INTRODUCCION

La palabra cromatografa significa grfica de colores y fue diseada por Michael

Tswett en el 1903. Tswett llev a cabo una extraccin de una mezcla de
pigmentos de hojas verdes y luego pas este extracto a travs de un tubo de
vidrio empacado con carbonato de calcio; de esta forma logr separar los
pigmentos presentes en las hojas.
Actualmente cromatografa es el nombre que se le da a un grupo de tcnicas
utilizadas en la determinacin de la identidad de sustancias, en la separacin
de componentes de las mezclas y en la purificacin de compuestos. Esta
tcnica es muy efectiva y por lo tanto se utiliza tanto a nivel de investigacin
como a nivel industrial.
Este mtodo puede variar de tcnica en tcnica, pero siempre se basa en el
mismo principio: Todos los sistemas de cromatografa contienen una
fase estacionaria y una fase mvil.

CROMATOGRAFIA
El termino cromatografa hace referencia a la escritura en colores, los
cuales provienen de los diferentes elementos qumicos que son estudiados.
La cromatografa es

un mtodo

fsico

de

separacin para

la

caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las

ramas de la ciencia y la fsica. Es un conjunto de tcnicas basadas en el
principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las
cantidades de dichos componentes.
Las tcnicas cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas hay
una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico)
que arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de
un slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla
interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los
componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van
separando. Despus de que los componentes hayan pasado por la fase
estacionaria, separndose, pasan por un detector que genera una seal que
puede depender de la concentracin y del tipo de compuesto.
Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los compuestos da
como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto
una separacin efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada
componente de la mezcla.
La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se
excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que

puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis).

Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad

analtica). En este caso, las cantidades de material empleadas son
pequeas.

Clasificacin

Las distintas tcnicas cromatogrficas se pueden dividir segn cmo est

dispuesta la fase estacionaria:
Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana

o sobre un papel. Las principales tcnicas son:

Cromatografa en papel

Cromatografa en capa fina

Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una

columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen:

Cromatografa de lquidos

Cromatografa de gases

Cromatografa de fluidos supercrticos

La cromatografa de gases es til para gases o para compuestos

relativamente voltiles, lo que incluye a numerosos compuestos orgnicos. En

el caso de compuestos no voltiles se recurre a procesos denominados de
"derivatizacin", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilizen en
las condiciones de anlisis.
Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de
alta resolucin (HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography),
que es la tcnica cromatogrfica ms empleada en la actualidad, normalmente
en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carcter
no polar, y la fase mvil posee carcter polar (generalmente agua o mezclas
con elevada proporcin de la misma, o de otros disolvente polares, como por
ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente

la fase estacionaria estaba compuesta de slice o almina, de carcter polar, y

por tanto la fase mvil era un disolvente orgnico poco polar. Una serie
eluotrpica, es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actan
como fase mvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una
fase estacionaria.

Cromatografa en papel

Lquido

Lquido ( molculas de agua contenidas en la celulosa del

papel )

Cromatografa en capa
fina

Lquido

Slido

Cromatografa de gases

Gas

Slido o lquido

Cromatografa lquida
en fase inversa

Lquido
(polar)

Slido o lquido
(menos polar)

Cromatografa lquida
en fase normal

Lquido
(menos polar)

Slido o lquido
(polar)

Cromatografa lquida
de intercambio inico

Lquido
(polar)

Slido

Cromatografa lquida
de exclusin

Lquido

Slido

Cromatografa lquida
de adsorcin

Lquido

Slido

Cromatografa de
fluidos supercrticos

Lquido

Slido

Trminos empleados en cromatografa

Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografa.

Cromatografa analtica se emplea para determinar la existencia y

posiblemente tambin la concentracin de un analito en una muestra.

Fase

enlazada es

una

fase

estacionaria

que

se

une

de

forma covalente a las partculas de soporte o a las paredes internas de la

columa.

Cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso

de separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla separada.

En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal

(obtenida,

por

ejemplo,

partir

de

un espectrofotmetro,

un espectrmetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores)

correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos
existentes en la muestra. En el caso de un sistema ptimo, la seal es

proporcional a la concentracin del analito especfico separado.

Cromatgrafo es el equipo que permite una separacin sofisticada. Por
ejemplo, un cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de lquidos.

Cromatografa es el mtodo fsico de separacin en el cual los

componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las
cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase mvil) se
mueve en una direccin definida.

Efluente es la fase mvil que atraviesa la columna.

Serie eluotrpica es una lista de disolventes clasificados segn su poder

de dilucin.

Fase inmovilizada es una fase estacionaria que est inmovilizada sobre

partculas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.

Cromatograma correspondiente a una cromatografa liquida en fase

reversa para compuestos fenlicos

Fase mvil es la fase que se mueve en una direccin definida. Puede ser un
lquido (cromatografa de lquidos o CEC). un gas (cromatografa de gases) o un
fluido supercrtico (cromatografa de fluidos supercrticos). La fase mvil
consiste en la muestra que est siendo separada/analizada y el disolvente, que
se mueven por el interior de la columna. En el caso de la cromatografa lquida
de alta resolucin, HPLC, la fase mvil es un disolvente no-polar como
el hexano (fase normal) o bien algn disolvente polar (cromatografa de fase
reversa) y la muestra que va a ser separada.. La fase mvil se mueve a travs
de la columna de cromatografa (fase estacionaria) de forma que la muestra
interacciona con la fase estacionaria y se separa.

Cromatografa preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de

sustancia para un uso posterior, ms que para anlisis.

Tiempo de retencin es el tiempo caracterstico que tarda un analito

particular en pasar a travs del sistema (desde la columna de entrada hasta el
detector) bajo las condiciones fijadas. Vase tambin: ndice de retencin de
Kovats

Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografa. Puede

consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla
es tratada en el curso del anlisis, la fase o fases que contienen los analitos de
inters es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya
separacin no resulta de inters es llamada residuo.

Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.

Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la

fase lquidamvil en cromatografa de lquidos.

Fase estacionaria es la sustancia que est fija en una posicin en el

procedimiento de la cromatografa. Un ejemplo es la capa de silica en
la cromatografa en capa fina.

