a
Capitulo 3
f
Tecnologia del DNA
recombinante y gendémica
‘Tras completar este capitulo
deberias ser capaz de:
1 Definir lo que es la tecnologia det
DNA recombinante y explicar cémo
se utiliza para clonar y manipular
genes.
Comparar y contrastar distintos
tipos de vectores; describir sus
caracteristicas précticas y sus
aplicaciones en biologia molecular.
1B Comprender cémo se construyen,
las bibliotecas de DNA y cémo se
rastrea para clonar un gen de
interés.
1 Deseribir edmo se pueden utilizar
la electroforesis en gel de agarosa,
‘el mapeo con enzimas de
restriccién y la secuenciacién det
DNA para estudiar la estructura de
los genes.
1B €xplicar las técnicas comunes
utilizadas para estudiar la
expresién génica.
star familiarizado con la
ribointerferencia o el RNA de
{nterferencia (RNAi) como una
nueva técnica muy poderosa para
silenciar la expresién génica.
entender las potenciales
consecuencias cientfficas y médicas
del Proyecto del Genoma Humano y
azonar sobre sus aspectos éticos,
legales y sociales.
Definir la genémica y la
bioinformatica y explicar por qué
estas disciplinas son grandes areas
del conocimiento en répido
desarrollo.
Estudiantes de grado de biologfa trabajando en un experimento sobre DNA
recombinante.
87 58
Como hemos visto en el Capitulo 1, la biotecnologfa noves
una ciencia nueva. Elhombre ha realizado précticas de me-
jora de cultivos y del ganado desde hace mucho tiempo y
hhemos utlizado microbios para crear alimentos y bebidas
mediante la fermentacién desde hace siglos. Sin embargo,
la moderna era de la biotecnologla comenzé cuando se des-
azrollaron las técnicas de clonacién del DNA. Empezando
en la década de los setenta del siglo x« y continuando du-
rante las tres décadas siguientes las técnicas de laboratotio
sobre tecnologia de DNA recombinante e ingenieria
genética, sorprendentes y de répido desarrollo, han cam-
‘biado para siempre la biologia molecular, a ciencia basi
ya investigacion médica. En este capitulo se presenta una
visién general de la historia de la manipulacién genética y
se tratan los descubrimientos principales de la tecnologia
del DNA recombinante que han revolucionado muchas
reas de la Gencia y de la medicina, Posteriormente se re~
visa la sorprendente variedad de técnicas modernas a dis-
‘posicién de los cientificos para la clonacién de genes y para
elestudio de la estructura y funcién de los genes. Fl capi-
tulo termina con una introduccién a la bioinformética, un
‘campo relativamente muevo con mucho potencial.
3-1 Introduccién a la tecnologia’
del DNA recombinante
ya lactlonacién del DNA
Cuando los centificos James Watson y Francs Cide descu-
brieron que la estructura del DNA es una moléculaformada
por una doble hélice, se dieron cuenta de la importancia po-
tencialy del impacto de este descubrimiento. Sin embargo,
ni siquiera estos dos ganadores del Premio Nobel podrian
haber imaginado el espectacular ritmo al que la biologi
‘molecular iba a avanzar durante el siguiente medio sgl.
Como se ha explicado en el Capitulo 2, en Jos afios
anteriores y posteriores al deseubrimiento de Watson y
Crick otros muchos cientificos contibuyeron a nuestra
moderna comprensién del DNA como el material gené-
tico de las células vivas. Un grupo de investigadores es-
tui In estructura del DNA y su replicacién en bacterias,
yen bacteridfagos. Los bacteritagos, a menudo sim-
plemente denominados fagos, son virus que infectan las
células bacterianas. Gran parte de lo que conocemos
sobre la replicacién del DNA y sobre las enzimas que sin-
tetizan DNA st ha aprendico mediante el estudio de las,
bacteras ls fagos. Por ejemplo una enzima clave en la
replicacién del DNA se denomina DNA ligasa. Recuér-
dese del Capitulo 2 que la ligasa une fragmentos adya~
centes de DNA (fregmentos de Okazaki) durante Ia
replicacién del DNA. La DNA ligasa es una enzima im.
portante en la tecnologia del DNA recombinante.
Bacterias como la Escherichia col, que estan presentes
dle manera natural en os intestines de los animales, incu-
yendo a los humanos, han desemperiado tn papel impor
tante como organismos modelo para los estudios de
genética y biologia molecular. E. coli sigue siendo un orga-
Capitule 3 Tecnologia del ONA recombinante y genémica
nismo favorito para muchos experimentos de laboratorio
de biotecnologia. Las importantes funciones de ls bacterias|
y de los virus en biotecnologia y las aplicaciones de la bio-
tecnologia microbiana se tratan con més detalle en el Ca-
pital 5.
A finales de la década de los sesenta, muchos centifi-
cos estaban interesados en la clonacién de genes y espe-
cularon que serfa posible clonar DNA cortando y pegando
DNA de diferentes origenes (Ia tecnologia del DNA re-
combinante). En cuanto comiences a saber més sobre
biotecnologia, te parecer que clonacin de genes, tecnolo-
‘gla del DNA recombinant e ingenierta genética describen el
‘mismo proceso, En realidad, estas téenicas son metodo-
logfas ligeramente diferentes que estén interrelacionadas.
Como verds en este capitulo, la tecnologia del DNA re-
combinante se utiliza normalmente para hacer posible la
clonacién de genes, mientras que la ingenieria genética a
menudo se basa en la tecnologia del DNA recombinante
yen la donacién de genes para modificar el genoma de
un organismo. Sin embargo, los términos tecnologia del
DNA recombinante¢ ingenieria genttica se wtilizan frecuen-
temente como sinénimos. La palabra clon deriva de un
término griego que hace referencia a un corte (a un es-
queje) que se utiliza para propagar o copiar una planta
Una definicién biolégica moderna de un clon es una mo-
lécula, célula u organismo que ha sido producido a par-
tir de otra entidad tinica, Las téenicas de laboratorio ne~
cesarias para la clonacién de genes que se describen en
este capitulo son distintas de las t€cnicas utilizadas para
clonar organismos completos como la oveja Dolly. La clo-
nacién de organismos se trata en el Capitulo 7.
Enzimas de restriccién y plasmidos
© vectores de DNA
‘A.comienzos de los setenta la clonacién de genes se con-
‘virié en una realidad. Muchos descubrimientos casi si-
multéneos y esfuerzos cooperativos entre muchos invest
gadores condujeron al descubrimiento de dos componentes
esenciales que hicieron posibles las técnicas de clonacién
de genes y del DNA recombinante: las enzimas de res-
triceién y el plasmido de DNA. Las enzimas de restric-
cin son enzimas cortadoras de DNA y el plésmido de DNA
es una forma circular de DNA autorreplicante que los cien-
tificos pueden manipular para transportar y clonar otros
ttozos de DNA.
