INTERACCIONES ANTIGENOANTICUERPO, ENSAYOS INMUNES

Y SISTEMAS EXPERIMENTALES

INTRODUCCIN
La utilizacin de la reaccin in vitro entre
antgenos y anticuerpos sricos (serologa)
sirve de base para muchos ensayos
inmunes.
Debido a la notable especificidad de la
respuesta inmune, la interaccin entre
antgeno y anticuerpo in vitro se utiliza
ampliamente con propsitos diagnsticos,
para la deteccin bien sea de antgenos o
de anticuerpos. Ejemplo serotipificacin de
diversos microorganismos utilizando
antisueros especficos.

 La interaccin de antgenos
multivalentes con anticuerpos con al
menos sitios de combinacin por
molcula, que generan ligamiento
cruzado (ver Figura), puede resultar
en:
- precipitacin (si el antgeno es
soluble)
- aglutinacin (si el antgeno es
particulado)

Se utilizan otros ensayos inmunes en

la evaluacin y el estudio de los
componentes celulares del sistema
inmune, como son:
- mtodos de rutina para medir la
funcin linfocitaria (mtodos para
medir la inmunocompetencia humoral
y de clulas T).
- sistemas de cultivo celular
- tcnicas de ADN recombinante

1. Interacciones Primarias Entre

Antgeno y Anticuerpo
Las fuerzas de unin entre un anticuerpo
y un eptope son por enlaces nocovalentes y por tanto relativamente
dbiles. Involucran fuerzas de van der
Waals, electrostticas e hidrofbicas.
Los complejos antgeno-anticuerpo se
pueden disociar fcilmente por:
- Cambio de pH
- Concentraciones salinas altas
- iones caotrpicos (cianatos que interfieren con
los puentes de hidrgeno de las molculas de
agua)

1.1 Constante de Asociacin, Afinidad y Avidez

Es una medida de afinidad de un anticuerpo
monovalente por un eptope del antgeno o
un hapteno.
La afinidad de unin de un anticuerpo anti-A
con un antgeno multivalente A puede ser
varias veces mayor que la afinidad con un
antgeno univalente A (ver Figura).
La asociacin entre un antgeno y
anticuerpos depende de:
- la afinidad de cada eptope y su anticuerpo
correspondiente
- la suma de las afinidades de todos los eptopes
involucrados.

 El termino avidez se utiliza para

denotar la energa de unin
promedio entre anticuerpos y un
antgeno multivalente.
En general, anticuerpos IgM tienen
mayor avidez que anticuerpos IgG,
aunque la unin de cada Fab en el
anticuerpo IgM puede tener la misma
afinidad que el Fab de un IgG.

2. Interacciones Secundarias entre

Antgeno y Anticuerpo
2.1 Reacciones de Aglutinacin
La reaccin de un anticuerpo con un
antgeno multivalente que es
particulado (ejemplo, una partcula
insoluble) resulta en el ligamiento
cruzado de varias partculas antgenos
por los anticuerpos. El ligamiento
cruzado resulta eventualmente en la
aglutinacin de los antgenos por los
anticuerpos.

Aglutinacin

2.1.1 Ttulo.
El ensayo de aglutinacin.
- es un mtodo que algunas veces se utiliza
para medir el nivel de un anticuerpo srico
especifico para un antgeno particulado.
- El ttulo aglutinante de un suero determinado
es una expresin semicuantitativa de los
anticuerpos presentes en el suero.
- se realiza mezclando diluciones sricas con
una concentracin fija de antgeno. Diluciones
altas no causan aglutinacin del antgeno. La
dilucin ms alta de un suero que alcanza
aglutinacin visible del antgeno se denomina
ttulo.

 Tubos con altas concentraciones de

suero que no causan aglutinacin
representan una prozona. Por qu
no aglutina? por exceso de
anticuerpos, cada eptope de una
partcula se une nicamente a una
sola molcula de anticuerpo, por lo
que se previene el ligamiento
cruzado entre diferentes partculas.
Debido al fenmeno de prozona es
imperativo que el antisuero se

2.1.2 Potencial Zeta.

Ciertos antgenos partculados pueden poseer
una carga elctrica, ejemplo, carga neta
negativa de eritrocitos debido al cido silico.
Partculas cargadas suspendidas en solucin
salina generan un potencial elctrico llamado
potencial zeta, que impide estn muy cerca la
una de la otra.
Debido al potencial zeta, anticuerpos con brazos
Fab cortos (IgG) puede que no aglutinen
antgenos, mientras que anticuerpos como IgM
con Fab ms largos y pentavalentes si lo pueden
hacer.
Cmo aglutinar antgenos de eritrocitos con
anticuerpos IgG?