DETECTORES

Un detector es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias

eludas a la salida de la columna cromatogrfica. Podemos expresar que el
detector son los "ojos" de un cromatgrafo.
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no
medible directamente, en una seal elaborable y ofrecernos informacin sobre
la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica.
En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica
entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los
componentes que previamente se han separado en la columna, esta accin se

traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar

mediante un registrador grfico integrador permitiendo indicar el momento
que salen de la columna los componentes.

Clasificacin de los detectores

Detectores segn su Grado de Selectividad :

Universales. Responde a la mayora de los solutos que pasan por l.

Especficos Selectivos. Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de
substancias con un mnimo de respuesta a otras.
Detectores Destructivos y No destructivos. Esta clasificacin,

obviamente, es en referencia a si la muestra es destruida o no.

Detectores segn su Modo de Respuesta:

Dependientes del Flujo Msico. Producen una seal que es proporcional a la

cantidad de soluto que pasa a travs de l en la unidad de tiempo pero es

independiente del volumen de gas portador requerido para la elucin.

Dependiente de la Concentracin. Dan una seal proporcional a la cantidad
de soluto por unidad de volumen de gas portador que pasa a travs de l.

Detectores segn el proceso de deteccin: Ionizacin, pticoespectroscpico, Electroqumico, etc.

Caractersticas de los Detectores: Los detectores pueden ser

clasificados segn:

Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la

muestra en una seal elctrica medible.

Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el

detector mantiene una sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. El

significado prctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la

concentracin para la cual el detector es confiable. Hay dos lmites en la curva
de linealidad:

El lmite de concentracin inferior, que es dado por el lmite de deteccin y,

El lmite Superior, definido por un porcentaje de desviacin arbitrario de la
curva de linealidad, normalmente se toma un 5% de desviacin.
Rango Dinmico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del

detector es constante.
Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la

seal. El significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor

determinante en la determinacin de la cantidad mnima detectable y el lmite
inferior del rango lineal.
Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de

sustancia que puede producir una seal que sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el

proceso en el que un detector est operativo sin que alguna sustancia pasa a
travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite diagnosticar el
buen o mal funcionamiento del detector.
Tipos de Detectores: Segn el proceso de deteccin pueden ser:

Conductividad Trmica (TCD)

Ionizacin de Llama (FID)

Captura Electrnica (ECD)

Ionizacin de Llama Alcalina (NPD)

Fotomtrico de Llama (FPD)

Emisin Atmica (AED)

Espectrmetro de Masas

Termoinico (TID)

Detector de Fotoionizacin

Quimioluminiscencia de Azufre (SCD)

Espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier

Conductividad Electroltica (DELCD)

Combustin Cataltica (CCD)

Ionizacin del Helio (HID)

CROMATOGRAFIA DE GASES
La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la
muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica.

La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia
de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las
molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs
de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la
cromatografa gas-slido (GSC), y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo
esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar
simplemente cromatografa de gases (GC).
CROMATOGRAFIA DE GAS-SOLIDO: En la GSC la fase estacionaria es slida
y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de
adsorcin.
CROMATOGRAFIA DE GAS-LIQUIDO: En la GLC, la fase estacionaria es
lquida, y los analitos se separan mediante reparto. En ambas tcnicas, el
desplazamiento de la fase mvil, se realiza mediante presin constante gracias
al Regulador de Presin.
La muestra se inyecta por medio de una jeringa en una cmara de
vaporizacin, lugar donde se vaporiza; para despus ser arrastrada hacia la
columna por medio de un gas inerte, para prevenir su reaccin con el analito o
la columna. Una vez ocurrido este proceso, en donde la fase mvil pasa por la
fase estacionaria, los resultados llegan al detector, que se hacen visibles en el
ordenador.
En la cromatografa de gases se usa como fase estacionaria un
compuesto orgnico polimrico de baja volatilidad, estable trmicamente y con
adecuadas caractersticas de disolvente. Es preciso sealar que deben usarse
fases estacionarias, similares funcionalmente al compuesto a analizar.
Componentes bsicos de un Cromatgrafo Gas - Lquido: De forma muy
esquemtica podemos resumirlos en:
1. Gas portador
2. Sistema de Inyeccin de muestra
3. Columna
4. Detector
5. Registrador

1. Gas portador
El gas portador cumple bsicamente dos propsitos: Transportar los
componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un
gas portador debe reunir ciertas condiciones:
-Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como
con la fase estacionaria)
-Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa
-Fcilmente disponible y puro
-Econmico
-Adecuado al detector a utilizar
El gas portador debe ser un gas inerte, para prevenir su reaccin con el analito
o la columna. Generalmente se emplean gases como el helio, argn, nitrgeno,
hidrgeno o dixido de carbono, y la eleccin de este gas en ocasiones
depende del tipo de detector empleado. El almacenaje del gas puede ser en
balas normales o empleando un generador, especialmente en el caso del
nitrgeno y del hidrgeno. Luego tenemos un sistema de manmetros y
reguladores de flujo para garantizar un flujo estable y un sistema de
deshidratacin del gas, como puede ser un tamiz molecular.
Generalmente la regulacin de la presin se hace a dos niveles: un primer
manmetro se sita a la salida de la bala o generador del gas y el otro a la
entrada del cromatgrafo, donde se regula el flujo. Las presiones de entrada

varan entre 10 y 25 psi, lo que da lugar a caudales de 25 a 150 mL/min en

columnas de relleno y de 1 a 25 mL/min en columnas capilares. Para
comprobar el caudal se puede utilizar un rotmetro o un simple medidor de
pompas de jabn, el cual da una medida muy exacta del caudal volumtrico
que entra a la columna.
La pureza de los gases es sumamente importante, se requieren niveles 4.5 o
mayores es de cir 99.995 % de pureza. Sin embargo, debido al cuidado que se
debe tener con la fase activa de la columna, se hace completamente necesario
la instalacin de trampas a la entrada del Gas carrier, estas trampas
obviamente tienen una capacidad limitada, pero son importantsimas al
momento de usar el Cromatografo. Estas trampas evitan el ingreso de
Hidrocarburos, agua, CO entre otros.