‘Los microbidlogos de la década de los sesenta descu-
brieron que algunas bacterias eran resistentes a los bac-
teriéfagos porque podian limitar la replicaciOn de los
fagos. El cientifico suizo Werner Arber propuso que el
crecimiento limitado de los fagos se producia porque.al-
{gunas bacterias contenfan enzimas que podfan cortar cl
DNA de los virus en trozos pequefios, evitando asf la re-
plicacién viral. Debido a esta capacidad se denominé a
estas enzimas enzimas de resricién, Las bacterias no tie-
nen sistemas inmunitarios para eludir a los fagos, sino
que las enzimas de restriccién proporcionan un tipo de
mecanisto de proteccién para algunas bacterias. ga. Introduceién ala tecnologia del DNA recombinante yalaclonaciéndelDNA 59
En 1970, trabajando con bacterias Haemophilus influer
zae, el investigador Hamilton Smith, de la Universidad
Johns Hopkins, aisl6 Hindlll, la primera enzima de restric-
‘cin que pudo ser bien descrita y utilizada para la clonacién
del DNA. Las enzimas de restriccién se denominan tam-
bién endonucleasas de restriccién (endo = «dentro de», nu-
cleasa = eenzima cortadora de dcido nucleico») ya que cor-
tan dentro de las secuencias de DNA en oposicién a las
cenzimas que cortan a partir de los extremos de las secuen~
das de DNA (exonudeasas). Smith demostré que HindD se
podria wilizar para cortar o digerir DNA-en fragmentos me-
nores. En 1978 Smith compartid el premio Nobel con Wer-
ner Arber y Danie] Nathans por sus descubrimientos sobre
Jas enzimas de restricci6n y sus aplicaciones.
as enzimas de restricci6n se encuentran sobre todo en
Jas bacterias y se les da nombres abreviados basados en los
nombres del género y especie de las bacterias a partir de las
‘que se aislan. Por ejemplo, una de las primeras enzimas
de restriccién en seraislada, BcoRI, se denomina asi porque
se descubri6 en una cadena de £. coli llamada RY13. Las
cenzimas de restriccién cortan el DNA rompiendo el enlace
fosfodiéster (en el eje azticar fosfato) que une los nucle6-
tidos adyacentes en una cadena de DNA. Sin embargo,
las enzimas de restriccién no cortan el DNA al azar, ni
todas las enzimas de restricci6n cortan el DNA en los mis-
‘mos sitios. Como las demés enzimas, las enzimas de res-
triccién muestran ser espectiicas de determinados sustra~
tos. Para estas enzimas, el sustrato es el DNA. Como se
muestra en la Figura 3.1a, las enzimas de restriccién se
unen al DNA, reconocen y cortan (digieren) en secuen-
cias especificas de bases denominadas secuencias de re-
conocimiento o posicién de restriceién.
‘Alas enzimas de restriccién se las conoce normal-
mente como cortadoras de cuatro 0 de seis pares de
bases porque reconocen tipicamente posiciones con una
is
Secuencia de
ONAno ance
‘metiado seconoarier
se la EcoR
a
a
secuencia de cuatro 0 seis nucleétidos. También se han.
identificado cortadoras de ocho pares de bases. Estas se~
cuencias de reconocimiento son palindromos: la dis-
posicién de los nucleétidos se lee del mismo modo hacia
delante y hacia atrés de las hebras opuestas de una mo-
Iécula de DNA. (Recuerda la palabra «reconocer» 0 la
frase edabale arroz a la zorra el abad» como ejemplos
de palindromos.) Algunas enzimas de restriccién como
la EcoRI cortan el DNA para construir fragmentos de
‘DNA con extremos sobresalientes de una sola hebra de-
nominados extremos cohesivos 0 «pegajosos» (ver Fi-
‘gura 3.1); otras enzimas construyen fragmentos con ex-
tremos no sobresalientes de doble hélice denominados
extremos romos. La Tabla 3.1 muestra algunas enzimas
de restriccién comunes, sus microorganismos de origen y
sus secuencias de reconocimiento. Ten en cuenta que las.
tes primeras enzimas de la tabla son cortadoras de seis,
pares de bases que producen moléculas de DNA con ex-
tremos cohesivos. La cuarta enzima (Taql) es una corta~
dora de cuatro pares de bases que produce extremos co-
hesivos, y las tres titimas enzimas producen fragmentos
de DNA con extremos romos. Las enzimas que producen.
extremos cohesivos a menudo se prefieren a las cortado-
ras de extremos romos en muchos experimentos de clo-
nacién porque los fragmentos de DNA con extremos co-
hhesivos se pueden unir mas fécilmente entre si. El DNA
de cualquier fuente, como bacterias, humanos, perros,
‘gatos, ranas, dinosaurios 0 antiguos restos humanos se
puede digerir por una enzima de restriccién particular
siempre que el DNA tenga una posicién de restriccién
para esa enzima, Ten esto en cuenta conforme lees las pa
‘ginas siguientes. En el sentido més simple, el descubri-
mento de las enzimas de restriccién dot6 a los bidlogos
moleculares de las «tijeras» necesarias para realizar la
clonacién de genes.
{
ti
DNA no
rmatlado
es
EcoRI no cortard ol
Ht, ONAmetlado
ry ie
DNA mettado
Figura 3.2 Secuencia de reconoctiiento de la enzima de restricciény accién dea enzima (3) 2
igestiin del ONA por EcoRI produce fragientos de ONA con extemosexhesivos. (b) La metilacn de la secvencta de
‘eeanociniento po a enaina ER metilasabloque el corte Gel ONA por parte de Eco 60 Capitulo 3. Tecnologia del DNA recombinante y genémica
‘Tabla 3.1 ENZIMAS DE RESTRICCTON COMUNES
Microorganismo Enzima Secuencia de reconocimiento
fuente
Crean exramos cohesives
Homophius ot
itenzae
schavcnis oR
or
acs amit
anyoiqvescins
Thermus Taal
aguabeus
‘Crean extremes romos
‘artabacter au 5
(eave
Haemaphius Hoot
asgyptcus
‘Serata Smal
2
eae
Ea
A comienzos de la década de los setenta, Paul Berg,
Herbert Boyer, Stanley Cohen, y sus colegas de la Uni-
versidad Stanford cambiaron la biologfa molecular para
siempre al hacer uso de la clonacién de genes. Berg ini-
, OQ
P5
Figura 2.3 Clonacién de un gon on un ptésmido con solocctén azul-blanea.
nologia del DNA recombinante, se puede producir un gran
abanico de valiosas protefnas a partir de genes clonados
que, de otro modo, seria muy diffcil obtener.
Los genes humanos se pueden clonar en plésmidos de
DNA y replicarlos en bacterias utilizando la tecnologia del
DNA recombinante. Fl primer producto genético humano
de esta tecnologia disponible comercialmente fue la insu-
Jina humana, una hormona peptfica producida por cé
Judas del pancreas llamadas células beta. Cuando suben los
niveles de glucosa en sangre, por ejemplo, tras haber i
gerido una comida rica en azicares, la insulina baja el
nivel de ghucosa en sangre estimulando el almacenamiento
de glucosa en el higado y en las células musculares en
{forma de largas cadenas de glucosa llamnadas glucégeno. Las personas con diabetes mellitus de tipo I, 0 insu-
lino-dependiente (DMID) no producen insulina por s
rismas. Como zesultado de esta carencia de insulina, los
Giabéticos experimentan niveles de azticar en sangre ex-
cesivamente altos (hiperglucemia) que, con el tiempo,
pueden ocasionar dafios graves en muchos érganos del
cuerpo. En 1977, se cloné insulina en un plasmid bac-
teriano, expresado en células bacterianas, y los cienificos
de Genentech, una empresa de biotecnologfa de San
Francisco, California, creada en 1976 por Herbert Boyer
y Robert Swanson, aslaron esta insulina, En el Capitulo
5 examinaremos los detalles de las técnicas utlizadas
para clonar insulina. Se suele considerar que Genentech,
abreviatura de tecnologia de ingenieria genética es la pri-
mera empresa de biotecnologia.
En 1982, la forma recombinant ¢e insulina humana,
llamada Humulina, se convirti6 en el primer producto
de DNA recombinante aprobado por la Administracién
de Alimentos y Férmacos (U.S. Food and Drug Adminis-
tration) para aplicaciones humanas. Poco después de que
Ja insulina se pusiera a disposicidn, se cloné la hormona
de crecimiento (utiizada para tratar nfios que sufren de
una variedad de enanismo) y, debido a la tecnologfa del
DNA recombinante, una gran variedad de otras protef-
znas de importancia médica que en su dia habian sido di-
ficles de obtener en cantidades adecuadas, se pudieron
poner a disposicign.
