y autoclave hasta un
sistema complejo con múltiples locales y pasillos (Brick, 1968;
ILAR, 1973; Mahouy, 1978).
Los sistemas de barreras para mantener una colonia SPF son
una combinación de factores constructivos, tecnológicos y
métodosoperacionales que se estabilizan en un ambiente
cerrado donde se minimiza la presencia de patógenos o de
microorganismos no deseados infectando la población animal
(ILAR, 1976).
La producción a gran escalade animales SPF es factible llevarla
a cabo en un sistema de barreras. El término general de barrera
o zona protegida abarca uno de los mejores métodos para
controlar el ambiente en un espacio determinado y para esto se
hace necesario contar con diferentes aspectos que deben
mantenerse controlados, estos son:
 Temperatura, humedad relativa y luz
 Filtración del aire con presión, lo cual está dado por la
inyección del mismo a través de un filtro HEPA con una
eficiencia de un 99,9 %. Esta sobrepresión de aire se ajusta
en la instalación para prevenir la contaminación
(diferencias de presiones / Presión (+)).
 Sistemas de autoclaves, baños germicidas, cilindros de
transferencias (Transfer) y taquillas filtros.
 Esterilización del agua (usualmente por filtración,
aunque el tratamiento con ozono, la acidificación o
halogenización pueden ser empleados o combinaciones de
diferentes métodos).
 Esterilización del alimento, encamado y otros insumos
(usualmente pasándolos por una autoclave de doble puerta
atravesando una pared barrera).
 Esterilización de ciertos utensilios (regularmente
realizado por desinfección químicaempleando potentes
desinfectantes, pasándolos o transfiriéndolos hacia el
interior de la instalación a través de cilindros de
transferencias (transfer) o baños germicidas).
 El personaldebe ser altamente calificado y responsable.
Sus movimientos dentro de la instalación deben ser
pausados y controlados, entrando una vez al día a través de
tres entradas. En la primera se quitarán la ropa de calle,
 realizarán algunos lavados y necesidades fisiológicas
(Taquilla Sucia), en la segunda se bañarán de forma
completa con agua esterilizada y jabón bacteriostático
(Ducha) y en la tercera se vestirán con ropa adecuada de
trabajo esterilizada (Taquilla Limpia). La ropa debe
cambiarse cada vez que se utilice debiendo ser esterilizada
antes de su uso, se emplearán cubiertas de cuello y cabeza,
mangas largas, máscaras para cubrir nariz y boca y se
utilizarán botas y guantes. La higiene del personal es
obligatoria y existirá un programa de salud que incluye:
examen médico, análisis de laboratorio microbiológicos y
clínicos y vacunaciones periódicas contra enfermedades
infecto-contagiosas transmisibles.

(ILAR, 1968, 1973; Veterinary Resources Branch [VRB], 1976;

FELASA, 1995, 1999, 2000).
Un último aspecto que se debe tener en cuenta y no por ello
menos importante es que debe existir un cuidadoso y
persistente monitoreo microbiológico para verificar el estado
de salud del animal mantenido en los sistemas de barreras
(CCPA, 1998).

III) Control microbiológico a los animales

de laboratorio.
La salud de un animal está siempre en riesgode adquirir una
variedad de infecciones, tales pueden ser inaparentes o no por
lesiones macroscópicas u obvias. La clínica de una infección
puede no ser observada hasta que el animal es estresado, por
ejemplo un procedimiento experimental (Kraft et al, 1992,
1993). La mayoría de las infecciones en roedores son
subclínicas y a menudo ocurren modificaciones en los
resultados de una investigación debido a infecciones naturales
en ausencia de infecciones clínicas. Por eso, la ausencia de
manifestaciones clínicas de una infección tiene un limitado
valor diagnóstico. De ahí que sea imprescindible la prevención
de la infección y no solamente la prevención de enfermedades
clínicas (Rehbinder et al, 1996, Niclas et al, 2002).
Además de las consideraciones de bienestar, el principal
objetivode un control de salud antes y durante los
experimentos, es definir el estado biológico de los animales
para tener en cuenta la presencia o ausencia de ciertos
microorganismos, lesiones y otras alteraciones como variables
experimentales (Rehbinder et al, 1996).
El control microbiológico a los animales de laboratorio se
recomienda para detectar la presencia de microorganismos no
deseados o para conocer los cambios microbiológicos en el
ambiente y así poder evaluar los procedimientos rutinarios de
desinfección. El monitoreo periódicoa los animales de
laboratorio para determinar la presencia de su microbiota no
patógena definida implantada voluntariamente o su microbiota
no patógena para la especie obtenida espontáneamente o
accidentalmente en contacto con el hombre es de gran
importancia (Charles River Laboratory, 1966, 1990; ILAR,
1973; Rehbinder & Hansen, 1993).
Existen cuatro razones básicas para incluir un microorganismo
particular en un monitoreo de salud:
1. Los microorganismos pueden influir en los resultados de
la prueba en los cuales los animales son usados.
2. Los microorganismos tienen una influencia negativa en
el status de los animales.
3. Los microorganismos pueden infectar otras especies,
incluyendo al hombre.
4. Los microorganismos tienen una influencia negativa en
el resultado de la producción de los animales.