2. Sistema de inyeccin de muestra

La inyeccin de muestra es un apartado crtico, ya que se debe inyectar una
cantidad adecuada, y debe introducirse de tal forma (como un "tapn de
vapor") que sea rpida para evitar el ensanchamiento de las bandas de salida;
este efecto se da con cantidades elevadas de analito. El mtodo ms utilizado
emplea una microjeringa (de capacidades de varios microlitros) para introducir
el analito en una cmara de vaporizacin instantnea. Esta cmara est a
50 C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil, y est
sellada por una junta de goma de silicona septa o septum.

Inyector de muestra para un GC

3. Columnas y sistemas de control de temperatura
En GC se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno y las
tubulares abiertas o capilares. Estas ltimas son ms comunes en la actualidad
(2005) debido a su mayor rapidez y eficiencia. La longitud de estas columnas
es variable, de 2 a 60 metros, y estn construidas en acero inoxidable, vidrio,
slice fundida o tefln. Debido a su longitud y a la necesidad de ser introducidas
en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma helicolidal con
longitudes de 10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno.
La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el
grado de separacin de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con
una precisin de dcimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de
ebullicin del analito o analitos, como tambin la mxima temperatura de
funcionamiento de la columna (fase estacionaria), y por lo general se ajusta a
un valor igual o ligeramente superior a l. Para estos valores, el tiempo de
elucin va a oscilar entre 2 y 30-40 minutos. Si tenemos varios componentes
con diferentes puntos de ebullicin, se ajusta la llamada

rampa de

temperatura con lo cual sta va aumentando ya sea de forma continua o por

etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede

significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable utilizar

temperaturas bajas para la elucin ya que aunque a mayor temperatura la
elucin es ms rpida, se corre el riesgo de descomponer el analito.
4. Detector
El detector es la parte del cromatgrafo que se encarga de determinar cundo
ha salido el analito por el final de la columna. Las caractersticas de un detector
ideal son:

Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisin cundo

sale analito y cuando sale slo el gas portador. Tienen sensibilidades
entre 10-8 y 10-15 g/s de analito.

Respuesta lineal al analito con un rango de varios rdenes de

magnitud.

Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal de salida.

Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por ejemplo desde

temperatura ambiente hasta unos 350-400 C, temperaturas tpicas
trabajo.

Estabilidad y reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales de

analito debe dar salidas de seal iguales.

Alta fiabilidad y manejo sencillo, o a prueba de operadores

inexpertos.

Respuesta semejante para todos los analitos, o

Respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido

nmero de analitos.

Detector de ionizacin de llama (FID)

En cromatografa de gases, el detector de ionizacin de llama (FID) es uno de
los detectores ms extensamente utilizado y, por lo general, uno de los ms
aplicables.

En un quemador, el efluente de
la columna se mezcla con
hidrgeno y con aire para luego
encenderse elctricamente.
La mayora de los compuestos
orgnicos, cuando se pirolizan a
la temperatura de una llama de
hidrgeno/aire, producen iones y
electrones que pueden conducir
la electricidad a travs de la
llama. Entre el extremo del
quemador y un electrodo colector
situado por encima de la llama,
se aplica una diferencia de
potencial de unos pocos cientos
de voltios, y para la medicin de
la corriente que resulta (de unos 10-12A) se utiliza un amplificador operacional
de alta impedancia.
La ionizacin en la llama de los compuestos que contienen carbono no es un
proceso bien establecido, aunque se observa que el nmero de iones que se
produce es aproximadamente igual al de tomos de carbono transformados en
la llama. El detector de ionizacin de llama debido a que es un detector que
responde al nmero de tomos de carbono que entra en el detector por unidad
de tiempo, es un detector sensible a la masa, ms que un sistema sensible a la
concentracin. En consecuencia, este detector tiene la ventaja de que los
cambios en el caudal de la fase mvil tienen poco efecto sobre la respuesta del
detector.
Grupos funcionales, tales como carbonilo, alcohol, halgeno y amina, originan
en la llama pocos iones o prcticamente ninguno. Adems, el detector es
insensible a los gases no combustibles como H2O, CO2, SO2, y NOx. Esas
propiedades hacen del detector de ionizacin de llama uno de los detectores
generales ms utilizado para el anlisis de la mayora de compuestos
orgnicos, incluyendo aquellos que estn contaminados con agua y con xidos
de nitrgeno y de azufre.
El detector de ionizacin de llama posee una elevada sensibilidad (del orden de
10-13 g/s), un gran intervalo lineal de respuesta (de 107), y un bajo ruido. Por
lo general, es resistente y fcil de utilizar. Una desventaja del detector de
ionizacin de llama es que se trata de un detector destructivo de la muestra.

Detector de conductividad trmica (TCD)

Uno de los primeros detectores que se utilizaron en cromatografa de gases, y

uno de los que todava tiene una gran aplicacin, se basa en los cambios en la
conductividad trmica de la corriente de gas ocasionados por la presencia de
las molculas de analito. Este dispositivo se denomina a veces un catarmetro.
El sensor de un catarmetro consiste en un elemento calentado elctricamente
cuya temperatura, a una potencia elctrica constante, depende de la
conductividad trmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser un
hilo fino de platino, oro o tungsteno, o tambin, un termistor semiconductor. La
resistencia del hilo o del termistor da una medida de la conductividad trmica
del gas.
Para la configuracin de los componentes del detector se emplean dos pares
de elementos, uno de los pares se coloca en el flujo del efluente de la columna,
y el otro en la corriente de gas previo a la cmara de inyeccin de la muestra.
Alternativamente, la corriente de gas se puede dividir en dos corrientes una de
las cuales atraviesa el inyector y la otra no. En cualquier caso, el efecto de la
conductividad trmica del gas portador se compensa, y se minimizan los
efectos de la variacin de caudal, presin y potencia elctrica. Las resistencias
de los pares de detectores gemelos se comparan entre s, incorporndolos en
un circuito sencillo de puente de Wheatstone.
Las conductividades trmicas del helio y del hidrgeno son aproximadamente
de seis a diez veces mayores que las de la mayora de los compuestos
orgnicos, de modo que, incluso en presencia de pequeas cantidades de
materia orgnica, tiene lugar una disminucin relativamente grande de la
conductividad trmica del efluente de la columna y, en consecuencia, el
detector experimenta un marcado aumento en la temperatura.
Las conductividades de los otros gases portadores son ms parecidas a las de
los constituyentes orgnicos y por esta razn con un detector de conductividad
trmica debe usarse hidrgeno o helio como gas portador.
Las ventajas del detector de conductividad trmica son su simplicidad, su
amplio rango dinmico lineal (aproximadamente 105), su respuesta universal
tanto a especies orgnicas como a inorgnicas, y su carcter no destructivo, lo
que permite recoger los solutos tras la deteccin. Una limitacin del
catarmetro es su sensibilidad relativamente baja (aproximadamente 10-8 g de
soluto/mL de gas portador). Otros detectores son de 104 a 107 veces ms
sensibles. Debera subrayarse que la baja sensibilidad de los detectores de

conductividad trmica, hace imposible con frecuencia su utilizacin con

columnas capilares, debido al pequeo tamao de muestra con el que estas
columnas operan.