‘Antes de la tecnologia del DNA recombinante, hor-
‘monas importantes como la insulina y la hormona de
crecimiento se tuvieron que aislar de los tejidos. La hor-
‘mona de crecimiento se aisl6 de las glindulas pituitarias
de los cadaveres humanos. Bste proceso no slo era caro
¢ ineficaz, sino que estos aislamientos también conlleva-
ban el riesgo de contaminar con virus desconocidos y
otros patSgenos a las personas que recibfan la hormona.
‘Ahora hay varios cfentos de productos de tecnologia de
DNA recombinante en el mercado con muchas aplica-
ciones en investigacién bésica, medicina y agriculture
‘Con una comprensin basica de las téenicas implica-
das en Ja manipulacién de un trozo de DNA, en Ia si-
guiente seccién continuaremos examinando algunos as-
pecios importantes de los vectores de DNA y cémo se
eligen y utlizan los diferentes vectores dependiendo de lo
que se desee conseguir.
2 zQué necesita tener un vector
para ser bueno?
BI niimero de vectores de DNA diferentes, funciones de
vectores y aplicaciones ha aumentado sustancialmente
desde que Stanley Cohen construy6 pSC101. Los plés-
midos’siguen siendo los vectores de clonacién més utili-
zadlos. Son populares porque permiten la clonacién y ma-
nipulacién rutinaria de trozos pequefios de DNA que
forman la base de muchas técnicas utilizadas a dic
un laboratorio de biologia molecular. Ademas, es bastante
3.2 iQuénecesita tener un vector para ser bueno? «65
sencillo transformer células bacterianas con DNA plasm
dico y relativamente sencillo aislar DNA plasnidico de cé-
lulas bacterianas. Uno de los primeros vectores de DNA
plasmidico, denominado pBR322, se diseii6 para tener
‘genes de resistencia a la ampicilina y ala tetraciclina y va-
rios sitios de restricci6n stiles. Sin embargo, se ha traba~
Jado en la ingenierfa de los vectores de clonacién del DNA
plasmidico a lo largo de los afios para que incorporen
otras caracterfsticas importantes que han hecho que el
pBR322 en la actualidad sea practicamente obsoleto.
Caracteristicas practicas de los vectores
de clonacién del DNA
Los modernos vectores de clonacién del DNA plasmidico
suelen incinir la mayorfa de las siguientes caracteristicas
deseables y précticas.
1 Tamario: deberian ser lo suficientemente pequeiios
como para que se puedan separar fécilmente del
DNA cromosémico de la bacteria hospedadora,
B Origen de ta replicacién (ori): es el sitio de replicacién,
del DNA que permite a los plésmidos replicarse de
forma separada del cromosoma de la célula
hospedadora. El ntimero de plasmidos que hay en
una célula se denomina miimero de copias. El
intimero normal de copias de plasmidos en la
‘mayoria de las células bacterianas es pequerio (suele
ser menos de 12 plésmidos por célula); sin embargo,
‘muchos de los plésmidos de clonacién mas deseables
se conocen como plésmidos de alto mimero de
copias porque se replican para crear cientos de miles
4e copias de plésmidos por célula
Sito de clonacin mitiple (MCS): el MCS, también
llamado polylinker, es un fragmento de DNA con
secuencias de reconocimiento para muchas enzimas
de restricci6n comunes diferentes (ver Figura 33a).
Estos sitios se crean en el plésmido de modo que la
digestion del plasmido por las enzimas de restriccién,
no da como resiltado la pérdida de un fragmento de
DNA. Mas bien, lo que ocurre es que el plésmido
circular sencillamente se vuelve lineal cuando Io
digiere una enzima de restricci6n. Un MCS (0
polylinker) aporta gran flexiblidad a los fragmentos
de DNA que pueden ser clonados en un plésmido
porque es posible insertar fragmentos de DNA
generados por los cortes con muchas enzimas
diferentes
Genes marcadores que se puedan selecionar: estos genes
permiten la seleccién e identificacién de bacterias
transformadas mediante un plésmtido recombinante
en comparacién con las células no transforinadas.
Algunos de los marcadores mas comunes que se
pueden seleccionar son genes de resistencia a la
ampicilina (amp") y a la tetraciclina (tet) y el gen
lez wiilizado para la seleccin azul-blanca
1B Seauencias del promotor de RNA polimerasa: se wtilican
estas secuencias para la transcripcién del RNA int vivo 66 Capitulo Tecnologia del ONA recombinante y genémica
fn vitro por la RNA polimerasa, Recuerda del
Capftulo 2 que la RNA polimerasa copia el DNA en.
RNA durante la transcripcin. fn vivo, estas
secuencias permiten a las células bacterianas fabricar
RNA a partir de genes clonados, lo que a su vez
causa la sintesis de proteinas. El RNA transcito in
vitro puede ser utilizado para sintetizar wsondas» de
RNA que pueden servir para estudiar la expresién
sgénica, como se describe en la Secci6n 3.4
© Secuencia de cebadores (primers u oligomucleétides) para
1a seeuenciacién del DNA: estos cebadores permiten la
secuenciacién de nucle6tidos de fragmentos de DNA
clonado (como se describe en la Seccién 3.4) que
hayan sido insertados en el plésmido.
Tipos de vectores
Igual que un destorntllador no puéde utilizarse para todos
los tipos y tamafios de tornillos, vectores como los plésmni-
dos bacterianos no pueden ser utilizados para todas las
aplicaciones en biotecnologia. Hay limitaciones a cSmo se
pueden utilizar los plismidos en la clonacién. Una primera
limitacién es el tamafio del fragmento de DNA que se
puede insertar en un plésmido. El tamafio de los insertos
no suele poder exceder de, aproximadamente, 6 a7 kilo-
bases (1 kb = 1,000 pb). Adernés, a veces las bacterias ex-
presan mal las proteinas de los genes de eucariotas. Como
resultado de estas limitaciones, los bi6logos moleculares
hhan trabajado para desarrollar muchos otros tipos de vec-
tores de DNA, cada uno con sus beneficios particulares de-
pendiendo de la aplicaci6n de clonacién. La Tabla 3.2 com-
para las caracteristicas importantes, las fuentes y las
aplicaciones de diversos tipos de vectores de clonacién.
Vectores bacteriéfagos
EI DNA del bacteri6fago lambda (2) fue uno de los pri-
eros vectores fagicos wilizados en la clonacién. EI cro-
‘mosoma 2.5 una estructura lineal de aproximadamente
49 kb de tamafio (Figura 3.4). EI DNA clonado se inserta
en los sitios de restriccién en el centro del cromosoma 2.
Después, los cromosomas recombinantes se empaquetan
en particulas virales in vitro, y se utilizan estos fagos para
infectar B. coli creciendo como tun césped (una capa con
timua que cubre la placa). A cada extremo del cromosoma
2X hay secuencias de 12 nucledtidos llamadas sitios o ex:
tremos cohesivos (COS) que pueden emparejar sus bases
‘unos con otros. Cuando 2 infecta a B. cli como hospeda-
dora, el cromosoma 2 utiliza estos sitios 0 extremos COS
para circularizarse y después replicarse. Bl bacteri6fago %
se replica mediante un proceso conocido como cielo If
tico. A medida que 2 se replica para crear més particulas
viricas, las células de E. coli infectadas se lisan (Isis signi-
‘Tabla 3.2 COMPARATIVA DE VECTORES DNA Y SUS APLICACIONES
Tipo de vector Mimo tamafio
de insercién (kb)
Aplicaciones
Vectores plismidos ~6-12 Clonaci6n de ONA, expresion de
bacterianos protefnas, subclonacién, secuenciacién
(circulares) directa del inserto
DNA. DNA.
