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TP Proteinas 2012
TP Proteinas 2012
Exactas - UNLP
Lic. Ciencia y Tecnologa de Alimentos
ANLISIS DE ALIMENTOS
ANLISIS DE ALIMENTOS
cuidando que el extremo del mismo quede sumergido en la solucin cida. Antes de conectar
completamente el baln se va agregando con cuidado la cantidad necesaria de solucin de
NaOH 40% como para neutralizar el cido sulfrico, primero sin agitar para que se ubique en el
fondo, y una vez agregado todo, conectar bien el baln, agitar para lograr la mezcla (el medio se
hace fuertemente alcalino que se detecta por formacin de un precipitado pardo oscuro,
dispersado por efecto de la ebullicin) y simultneamente se comienza el calentamiento a
ebullicin del contenido del baln. El indicador vira a azul cuando empieza a destilarse el NH3 por
arrastre en corriente de vapor. Se sigue destilando hasta llegar a aproximadamente 200 ml en el
erlenmeyer colector (los primeros 150 ml de destilado contienen generalmente la totalidad del
NH3). Una vez alcanzado dicho volumen, se retira el erlenmeyer enjuagando dentro del mismo el
extremo del refrigerante con AD, para no perder nitrgeno y luego se apaga el calentamiento.
c) Valoracin: El destilado se valora con solucin de H2SO4 0.2 N, hasta lograr el viraje del indicador
Mortimer al color inicial rojo.
d) Blanco: Se debe realizar un blanco de reactivos, siguiendo las mismas indicaciones pero sin
colocar muestra en el baln.
Clculos:
Protena total % = (VMyestra - VBlanco) x NAcido x 0.014 x F x 100/gMuestra
Siendo VMuestra ml de cido gastados en la valoracin de la muestra
VBlanco
ml de cido gastados en la valoracin del blanco
NAciodo
normalidad del cido sulfrico
0.014
peso del meq de nitrgeno, en g
F
factor de conversin de nitrgeno a protena
gmuestra
peso en g de la muestra
En los clculos para convertir nitrgeno a protenas, usar el factor 6,25 para carnes, 5,7 para
cereales y soja y 6,38 para leche y derivados.
Determinacin de Nitrgeno bsico voltil- ndice de putrefaccin
Aplicacin: carne vacuna, pescado
Fundamento: El pH de msculo de pescado fresco est entre 6,6 y 6,8 (lo conserva en el momento
de la muerte). Despus de muerto se acumula cido lctico, provocando cada de pH, pero como en
el msculo hay compuestos con carcter buffer, no permiten que se vea ese descenso. Por
descomposicin del msculo se acumulan amonaco, dimetilamina y trimetilamina. Si en ese
momento se produce contaminacin bacteriana, entonces comenzar a subir el pH (primero
lentamente y rpido al final), en condiciones extremas de deterioro puede llegar a 7,5-8,0. Ocurre un
proceso de autolisis que lleva al aminocido:
R-CH-NH2-COOH
CO2 + R-CH2-CH2-NH2
Decarboxilasas
Aminooxidasas
NH3
R-CH2-COOH
(algunos son voltiles y
arrastrables por agua)
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Hay accin sobre el xido de trimetilamina que existe en algunos peces de agua salada. El lctico
en el msculo es reductor y acta sobre el O=N(CH3)3 (precursor).
CH3
I
H-C-OH
I
COOH
Enzimas
+ 2 O=N(CH3)3
2 N(CH3)3 +
microbianas
bsico
voltil
CH3
I
COOH + CO2 + H2O
voltil
Determinacin de Nitrgeno lcali lbil: Mtodo de Kofranyi (1950. Milchwissenschafts, 5154 Vol. 2). Determinacin de protenas en leche por destilacin directa.
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se hacen diluciones o se agrega casena para obtener las concentraciones proteicas deseadas. El
contenido de protenas que cubra el rango de la curva de calibracin, debe ser de 1 a 4 % (p/v).
NOTA: Actualmente los anlisis en leche se realizan siguiendo la metodologa especificada en las
normas IDF, de la Federacin Internacional de Lechera (FIL). Para la determinacin del contenido
de protenas se utiliza el mtodo de Kjeldhal, utilizando cido brico para recoger el destilado.
Mtodos extractivos colorimtricos
a) Mtodo de Biuret
Fundamento: Los polipptidos (la mnima unidad de reaccin es el tripptido) reaccionan con una
solucin diluida de sulfato cprico (Cu2+) en medio fuertemente alcalino, mostrando una coloracin
azul caracterstica.