2.1.3 El Test de Coombs

El termino denota, la deteccin usando antiinmunoglobulinas, de cualquier Ig unida a un
antgeno
- Emplea anticuerpos contra inmunoglobulinas
(por eso tambin se llama el test antiinmunoglobulina).
- Se basa en dos hechos importantes:
i) inmunoglobulinas de una especie son
inmunognicas cuando se inyectan en otra especie
ii) muchas de las anti-inmunoglobulinas (ejemplo,
IgG de conejo anti-humano) se unen a la porcin Fc
del anticuerpo, dejando libre las porciones Fab para
que reaccionen con el antgeno.

 Cuando se utiliza por ejemplo, IgG

humano contra antgenos de eritrocitos
exhibiendo potencial zeta no hay
aglutinacin, pero al adicionar IgG de
conejo contra IgG humano ste se une a
Fc y puede hacer ligamiento cruzado de
IgG humanos sobre eritrocitos
relativamente distantes (ver Figura).
Incluso la adicin de anti-inmunoglobulina
puede causar aglutinacin en caso de
concentracin alta de anticuerpos
dirigidos contra eritrocitos (fenmeno de
prozona).

Hay dos versiones del Test de Coombs.

1. Test directo.
Detecta anticuerpos unidos.
- se adicionan anti-inmunoglbulinas a las
partculas (ejemplo, eritrocitos) que se
sospecha tienen anticuerpos unidos a
antgenos sobre sus superficies.
- Ejemplo: recin nacido con sospecha de
enfermedad hemoltica. Si el Test de Coombs
utilizando una suspensin con eritrocitos de
un beb aglutina significa que presenta la
enfermedad.

2. Test indirecto.
Detecta anticuerpos en suero.
- se utiliza para detectar la presencia, en el
suero, de anticuerpos especficos contra
antgenos particulados.
- anticuerpos sricos si se adicionan a
partculas puede que no las aglutinen debido al
potencial zeta. La adicin subsiguiente de antiIg causar aglutinacin.
- Ejemplo: deteccin de anticuerpos IgG antiRh en la sangre de mujeres Rh-negativas.

2.1.4 Aglutinacin Pasiva.

Si el antgeno es un constituyente
natural de una partcula, la reaccin
de aglutinacin se conoce como
aglutinacin directa.
Si la reaccin de aglutinacin ocurre
entre anticuerpos y antgenos
solubles que se han adherido a una
partcula insoluble, se conoce como
aglutinacin pasiva.

 La reaccin de aglutinacin (directa o

pasiva, sin o con el Test de Coombs) se
utiliza ampliamente en clnica.
Ejemplos:
- tipificacin de eritrocitos en bancos de sangre
- diagnstico de diversas enfermedades
hemolticas mediadas inmunolgicamente
(anemia auto-hemoltica inducida por droga)
- tests para el factor reumatoide (IgM humana
contra IgG humana)
- test confirmatorio para sfilis
- test ltex de embarazo (deteccin de HCG en
la orina de una mujer embarazada)

ENSAYOS DE
AGLUTINACIN
Hemaglutinacin
de Isoantgenos
En la tipificacin sangunea, los anticuerpos
se adicionan a clulas sanguneas rojas
dando una reaccin positiva cuando se
amontonan las clulas o "hemaglutinacin".
Los reactivos se preparan en una solucin
coloreada para observar ms facilmente los
agregados RBC. De la misma manera, en un
suero de paciente, se le puede probar al
anticuerpo, la capacidad de generar
hemaglutinacin de RBCs debido a la
presencia del anticuerpo que reconoce
isoantgenos que no estn presentes en los

- Personas con el tipo de

sangre A tienen
anticuerpos anti-B;
-Personas con el tipo de
sangre B tienen
anticuerpos anti-A;
- Personas con el tipo de
sangre O tienen
anticuerpos anti-A y antiB;
- Personas con el tipo de
sangre AB no tienen
anticuerpos que
reconozcan ningn
isoantgeno. Por tanto, la
prueba es un mtodo
rpido para determinar si

 Prueba de Aglutinacin en Ltex

El test de aglutinacin en ltex es uno
de los diversos tipos de aglutinacin
por anticuerpos que detectan
antgenos en una muestra utilizando
anticuerpos unidos a una cama u otro
material visible.
Detecta la presencia de antgenos
bacterianos que estn presentes como
reactivos en el sistema, unidos a la
superficie de camas azules de ltex.
Una reaccin positiva causa la
agrupacin de las camas. Las camas
agrupadas se pueden ver a simple

2.2 Reacciones de Precipitacin

2.2.1 Reacciones en soluciones.
Ocurren cuando se mezclan anticuerpos
y antgenos solubles.
La precipitacin de complejos antgenoanticuerpo ocurre debido a que
anticuerpos divalentes cruzan
ligadamente antgenos multivalentes
formando un enrejado, que cuando
alcanza un determinado tamao precipita
(reaccin de precipitina).