Vectores 25 DNA complementario (cDNA), bibliotecas
bacterl6fagas ‘genémicas y bibliotecas de expresién
Gineates)
osmida (circular) ~35 Bibliotecas gen6micas y bibliotecas de
‘DNA, clonacion de grandes fragmentos
e DNA
Cromosoma atificial ~300 Bibliotecas gen6micas, clonacin de
bacteriano (BAC, ‘grandes fragmentos de DNA
circular)
‘Cromosoma artificial 200-2.000 Bibliotecas gendmicas,clonacién de
de levaduras
(VAC, circular)
Vector Ti (circular) Varia dependiendo det
tipo de vector Th
utiizado
srandes fragments de DNA
Transferencia de genes en plantas
Limitactones
Tamafio de insercién restrngido, expresion
limitada de protefnas, problemas con el
rndmero de copias, repicacion rstringida
a las bacterias
Limitaciones al empaquetamiento del DNA
por su tamafo de insercin; problemas de
replicacin del hospedador
Restricciones de empaquetamiento det
ago; no es ideal para la expresion de las
protefnas; no se puede replicar en las
‘células de los mamiferos
Replicacion restringida alas bacterias;
no se puede utilizar para la
‘expresion de las proteinas
Debe crecer en levatura; no se puede
utilizar en bacteria +
Limitado a su uso solo en cétulas
vegetales; nGmero de sitios de
restricc6n distribuido ateatoriamente;
el gran tamafio del vector difcutta su
‘manipulacién 32 .Quénecesita tener un vector paraser bueno? «67
ee ort pec
:
ne Pose eee C aa
‘ow Jeon
eee a
{Smahos drenies
Ca ‘ 7 Seueaate
[ SR, ° ED oooh
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‘para la replicacién pero son!| s—)
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muchos logos) recombinant
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‘nos zon
erazojaierto Gragereso 1 ie
DA godin Erpaqustians del ONA
‘ete | eee erase oh
| zt dts de. colpr pectin ded
pata conar el DNA
sana 8)
©
‘ied
éapod co
bacleras
tra 3x4 Clonactén en bacteriéfago lambda (a) Se conan fagmentos de DUA foro en el
Cromosoma hy despots 3 wempaguetan en particule Wales que se utlizan para infectar Eco como cisped
nla placa a Uss de ebuas bactarianas por Vitus cea placas ene césped de E cal. (b) Microfotografa,
‘lectrénie de transmsi6n de un fago 2 pagado ala superficie de E. col.
fica ruptura) gracias a, creando zonas de bacterias muer-
tas lamadas placas que aparecen como manchas més cla-
ras en el césped bacteriano. Cada placa contiene millones
de particulas de fago recombinante. En la Secci6n 3.3, dis-
ccutimos cémo se ven las placas para identificar el DNA re-
combinante. Una ventaja primordial de estos vectores es
que permiten la clonaci6n de fragmentos mnés grandes de
DNA (de hasta aproximadamente 25 kb) que los plésmi-
dos. Muchos vectores bacteridfagos también se pueden
utilizar como vectores de expresi6n de protefnas.
Vectores césmidos
Los vectores césmidos contienen extremos COS de
DNA 2, un origen plasmidico de replicacién y genes de
resistencia antibigtica, pero la mayoria de los genes vira-
les se han elimminado. Se clona DNA en un sitio de res~
triccién y el cdsmido se empaqueta en particulas virales,
como ocuurre con los vectores bacteridfagos que se utili-
zan pata infectar B. coli, en donde los c6smidos se repli-
can como plésmido con bajo ntimero de copias.
as colonias bacterianas se forman en una placa y las,
recombinantes se pueden ver mediante seleccién anti-
bidtica. Una de las principales ventajas de los csmidos
es que permiten la clonacién de fragmentos de DNA en.
€1 rango de los 20 a los 45 kb.
Vectores de expresién.
‘Los vectores de expresi6n de protefnas permiten la sin-
tesis de alto nivel (expresidn) de las proteinas eucariotas
dentro de las células bacterianas porque contienen una
secuencia promotora procariota adyacente al sitio en el
que se inserta el DNA en el plésmido. La RNA polime-
tasa bacteriana puede unirse al promotor y sintetizar
grandes cantidades de RNA (para el inserto), que después
se traducen en proteina. Después, la protefna puede ser
aislada utlizando las técnicas bioquimicas descritas en el
Capftulo 4. Sin embargo, no siempre es posible expresar
una protefna funcional en las bacterias. Por ejemplo, los,
ribosomas bacterianos a veces no pueden traducir las se-
cuencias de mRNA eucariota. Si se produce una pro- 68 —_Capitule.g Tecnologia del DNA recombinante y genémica
teina, puede ocurrir que no se doble ni sea procesada co:
rrectamente, como ocurte en las células eucariotas que
utilizan organelos para doblar y modificar protefnas.
‘También, hacer productos recombinantes en las bacterias,
puede convertirse en un problema porque £. coli a me-
nudo no secreta protefnas, de modo que los vectores de
expresién se utilizan con frecuencia en Bacillus subtilis,
tuna cepa més adecuada para la secreci6n de proteinas.
En algunos casos, las bacterias hospedadoras pueden
reconocer las proteinas recombinantes como foréneas y
degradar la protefna, mientras que en otras la proteina
cexpresada es letal para las células bacterianas hospeda-
doras. Ciertos virus, como S¥40, pueden ser utilizados
para transportar los vectores de expresidn en las células
de los mamiferos. Normalmente, los vectores derivados
de SV40 contienen una fuerte secuencia promotora
(viral) para transcripciones de alto nivel y una sefial de
poliadenilacién para afiadir una cola de poliadenilacién al,
extremo 3 de los mRNA sintetizados. Se han utilizado
variaciones de vectores asi en terapia génica humana
como se describe en el Capitulo 11.
Cromosomas artificiales bacterianos
Los eromosomas artificiales bacterianos (BAC) son
grandes plésmidas de bajo nimero de copias, presentes
como de una a dos copias en células bacterianas que con-
tlenen genes que codifican el factor F (un conjunto de genes
{que controla la replicacién bacteriana). Los BAC pueden,
aceptar insertos de DNA de entre los 100 a los 300 kb. Ain.
no est muy claro por qué los BAC pueden aceptar y repli-
car grandes fragmentos de DNA. Los BAC fueron muy uti-
lizados en el Proyecto del Genoma Humano para clonar y
secuenciar grandes fragmentos de cromosomas humanos.
Cromosomas artificiales de levaduras
Los cromosomas artificiales de levaduras (VAC) son
ppequefios plésmidos que han crecido en B, cll y han sido
introductdos en eélulas de levadura (como Saccharomyces
cerevisiae). Un YAC es una versiOn en miniatura de un cro-
‘mosoma cucariota. Los YAC contienen un origen de re-
plicacién, marcadores de selecei6n, dos tel6meros y un
‘centrémezo que permiten la replicacin del YAG y la se-
sgregacion en células hijas durante la divisién celular. Los
fragmentos de DNA foréneo se clonan en un sitio de res-
triccién en el centro del YAC. Los YACs son particular-
‘mente titles para clonar grandes fragmentos de DNA de
200 kb hasta aproximadamente 2. megabases (mb = 1 mi-
lién de bases) de tamafio. Similares a los BAC, los YAC
también han desempefiado un papel importante en los
esfuerzos de clonacién del Proyecto del Genoma Humano.