Detector termoinico de llama (FTD)

El detector termoinico (FTD) es un detector selectivo de los compuestos
orgnicos que contienen fsforo y nitrgeno. Su respuesta a un tomo de
fsforo es aproximadamente 10 veces mayor que a un tomo de nitrgeno, y
de 104 a 106 veces superior que a un tomo de carbono. En comparacin con
el detector de ionizacin de llama, el detector termoinico es unas 500 veces
ms sensible para los compuestos que contienen fsforo y unas 50 veces ms
sensible a las especies nitrogenadas. Estas propiedades hacen de la deteccin
termoinica un sistema particularmente til para la deteccin y determinacin
de muchos pesticidas que contienen fsforo.
Un detector termoinico tiene una configuracin similar al detector de llama. El
efluente de la columna se mezcla con hidrgeno, pasa a travs de la llama, y
se quema.
El gas caliente fluye alrededor de una bola de slicato de rubidio calentada
elctricamente, la cual se mantiene a unos 180 V con respecto al colector. La
bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura de 600 a 800C.
Lo que ocurre exactamente en el plasma, que hace que se produzcan
inslitamente una gran cantidad de iones a partir de las molculas que
contienen fsforo o nitrgeno, realmente no est bien establecido, pero el
resultado es una gran corriente de iones, la cual se utiliza para la
determinacin de compuestos que contienen esos dos elementos.

Detector de captura de electrones (ECD)

El detector de captura de electrones (ECD) opera casi de la misma forma que
un contador proporcional para la medida de radiacin X. En este caso el
efluente de la columna pasa sobre un emisor , como nquel-63 o tritio
(adsorbido sobre una lmina de platino o de titanio). Un electrn del emisor
provoca la ionizacin del gas portador (con frecuencia se trata de nitrgeno) y
la produccin de una rfaga de electrones. De este proceso de ionizacin, en
ausencia de especies orgnicas, resulta una corriente constante entre un par
de electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye en presencia de molculas
orgnicas que tiendan a capturar los electrones. La respuesta es poco lineal, a
no ser que el potencial a travs del detector se aplique en forma de impulsos.
El detector de captura de electrones es de respuesta selectiva, siendo muy
sensible a las molculas que contienen grupos funcionales electronegativos
tales como halgenos, perxidos, quinonas, y grupos nitro; en cambio, no es
sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e hidrocarburos. Una
aplicacin importante del detector de captura de electrones es la deteccin y
determinacin de insecticidas clorados.
Los detectores de captura de electrones son altamente sensibles y tienen la
ventaja de no alterar la muestra de manera significativa (a diferencia del
detector de llama). Por otra parte, su intervalo lineal de respuesta
normalmente se limita a unos dos rdenes de magnitud.

Detector de emisin atmica (AED)

El detector ms reciente, y ya disponible en el comercio, para cromatografa de
gases, se basa en la emisin atmica. En este dispositivo, el eluyente se
introduce en un plasma de helio obtenido con microondas, que se acopla a un
espectrmetro de emisin con series de diodos. El plasma es suficientemente
energtico como para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarlos,
y as obtener sus espectros de emisin caractersticos. Esos espectros son
recogidos en un espectrmetro que utiliza una serie de diodos configurados en
un plano mvil, que es capaz de detectar la radiacin emitida desde 170 a 780
nm. La serie de diodos movible es capaz de controlar simultneamente de dos
a cuatro elementos en cada posicin. Hasta el momento, el programa de
tratamiento de datos suministrado con el detector permite medir la
concentracin de 15 elementos. Presumiblemente, un futuro software permitir
tambin la deteccin de otros elementos.

Otros tipos de detectores

Un espectrmetro de masas unido directamente al cromatgrafo es otro medio
de llevar a cabo la deteccin de los compuestos separados
cromatogrficamente.

El espectrmetro de masas es un instrumento que permite analizar con una

gran precisin la composicin de diferentes elementos qumicos e istopos
atmicos, separando los ncleos atmicos en funcin de su relacin masacarga (m/z). Puede utilizarse para identificar los diferentes elementos qumicos
que forman un compuesto o determinar el contenido isotpico de diferentes
elementos en un mismo compuesto.
El espectrmetro de masas mide razones carga/masa de iones, calentando un
haz de material del compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los
diferentes tomos. El haz de iones produce un patrn especfico en el detector
que permite analizar el compuesto qumico.
En trminos generales, molculas
diversas tienen masas diversas,
hecho
utilizado
por
un
espectrmetro de masas para
determinar qu molculas estn
presentes en una muestra Se
vaporiza una muestra obteniendo
iones
que
poseen
pesos
moleculares especficos y una carga y debido a ella tendrn movimiento bajo
influencia de un determinado campo elctrico.
Los iones se envan al compartimiento de aceleracin donde pasan a travs de
una lmina metlica. Despus se aplica un campo magntico a un lado del
compartimiento que atrae a cada uno de los iones con la
misma fuerza (suponiendo que tengan carga idntica) y se los desva sobre el
detector. Los iones ms ligeros se desviarn ms que los iones pesados porque
la fuerza aplicada a cada ion es igual pero los iones ligeros tienen menos masa
y se desviaran ms. El detector mide exactamente cunto de lejos se ha
desviado cada ion y, a partir de ese, dato se calcula el "cociente masa por
unidad de carga". Con esta informacin es posible determinar con un alto nivel
de certeza cul es la composicin qumica de la muestra original.
El detector registra la carga inducida o la corriente producida cuando un ion
pasa cerca o golpea una superficie. En un instrumento de exploracin la seal
es producida en el detector durante la trayectoria de la misma (en qu m/z) y
producir un espectro de masa, un expediente del m/z's en el cual los iones
estn presentes. Tpicamente, se utiliza un cierto tipo de multiplicador de
electrones (electromultiplicador).
Actualmente, el elemento de deteccin por excelencia es el ya nombrado
electromultiplicador. Su funcionamiento se basa en el efecto cascada producido
al impactar un determinado ion (o iones) en el mismo. Aplicando una diferencia
de potencial entre sus extremos, se consigue el aumentar el factor de
amplificacin, que vendr determinado por el nmero de subetapas
amplificadoras que componen el detector. Normalmente es un componente

sometido a desgaste que ha

perder eficiencia de amplificacin.

