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PROCEDIMIENTO DE VALIDACIN
SECUNDARIA DE MTODOS
MICROBIOLGICOS NORMALIZADOS
CUALITATIVOS
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1.

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OBJETIVO

Producir evidencia que el laboratorio es capaz de cumplir con las especificaciones tcnicas
originales del mtodo.

2.

CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

Se aplica en la validacin secundara de mtodos de ensayo microbiolgicos normalizados

destinados a ensayos de presencia/ausencia.

3.
FUNDAMENTO
El procedimiento para la validacin de mtodos microbiolgicos normalizados es un
procedimiento que permite estimar el desempeo de los mtodos escogidos para uso rutinario, a
travs de la confirmacin de una o ms caractersticas de desempeo, en las condiciones de uso
del laboratorio.
Los criterios de eleccin de las caractersticas a evaluar para mtodos cualitativos incluye:
Lmite de Deteccin, Inclusividad, Exclusividad.

4.
4.1

REFERENCIAS
Curso-Taller sobre Validacin de Mtodos Microbiolgicos, Santiago de Chile, ISP,
24/9-5/10 2007.

Elaborado por
TM. Lic. Fabiola Rojas C.

Revisado por
Aprobado por
TM. Lic. Mariana Fernndez C. BQ. Viviana Cachica C.

Encargada Laboratorio Recuentos

Encargada Calidad Depto.

Jefe Seccin Microbiologa

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TERMINOLOGA

Analito: es el microorganismo que se desea detectar o cuantificar.

Blanco: es el alimento a ser usado como matriz, en el cual no fue detectado el analito cuando fue
analizado por el mtodo de referencia usado en el laboratorio, en diversas repeticiones.
Exactitud relativa: es la aproximacin del acuerdo entre un resultado de prueba y el valor de
referencia aceptado. Para el propsito de este protocolo, el valor de referencia aceptado es
seleccionado como el valor obtenido por el mtodo de referencia. Por tanto la expresin
relativo implica que el mtodo de referencia no garantiza automticamente el valor de
referencia aceptado. Cuando es aplicado a un grupo de resultados de la prueba, involucra una
combinacin de componentes aleatorios y un error sistemtico comn o componente de los
sesgos.
Factor de overdispersin (u): Es la incertidumbre aleatoria debido a la naturaleza de los
mtodos microbiolgicos cuyos datos se presentan como una distribucin diferente de la
distribucin normal de Poisson y es medida en los trminos de desviacin estndar relativa.
Exclusividad: permite conocer el desempeo selectivo del mtodo en relacin a las cepas
interferentes normalmente presentes en el alimento.
Inclusividad: es la habilidad de un mtodo de ensayo de detectar el analito de una gran variedad
de cepas del mismo grupo.
Limite de cuantificacin para mtodos cuantitativos: es la menor cantidad del analito que
puede ser medido y cuantificado con precisin y exactitud aceptables en condiciones
experimentales definidas para el mtodo en validacin.
Linealidad para mtodos cuantitativos: es la habilidad de un mtodo que, cuando es usado
con una determinada matriz, ofrece resultados que corresponden a una proporcin de la cantidad
del analito presente en la muestra.Un aumento del analito en la muestra corresponder a un
aumento lineal o proporcional en el resultado.
Lmite de deteccin: es la menor concentracin de un analito en una muestra, la cual puede ser
detectada con un nivel de confianza especificado en las condiciones definidas para el mtodo.
Matrices: son los alimentos de cada categora seleccionada, utilizados como base para los
anlisis en el procedimiento de validacin.

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Mtodo Normalizado (MN): mtodos internacionalmente aceptados y validados que est