Vectores Ti
Los vectores Ti son plésmidos que se originan natural-
mente (de alrededor de 200 kb de tamaito) aislados de la
bacteria Agrobacterium tumefaciens, un patégeno vegetal
que vive en el suelo y que causa tna enfermedad en las,
plantas llamada tumor del cuello o agalla. Cuando A. tu
‘mefaciens entra en las plantas hospedadoras, wn fragmento
de DNA (T-DNA) del plésmido T (letras que vienen de win-
{ductor de tumores») se inserta en el cromosoma hospeda-
dor. EIT-DNA codifca la sintesis de una hormona llamada
auxina, que debilita la pared de la célula hospedadora. Las
células infectadas se dividen y se agrandan para formar un
tumor (agalla). Los genetistas de plantas reconocen que si
pudieran eliminar la auxina y otros genes perjudiciales del
plasmid, el vector resultante podria uilizarse para im-
plantar genes en as células vegetales. Los vectores Tse uti
lizan para transferir genes a plantas, como veremos en el
Capitulo 6.
‘Ahora que hemos examinado distintos tipos de vec~
tores y sus aplicaciones, en la seccién siguiente centrare-
‘mos nuestra atencién en cémo los cientificos pueden uti-
lizar la tecnologfa del DNA recombinante para identificar
y clonar genes de interés.
3.3 Cémo identificar y clonar
un gen de interés?
Cortar y pegar diversas piezas de DNA para producir una
molécula de DNA recombinante ha llegado a ser una téc-
nica rutinaria en biologie molecular. Pero los experi-
mentos de clonaci6n que hemos descrito hasta ahora per-
miten la clonacién aleatoria de fragmentos de DNA
basandose en sitios de corte de las enzimas de restricci6n,
yno en la clonacién precisa de un solo gen o de un frag-
‘mento de DNA concreto de interés. Por ejemplo, si estu-
vieras interesado en clonar el gen de la insulina y sim-
plemente cogieras DNA del péncreas, lo cortaras con
‘enzimas y ligaras el DNA digerido en plésmidos, crearias
cientos de miles de plésmidos recombinantes y no s6lo
un plésmido recombinante con el gen de insulina. Los
bidlogos moleculares denominan a este enfoque la clo-
nacién shoigun (0 aleatoria) porque se clonan a la vez
muchos fragmentos aleatoriamente y no hay genes indi-
viduales destinados especificamente para la clonacién.
Cémo sabriamos qué plésmido recombinante contiene
el gen de la insulina? Ademés, si el gen de la insulina (0
las secuencias adyacentes) no tuviera sitios de reconoci-
iento para la enzima de restriccién que hubiéramos uti-
lizado, podria ocurrir que no tuviéramos ningin plés-
mido recombinante que contuviera el gen de la insulina.
‘Aun si hubiéramos creado plésmidos con el gen ée la in-
sulina, 2e6mo podriamos separarlos de los otros plasm
«dos recombinantes? Es decir,
bacterin
[ 2)Teatarel tro oon
etergente y NaOH
CES para provecar la
ess iss bacteriana y
dlesnaturalizar el DNA.
8) Far el DNA at fio por
Solucin que calor en una estufa do
conten on hibridacién o por
sonda marcat fexposicion a uz
radiacvaments travolta.
4) Afar a sonda marcada
radlactvamente al fio.
5) La sonda se hr con
1 gon deseaco de las
‘une bacterianas,
iregano ene 6) Lavra ito para sina?
pares db bases Ia sonda po uiday exporter
elifroa la pee do
{ayes X (utoracograta)
Potala
revoinda
Colonie que
confers 7) Comparer la pelicula.
‘genes do. tevelada oon la placa
intrea nesta para ertcar
Ins colonies que
‘ontengan a en
‘enter
2) Se puede der que
roman as al uo
Contonene gene rds
9 ‘en un cuftivo liquide y
Oy ete
@ os 10NA
recombinant plasmiioo.
DNA plasmisico
recombinant
Figura 3.6 Hibridactén de colonias:rastreo de a biblioteca con
tuna sonda de DNA para identifiear el gen clonada de interés
3.3 {Como identificar y elonar un gen deinterés? 72.
cDNA, porque muchas secuencias de genes en ratas y 1a-
tones son similares a las que se encuentran en los genes
humanos. Si el gen de interés no ha sido clonado en otra
especie pero existe informacién sobre la secuencia de pro
teinas, se puede fabricar una serie de oligonuclestidos,
sintetzados quimicamente baséndose en una predicciin
de codones que pueden codificar para la secuencia de pro-
teinas conocida. Si se conoce alguna secuencia parcial de
aminodcidos para una proteina codificada por un gen que
se vaa clonar, es posible etrabajar hacia atrés»y disefiar
cligonucleotidos basados en los nucledtidos predichos que
codificaban la secuencia de aminodcidos. Ademés, si hay
algiin anticuerpo disponible para la proteina codificada
por el gen de interés, se puede utilizar una biblioteca de
expresiOn, que da como resultado la expresién de la pro-
teina en las bacteria, y se puede rastrear con el. anti
cuerpo para detectar las colonias que expresen la proteina
recombinante.
El rastreo de la biblioteca raramente da como resu-
tado el aislamiento de clones que contienen genes de lon-
gitud completa. Es més comtin obtener clones con pe-
uefios fragmentos del gen de interés (un motivo por el,
cual esto ocurre con las bibliotecas de eDNA es porque
puede ser dificil aislar mRNA de longitud completa o sin-
tetizar cDNA de longitud completa para el gen de interé).
Cuando se clonan pequefios trozos de un gen, los cient
ficos secuencian estos trozos y buscan correspondencias
entre secuendias. A continuacién, se pueden juntar los
fragmentos coincidentes de DNA como si se tratara de un.
puzzle en un intento por reconstruir el gen de longitud
completa, lo cual a menudo requiere de un rastreo inten-
sivo y repetido por toda la biblioteca cultivando muchas
bacteras yutlizandolas para hibridar colonias. Buscar co-
dones de inicio y de parada (también llamados codones,
stop o de terminacibn) en las partes secuenciadas es una
forma de predecr si se han juntado las piezas del gen en-
tero. Mediante este proceso, 10s fragmentos eoincidentes
pueden juntarse para localizar un gen entero.
Mas adelante en este capftulo discutiremos c6mo las
estrategias de secuenciacién del tipo shotgun (o aleatorias)
de todo el genoma posibiltan a los cientificos el secuen-
ciar genomas enteros. Debido a los estudios gendmicos,
las bibliotecas se estén convirtiendo en una manera cada
vex menos utilizada de identifica y clonar genes. En
lugar de utilizar una biblioteca para identificar uno 0 va
rios genes ala vee, la gendémica hace posible que los cien-
tilicos identifiquen secuencias para todos los genes en un
genoma.
Reaccién en cadena de la polimerasa
Aungue las bibliotecas son muy efectivas y muy utiliza
das para clonar e identificar un gen de interés, la reac-
cidn en cadena de la polimerasa (PCR) ¢s un enfoque
mucho mas répido para clonar que construir y rastrear
una biblioteca. La PCR es, a menudo, la técnica clegida.