de

reemplazarse

con

el

tiempo

al

Detector fotomtrico de llama

Se ha utilizado extensamente para el anlisis de contaminantes del aire y del
agua como los pesticidas y los hidrocarburos. Se trata de un detector selectivo
que sobre todo es sensible a los compuestos que contienen azufre y fsforo. En
este detector, el eluyente se hace pasar a travs de una llama hidrgeno/aire a
baja temperatura, la cual convierte parte del fsforo a una especie HPO que
emite bandas de radiacin centradas alrededor de 510 y 526 nm. El azufre de
la muestra se convierte simultneamente en S2, el cual emite una banda
centrada en 394 nm. Para aislar esas bandas se emplean los filtros adecuados,
y sus intensidades se registran fotomtricamente. Con la fotometra de llama
se han detectado otros elementos entre los que se incluyen los halgenos,
nitrgeno y diversos metales, como el estao, cromo, selenio y germanio.

Detector de fotoionizacin
El eluyente de la columna se irradia con un haz intenso de radiacin
ultravioleta de energa variable desde 8.3 a 11.7 eV ( = 149 a 106 nm), la cual
provoca la ionizacin de las molculas. Al aplicar un potencial a travs de una
celda que contiene los iones producidos, se origina una corriente de iones, la
cual es amplificada y registrada.

Detector de Quimioluminiscencia

Recientemente se ha incorporado a la gama disponible de detectores para

cromatografa de gases el detector de quimioluminiscencia.
La
quimioluminiscencia
se
define
como
la
emisin
de radiacin
lectromagntica (normalmente en le regin del visible o del infrarrojo cercano)
producida por una reaccin qumica.
Como la intensidad de emisin es funcin de la concentracin de las especies
qumicas implicadas en la reaccin quimioluminiscencia, las medidas de la
intensidad de emisin pueden emplearse con fines analticos.
Algunas limitaciones en el anlisis por quimioluminiscencia, como la
dependencia de la emisin de varios factores ambientales que deben ser
controlados, la falta de selectividad, ya que un reactivo quimioluminiscente no
se limita a un nico analito, y finalmente, como ocurre en otros sistemasde
deteccin en flujo, la emisin quimioluminiscente no es constante sino que
vara con el tiempo (el flash de luz est compuesto de una seal que se
produce tras la mezcla de los reactivos, alcanzando un mximo y despus cae
hasta la lnea base), y este perfil de emisin frente al tiempo puede variar
ampliamente en diferentes sistemas quimioluminscentes, por lo que hay que
extremar el cuidado para detectar la seal en sistemas en flujo, midiendo en
periodos de tiempo bien definidos.
En quimioluminiscencia, la emisin de luz es causada por los productos de una
reaccin especfica qumica, se basa en la reaccin entre ciertos compuestos
azufrados y el ozono. La intensidad de fluorescencia resultante es proporcional
a la concentracin de azufre. Este detector ha demostrado ser especialmente
til en la deteccin de contaminantes como los mercaptanos. En el detector de
quimioluminiscencia del azufre el eluyente se mezcla con hidrgeno y aire y se
produce la combustin como en el detector de ionizacin de llama. Los gases
as obtenidos se mezclan con el ozono, y se mide la intensidad de emisin
resultante. El analizador de azufre utiliza un quemador dual para lograr la
combustin a alta temperatura de los compuestos que contienen azufre para
formar monxido de azufre (SO). Un tubo fotomultiplicador detecta la luz
producida por la reaccin de quimioluminiscencia del SO con el ozono. Esto
resulta en una respuesta lineal y equimolar sin interferencia de las matrices de
muestra.
El detector de quimioluminiscencia del azufre tambin se ha adaptado para la
cromatografa de fluidos supercrticos.
Por su parte el detector de quimioluminiscencia de nitrgeno, produce una
respuesta lineal y equimolar a los compuestos de nitrgeno. Esto se logra por
medio de un quemador de acero inoxidable que permite una alta temperatura

de combustin para pasar compuestos que contienen nitrgeno a xido ntrico

(NO). Un tubo fotomultiplicador detecta la luz producida por la reaccin
subsecuente de quimioluminiscencia del NO con el ozono.

Aplicaciones de la cromatografa gas-lquido

Para evaluar la importancia de la GLC, es necesario distinguir entre los dos
papeles que desempea la tcnica. El primero como herramienta para realizar
separaciones; en este sentido, resulta inmejorable cuando se aplica a muestras
orgnicas complejas, a organometlicos y a sistemas bioqumicos. El segundo,
una funcin claramente distinta, es el de proporcionar un medio para llevar a
cabo un anlisis. En este caso se emplean los tiempos o volmenes de
retencin para la identificacin cualitativa, mientras que las alturas de los picos
o sus reas dan informacin cuantitativa. Con fines cualitativos, la GLC es una
tcnica mucho ms limitada que otros mtodos. En consecuencia, una
tendencia importante en este campo ha consistido en la combinacin de las
notables cualidades para el fraccionamiento que tiene la GLC con las mejores
propiedades para la identificacin que tienen algunos instrumentos como los
espectrmetros de masas, infrarrojo y NMR

