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Autores:

Quijano
Juliana,Quijano Parra
Glvez Ivn

Vargas
Alfonso,

Mnica
Melndez

Ttulo de la ponencia: Calidad del aire de


Cucuta-Colombia
:cuantificacion
de
Hidrocarburos Aromaticos Policiclcicos

Escuela o facultad :Departamento de Qumica.


Facultad de Ciencias Bsicas. Universidad de
Pamplona
rea temtica: Qumica Atmosfrica
Palabras claves: Benzo(a)pyrene, PM 2.5, Test de
Ames, ensayo cometa, actividad mutagnica y
genotxica.
Resumen
Las exposiciones prolongadas a la contaminacin
del aire por el material particulado-fraccin
respirable PM 2.5, se han asociado con la
mortalidad atribuible a enfermedad isqumica del
corazn, arritmias, insuficiencia cardaca, y paro
cardiaco. Los hidrocarburos aromticos policclicos
(HAPs) son uno de los contaminantes prioritarios
del aire debido a sus propiedades extremadamente
peligrosas para la salud humana. Muchos de los
HAPs son citotxicos y mutagnicos. Para
determinar la actividad mutagnica de las muestras
del aire de Pamplona se sigui el test de Ames,
usando las cepas TA 100 y TA-98 de Salmonella
typhimurium. Se utiliz el ensayo Cometa para
determinar el dao genotxico.
La extraccin de la materia orgnica presente en las
muestras del aire de Pamplona (PM2.5)se realiz
por ultrasonido, utilizando como solvente el
Diclorometano. En este trabajo nosotros reportamos
la identificacin de un grupo de HAPs determinados
por Cromatografa de Gases/FID en el aire de
Pamplona, Colombia; los HAPs encontrados fueron
los siguientes: Benzo(a)pireno, Benzo(c) fluoreno,
Benzo(b)fluoranteno, Criseno, Benzo(k)fluoranteno,
clasificados como carcinognicos y probablemente
carcinognicos para humanos. Es necesario sealar
que el Benzo(a)pireno es considerado carcingeno
en humanos segn la Agencia Internacional de
Investigacin del Cncer (IARC). La actividad
mutagenica y genotoxica inducida por el material
particulado (PM2.5) de Pamplona la podemos
atribuir a las emisiones de los motores disel,

debido a que esta ciudad es recorrida por una va


nacional, la cual presenta un alto flujo de vehculos
de carga que funcionan a base de este combustible.
Palabras clave: Benzo(a)pyrene, PM2.5, Test de
Ames, ensayo cometa, actividad mutagnica y
genotxica.
Mutagenic
and
genotoxic
on
air
Pamplona-Colombia
by
polycyclic
aromatic hydrocarbons and metals
Abstract
Prolonged exposure to air pollution by particulate
matter (respirable fraction PM 2.5), have been
associated with mortality attributable to ischemic
heart disease, arrhythmias, heart failure, and
cardiac arrest. Polycyclic aromatic hydrocarbons
(PAHs) are among the priority pollutants in the air,
due to the properties extremely dangerous for
human health. Many PAHs are cytotoxic and
mutagenic.
Mutagenic and genotoxic activity from Pamplona air
samples was determined by the Ames test and the
comet assay. To determine the mutagenic activity
from Pamplona air samples we use the Ames test
with Salmonella typhimurium strains TA 100 and TA98. Comet assay was used to determine the
genotoxic damage.
In this paper we report the identification of a group
of PAHs determined by gas chromatography / FID
from Pamplona-Colombia air; PAHs found are:
Benzo (a) pyrene, Benzo (c) fluorene, Benzo (b)
fluoranthene, Chrysene, Benzo (k) fluoranthene,
classified as carcinogenic and probably carcinogenic
to humans. Mutagenic and genotoxic activity
induced by particulate matter (PM) in Pamplona can
be attributed to emissions from diesel engines,
because this city is crossed by a national route,
which has a high flow of freight vehicles operating
based on this fuel.
Keywords: Benzo (a) pyrene, PM2.5, Ames test,
comet assay, mutagenic and genotoxic activity