Desarrollada a mediados de la década de los ochenta del
siglo xx por Kary Mullis, la PCR resulté ser una técnica 72 apituleg Tecnologia del DNA recombinante y genémica
revolucionaria que ha tendo gran impacto en muchas
areas de la biologia molecular. En 1993, Mullis gané el
Premio Nobel de Quimica por su invento. La PCR es una
técnica para hacer copias o amplificar una secuenciaespe-
cifea del DNA en un corto perfodo de tiempo. El concepto|
‘que hay detrés de una reaccién de PCR es increfblemente
sencillo. Aqui, se afiade el DNA diana que se desea am-
plificar a un tubo de paredes finas y se mezcla con des-
oxirribonucledtidos (dATP, dCTP, AGT, €TTP), solucién
tampén (0 buffer) y DNA polimerasa. Se aftade a la mei
cla una pareja de primers. Los primers son oligonucleé-
tidos cortos de DNA de cadena simple que suelen tener
tuna longitud de 20 a 30 nucledtidos. Estos primers, u oli-
gonucledtidos, son complementarios de los que flan-
quean los extremos opuestos de la secuencia del DNA
diana que se desea amplificar (ver Figura 3.7)
‘A continuacién, el tubo de reaccién se coloca en un.
instrumento llamado termociclador. Bn esencia, un ter-
mociclador es un sofisticado bloque de calentamiento
capaz de cambiar la temperatura muy répidamente en in-
tervalos de tiempo muy breves. El termociclador toma la
muestra mediante una serie de reacciones lamadas ciclo
de PCR (Figura 3.7). Cada ciclo consiste em tres fases. En
Ja primera, llamada desnaturalizacién, se calienta el tubo
de reaccién hasta entre 94°C y 96°C aproximadamente,
causando la separacién del DNA diana en cadenas sim-
ples. En la segunda fase, llamada hibridaciin (0 anilla-
‘miento), se enttialigeramente el tubo hasta entre 50°C y
65 °C, Io que permite que los primers (u oligonuctestidos)
creen enlaces de hidrégeno con las bases complementa-
rias situadas a extremos opuestos de la secuencia diana.
Durante el alargamiento, la tiltima fase del ciclo de PCR,
la temperatura se suele elevar un poco (a unos 70°C 0
75°C) y la DNA polimerasa copia el DNA diana unién-
dose a los extremos 3’ de cada cebador (también llamado
primer u oligonucleétido) utilizando éstos como moldes.
La DNA polimerasa afiade nucledtidos al extremo 3° de
cada oligonucleétido para sintetizar una cadena comple-
mentaria, Al final de cada ciclo, la cantidad de DNA diana
se ha duplicado. El termociclador repite estas tres fases
de nuevo segiin el niimero total de ciclos determinado
por el investigador, que suele ser de 20 0 30 ciclo.
Una clave del ciclo es el tipo de DNA polimerasa que
se utiliza en la reacci6n. Los calentamientos y entra
mientos repetidos necesarios para la PCR desnaturaliza-
rfan y destruirfan la mayoria de las DNA polimerasas des-
pués de unos pocos ciclos. Disponemos de varias fuentes
de DNA polimerasas adecuadas para el ciclo de PCR. Una
de las primeras y més populares enzimas para la PCR es
conocida como la Taq DNA polimerasa. Taq se aisla de
la arquea denominada Thermus aquatics, una especie que
prospera en manantiales de agua caliente: Debido a este
habitat al que 7: aquaticus esta adaptada (se descubri6 pri-
mero en los manantiales de agua caliente del Parque Na-
cional de Yellowstone), su DNA polimerasa ha evolucio-
nado hasta poder aguantaraltas temperaturas (ese tipo de
icrobios recibe el nombre de terméfilas por su capacidad,
Nuclestido:
‘dATP
acrP
GTP
ore
NA ana
DNA potimerasa
Poe Be
on
t
Secuencia
‘dana
1) Aplcar calor |
ara desnaturaizar
IDNA
af
‘Faso de hibidactén!
anillamiento
2) Enar para
permite que se
tunan (se ibs)
los primers
Il EICICLO1
1 finde 2
cules
Fase de
alargamionto
3) LaDNA
polimerasa alarga
elextremo 3 de
cada primer
Figura 3.7 Lareaceién en cadena de la polimerasa
para sobrevivir y prosperar en entomos de calor ex-
tremo). Como Tag es estable a altas temperaturas, puede
aguantar los cambios de temperatura necesarios para el
ciclo de PCR sin desnaturalizarse. En 1989, la revista
Science nombr6 ala polimerasa de Tag Molécula del Aiio,
Ta gran ventaja de la PCR es su capacidad para am-
plificar millones de copias del DNA diana a partir de una
cantidad muy pequefia de material iniclal en un corto
perfodo de tiempo. Como el DNA diana se duplica des-
pués de cada cielo de PCR, después de unos 20 ciclos se P_zCémo determinan los cientificos qué
secuencias primer (0 cebadores) y qué
condiciones de temperatura deberian
utilizrse en un experimento de PCR?
R_Disefar los primers 0 cebadoresy elegir ls temperatures
adecuadas son pardmetros de importancia critica. Los
programas de software utilizados para diseiiar
‘ligonuclestidos simplifican mucho este proceso, pero
‘incluso con la ayuda de esos programas se deben considerar
ruchos aspectos tales como:
« Los primers s6lo deben unirse a secuencias especificas en
la secuencia del DNA diana de interés para evitar que se
tunan a otras secuencias.
‘© Las secuencias complementarias par la unin de los
cebadores al DNA diana no deben estar muy alejadas unas
de otras ni demasiado cerca.
«© Los cebadores deben contener las cuatro bases en niimero
aproximadamente similar
‘© Evitar que puedan unise entre sf los primers formando
‘xdimeros de primers» asegurindonos que los pares de
primers no tienen nucleétidos de guanina y citosina en
sus extremos 3:
Las secuencias de los primers y los requisitos de la ONA
polimerasa que se utiliza en el experimento son los factores
{que determinan las termperaturas elegidas para un
experimento de PCR. La temperatura de desnaturalizacion
testa casi siempre en tome a los 94-95 °C para la mayoria de
los experimentos, pero seleccionar la temperatura de
hibridacion correcta es critic. Si esta temperatura fuera
demasiado alta, los cebadores no seran capaces de unirse al
DNA diana, Sila temperatura es demasiado baja, puede que
los cebadores se unan a segmentos de DNA no especificos,
‘ausando la amplifcacion de secuencias que no son diana
La temperatura de hibridacin se determina en gran medida
por la composicin A+ Ty G + C de los primers. Los que
‘tengan un alto contenido de pares de bases G + C pueden
hibriderse a temperaturas més altas que los que tengan un
alto contenido en pares A+ T. Las temperaturas ideales de
hibridacin se caleulan con base en los porcentajes de G+ C
y A+ T que tienen los cebadores.
han producido aproximadamente 1 millén de copias
(28) del DNA diana a partir de una sola molécula. Las
nuevas aplicaciones de la tecnologia de la PCR hacen.
posible determinar la cantidad de producto PCR que se
fabrica durante un experimento mediante una técnica
llamada PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR),
que utiliza oligonucle6tidos con moléculas fluorogéni-
cas y termocicladores especializados que permiten a los,
investigadores cuantificar las reacciones de amplifica-
cidn a medida que ocurren. Mas tarde, pero dentro
de este capitulo, seguiremos hablando de la qPCR. Se
33 {Cémo identifiear yclonar un gen deinterés? 73,
puede visualizar una clase excelente sobre la PCR en la
pagina web del Centro de Aprendizaje Cold Spring Har-
bor DNA Learning Centre que aparece en la lista de la pa-
gina web adjunta.
‘La PCR tiene aplicaciones muy amplias en investiga-
cién y medicina, como en la fabricacién de sondas de
DNA, el estudio de la expresién génica, la amplificacién
de diminutas cantidades de DNA para detectar pat6genos,
virales e infecciones bacterianas, la amplificacién del
DNA para diagnosticar enfermedades genéticas, la de-
teccién de cantidades traza de DNA en tejidos para re-
solver un crimen e incluso la amplificacién de DNA an-
tiguo a partir de tejido fosilizado de dinosaurios (Figura
3.8). Muchas de estas aplicaciones se describen en otros
capftulos.