siendo sometido a la validacin secundaria.
Mtodo de Referencia (MR): mtodo en uso rutinario en el Laboratorio, cuyas caractersticas
de desempeo son bien conocidas.
Nivel de Fortificacin (NF): es el nmero de unidades formadoras de colonia adicionado a cada
gramo o mililitro de la matriz de alimento en anlisis durante el procedimiento de fortificacin.
Overdispersin: variacin en exceso de la aleatoriedad de Poisson, la cual es detectada
cualitativamente por el ndice de dispersin de Poisson,
Repetibilidad: es el grado de concordancia entre los resultados obtenidos por la aplicacin de
un mismo procedimiento analtico, mismo material, en las mismas condiciones de anlisis
(analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos de tiempo.
Resultado extremo o Outlier: corresponde a cualquier valor extremo que ocurra debido a
situaciones anormales. En menos de 1% de las pruebas, estos resultados pueden ocurrir
aleatoriamente en situaciones normales.
Validacin Primaria o Completa: se refiere al establecimiento de las especificaciones para el
desempeo de un mtodo nuevo y/o una verificacin experimental que un mtodo tericamente
cumple con criterios de calidad deseados.
Validacin Secundaria: se refiere a la comprobacin experimental de que un mtodo
establecido funciona de acuerdo con sus especificaciones, en las condiciones disponibles en el
laboratorio usuario.

6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1 Materiales e Insumos
Cepas objetivo
Cepas interferentes
Caldo cerebro corazn (BHI)
Diluyentes
Agar selectivo especfico del mtodo a evaluar
Placas estriles
Pipetas estriles

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6.2 Equipos
Bao de agua termorregulado
Incubadoras
Stomacher

7.

DESARROLLO PARA LA VALIDACIN SECUNDARIA DE MTODOS

CUALITATIVOS

7.1 Lmite de Deteccin de mtodos cualitativos normalizados cuyas caractersticas de

desempeo de la validacin preliminar estn declaradas:
7.1.1

Considerando los criterios de eleccin de las caractersticas a evaluar, el

procedimiento de validacin secundaria de mtodos normalizados cualitativos
incluir la evaluacin de las caractersticas:

7.1.2

7.1.3

Lmite de deteccin
Inclusividad.
Exclusividad.

Para los mtodos de los cuales se conocen los valores de las caractersticas de
desempeo obtenidas en la validacin primaria, la validacin secundaria se
restringir a la confirmacin del lmite de deteccin declarado, analizando como
mnimo 30 repeticiones en este nivel del lmite de deteccin.
Las actividades relacionadas con la seleccin de matrices, fortificacin de muestras,
pruebas para evaluacin de inclusividad y exclusividad debern seguir las mismas
instrucciones descritas para los mtodos que no poseen las caractersticas de
desempeo declaradas.

7.2 Limite de Deteccin de mtodos cualitativos normalizados cuyas caractersticas de

desempeo de la validacin preliminar no estn declaradas:
7.2.1

7.2.2

En la validacin secundaria de mtodos normalizados cualitativos que no tienen

declarado el lmite de deteccin de la validacin preliminar, pueden ser aplicadas las
ecuaciones descritas a continuacin para la evaluacin del lmite de deteccin de
estos mtodos.
Si el lmite de deteccin es definido en trminos de probabilidad de un resultado
positivo con un determinado intervalo de confianza (95%), el mismo puede ser

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calculado de la probabilidad de los negativos que es ofrecida por la frmula

originaria de los mtodos cuantitativos:
2

p0=(1+u2c) -1/ u2 p0=1-p(+)=1-0,95 = 0,05 c =

(0,05-u - 1)
u2

Donde: u es el factor de overdispersin (incertidumbre del recuento) y c es el nmero de

clulas.
7.2.3. As para mtodos cualitativos el lmite de deteccin terico a ser verificado seria 3 ufc
/25g (distribucin de Poisson) para una probabilidad de 95% de detectar el analito, presente
en la alcuota analizada, segn el procedimiento descrito a seguir.
7.3 Procedimiento para la determinacin del lmite de deteccin (LD)
7.3.1 Para obtener la probabilidad estadstica de 95% de confianza es necesario generar,
como mnimo, 30 resultados en el nivel de fortificacin en la prueba.
7.3.2 Los anlisis para determinacin del lmite de deteccin deben ser realizadas todas en
el mismo da, por un mismo analista en cada etapa, utilizando los mismos equipos y
mismos lotes de medios de cultivo, reactivos y dems insumos.
7.3.3 Los resultados sern anotados en el RG-712.00-XXX ver (Anexo N 1).
7.3.4