Introduccin. La contaminacin del aire por

material particulado (PM) se considera un serio


problema ambiental debido a la presencia en la
atmsfera de materiales peligrosos tales como
metales traza txicos [1]. Se ha demostrado
que los metales asociados con PM aumentan
las lesiones cardiopulmonares en los seres
humanos [2]
.Estudios epidemiolgicos
relacionados con los efectos en la salud de la
contaminacin ambiental del aire sugieren que
esta puede ser la responsable del aumento de
la tasa de cncer de pulmn [3]-[5]
Los estudios epidemiolgicos han informado las
asociaciones entre los problemas de salud,
especialmente enfermedades respiratorias y la
exposicin a partculas finas y ultrafinas (PM10 y
PM2.5). Las partculas de la fraccin respirable
(PM10 y PM2.5) tienen la capacidad de penetrar y
depositarse en las regiones traqueo-bronquial y
alveolar del tracto respiratorio [6].En cuanto a
los efectos sobre la salud humana, el material
particulado (PM) fraccin respirable es el de
mayor preocupacin, ya que a largo plazo la
exposicin al PM se ha asociado con una
mayor incidencia de enfermedades pulmonares,
cardiovasculares y cncer [7],[8].
En las reas urbanas los metales pesados
provienen de las emisiones vehiculares y
actividades
industriales[9].
Diferentes
Hidrocarburos aromticos y metales son
considerados como probables o posibles
carcingenos humanos por la Agencia
Internacional de Investigacin del Cncer [10].
Los metales pesados manifiestan los efectos
citotxicos en las clulas de varios tejidos, y la
regulacin estricta de los metales es esencial
para la salud de los organismos [11].La
identificacin y cuantificacin de la exposicin
humana a estos compuestos mutagnicos y
genotoxicos es imprescindible en la evaluacin
de los riesgos de la salud pblica. Las
partculas
PM10
y
PM2.5
muestran
mutagenicidad directa e indirecta
y los
hidrocarburos aromticos policclicos (HAPs)
son considerados como las principales causas
de accin indirecta de mutagenicidad, mientras

que
los
hidrocarburos
aromticos
nitropoliciclicos(NPAHs)
son
considerados
como las causas principales de la accin
directa
de
la
mutagenicidad
[12].La
mutagenicidad de las partculas emitidas por los
tubos del escape de motores diesel (DEP) ha
sido ampliamente estudiada [13]-[15] y se ha
demostrado su actividad mutagenica directa
[16].Partculas del escape de motores diesel
(DEP) causan una grave contaminacin del aire
urbano [12] y pertenecen a la clase de
partculas del tamao de las vas respiratorias,
lo cual ha sido implicado como responsable de
aumento de la mortalidad diaria y las tasas de
morbilidad en condiciones ambientales de la
exposicin [6].Los estudios de mutgenos en el
aire proporcionan algunas evidencias sobre el
origen de estos. Debido a que un nmero de los
estudios se produjo en sitios urbanos, varios
investigadores indican que las fuentes mviles
(automviles, camiones, etc), contribuyen
significativamente al nivel de mutgenos en el
aire[13],[17].
Aparte de su carcinogenicidad, los HAPs
pueden ejercer sus efectos negativos sobre el
organismo humano por la induccin de estrs
oxidativo.Estos compuestos tienen la capacidad
para entrar en ciclos redox, aumentar la
formacin de especies reactivas del oxgeno
(ROS) y por lo tanto, causar estrs oxidativo. El
efecto del PM en los organismos depende de
su composicin qumica: un mayor contenido
de HAPs aumenta la genotoxicidad del PM,
resultando en la formacin preferencial de
aductos HAP-ADN [18]
En el aire de Colombia, no existe informacin
en
general
sobre
los
niveles
de
mutagenicidad /genotoxicidad y su relacin con
los metales
pesados e hidrocarburos
Aromticos Poli cclicos (HAPs).En el presente
estudio las partculas en suspensin (PM2.5) y
los compuestos voltiles se recogieron en un
equipo Partisol 2025 Plus durante el periodo
comprendido entre Enero- Julio 2011 cerca de
una va muy transitada en Pamplona-Norte de
Santander por vehculos que funcionan con

diesel y gasolina. Estas muestras se analizaron


para la deteccin de Hidrocarburos Aromticos
Poli cclicos (HAPs) por Cromatografa de
gases/FID,
los
metales
pesados
se
determinaron por Absorcin Atmica
y se
realizaron bioensayos para determinar su
actividad gen txica y muta gnica; las
actividades muta gnicas y gen txicas
asociadas con el aire ambiente de PamplonaColombia, se evaluaron utilizando dos
bioensayos: el tes de Ames usando cepas de
Salmonella typhimurium TA 98 y TA100 y el
ensayo cometa.
Metodologa.