Clonacién de productos de PCR
A menudo se utiliza la PCR en ver del rastreo de biblio-
tecas para clonar un gen porque es répido y efecivo (Fi-
fguza 3.9), Una desventaja dela clonaci6n mediante PCR
s que necesitamos saber algo acerca de las secuencias de
DNA que flanquean nuestro gen de interés para disefiar
Jos primers. Es mas fécl donar mediante PCR si ya se ha
clonado el gen en otra especie, por ejemplo uilizando
primers para un gen clonado anteriormente a partir de
tin ratén que clonar el gen equivalent a partir de un ser
humano.
“ay muchas formas de clonar un gen utilizando PCR.
‘Uno de los primeros enfoques implicé el diseio de ceba-
dores para un gen de interés que inclu secuencias de re-
conocimiento de enaimas de restriccién construidas en los
cebadores. En esta técnica, se amplifica el gen y se trabaja
nila ingenierfa de los sitios de restriccién en los primers
para que digieran los productos de la PCR con tna en-
Tima de restrccin. Estos productos se ligan en un vector
{que puede se utlizado para la secvenciacion de DNA. Un
Enfoque més moderno de la clonacién con PCR aprove-
che una pecullardad interesante de las polimerasas ter-
roestables. A medida que se copia el DNA, Taq y otras
polimerasas utilizadas normalmente pera la PCR aaden
un solo nucledtido de adenina al extremo 3’ de todos los
productos PCR (ver Figura 3.9). Después de ampliicar un
gen diana, los productos PCR clonados pueden ser liga-
dos en plasmidos lamados vectoresT. Estos contienen tn
nucleotide de timina de cadena simple a cada extremo
{que puede unir pares de bases complementariamente con
Tosmucleétidos de adenina que hay por encima en los pro-
ductos dela PCR, Una ver ligado en un vector Tel plés-
mido recombinante que contiene el producto PCR clo-
nado puede ser introducdo en. las bacterias por
transformacién y se puede determinar su sequencia de
iudlestidos.
‘Ahora ya has aprendido algunas de las estrategias mas
habituales que se utilizan para clonar genes. Bn la si-
guiente seceién, consideramos un amplio abanico de en-
foques diferentes que usan los centficos para estudiar
Jos genes conados 74 Capitulo 3. Tecnologia del DNA recombinante y gendmica
Prusbas de genes human
‘Amplicacén 42 ONA yy Gagnésice de enfermedades
Clonacin 62 DNA
ovo comin, ONA de ses)
stu de le expresisn
| atria ps. arr
saPoR)
Prusbas dagnéstas para los
‘oat orense de DNA
Posies epaeritt | ientacinderestehumancs | plgenos casas
yasemneainde | reiserfs de soados | boats prsbas
Foor
Tomo enastoresgmaae dels | que onl caso Jo bots
fonzones colactofas, | dello humana y muestas de
‘rade Contoren 200% yeltsunami ds | yvius yprusbas en muestas
Indoneia en 2004) e alimanos y agua para
‘ontaminacén baclerans)
Figura 3.8 Aplicacfones de la PCR La anplificscién del DNA mediante PR sha convert en
una tGcncaesencial en bologia molecular con un gran espcto de aplicaciones diferentes. Agunas de
{as mis comunes relacionadas con la iotecologa se han reprsentado en esta Figur
enue se
DNAdane doses coner
® 3
Desnatratzar a
DNA RE ampitear DNAcon Tag DNA
(Goumesy potas, equ ahade
Inuledido “Aol extrem
eel producto PCR
20cm
‘ctor con un
‘Amplifear DNA ana apts
‘cada exromo
LUpary subconar
al produc dela PCR,
enelvecorT Transtormar
ecterie
Figura 3.9 Clonactén de un gen mediante PCR 44 2Qué se hace con un gen clonada? Aplicaciones de la tecnologia del DNA recombinante
3.4 Qué se hace con un gen clonado?
‘Aplicaciones de la tecnologia del
DNA recombinante
@Por qué donar DNA? 2Qué se puede hacer con un gen.
lonado? Hay numerosas aplicaciones de la clonacién de
genes y de la tecnologia del DNA recombinante. La Figura,
3,10 resume las aplicaciones més comunes de la clonacion.
de genes, muchas de las cuales se tratan en otros capitulos.
En esta seccién presentamos algunas de las primeras apli
caciones més importantes de la lonacién de genes.
Electroforesis en gel y mapeo de la estructura
genética con enzimas de restriccién
Normalmente, después de haber clonado un gen se cons
truye algiin tipo de mapa fisico del mismo para determi-
nar tanto qué enzimas de restricci6n cortan el gen clo-
nado como la ubicacién de estos sitios de corte. Es muy
itil conocer el mapa de restriccin de un gen para fa-
bricar clones a partir de trozos pequeiios del mismo (lo
‘que se denomina subclonaci6n) y para manipular muchos
fragmentos relativamente pequefios de DNA (por ejem-
xpcosar protons y estar
tccturayfnesonamient a i:
Silay purer protetras para
fetta osrutra do ls prteinas
‘yu fonionamn nro
tratamiona dos.
leeds
ee 6 Sse 5
(crear animsies wanegénics y
Sinaloscon gone ana para
‘stir el funtonarionto
enetico
Produocn a escala,alslamientoy
prfesclon da prooins Ierepsutcas
(bre) sutng, hoemona de
thveno nuinanayproteinas pata
fachanlucin de cosguos uttadas
fveltstaminto deo slaquos al
fvazdn) para su apace
eres humanoa come productos
ONArocombinants
moe
ii
Figura 3.10 Aplicaciones de la tecnologia dol DNA recombinants
sas peeling puitcada pare
fabrcorarcusrpas confines médices|
Yio fier vacua ara ot
O Pe
cenalgen
inorietonde
8
plo, de 100 a 1.000 ph) para secuenciar el DNA y prepa~
rar sondas de DNA para estudiar la expresién génica.
Para crear un mapa de restriccién, el DNA clonado se
somete a una serie de digestiones simples con enzimas de
restriccién, asf como digestiones dobles con enzimas com-
binadas. Después, los investigadores utilizan electrofo-
resis en gel de agarosa (ver Figura 3.11a), una técnica
comin en biologia molecular, para separar y visvalizar
los fragmentos de DNA baséndose en el tamafio. Final-
‘mente, el patrOn de fragmentos creado por las digestiones
se analiza para construir el «mapav. La agarosa es un ma-
terial que se afsla de las algas, fundido en una solucion
tampén (o buffer) y vertido en una bandeja de plistico. A.
medida que se enfria la agarosa, se solidifica formando
tun gel semisélido horizontal que tiene agujeritos 0 poros
a través de los cuales viajardn los fragmentos de DNA. El
porcentaje de agarosa utilizada para crear el gel deter-
‘mina su capacidad para resolver los fragmentos de DNA
de diversos tamafios. La mayorfa de las aplicaciones sue~
len implicar geles que contienen de 0,5 a 2 por ciento de
agarosa. Un gel con un alto porcentaje de agarosa (un
2 por ciento, por ejemplo) tiene mejores cualidades para
separar pequefios fragmentos de DNA porque se abrirdn
paso a través de los poros més facilmente que los frag-
Enconarlaubracin eomosénica
debs genes clonado, determina el
nero de copies do os ges y
‘etuiar su eacture
y Forza ia mutacin de oe
(anes y estar
findonariora da
Ce profena aera producisa
Crear microorganisms,
fnimalse y panias median
Ingenieria genética que
tongan vals apticaciones,
‘ode ieoorganiames ate
(dagadan os rescues
hasta plantas y
‘rials esltortos
‘enfermedades
come
Ustzacii on FS pee
ienas aes ae nti
oer ‘Shonen [2 | Exess
Sore ag nant wc
tpondtcn da ona Et
Clagnosticarastomos
fn ls gone humana,
Yentermedaes necsiosas 76 Capitulo 3 Tecnologia del DNA recombinante y genémica
os
gPatentar ono patentar?