(Hansen, 1989).
En un monitoreo biológico para organismos específicos no
deseados, existen consideraciones generales, así como aspectos
a tener en cuenta como es la frecuencia de los muestreos, el
tamaño de la muestra (número de animales a muestrear), el
tipo de muestras, el métodode examen o el procedimiento para
detectar e identificar los organismos específicos, el
conocimiento de la sensibilidad y especificidad de los métodos
o test usados y el conocimiento de la prevalencia de los
microorganismos (Charles River UK. Limited, 1985; Bondy et
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Homberger, 1994; UC Davis, 2004).
Por tanto, todo sistema de control, de monitoreo y de
regulaciones que se establezca para la prevención de
infecciones y para el control y mantenimiento del status
higiénico sanitario de los animales es un aspecto fundamental
y debe ser llevado a cabo con gran rigor técnico.

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Biografía del autor

Nombre y
Layna de las Mercedes Riera Ojeda
Apellidos

Fecha y Lugar de
24/09/1963 Ciudad de la Habana, Cuba
nacimiento

E-mail , nivian[arroba]censa.edu.cu

Graduado, Fecha Licenciatura en Universidad de la

1986
y Lugar Microbiología Habana (U.H)

Dirección Calle 3era e/ 4ta y 6ta Edif. 2 apto 8 Rpto La Unión.

particular Boyeros. Ciudad de la Habana. Cuba

Centro Nacional para la Producción de Animales de

Centro Trabajo
Laboratorio (CENPALAB). La Habana. Cuba

Fecha
1986 (más de 20 años de trabajo en el sector)
incorporación

Otros Títulos

Grado Master en Microbiología

Fecha: 2001 Lugar: U.H
científico Clínica
Categoría
- Fecha: - Lugar: -
Docente

Categoría
Lugar: CITMA.
Científica o Tecnólogo de 1er Nivel Fecha: 2004
Cuba
Tecnológica

Labor que Especialista Integral en Microbiología.

desempeña Jefa del Grupo de Mejora Continua de la Calidad

Líneas de Investigación que desarrolla y las investigaciones más

importantes realizadas en los últimos 5 años.

Año Líneas de trabajo e Investigaciones realizadas

Obtención y control microbiológico de diferentes especies

1986-1990
de animales de laboratorio en condiciones gnotobióticas

1986- Estudios de la incidencia de entidades microbianas en

Actualidad animales laboratorio

Normalización de sistemas inmunoenzimáticos ELISA

1990-
para el diagnóstico bacteriológico en animales de
Actualidad
laboratorio

1995, 1999 y
Obtención y evaluación de vacunas bacterianas en
2004-
animales de laboratorio
Actualidad

Especialista principal en microbiología en la producción

2000- de animales gnotobióticos.
Actualidad Implantación del Sistema de Aseguramiento y Control de
la Calidad en el CENPALAB

2005- Evaluación y Mejora del Sistema de Aseguramiento y

Actualidad Control de la Calidad en el CENPALAB

 
 MSc. Layna Riera Ojeda
Centro Nacional para la Producción de Animales de
Laboratorio (CENPALAB). La Habana. Cuba
Diciembre 2006
ma de Aseguramiento y Control de la Calidad en el CENPALAB

Evaluación y Mejora del Sistema de Aseguramiento y Control de la

2005-Actualidad
Calidad en el CENPALAB

 
MSc. Layna Riera Ojeda
Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB).
La Habana. Cuba
Diciembre 2006