Seleccin y Estudio de las Matrices

7.3.4.1 Cuando el mtodo analtico a ser verificado se destina al anlisis de todos los tipos
de alimentos, la matriz que se escoja para la validacin secundaria ser aquella donde
se espera las mayores dificultades para la recuperacin del analito.
7.3.4.2 Cuando el mtodo analtico a ser verificado se destina al anlisis de un nico tipo de
alimento, la validacin secundaria deber ser realizada usando esta matriz especfica.
7.3.4.3 Pesar 900 g o medir 900 mL de la matriz escogida y homogeneizar muy bien.
7.3.4.4 Usando el mtodo de referencia del laboratorio, confirmar la ausencia del analito en
la matriz seleccionada a travs del anlisis de 6 alcuotas de 25 g, retiradas de
diferentes partes del homogeneizado de la matriz (900 gramos o mililitros),
anteriormente preparada y homogeneizada. Registrar los resultados en el RG-712.00XXX (ver Anexo N 1). En caso de un producto estril (ej. consevas) realizar solo un

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anlisis. Si todos los anlisis se confirman como negativos, usar los 750 g, o 750 mL
restantes para la fortificacin de la siguiente manera:

Si la matriz fuera slida, fraccionar las 750 g en 30 alcuotas de 25g e identificar

adecuadamente antes de la fortificacin.
Si la matriz fuera lquida, la fortificacin deber ser hecha en los 750 mL de matriz, antes
del fraccionamiento en 30 alcuotas de 25 mL.

7.3.5

Condiciones para el ensayo de Seleccin y Estudio de las Matrices

Analito: usar una cepa del analito que normalmente est asociada a la categora del
alimento en prueba, o una que sea de inters para los programas de control de la
Institucin.
Nmero de alcuotas: 30 alcuotas de 25 g o mL
Nivel de fortificacin para mtodos que no presentan declaracin del limite de
deteccin: 3 ufc/25g o mL.
Nivel de fortificacin para mtodos que presentan el valor del lmite de deteccin:
verificar el valor declarado.

7.3.6 Procedimiento para la fortificacin de la matriz

7.3.6.1 La fortificacin de las muestras es hecha a travs de la adicin de diluciones
conocidas del microorganismo a prueba, a partir de su fase estacionaria, en la matriz
en cuestin, confirmada como negativa para el microorganismo a prueba, de acuerdo
con las siguientes instrucciones:
7.3.6.1.1 Preparar fase estacionaria del analito en caldo cerebro corazn (BHI), o en caldo
no selectivo especfico para el analito.
7.3.6.1.2 Hacer diluciones de la fase estacionaria del analito hasta 10 -9 en solucin salina
peptonada, o el diluyente especfico para el analito evaluado.
7.3.6.1.3 Hacer recuento en duplicado de las diluciones, 10-7, 10-8 y 10-9 en agar para
recuento total (PCA o otro no selectivo apropiado para el microorganismo).
7.3.6.1.4 Realizar las lecturas y hacer los clculos de los nmeros de clulas en cada una de
las diluciones de la fase estacionaria del analito de manera de establecer la
dilucin que ser usada para la fortificacin de la matriz y registrar los resultados
de los recuentos y del clculo en el RG-712.00-XXX (ver Anexo N1).
7.3.6.1.5 Preparar nueva fase estacionaria en caldo cerebro corazn (BHI) o en caldo no
selectivo especfico para el analito del mismo lote evaluado en el da anterior.
Preparar las diluciones necesarias y mantener en refrigeracin hasta el momento
de la fortificacin (no ms que 20 minutos).
7.3.6.2 Si la matriz es slida, realizar la fortificacin en cada una de las 30 alcuotas
preparadas de acuerdo con el punto 7.3.4 a travs de la adicin del volumen y
dilucin calculados para la obtencin de 3ufc/25g (para mtodos que no poseen la