FL Proyecto del Genoms Humano se complet
antes de Lo previsto en parte debido a la
ccompetencia entre los centros de
‘nvestigacién del genoma que contaban con fondos pablicos y
las einpresas con capital privado, como Cetera Genomics,
dirigida en su origen por el anterior investigador del NIH
(Unstituto Nacional de la Salud) Craig Venter. Durante su
permanencia en el Instituto para la Investigacion del Genoma
(Unstitute for Genomic Research, 0 TIGR, por sus siglas en
Snglés), Venter y sus compaferos fueron los primeros
ciantificos en secuenciar el genoma de un organismo vivient,
la bacteria Hoemophitus influenzae. Este grupo solicits las
patentes de la secuencia de nuclebtidos de H. influenzae y de
la tecnologia bioinformatica utilizada pare analizar este
genom. .
Con anterioridad, Venter y sus compafieros describieron un
conjunto de experimentos en el que clonaban aleatoriamente
fragmentos cortos de cDNA procedentes de células ceebrales
hhumanas, Estas secuencias cortas, denominadas marcadores
de secuencia expresada (EST), podrian utilizarse
te6ricamente como sondas para identifcar toda la longitud de
tun cDNA. Algunos de los EST de Venter resultarcn ser
{dénticos a genes ya clonados o a porciones de un gen; otros
patecfan ser nuevas secuencias de genes 0 DNA basura 0 no
codificante. Esperendo obtener los derechos de propiedad de
los genes completos que se podrian identifcar a partir de los
EST de Venter, el TIGR solicits una patente. Esta solicitud
.gener6 una enorme polémics.
Se deberta permitir los cientificos patentar secuencias
de DNA de organismos vivos de fa naturaleza? zQué sucede si
se otorga una patente para slo pequefios fragmentos de un
gen ~aunque se desconozca lo que hace una secuencia de
DNA~ por el mero hecho de que algunas personas o una
‘empresa quieran una patente para reivindicar que han sido los
primeros en clonar un trozo de DNA? Qué pasa si no hay una
utilidad clara de las secuencias de DNA clonadas? ;Se puede o
se debe permitir a los investigadores que uilzan un chip de
DNA o que han construido una biblioteca de DNA que
patenten el genoma completo de cualquier organismo que
hhayan estudiedo?
cuando se ororga UM paUENE, TOS CIEMUTACOS SueIeN fave
sobre la informacion patentada un monopolio de dos décadas
desde la fecha de solicitud de la patente. Muchos creen que el
acapararinformacién sobre el genoma va contra la tradicion
e compartir informacion para que la ciencia pueda avanzar.
{El proceso de concesién de patentes podria ralentizar los
vances en la clonacién de genes si los grupos acaparasen los
datos y no compartieran informacién? zPodsia o deberta un
‘grupo reivindicar sus derechos sobre un gen, impidiendo por
tanto a otros trabajar o desarrllar productos a partir de él?
Desde 1980, la Oficina de Patentes y Marcas Registradas de
{os Estados Unidos ha concedido patentes sobre mis de
20,000 genes o secuencias de genes y se estima que se ha
patentado el 20% de los genes, hurmanos. A algunos
cientifics les preocupa que conceder patentes simplemente
por clonar un trozo de DNA es obtener una patente por un
muy poco trabajo. Dado que los ordenadores hacen la mayor
parte del trabajo rutinario de la secuenciacién del genom,
‘quién deberia obtener la patente? 2¥ qué hay de las
personas que descubran para qué sirve ese gen? ;Se deberta
patentar a un organism vivo obtenido por ingenieria
genética? Se han patentado bacterias obtenidas por
ingenierfa genética (por ejemplo, las que se utitizan para
\impfar la contaminacién ambiental) y animales transgénicos,
asf como genes de importancia clinica como el interferén
beta. Puede un grupo reivindicar con antelacién sus
derechos sobre los usos futures de un gen, aunque no haya.
datos para apoyar esos derechos? zQué sucederta si una
secuencia de genes estuviera relacionada'con una enfermedad
para la que se podria desarrllar una terapia génica? :Cusl es
la mejor manera de utilizar esta informacién para el avance
de la medicina y la curacin de enfermedades?
Muchos cientificos creen que mejor que patentar las
propias secuencias de los genes, es mis adecuado patentar la
rhueva tecnologia utilizada para descubrir y estudiar los genes
asi como las aplicaciones de la teenologfa genética, tales
como los enfoques de las terapias génicas. Se han otorgado
algunas patentes sobre la tecnologia, aunque el critero para
establecer lo que es una tecnologia nueva ests, en el mejor
de los casos, poco claro.
Desde el punto de vista comercial, una ventaja de las
patentes es que proporciona a las empresas privadas un
incentivo para llevar al mercado una medicina o una.
‘eenologia. AC mismo Yiempo, esto puede ralentizar fos
vances en la cura de una enfermedad al encarecer el
tratamiento. ;Patentar 0 no patentar? TA decides.
mentos grandes, que no se separan bien a través de un.
gel denso. Para separar grandes fragmentos de DNA es
mejor utilizar porcentajes ms bajos de agarosa,
Para corter un gel, se sumérge en una solucién tam:
pOn que conducira carga eléctrica, Las muestras de DNA.
se cargan en pequefias depresiones del gel denominadas,
pozos. A continvacin, se aplica una corriente elécttica
entre los electrodos situados en los extremos opuestos del
gel. La separacién del DNA mediante electroforesis se
basa en el hecho de que el DNA migra por el gel segin st.
carga y tamafio (en pares de bases). El eje azticar fosfato
produce DNA. cargado negativamente; por lo tanto,
cuando el DNA se coloca en un campo eléctrico, migra
hacia el Anodo (el polo positive) y es repelido por el cé
todo (cl polo negativo). Como todo el DNA tiene carga
negativa, independientemente de la longitud o del ot
gen, la tasa de migracién y separacién del DNA por el gel
de agarosa depende del zamario de la molécula, Dado que
la distancia de migracién es inversamente proporcional
al tamafio de um fragmento de DNA, los fragmentos lar 2:4" eQué se hace con un gen clonado? Aplicaciones dela tecnologia del DNA recombinante 77
o
@
Mozcla da ragmentos
DNA de discs tanafos
‘Tet gscon colorante ue
} ‘soars at NA
(Promuro de ose)
Visuals bandas por
‘orescenle bao la
‘uz trevts
DDNAde& cot ein ortar
‘DNA de. cot + Hin
areador 0 ONA
Mareador de ONA
DNA dein corer
Fragmenios
mastarges
‘ina
& Fragmentos
ras ores
Gel compiled
® noo ® e
Figura 3.12 Clectroforesis en golde agarosa (2) Los fagmentos Ge DNAse pueden separ y visualizar mediante electoforesis
en gel de ageros,(b)Fotogratia de un gel de agarose teRido con bromuro de eida. Los canes etiguetades como «Marcador de ONAD se
‘argaron con DNA de tamafo estndarpeparado comerialmente, que sive de escalera de ragmantos de tamaioconocdo'y que se
Uitlizan para determnare tamafo d las muestrasexperinantaes del DNA qe se etd anaizando. El can etiqutado coma «OWA deh
sin cortara muestra NA eromasémic sn eortar de alto pezo mlecuar del Tago;
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