Reactivos:
Solucin A:
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- Sustancias o buffers que acidifiquen el medio.
- Agentes quelantes del cobre.
Rango: 0.05-0.4 mg/ml
Reactivos:
Na2CO3 2% en NaOH 0.1N: Solucin A
CuSO4.5H2O 1.0%
Tartrato de Na y K 2%
Solucin de Folin: Reactivo de Folin Ciocalteau diluido con agua destilada 1:1
Determinacin: Se mezclan en el momento de la determinacin volmenes iguales de la solucin de
CuSO4 y de la del tartrato. A esta mezcla la llamaremos solucin B. Aadir 1ml de la solucin B a 50
ml de la solucin A, para obtener la solucin A+B.
Se prepara la dilucin de la muestra que corresponda (200 l) a la que se le adiciona 1ml de
solucin A+B. Agitar bien y dejar reposar 10 min.
Pasado este tiempo agregar 100 l del reactivo de Folin diluido. Agitar bien y dejar reposar 30
min. Leer absorbancia a 750nm
Determinacin de Nitrgeno amnico: Mtodo de Sorensen
Aplicacin: Sirve para determinar N amnico en muestras lquidas o extractos. La finalidad es poder
determinar la concentracin de amonaco o grupos amino libres de aminocidos, pptidos y
protenas. Es til para dosar aminocidos libres en jugos de fruta, el grado de hidrlisis de una
protena, o amonio despus de la destruccin de materia orgnica en el mtodo de Kjeldahl, etc.
Determinacin: Neutralizar 10 ml de muestra con NaOH 0,1 N usando fenolftalena como indicador.
Es importante no excederse en el agregado de NaOH, detenerse en el punto en que aparece una
dbil coloracin rosada que persiste por 30 seg. Otra posibilidad es utilizar un pHmetro y llegar a pH
8.
Agregar 10 ml de formol neutralizado recientemente con fenolftalena y titular de inmediato la
acidez liberada con NaOH 0,1 N hasta ver el punto final. Tomar este ltimo valor para el clculo de N
amnico y el primero para el clculo de la acidez.
Clculo:
g %N = VNaOH NNaOH 0,014 x 100/peso de muestra
Determinacin de aminocidos aromticos: mtodo de Hull
Reactivos: todos los reactivos deben estar a una T > 30C
- Rvo Folin-Cicoltou: 1 vol FC (cido fosfomolbdico-cido fosfotngstico) + 2 vol AD
- CO3Na2 15% + Hexametafosfato sdico 2%
Determinacin: Mezclar 0.5 ml de muestra con 1 ml de CO 3Na2-Hexametafosfato y esperar 5 min.
Luego agregar 0.3 ml de Rvo FC. Esperar 5 min y leer la absorbancia a 650 nm.
Curva de calibracin: Con tirosina como patrn preparar soluciones de diferente concentracin y
agregar el volumen necesario de TCA 12% como para tener una concentracin final de 8%.
Centrifugar y sobre los sobrenadantes aplicar la tcnica descripta anteriormente.
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Extraccin de Protenas
A continuacin se presentan algunos protocolos comunmente utilizados para la extraccin de
protenas de distintos productos alimenticios.
Productos crneos.
- Homogeneizar 1 g de msculo picado con 10,0 ml de buffer Tris-HCl 0,03 M, pH = 7,0.
- Centrifugar a 7000 g (15 min, 4 C). Separar el sobrenadante.
- Repetir el tratamiento anterior sobre el pellet.
- Mezclar los dos sobrenadantes obtenidos. La solucin resultante constituye la fraccin de
protenas extrables en agua (PEA) (protenas sarcoplsmicas fundamentalmente).
- Tratar el pellet remanente luego de los dos pasos de extraccin previos con 10,0 ml de
buffer Tris-HCl 0.03 M conteniendo KCl 0,6 M, pH = 7.
- Centrifugar (7000 g, 15 min, 4 C) y separar el sobrenadante.
- Repetir el tratamiento anterior sobre el pellet.
- Mezclar los dos sobrenadantes: se obtiene la fraccin de protenas extrables con sal
(PES) (protenas miofibrilares fundamentalmente).
Harina de soja.
- Tratar 1 g de harina de soja desgrasada con 10,0 ml de agua alcalinizada con NaOH 1 N a
pH = 8.