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declaracin del valor del LD), o para la obtencin del valor equivalente al lmite de
deteccin declarado. Homogeneizar bien.
7.3.6.3 Si la matriz es lquida, realizar la fortificacin de los 750 mL de la matriz preparada
de acuerdo con el punto 7.3.4, a travs de la adicin del volumen y dilucin
calculados para la obtencin de 90ufc/750 mL (para mtodos que no poseen la
declaracin del valor del LD), o para la obtencin de 30 veces el lmite de deteccin
declarado. Homogeneizar muy bien y despus fraccionar en 30 alcuotas de 25 mL,
identificando adecuadamente.
7.3.6.4 Mantener en refrigeracin hasta el inicio de los anlisis (no ms de 1 hora).
7.3.7 Anlisis de las muestras
7.3.7.1 Analizar las 30 muestras usando el mtodo a evaluar. Registrar los resultados en el
RG-712.00.XXX (ver anexo N1)
7.3.8 Tratamiento de los datos e Interpretacin del Lmite de Deteccin
7.3.8.1 Considerando los resultados positivos, determinar el porcentaje de recuperacin
obtenida por la ecuacin:

% Recuperacin

n Pos x 100
-----------------30

7.3.9
Criterio de aplicacin
7.3.10 Mtodos que no poseen el LD declarado: Ser confirmado el lmite de deteccin de
la distribucin de Poisson (3 ufc/25 g o mL) si el resultado del clculo de
recuperacin fuera mayor al 95%. Cuando la recuperacin obtenida es menor al
95%, repetir la evaluacin utilizando otro(s) nivel(es) de fortificacin, como por
ejemplo 5 ufc/25 ml o g, de manera a establecer cual es el LD del mtodo
normalizado en las condiciones de uso del laboratorio.
7.3.11 Mtodos que poseen el LD declarado: Ser confirmado el lmite de deteccin
declarado si el resultado del clculo de recuperacin fuera mayor al 95%. Cuando la
recuperacin obtenida es menor que 95%, repetir la evaluacin antes de determinar
que el LD es diferente del declarado.
7.3.12 Si fuera de inters del laboratorio, determinar cual es el LD del mtodo en las
condiciones de uso del laboratorio a travs de la repeticin con valores de
fortificacin mayores.

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7.3.10 Inclusividad
7.3.10.1La segunda etapa del procedimiento de verificacin secundaria es la determinacin de
la inclusividad, que permite conocer el desempeo del mtodo en relacin a los
analitos que primordialmente interesan al laboratorio.
7.3.10.2Condiciones para el ensayo de Inclusividad

Matrices: no sern usadas matrices

Analitos: diferentes cepas del analito en cuestin aisladas de diferentes tipos de
alimentos y regiones geogrficas.
Nmero de muestras: 30 cepas puras del analito ms prevalentes en la regin o ms
frecuentemente aisladas en el laboratorio.
Concentracin de los inculos: debe estar entre 10 y 100 veces el lmite de deteccin.
Nmero de repeticiones: una repeticin por cepa.

7.3.10.3 Procedimiento para la inoculacin:

7.3.10.3.1 Preparar fases estacionarias de los analitos de acuerdo con el descrito en 7.3.6 y
calcular las diluciones que permitan la obtencin de la concentracin deseada.
7.3.10.3.2 Hacer un recuento en PCA, por duplicado, para conocer el nmero real inoculado
en cada caso. Registrar los recuentos en RG-712.00.XXX (ver anexo N2) resultados Agar Plate Count (PCA).
7.3.10.3.3 Para cada analito, calcular las diluciones que permiten la obtencin de inculos con
la concentracin de clulas entre 10 y 100 veces el LD.
7.3.10.3.4 Preparar nueva fase estacionaria usando el mismo lote de medio usado
anteriormente y diluir de acuerdo a lo calculado en 7.3.10.3.3
7.3.10.3.5 Inocular, con los volmenes y diluciones calculadas para cada analito, el medio de
cultivo indicado para el enriquecimiento selectivo del mtodo a probar.
7.3.10.3.6 Incubar y seguir el anlisis de acuerdo con el indicado para el mtodo.
7.3.10.3.7 Registrar los resultados en el Anexo RG-712.00-XXX (ver anexo N2) - Resultados
Presencia/Ausencia.
7.3.10.4 Interpretacin de los resultados
7.3.10.4.1 Analizar los resultados de inclusividad considerando tanto los aspectos
cualitativos (caractersticas de las cepas) como cuantitativos (n de clulas
recuperadas) de los analitos evaluados.
7.3.10.4.2 Es deseable que el mtodo evaluado sea capaz de recuperar todos los analitos de
inters prioritarios, los cuales son normalmente recuperados por el mtodo de
referencia.