1. Anlisis cualitativo:
Los cromatogramas se utilizan a menudo como criterio de pureza de
compuestos orgnicos. Los contaminantes, si estn presentes, se manifiestan
por la aparicin de picos adicionales; las reas de estos picos proporcionan una
estimacin aproximada del grado de contaminacin. La tcnica tambin es til
para evaluar la efectividad de los procedimientos de purificacin.
En teora, los tiempos de retencin deberan servir para la identificacin de los
componentes de una mezcla. Sin embargo, la aplicabilidad de tales datos est
limitada por el nmero de variables que han de controlarse para obtener

resultados reproducibles. No obstante, la cromatografla de gases es un medio

excelente para confirmar la presencia o ausencia de un supuesto componente
en una mezcla, siempre que se disponga de un patrn. Tras la adicin del
compuesto conocido a la muestra, el cromatograma no debe presentar ningn
pico nuevo, y debe observarse el aumento de alguno de los picos existentes.
La prueba es particularmente convincente si el resultado se repite con
columnas diferentes y a distintas temperaturas.
1.1. Factores de selectividad
Si se elige una sustancia patrn B, entonces el factor de selectividad puede
proporcionar un ndice para la identificacin del compuesto A, el cual es en
gran parte independiente de las variables de la columna excepto la
temperatura; esto es, pueden obtenerse tablas numricas de factores de
selectividad para compuestos puros relativos a un estndar comn, y entonces
utilizarse para la caracterizacin de solutos.
Desafortunadamente, no es posible encontrar un patrn universal que permita
obtener factores de selectividad de una magnitud razonable para todos los
tipos de analitos. As, el conjunto de factores de selectividad disponibles
actualmente en la literatura es limitado.
1.2. ndice de retencin
El ndice de retencin I fue propuesto por primera vez por Kovats en 1958 como
un parmetro para identificar solutos a partir de los cromatogramas. El ndice
de retencin para un soluto dado puede deducirse del cromatograma de una
mezcla del soluto y de al menos dos alcanos normales (de cadena lineal) que
tengan unos tiempos de retencin tales, que el del soluto considerado quede
entre los mismos. Esto es, los alcanos normales son los patrones en los que se
basa la escala de ndices de retencin.
Por definicin, el ndice de retencin para un alcano normal es igual a 100
veces el nmero de carbonos del compuesto sin considerar el relleno de la
columna, la temperatura u otras condiciones cromatogrficas. El ndice de
retencin para todos aquellos compuestos que no sean alcanos normales vara,
a menudo varios cientos de unidades de ndice de retencin, con las variables
de la columna.
Es bien conocido que en una serie homloga al representar el logaritmo del
tiempo de retencin ajustado frente al nmero de tomos de carbono se
obtiene una grfica lineal. Los ndices de retencin de un compuesto se
deducen por interpolacin a partir de un cromatograma de una mezcla del
soluto de inters y dos o ms alcanos patrn.
Es importante subrayar que el ndice de retencin para un alcano normal es
independiente de la temperatura y del relleno de la columna. As, I para el
heptano, por definicin, siempre es 700. Por el contrario, los ndices de
retencin de los dems solutos con frecuencia pueden variar
considerablemente de una columna a otra. Por ejemplo, el ndice de retencin
del acenafteno en una fase estacionaria de polidimetilsiloxano polimerizado, a
140 C es 1460. Con 5% fenilpolidimetilsiloxano como fase estacionaria, a la
misma temperatura resulta ser 1500, mientras que con polietilenglicol como
fase estacionaria, el ndice de retencin es 2084.
El sistema de ndices de retencin tiene la ventaja de basarse en materiales de
referencia disponibles fcilmente que cubren un amplio intervalo de puntos de

ebullicin. Adems, la dependencia de los ndices de retencin con la

temperatura es relativamente pequea.
2. Anlisis cuantitativo
La seal del detector de una columna cromatogrfica gas-lquido se ha
utilizado generalmente para anlisis cuantitativos y semicuantitativos. En
condiciones cuidadosamente controladas se consigue una exactitud (relativa)
del 1 %. Como con la mayora de los instrumentos analticos, la fiabilidad se
relaciona directamente con el control de las variables; la exactitud tambin
depende en parte de la naturaleza de la muestra. La discusin general del
anlisis cuantitativo cromatogrfico, dada anteriormente, se aplica tanto a la
cromatografia de gases como a otros tipos; por esta razn no se hacen aqu
ms consideraciones sobre este aspecto.

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS

INSTRUMENTACIN PARA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de
tamao de partcula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la
moderna cromatografia de lquidos, se requieren presiones de algunos cientos
de kilos por centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas
presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro
que el que se utiliza en otros tipos de cromatografia. La Figura adjunta
muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo
de lquidos de alta resolucin tpico. Cada uno de los componentes se trata en
los prrafos que siguen a continuacin.

Fig.1-Esquema de un aparato de HPLC

1. Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento de los

disolventes
Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o ms recipientes de vidrio o
de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un
disolvente. Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar
los gases disueltos en general oxgeno y nitrgeno- que interfieren formando
burbujas en los sistemas de deteccin. Un desgasificador puede consistir en un
sistema de bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para
calentar y agitar los disolventes o, como se muestra en la Figura 1, sistemas de
difusin que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin
mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia
estos sistemas tambin contienen un dispositivo para la filtracin del polvo y
de las partculas slidas en suspensin de los disolventes. No es necesario que
los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de
HPLC como se muestra en la Figura 2. Por ejemplo, una forma conveniente de
tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en
filtrarlos mediante el vaco a travs de un filtro de poro muy pequeo. Este
tratamiento elimina los gases adems de la materia en suspensin.
Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se
denomina una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin
se aumenta notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se
utilizan dos (y a veces ms) disolventes con una polaridad significativamente
distinta. Una vez comienza la elucin, se vara la relacin de los disolventes de
forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de
etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo estn
equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde
dos o ms recipientes en una cmara de mezcla a una velocidad que vara
continuamente y la relacin de volumen de los disolventes se puede modificar
lineal o exponencialmente con el tiempo.
La Figura 2 ilustra la ventaja de una elucin con gradiente en la separacin de
una mezcla de clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elucin isocrtica

con metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elucin con gradiente,
que se inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando
la concentracin de metanol un 8%/min. Obsrvese que la elucin con
gradiente acorta notablemente el tiempo de separacin sin sacrificar la
resolucin de los primeros picos. Ntese tambin que la elucin con gradiente
produce unos efectos similares a los producidos por la programacin de
temperatura en cromatografa de gases.