EL monitoreo del PM2.5 se realiz con un equipo


Partisol- Plus Model 2025-Air sampler.
U.S.EPA. Reference designated PM2.5 Method
RFPS 0498-118 in accordance with 40CFR Part
53 de la Ruprecht-Patashnick. Se realiz el
monitoreo de la fraccin respirable PM 2.5 en
Pamplona-Norte de Santander. Las muestras
ambientales obtenidas en muestreos de 24
horas, con una frecuencia de tres das se
realizaron durante el perodo comprendido
entre Enero-Julio del 2011.El monitoreo de PM
2.5 se realiz en una va que presenta un alto
flujo vehicular, particularmente de trfico
pesado que utiliza como combustible el Diesel
ya que ste sector es paso obligado del
transporte vehicular que une a Colombia con
Venezuela, generando un mayor riesgo en la
salud
humana
por
la
exposicin
a
contaminantes, en especial en la poblacin ms
vulnerable. Otra particularidad que tiene
Pamplona es que no tiene industrias
contaminantes y la nica fuente de
contaminacin atmosfrica son los vehculos
que circulan por esta ciudad. Por consiguiente
el anlisis fisicoqumico de los filtros nos dar
una idea de la magnitud de la contaminacin
ambiental producida nicamente por la
combustin vehicular.
Anlisis de metales.
Para la deteccin de los metales presentes en
el
PM2.5 se
utiliz
un
equipo
de
Espectrofotometra de Absorcin Atmica (EAA)

Perkim Elmer Analyst 300. Para realizar la


curva de calibracin se usaron patrones
Analticos de Merck.
Para la extraccin y el anlisis de los elementos
metlicos recolectados en la localidad de
Pamplona (Norte de Santander), se utiliz el
mtodo (EPA IO-3.2, 1999), que establece una
digestin del 10% del rea del filtro.
Extraccin de la Materia Orgnica de los
filtros de PM2.5
La materia orgnica de los filtros de PM 2.5
(HAPs) se extrae por ultrasonido [19], en un
bao ultrasnico (Branson 1510, modelo
1510R-MT); se utiliza diclorometano como
solvente de extraccin. Una vez obtenido el
extracto orgnico, se lo concentra en un
evaporador rotatorio de vaco , marca Heidolph
modelo Laborota 400-1, a una temperatura de
30C a 150 rpm; hasta aproximadamente 10 ml.
Posteriormente el extracto se transfiri a dos
viales cada uno de 5ml. El extracto global se
utiliza para la determinacin de Hidrocarburos
Aromticos
Poli
cclicos
(HAPs)
por
Cromatografa de Gases y el otro para los
ensayos muta gnicos.
Las muestras de HAPs se secaron con Na 2SO4,
con el fin de eliminar el agua residual y preparar
la muestra para el anlisis cromatogrfico. Se
guardaron en frasco mbar, mantenindolas
refrigeradas a 4 C.
Deteccin de Hidrocarburos Aromticos Poli
cclicos (HAPs)
Para identificar los Hidrocarburos Aromticos
Poli cclicos (HAPs) presentes en el PM 2.5 de
Pamplona
se
utiliz
un
equipo
de
Cromatografa de Gases marca Agilent
Technologies 6890A Plus Series II HewletPackard Plus con detector FID (Flame
Ionization Detector). La columna utilizada es
Agilent DB-EUPAH 20m de longitud, 0.18mm
de dimetro, 0.25m de dimetro interno(5%
phenyl
methylpolysiloxane).
Para
la
identificacin de los HAPs se utiliz el patrn de
16 hidrocarburos de Restek (catalogo # 31841
EPA Method 8310 PAH Mixture). La
identificacin cualitativa de los HAPs presentes

en el extracto global se realiz de acuerdo a


las siguientes condiciones: detector FID a
320C Mezcla (mL/min): Aire 400 H 2 30 N2
45. Se inyect 1 l, modo splitless a 320 oC.
Temperatura inicial 45C por 0.8 min y se
incrementa de la siguiente manera: 45C/min
hasta 200C, 2,50C/min hasta 225C, 3C/min
hasta 266C, 5C/min hasta 300C, 10C/min
hasta 320C durante 4,50min.Tiempo de
anlisis por muestra 41.21 min. Gas de arrastre
Helio, flujo 20 mL/min. Temperatura del inyector
250 C.
Test de Ames
Uno de los mtodos para determinar la
actividad mutagnica de la materia orgnica
proveniente del PM 2.5 es el test bacteriano
desarrollado por Ames [20] que utiliza cepas
mutadas de Salmonella tuphimurium, las cuales
no sintetizan la histidina, por lo tanto, son
incapaces de formar colonias en agar sin este
aminocido. Las mutantes se reconocen,
porque revierten esta caracterstica cuando se
les pone en contacto con un mutgeno. Las
variedades ms populares utilizadas en las
investigaciones mutagenicas son las cepas TA
98 y TA 100
Ensayo Cometa. El ensayo cometa es una
tcnica altamente sensible para evaluar el dao
y la reparacin del ADN en cualquier tipo de
clula eucariota. Este, en su versin alcalina,
permite detectar roturas de simple cadena y
sitios sensibles al lcali que se originan durante
la reparacin dando lugar a la formacin de la
cola del cometa[21].
Resultados y Discusion
Los metales hallados en el aire de Pamplona
son: Fe ,Pb, Zn,K,Ni, Mn y Cr. Es de anotar que
en el municipio de Pamplona la principal fuente
de contaminacin atmosfrica es el trfico
vehicular, porque en este municipio no existe
ningn tipo de industria, lo que nos permite
inferir que los metales pesados encontrados en
el aire de Pamplona son emitidos bsicamente
por la combustin vehicular, estos resultados
concuerdan con estudios realizados por otros
autores [22]-[25]. Como se puede observar en