Precipitacin
Una reaccin de precipitacin ocurre
como resultado de la combinacin de
anticuerpos en solucin con sustancias
solubles con las que los anticuerpos
reaccionan.
Si ocurre in vivo una reaccin de
precipitacin en las articulaciones o en el
rin, ocasiona inflamacin debido a que
los complejos inmunes en esas reas son
filtrados hacia afuera causando
irritacin.

Precipitacin
(continuacin)

En un test de precipitina srica, se

combinan las diluciones del antgeno el
anticuerpo en solucin acuosa hasta que
ocurre una reaccin de precipitacion y
particulas visibles se acumulan.
Con un nefelometro se puede medir la
cantidad de "flocculation, midiendo las
propiedades de dispersin de la luz de
particulas en agregacin. La prueba "Gold
Standard" para la sfilis tiene como base
una reaccin inmunolgica de floculacin.

Precipitacin en Solucin
Es dificil de lograr la Zona de
Equivalencia precisa donde hay una
concentracin perfecta tanto de
antgeno como de anticuerpo en
solucin.
Se requeriran preparar muchos tubos
con diversas concentraciones de
anticuerpos y antgenos para lograr
justo la cantidad apropiada.
nicamente despus de la
centrifugacin el anillo delgado se hace
ms visible.

 En la prctica, las reacciones de

precipitacin se preparan
generalmente, como reacciones de
difusin en agar, para hacer ms
visible el precipitado.

Inmunodifusin en Geles de Agar

Se utiliza un gel de agarosa como matrix para
combinar difusin con precipitacin. Los
reactivos difunden a travs del gel resultando
en precipitacin cuando se alcanzan los
puntos de equivalencia.
Un solo antgeno puede dar lugar a una sola
lnea de precipitacin en la presencia de su
anticuerpo homlogo. Cuando hay dos
antgenos presentes en un sistema, cada uno
se comporta independientemente. Por lo
tanto, si se detectan varias bandas de
precipitacin, equivalen al menos a un
nmero igual de combinaciones antgenoanticuerpo.

 Los anticuerpos sricos no son homogneos(uno

tiene anticuerpos que reconocen todo tipo de
organismos infecciosos y de alergnos).
Es dificil obtener un solo antgeno aun en las
preparaciones ms puras, de modo que hay
diversas reacciones posibles antgenoanticuerpo en una sola mezcla.
La difusin en gel permite examinar dichos
sistemas mltiples debido a que la tcnica
permite la separacin de las reacciones.
Como los componentes individuales en un
sistema reaccionan independientemente, los
tests de precipitacin en agar se denominan
"inmunodifusin doble " o simplemente
inmunodifusin (anteriormente se denominaba
de Ouchterlon).

 El color blanco espeso de la matrix slida

de agar permite visualizar la reaccin de
precipitacin. El mtodo se utiliza
clinicamente en inmunologa/reumatologa.
Esta tcnica tiene diversas y diferentes
aplicaciones; ejemplos incluyen:
- Determinacin de la homogeneidad de
sistemas antgeno-anticuerpo.
- Diagnosticar enfermedades autoinmunes
especificas.
- Despus de la purificacin de una mezcla
de antgenos.
- Elucidar las reacciones entre antgenos
relacionados serolgicamente.

La precipitacin aparece
como una lnea continua
en la forma de un
ngulo entre los dos
pozos y el pozo 3.
Esta banda sin ninguna
proyeccin en el angulo
se denomina banda de
identidad.

Si se coloca en el pozo 1
una solucin con antgenos
X y Y, en el pozo 2 una
solucin con solo antgeno
X, y en el pozo 3 antisuero
con anticuerpos especificos
tanto para X como para Y,
se observa una reaccin
similar a la de la Fig.
Note que hay una
proyeccin de reaccin
hacia el pozo XY, lo que
indica que estn
relacionados los dos
materiales antignicos de
los pozos 1 y 2, pero que el
material en el pozo 1 posee

Si el material en los
pozos 1 y 2 no poseen
antgenos en comn y el
antisuero en el pozo 3
posee especificidades
para ambos materiales,
la reaccin aparece
como dos lneas que se
cruzan.