2. Sistemas de bombeo
Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen:
(1) la generacin de presiones por encima de 400 kg/cm2, (2) un flujo libre de
pulsaciones, (3) un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min, (4) el control y
reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo y (5) componentes
resistentes a la corrosin (juntas de acero inoxidable o tefln). Debe subrayarse
que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un
riesgo de explosin, debido a que los lquidos no son muy compresibles. De
este modo, la rotura de un componente del sistema slo supone una prdida
de disolvente. Es evidente que esta prdida puede suponer un riesgo de
incendio.

Fig.2-Mejora de la eficiencia de la
separacin mediante la elucin con
gradiente.
Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero
inoxidable, relleno 1% Permaphase
ODS.
Muestra: 5 L de bencenos clorados en
isopropanol. Detector: fotmetro de
UV (254
nm). Condiciones: temperatura 60C,
presin 80 kg/cm2. (a) elucin con
gradiente: metanol 40% / agua 60% e
incremento de la proporcin de metanol
a una velocidad de un 8% / min (b)
Elucin isocrtica con metanol 50% /
agua 50%

2.1. Tipos de bombas

Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y
desventajas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y
bombas neumticas o de presin constante.
Las bombas recprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90% de los
sistemas de HPLC comercializados, consisten, por lo general, en una pequea
cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivn de un
pistn accionado por un motor. Dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y
cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia
afuera de un cilindro. Las bombas recprocas tienen la desventaja de que
producen un flujo con pulsaciones, las cuales se han de amortiguar dado que
su presencia se manifiesta como ruido en la lnea base en el cromatograma.
Entre las ventajas de las bombas recprocas se pueden citar su pequeo
volumen interno (35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima de
los 500 kg/cm2), su fcil adaptacin a la elucin con gradiente, y sus caudales
constantes, que son prcticamente independientes de la contrapresin de la
columna y de la viscosidad del disolvente.
2.2. Amortiguadores de pulsos

Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones de

flujo. Un mtodo sencillo de amortiguacin contiene un fuelle flexible o un gas
compresible en la porcin superior cerrada de un tubo en T para absorber parte
de la energa de pulsacin. Cuando la bomba se rellena esta energa se libera
para ayudar a suavizar la pulsacin de presin. Los amortiguadores
electrnicos de pulsos proporcionan una carrera hacia delante corta y rpida
del pistn, y enseguida la carrera rpida de recarga de la bomba. El pequeo
impulso hacia delante amortigua el pulso de flujo llevando disolvente a la
presin del sistema.
2.3. Control del caudal y sistemas de programacin
Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos
comerciales se equipan con dispositivos controlados por ordenador que
permiten medir el caudal mediante la determinacin de la cada de presin a
travs de un restrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier diferencia
entre la seal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la
velocidad del motor de la bomba.
Por otro lado, la mayor parte de los instrumentos pueden variar la composicin
del disolvente bien sea de una forma continua o bien de forma escalonada.
3. Sistemas de inyeccin de muestra
A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa
de lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la
columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que
acompaa a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se
emplean han de ser muy pequeos, de unas pocas dcimas de microlitro a tal
vez 500 L. Adems, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el
sistema.
En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la
introduccin de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra
en la Figura 3. Estos dispositivos estn normalmente integrados en el equipo
cromatogrfico y hay bucles intercambiables que permiten la eleccin de
tamaos de muestra desde 5 a 500 L. Con bucles de este tipo se puede
introducir la muestra a presiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisin
relativa de unas dcimas por ciento.

Tambin existen vlvulas de inyeccin de micromuestras, con bucles con

volmenes de 0,5 a 5 L.

Fig.3-Bucle de muestra para cromatografa de lquidos.

4. Columnas para cromatografa de lquidos
Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con
tubo de acero inoxidable de dimetro interno uniforme. Cientos de columnas
empaquetadas que difieren en tamao y relleno se comercializan por distintos
fabricantes y su coste oscila, por lo general, de 30 000 a 100 000 pesetas.
4.1. Columnas analticas
La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen una longitud
entre 5 y 30 cm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden alargar, si
es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las
columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los
rellenos ms comunes son 3, 5 y 10 m.
Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y
4.6 mm de dimetro interno, y empaquetada con partculas de 5 m. Estas
columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro.
Tambin, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms rpidas,
las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas
columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se
rellenan con partculas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm.
Estas columnas tienen hasta 100 000 platos/metro y presentan la ventaja de la
rapidez y del mnimo consumo de disolvente. La ltima propiedad es de
considerable importancia, puesto que los disolventes de alta pureza que se
requieren en cromatografa de lquidos son muy caros.
4.2. Precolumnas

En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca

delante una precolumna que elimina la materia en suspensin y los
contaminantes de los disolventes. Adems, en cromatografa lquido-lquido, la
precolumna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as
minimizar las prdidas de sta en la columna analtica. La composicin del
relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analtica; sin
embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor para minimizar la
cada de presin.
4.3. Termostatos
En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y
las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si
se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado
centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los
instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que
controlan la temperatura de la columna a las dcimas de grado, desde la
temperatura ambiente hasta 150 C. Para poder controlar con precisin la
temperatura, las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua
que provenga de un bao a temperatura constante.
4.4. Tipos de rellenos de la columna
En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos,
pelicular y de partcula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de
polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a 40
m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de
slice, almina o de una resina de intercambio inico. Para algunas aplicaciones
se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria
lquida que se mantiene fija por adsorcin. Las bolas tambin se pueden tratar
qumicamente para obtener una capa superficial orgnica. Por lo general, los
rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las
columnas analticas.
Los tpicos rellenos de partculas porosas de cromatografa de lquidos estn
formados por micropartculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la
menor dispersin posible para un tamao determinado. Las partculas son de
slice, almina o resinas de intercambio inico, aunque la slice es el material
ms comn. Las partculas de slice se sintetizan aglomerando partculas de