la Tabla 1, se detect actividad mutagnica


directa en las cepas TA-98 y TA-100, esta
actividad supera ms de dos veces el control
negativo, lo que nos indica la presencia de
compuestos mutagnicos. Esta mutagenicidad
la podemos atribuir al Pb, dado que ha sido
asociado con varios efectos, incluyendo
carcinogenicidad,
mutagenicidad
y
teratogenicidad [26]. De igual manera
compuestos de Pb han sido enumerados como
posibles carcingenos humanos sobre la base
de datos de roedores [27]. Como se observa en
la tabla 2, las muestras de aire analizadas
muestran un alto potencial genotxico, cuando
se evalu en el ensayo Cometa. Este resultado
nos indica que existe un riesgo en la poblacin
expuesta, teniendo en cuenta que existe una
correlacin entre el incremento del dao en el
ADN y cncer en humanos [28].Parte de la
actividad mutagnica tambin la podemos
atribuir al Cr y el Ni, los cuales son conocidos
metales cancergenos [21],[22],[26]. Los
metales pesados causan estres oxidativo y
pueden asociarse con formacin de tumores en
clulas mamarias [13]. El perfil cromatogrfico
del extracto global de los compuestos orgnicos
presentes en el PM2.5 de la ciudad de Pamplona
muestra la existencia de los siguientes
hidrocarburos aromticos poli cclicos (HAPs) :
Benzo(
c)
fluoreno,
Criseno
(2B),
Benzo(b)fluoranteno (2B), Benzo(k)fluoranteno
(2B),Benzo(a)Pireno(1).
Es de anotar que
estos HPAs provienen exclusivamente de la
combustin de las fuentes mviles que circulan
con diesel y gasolina.Estos hallazgos nos
indican que parte de la mutagenicidad y
genotoxicidad mostrada por el aire de
Pamplona, es ocasionada por los
HAPS
encontrados, dado que existe suficiente
evidencia que correlaciona la presencia de
estos compuestos y el riesgo para la salud
humana. Por ejemplo, el Benzo (a) pireno est
clasificado segn la EPA [29] en el grupo 1
como carcingeno para humanos; ,el Criseno,el
Benzo (b) fluoranteno y el Benzo (k) fluoranteno

se clasifican en el grupo (2B ) como


posiblemente carcinognicos para humanos.
Conclusin
El aire de Pamplona muestra genotoxicidad y
mutagenicidad, la cual probablemente se debe
a los HAPs Benzo (a) Pireno,Criseno, Benzo(b)
fluoranteno,Criseno, Benzo(k)fluoranteno as
como a los metales Cr, Ni, Pb,esta
genotoxicidad est relacionada con las
emisiones de los motores Diesel que circulan
por la ciudad.
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Tabla 1. Actividad mutagnica en cepa TA-98 y
TA-100 de Salmonella tiphymurium , de
muestras de aire provenientes del municipio de
Pamplona Norte de Santander Colombia .
Dosis (g)
50
100
150
Control
negativo
Control
positivo

Nmero de revertantes
TA-98
TA-100
191 10
299 17
222 12
322 20
237 21
385 13
22 4
90 5
437 14

567 24

Cada valor corresponde al promedio de tres


experimentos independientes. Como control
negativo se uso DMSO 12% y como control
positivo se us 4-NQO. Se considera respuesta
positiva si las revertantes del tratamiento
superan mas de dos veces las revertantes del
control negativo.
Tabla 2. Dao del ADN en linfocitos de sangre
perifrica humana inducida por material
particulado fraccin respirable PM2.5 de
Pamplona Norte de Santander Colombia.
Dosis
Promedio de la longitud de
(m)
cola en m DS
50
108 17
100
154 20
150
162 22
Control
164 21
positivo
Control
41 11
negativo
Se analizaron un total de 200 clulas en cada
uno de los ensayos. Como control positivo se
us el perxido de hidrogeno y como control
negativo se utiliz dimetil sulfoxido que fue el
solvente usado para disolver las muestras.

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