Inmunoelectroforesis (IEP)
La (IEP) es un procedimiento que combina la
separacin de antgenos por electroforesis de
zona con la difusion de anticuerpos
precipitantes en angulos rectos hacia la
direccin de la migracin del antgeno.
La extensin de la migracin de cualquier
protena depende del buffer de electroforesis,
tiempo, voltaje, y punto isoelctrico de la
protena. En especial, el pH determina la
separacin de una protena de otra.
La diferencia neta entre el punto isoelctrico de
una determinada protena y el pH del buffer de
electroforesis determina la extensin de la
migracin hacia el catodo o el anodo.

 Este mtodo inmunolgico se utiliza para

detectar anormalidades en protenas
sricas especificas y para identificar
inmunoglobulinas especificas utilizando
reactivos anticuerpos anti-humanos.
Los reactivos anticuerpos anti-humanos se
han preparado contra fracciones
purificadas de globulinas humanas y se
obtienen comercialmente para propsitos
de investigacin o biomdicos.

WESTERN BLOT

RADIOINMUNOENSAYO

ELISA

CLASIFICADOR
DE CELULAS
ACTIVADO POR
FLUORESCENCIA

Anticuerpos Monoclonales

Mtodo de Inmunofluorescencia
Su propsito es detectar la localizacin y la
abundancia relativa de cualquier protena
para la cual se tiene un anticuerpo.
Utilizando anticuerpos para la protena, puede
conocer donde esa protena se localiza.
Por ejemplo, si va a utilizar anticuerpos para
la bomba calcio ATPasa, que se localiza en el
reticulo endoplasmtico de la clula debe
tener presente:
- que el anticuerpo utilizado reconoce la calcio
ATPasa de gallina.
- la inmunofluorescencia se puede utilizar
para cualquier protena.

 La clave para ste mtodo es la habilidad

para visualizar el anticuerpo cuando se
mira a travs de un microscopio.
Como los anticuerpos son ms pequeos
que las calcio ATPasas, el anticuerpo no se
puede ver directamente.
Por lo que se usa un marcador
fluorescente unido covalentemente al
anticuerpo.
Cuando una luz ilumina el marcador
fluorecente, este absorve la luz y emite
una luz de color diferente que es visible
para el investigador y se puede fotografiar.

Figure. Illustration of the direct and indirect methods for

immunofluorescence.

Figura. In most
immunofluorescence
experiments, two antibodies are
employed.
The first one, called the primary
antibody, is typically generated
in a mouse and binds to your
favorite protein, which in this case
is the chicken calcium ATPase
(shown as a series undulating
striped line that zigzags through
the ER membrane 10 times).
The secondary antibody was
purchased from a company that
sells antibodies that bind to
mouse antibodies and have a
fluorescent dye covalently
attached to it. As illustrated here,
the secondary antibodies can bind
to multiple sites on the primary
antibody and thus produce a
brighter signal since more dyes

Figura.
This immunofluorescence
micrograph shows the ER
being labeled with a
monoclonal antibody
against the chicken calcium
ATPase.
This chicken cell was fixed,
permeablilized, and
processed for
immunofluorescence.
White indicates the location
of the fluorescent antibody
and thus the calcium ATPase
to which the antibody was

Immunofluorescence image of
the eukaryotic cytoskeleton.
Actin filaments are shown in red,
microtubules in green, and the

Immunofluorescence - Axons of
the Drosophila CNS antibody
[BP102] (ab12455)

RATONES TRANSGNICOS
Genes responsible for
particular traits or disease
susceptibility are chosen and
extracted. Next they are
injected into fertilized mouse
eggs. Embryos are implanted
in the uterus of a surrogate
mother. The selected genes
will be expressed by some of
the offspring.
Since the first gene transfers
into mice were successfully
executed in 1980, transgenic
mice have allowed researchers
to observe experimentally
what happens to an entire
organism during the

The image shows transgenic mice

that carry the piggyBac transposon
that has caused their cells to
express red fluorescent protein.
(Credit: Howard Hughes Medical
Institute (HHMI), Yale University).

Transgenic mouse lines

expressing GFP, known as "green
mice." FEBS Lett, 407, 313-9
(1997)

RATONES
KNOCKO
UT

N2KO mice created by the PI in

1997, that contain a targeted
deletion of the Nhlh2
transcription factor (Good et al,
1997).
These animals develop an adult
onset overweight phenotype,
characterized by increased body
weight and body fat after 7
(females) to 12 (males) weeks
of age.
Weight gain is not due to
increased food intake but due,
rather, to failure to partake in
high levels of physical activity.
Thus, failure to exercise leads to
adult-onset obesity in N2KO
mice (Coyle et al., 2002).
This problem extends directly to
humans, as being overweight is
a worldwide problem that