- Agitar durante 1 h en agitador magntico a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 10000 g (15 min, 4 C). Separar el sobrenadante: fraccin de protenas
solubles.
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Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)
La composicin polipeptdica de un extracto proteico puede ser evaluada mediante una
electroforesis, basada en la capacidad de migracin de una partcula cargada bajo la accin de un
campo elctrico. A pHs diferentes al pI, las protenas se encuentran cargadas y se mueven frente
a la fuerza impulsora generada por un campo elctrico. Segn la ley de Stokes las partculas se
movilizarn a una velocidad definida segn su tamao, carga y viscosidad del medio. En las
electroforesis proteicas se utilizan soportes estructurados los cuales adems actan como tamiz,
limitando as la movilidad de las protenas de acuerdo a su tamao.
El gel de poliacrilamida es el soporte mas comnmente utilizado por su alta reproducibilidad,
estabilidad (pH, temperatura, fuerza inica), inercia qumica y porosidad controlable. La
polimerizacin de la acrilamida sigue un mecanismo de radicales libres cuyo iniciador es el
persulfato de amonio con el N, N, N, N tetrametiletilenodiamina (TEMED) actuando como
catalizador. La porosidad del gel se controla mediante la relacin entre la acrilamida y la N, Nmetileno-bis-acrilamida, la cual acta como entrecruzador, y la concentracin de ambos
compuestos.
En el caso de las electroforesis desnaturalizantes, la protena tratada con SDS, detergente
aninico, pierde su estructura cuaternaria y terciaria, y los polipptidos que forman las
subunidades de protenas multimricas, y las protenas monomricas se cargan negativamente de
manera uniforme separndose de acuerdo a su tamao.
Reactivos y equipo
Buffer de electrodo: Tris(hidroximetil)aminometano-HCl (Tris-HCl) 25 mM, glicina 192 mM (pH
8,3), con dodecil sulfato de sodio (SDS) 0,1 % p/v.
Buffer de gel stacking (4x): Tris-HCl 500 mM (pH 6,8) con SDS 0,4 % p/v; N,N,N,N,
tetrametiletilenodiamina (TEMED) 0,4 % v/v.
Buffer de gel separador (4x): Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) con SDS 0,4 % p/v; N,N,N,N,
tetrametiletilenodiamina (TEMED) 0,4 % v/v.
Buffer de muestra para electroforesis desnaturalizante: Tris-HCl 62,5 mM (pH 6,8), sacarosa
15 % v/v, SDS 2% p/v, EDTA 25 mM y azul de bromofenol 0,05 % p/v con o sin 2-mercaptoetanol
(2-ME) 5% v/v, para obtener condiciones reductoras o no reductoras, respectivamente. El 2-ME
reduce enlaces disulfuro y desarma estructuras multimricas estabilizadas por uniones covalente
de grupos tioles de cistenas.
Solucin de acrilamida-bisacrilamida: 30 g de archilamida y 0,8 g de bisacrilamida se llevan a
un volumen final de 100 mL con agua destilada. Luego se filtra y se almacena en frasco color
caramelo.
Equipo de electroforesis: Mini Protean II (BIO-RAD Life Sciences, EE. UU.) con separadores
entre placas de 1 mm de espesor.
Preparacin de las muestras y siembra
En el caso de extractos proteicos, los mismos sern mezclados con buffer muestra. Si se trata de
muestras slidas las mismas sern directamente solubilizadas en buffer muestra 1x. En el caso de
muestras tratadas con 2-ME, sern calentadas a 100 C durante 3 minutos. Las mezclas se
centrifugarn a 12.000 g durante 10 min a 20 C. En los distintos geles de poliacrilamida se
sembraron entre 5 L y 25 L de muestra por calle o 3 L de solucin patrn para tener una
concentracin detectable y buena resolucin con la tincin con Coomasie Brilliant Blue R-250.
Preparacin del gel, siembra y corrida
Se prepararn geles de separacin con una concentracin de arcrilamida del 12 % p/v y un gel de
concentracin o stacking de 4 % p/v, de acuerdo con
Para 1 gel de 1mm:
-Gel separador (7 ml en total): Acril. Stock
2.73 ml
12%
Buffer gel (4x)
1.75 ml
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ANLISIS DE ALIMENTOS
Agua
Persulfato 10%
TEMED
2.52 ml
25 l
7 l