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7.3.11 Exclusividad
7.3.11.1La tercera etapa del procedimiento de verificacin secundaria es la determinacin de
la exclusividad, que permite conocer el desempeo selectivo del mtodo en relacin a
los interferentes que primordialmente interesan al laboratorio.
7.3.11.2 Condiciones para el ensayo

Matrices: no sern usadas matrices

Analitos: diferentes cepas de interferentes que comnmente estn presentes en los
alimentos analizados por el laboratorio.
Nmero de muestras: 30 cepas puras de los interferentes.
Concentracin de los inculos: debe estar entre 103 y 104
Nmero de repeticiones: una repeticin por cepa.

7.3.11.3 Procedimiento para la inoculacin

7.3.11.3.1 Preparar fases estacionarias de los microorganismos de acuerdo con el descrito en
7.3.6 y calcular las diluciones que permitan la obtencin de la concentracin
deseada.
7.3.11.3.2 Hacer un recuento en PCA, por duplicado, para conocer el nmero real inoculado
en cada caso. Registrar los recuentos en el RG-712.00.XXX (ver anexo N 3) resultados Agar Plate Count (PCA).
7.3.11.3.3 Para cada microorganismo, calcular las diluciones que permiten la obtencin de
inculos con la concentracin de clulas entre 103 y 104.
7.3.11.3.4 Preparar nueva fase estacionaria usando el mismo lote de medio usado
anteriormente y diluir de acuerdo a lo calculado en 7.3.11.3.3.
7.3.11.3.5 Inocular el medio de cultivo indicado para el enriquecimiento selectivo del
mtodo a probar con los volmenes y diluciones calculadas para cada
microorganismo.
7.3.11.3.6 Incubar y seguir el anlisis de acuerdo con el indicado para el mtodo
7.3.11.3.7 Registrar los resultados en el RG-712.00-XXX- Resultados Presencia/Ausencia.
7.3.12 Interpretacin de los resultados
7.3.12.1Analizar los resultados de exclusividad considerando tanto los aspectos cualitativos
(caractersticas de las cepas, cuales cepas no fueron inhibidas) como cuantitativos
(inhibicin total o parcial) de los interferentes evaluados.
7.3.12.2Es deseable que el mtodo evaluado sea capaz de inhibir total o parcialmente la
mayora de los microorganismos interferentes, especialmente aquellos que presentan
la mayor posibilidad de competicin o confusin con el analito.

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7.3.13 Registro Final

7.3.13.1Al terminar los ensayos, registre todos los resultados obtenidos en RG-712.00-XXX
(ver anexo N 4).

8.

REGISTROS

Identificacin
del registro
RG-712.00-XXX

Almacenamiento

RG-712.00-XXX

Archivador
Registros ?

RG-712.00-XXX

Archivador
Registros ?

RG-712.00-XXX

Archivador
Registros ?

Archivador
Registros ?

Proteccin

Recuperacin Tiempo retencin y

disposicin
rotulado Acceso restringido Papel
5 aos y eliminado en
al personal de la
trozos a en basura
Seccin
de
normal
Microbiologa
Alimentos
rotulado Acceso restringido Papel
5 aos y eliminado en
al personal de la
trozos a en basura
Seccin
de
normal
Microbiologa
Alimentos
rotulado Acceso restringido Papel
5 aos y eliminado en
al personal de la
trozos a en basura
Seccin
de
normal
Microbiologa
Alimentos
rotulado Acceso restringido Papel
5 aos y eliminado en
al personal de la
trozos a en basura
Seccin
de
normal
Microbiologa
Alimentos

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TABLA DE MODIFICACIONES

Revisin N Pg.
Modificada

Motivo del cambio

Fecha Aprobacin

10. ANEXOS
10.1 Anexo N1 Registro Validacin Secundaria para mtodos Normalizados
Lmite de Deteccin RG-712-00-XXX.
10.2 Anexo N2 Registro Validacin Secundaria para mtodos Normalizados
Inclusividad RG-712-00-XXX.
10.3 Anexo N3 Registro Validacin Secundaria para mtodos Normalizados
Exclusividad RG-712-00-XXX.
10.4 Anexo N4 Registro Validacin Secundaria para mtodos Normalizados
Aprobacin Final RG-712-00-XXX.

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