slice de tamaos inferiores al micrn en unas condiciones tales que se forman

partculas mayores con dimetros muy uniformes.
Las partculas que resultan se recubren muchas veces con pelculas orgnicas,
que se unen qumica o fsicamente a la superficie.
5. Detectores
A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografa de lquidos no
hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores
de ionizacin de llama y de conductividad trmica. Uno de los mayores retos en
el desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el perfeccionamiento de
los detectores.
Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las
propiedades listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la
excepcin de que un detector para cromatografa de lquidos no es necesario
que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Adems, un
detector de HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el
ensanchamiento de banda.
Los detectores en cromatografia de lquidos son de dos tipos bsicos. Los
detectores basados en una propiedad de la disolucin responden a una
propiedad de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante
dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por
contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a
alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o
intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil. En la Tabla adjunta
se indican los detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas de sus
propiedades ms importantes. Un informe de 1982 sobre 365 trabajos
publicados en los que tena un papel importante la cromatografia de lquidos,
revel que el 71 % se utilizaban en la deteccin de la absorcin UV, el 15% la
fluorescencia, el 5,4% el ndice de refraccin, el 4,3% empleaba medidas
electroqumicas y el 4,3% restante otras medidas.
5.1. Detectores de absorbancia
La Figura 4 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la
medida de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica. A
fin de minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de

estas cubetas ha de ser lo menor posible, de modo que los volmenes se

limitan por lo comn de 1 a 10 L y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm.
La utilizacin de cubetas de este tipo est restringida a presiones no mayores
de unos 50 kg/cm2.

Cara
ctersticas de los detectores de HPLC

Figura 4-Celda de detector ultravioleta en HPLC

Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que

uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que

reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se

utilizan detectores fotoelctricos contrastados. Tambin se utilizan
instrumentos de un solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del
disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan
para el clculo de la absorbancia.

Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros. Los detectores

de absorcin UV

ms simples son los fotmetros de filtros con una lmpara de mercurio como
fuente. Lo ms comn en estos casos es aislar la lnea intensa a 254 nm por
medio de filtros; en algunos equipos tambin se pueden utilizar las lneas a
250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este tipo de
detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a
alguna de estas longitudes de onda.
Algunos grupos funcionales orgnicos y diversas especies inorgnicas exhiben
una banda ancha de absorcin a una o ms de esas longitudes de onda.

Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores. La

mayora de los

fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que consisten en un

espectrofotmetro de barrido con ptica de red. Algunos se limitan a la
radiacin ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiacin ultravioleta y la
visible. Se pueden elegir varios modos operacionales. Por ejemplo, se puede
obtener el cromatograma completo a una sola longitud de onda o
alternativamente, cuando los picos que eluyen estn suficientemente

separados, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico. En este
caso, debe emplearse el control por ordenador para elegir la mejor longitud de
onda en cada caso. Cuando se desean los espectros completos con fines de
identificacin, se puede parar el flujo del eluyente durante un tiempo suficiente
que permita el barrido de la regin de longitud de onda que interesa.
Los detectores espectrofotomtricos de ultravioleta ms potentes son los
instrumentos de series de diodos. Algunos fabricantes ofrecen este tipo de
instrumentos, que permiten recoger los datos de un espectro completo en
aproximadamente un segundo. De esta forma, los datos espectrales para cada
pico cromatogrfico se pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo
de la columna. Una de las formas de presentacin de los datos espectrales, que
resulta til para la identificacin de las especies y para elegir las condiciones
de la determinacin cuantitativa, consiste en un grfico tridimensional tal como
el que se muestra en la Figura 6. En este caso, los espectros se obtuvieron a
intervalos de cinco segundos. La aparicin y desaparicin de cada uno de los
esteroides en el efluente de la columna resulta evidente.

Figura 5-Espectros de absorcin del efluente de una columna de HPLC tomados

a intervalos de 5 s para una mezcla de tres esteroides.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo. Comercialmente se

ofrecen dos tipos de

detectores de infrarrojo. El primero con barrido de longitud de onda que

proporcionan tres segmentos de filtro semicirculares. El segundo, mucho ms
sofisticado, es un tipo de detector infrarrojo que se basa en los instrumentos de
transformada de Fourier.

Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiacin

ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o
de fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los
volmenes de 1.5 a 10 L. Los instrumentos de infrarrojo ms sencillos pueden
trabajar a una o ms longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener
los espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elucin. Los
instrumentos con transformada de Fourier se utilizan de manera anloga a los
instrumentos de series de diodos para las medidas de absorbancia ultravioleta
que se han descrito en la seccin anterior.
Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a
la baja transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo,
las bandas anchas de absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden
prcticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones.
5.2. Detectores de fluorescencia
Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseo a los
fluormetros y espectrofluormetros. En la mayora de ellos, la fluorescencia se
detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente
respecto al haz de excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente
de excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin
fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de fluorescencia
probablemente se basarn en el uso de fuentes de lser sintonizables, las
cuales permiten una mayor sensibilidad y selectividad.
Una ventaja inherente a los mtodos de fluorescencia es su alta sensibilidad,
que resulta ser ms de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de
absorbancia.
En cromatografa de lquidos se ha aprovechado esta ventaja para la
separacin y determinacin de los componentes fluorescentes de las muestras.
5.3. Detectores de ndice de refraccin
Estos detectores miden la diferencia de ndice de refraccin, entre el disolvente
que en su camino hacia la columna pasa a travs de una mitad de la cubeta y
el efluente de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos
estn separados por una placa de vidrio montada a un ngulo de modo que si

las dos disoluciones difieren en el ndice de refraccin se produce una

desviacin de un haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto
a la superficie fotosensible del detector provoca una variacin de la seal de
salida, la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma.
Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a
casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los
detectores de llama en cromatografia de gases. Adems, son fiables y no
dependen del caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de
temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas
pocas milsimas de grado centgrado. Por otra parte, no son tan sensibles
como la mayora de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar
en la elucin con gradiente.

5.4. Detector de dispersin de luz

Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la
HPLC, el detector de dispersin de luz (ELSD). En este detector, el efluente de
la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla
mediante un flujo de nitrgeno o aire. Las finas gotitas se llevan a travs de un
tubo de conduccin a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporacin
de la fase mvil, lo que origina unas finas partculas de analito. La nube de
partculas de analito pasa a travs de un haz lser. Mediante un fotodiodo de
silicio se detecta la radiacin dispersada perpendicularmente al flujo.

Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta

resulta ser aproximadamente la misma para todos los solutos no voltiles.
Adems es notablemente ms sensible que el detector de ndice de refraccin.

5.5. Detectores electroqumicos

Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de
detectores electroqumicos. Estos dispositivos se basan en cuatro mtodos
electroanalticos que incluyen la amperometra, la voltamperometra, la
coulombimetra y la conductimetra.