UNIVERSIDAD DE SUCRE

PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

LABORATORIO DE BIOINGENIERIA
EXPERIMENTO N 2
DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES POR EL MTODO
DNS (cido 3,5 - dinitrosaliclico)

1. INTRODUCCIN:
Este mtodo, desarrollado originalmente por Summer (1921) y modificado por
Miller (1959) nos ayuda a determinar la presencia de grupos carbonilos libres
(C=O) en los llamados azcares reductores. Esto involucra la oxidacin del
aldehdo presente en el grupo funcional. Simultneamente, en presencia de
calor el cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) se reduce a cido 3-amino,5nitrosaliclico bajo las condiciones alcalinas, desarrollndose un color amarillo
caf. Se adiciona sulfito (no necesario para la reaccin del cambio de color) en
el reactivo para absorber el oxgeno disuelto, ya que ste puede interferir con
la oxidacin de la glucosa.

grupo aldehdo

DNS

reduccin

oxidacin

grupo carboxilo

cido 3-amino,5-nitrosaliclico

En la reaccin se muestra que un mol de azcar reaccionar con un mol de DNS.

Sin embargo, no cabe duda que se dan muchas otras reacciones y la
estequiometra de la reaccin es mucho ms complicada que lo antes expuesto.
El tipo de reaccin lateral depende de la naturaleza exacta del azcar
reductor. Diferentes azcares reductores arrojan distintas intensidades de
color; as, se hace necesario calibrar para cada azcar. Adems de la oxidacin
de los grupos carbonilos en el azcar, otras reacciones laterales como la
descomposicin de azcar tambin compiten para la disponibilidad del cido
3,5-dinitrosaliclico. Como consecuencia, por ejemplo, la carboxi metil celulosa

puede afectar la curva de calibracin alterando la intensidad del color

desarrollado.
Este es un mtodo conveniente y relativamente barato, aunque su especificidad
no es tan alta (Wang, 1999). Cuando los efectos de compuestos extraos no son
conocidos, uno puede incluir efectivamente el llamado control interno para el
desarrollo del color en muestras desconocidas; entonces, una cantidad conocida
de azcar se adiciona a esta muestra. El aumento en la absorbancia en el
segundo desarrollo de color es equivalente a la cantidad incrementada de
azcar. Altas concentraciones de protena tambin interfieren en la
determinacin de los azcares reductores. Sin embargo, otra de las ventajas
de este mtodo es que el color final desarrollado es estable hasta 24 horas, es
sencillo y rpido.
2. OBJETIVO:
Aplicar una tcnica sencilla, rpida y eficaz para determinar azcares
reductores en caldos y medios de fermentacin que permitan conocer los
rendimientos en sustrato y productos durante un bioproceso.
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales

Tubos de ensayo tapa rosca

Pipetas de 1, 5 y 10 mL
Pipeteador automtico
Auxiliar de pipeteo
Matraz aforado de 1000 mL
Frasco color mbar
Espectrofotmetro
Vortex

b) Reactivos
Solucin del cido 3,5 dinitrosaliclico, 1% :
o
o

DNS: 5 g
Fenol: 1 g

o
o
o

Sulfito de sodio anhidro: 0.25 g

Hidrxido de sodio: 5 g
Aforar a 500 mL con agua destilada

Solucin de tartrato de sodio y potasio al 40% (sal de Rochelle)

Conservar refrigerado dentro de un frasco color mbar para mayor
estabilidad.
Solucin estndar de glucosa :
Disolver 1 gr. de glucosa anhidra en 1000 mL de agua destilada, conservar en
refrigeracin hasta el momento de usarla.
4. PROCEDIMIENTO:
Establecer una escala estndar de 0 a 1000 ppm de glucosa. Dentro de una
serie de tubos de ensayo, previamente lavados y sumergidos en solucin de
cido sulfrico al 5% durante una noche, introducir: 0; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; y 1
mL de solucin estndar de glucosa y completar a 1 mL con agua destilada.
Elabore la siguiente tabla al momento de registrar los datos:
Tubo
1
2
3
4
5
6

mL. de s/n
estndar
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

mL. de agua
destilada
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

Concentracin
final (ppm)
0
200
400
600
800
1000

Absorbancia
(575 nm)
-

La determinacin de azcares reductores es efectuada sobre 1 mL de la

muestra convenientemente diluida; por ejemplo, 1/20. La curva estndar y
las muestras deben ser tratadas con el siguiente procedimiento:

Adicionar 1 mL del reactivo DNS

Agitar fuertemente en un vortex
Poner a ebullicin durante 5 minutos
Adicionar 0.3 mL de la solucin de sal de Rochelle

 Enfriar rpidamente (bao de hielo)

Agitar en un vortex
Leer absorbancia a 575 nm.
5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Grafique la curva de calibracin (Concentracin vs Absorbancia) para la
determinacin de azcares reductores con el mtodo del DNS. Muestre
todos los resultados obtenidos. Calcule el valor de R2.
Calcule la concentracin en azcares reductores (Glucosa) de la muestra
problema.
Consulte otros mtodos utilizados para la determinacin de azcares
reductores y glucosa. Qu ventajas y desventajas presentan para su uso
en biotecnologa?
ADVERTENCIA!
El reactivo DNS es altamente txico, cancergeno y abortivo debido al fenol.
Mucho cuidado al manipularlo. Usar siempre guantes de ltex. (U.S.
Environmental Protection Agency. 2013.)
4.

REFERENCIAS:

Miller, G.L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of

reducing sugar, Anal. Chem., 31, 426-428
Wang, Nam Sun. 1999. Biochemical Engineering Laboratory Manual.
University of Maryland. Deparment of Chemical Engineering.
U.S. Environmental Protection Agency. 2013. Integrated Risk Information
System.
Acceso:
Marzo,
16
de
2013,
En:
http://www.epa.gov/iris/subst/0088.htm.

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Y PARMETROS DE

LA ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN (Vmax y Km)
1. INTRODUCCIN:
La bsqueda de informacin para encontrar informacin para determinar las
propiedades de las enzimas, para su uso a nivel industrial en el diseo de
biorreactores es necesario discriminar modelos que nos permitan calcular la
velocidad intrnseca de reaccin, uno de los modelos mas usados son los
modelos de Michaelis Menten y Briggs y Haldane.
El mecanismo del modelo de Michaelis - Menten se puede describir de la
siguiente manera:
K1

E+S

K2

ES

E+P

K-1

E : Enzima
S: Substrato
ES: Complejo enzima-substrato
P : Producto
K1, k-1, k2 : Constantes de reaccin.
Cuando se mezcla la enzima mas el substrato, se forma un complejo ES e
inmediatamente, se rompe para formar E + S e E + P. Para Conseguir el modelo
matemtico, Michaelis - Menten se asume lo siguiente:
a El estudio se basa en velocidades iniciales, la concentracin de producto en
este caso puede ser considerada despreciable, de forma que la reaccin
inversa prcticamente ocurrir.
b la mezcla de enzima con el substrato ocurre la formacin de un complejo
d [ ES ]
ES, que permanece a una concentracin constante,
0
dt
complementando tenemos:
d [ ES ]
[ E ][S ]K1 [ E ][ P]K 4 [ ES ]K 2 [ ES ]K 3 0
dt

K 2 K 3 [ E ][S ]

Km
K1
[ ES ]

Nota: la constante Km, es la constante de Michaelis-Menten, puede ser

aproximadamente igual la constante de disociacin del complejo [ES], as la
constante K3 es generalmente menor que K1 y K2, asi mismo:
Km

K 2 K3 K 2

K1
K1

Por otro lado, el total de enzima que participa en la reaccin [Eo] es igual a
suma de la enzima libre [E] con una enzima en forma de complexo [ES], que
ser:

E 0 E ES
Visto as K3 es menor que K1 e K2, la transformacin de ES en E + P ser la
etapa limitante del proceso, que es
v K 3 E 0

De la misma forma, toda la enzima esta participando da reaccin, entonces la

velocidad de reaccin estar en su mximo:
v max K 3 E 0

entonces tenemos:

[ E ][S ]
v
[ ES ]
Km

v max [ Eo] [ E ] [ ES ]

v v max

[ E ][S ]
[S ]
Km

[ E ][S ] Km [ S ]
[E]
Km

[S ]
: Ecuacin de Michaelis-Menten
Km [ S ]

De esta ecuacin se tiene que:

Se [S] >> Km v = v max (reaccin de orden cero)
Se [S] << Km v

v max
[ S ] (reaccin de primer orden)
Km

v max
Km = [S]
2
La determinacin de las constantes Km e v max de Ecuacin de MichaelisMenten difcil de ser obtenida a partir do grfico v = fs (s), pues v max es
una asintota sujeta a grandes imprecisiones. Existen maneras ms prcticas de
ser obtener estas constantes, siguiendo la tcnica de linearizacion de ecuacin.
Existen 3 tipos corrientes de linearizaion para a ecuacin de MichaelisMenten: Ecuacin de Lineweaver- Burk, Ecuacin de Eadie-Hanes y ecuacin de
Hofstee,

Se v

2. OBJETIVO:
Medir la actividad enzimtica de una glucoamilasa fngica (A. niger) y los
parmetros de Michaelis-Menten (Vmax y Km) en diferentes condiciones de
reaccin (Concentracin de sustrato, Velocidad de agitacin y temperatura).
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a) Materiales:

Biorreactor de 500 mL (Erlenmeyer)

Agitador magntico
pHmetro
Balanza analtica
Balones aforados
Estufa
Pipetas
Termmetros

b) Reactivos:

4.

Maltosa
Bufer citrato y fosfato
NaOH 0,1N
HCl 0,1N
DNS
PROCEDIMIENTO:

 Preparar 5 soluciones de maltosa con las siguientes concentraciones: 5%,

10%, 15%, 20% y 25% en biorreactores de 500 mL.
Estabilizar el pH a 4,3 con una solucin Buffer citrato; HCl o NaOH 0,1N;
dependiendo del pH inicial.
Estabilizar la temperatura de biorreaccin segn se asigne a cada grupo
(25C, 45C y 65C).
Estabilizar la velocidad de agitacin segn se asigne a cada grupo (200, 400
y 600 rpm).
Realizar una dilucin en agua destilada (1:50) de la enzima glucoamilasa
fngica a utilizar (densidad 1,2 gr/mL).
Adicionar 1 mL de solucin enzimtica en cada biorreactor agitado
continuamente bajo las condiciones ambientales de cada trabajo.
Tomar, exactamente, 1 mL de muestra en los siguientes tiempos: 0, 5, 10,
15, 20, 25, y 30 minutos de biorreaccin.
Inactivar la enzima en agua hirviendo (100C) durante 5 minutos, posterior
choque trmico en bao de hielo (4C).
Determinar la concentracin de glucosa (Producto) presente en cada
muestra utilizando la tcnica del DNS.

5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Calcular la actividad enzimtica de la glucoamilasa fngica (A. niger)
expresada en U.I (cantidad de la enzima que produce 1 mol de
glucosa/minuto) y en AGU (1 AGU es la cantidad de enzima que fragmenta 1
mol de maltosa/minuto).
Calcular el nmero de recambio de la enzima (# molculas de sustrato
transformadas por unidad de tiempo por molcula de enzima).

 Graficar la formacin de producto en funcin del tiempo ([P] vs [t]) y

calcular las velocidades iniciales para cada concentracin de sustrato.
Graficar las velocidades iniciales en funcin de cada concentracin de
sustrato ([Vel.] vs [S] ).
Determinar los parmetros de Michaelis-Menten (Vmax y Km) utilizando los
mtodos de Limeweaver-Burk, Eadie-Hofstee y Langmuir.

6. REFERENCIAS:
Duarte, A. 1995. Introduccin a la Ingeniera Bioqumica. Universidad Nacional
de Colombia. Departamento de Ingeniera Qumica.
Lujn, D., Alvarino, N. 1999. Estudio preliminar para la Obtencin de Jarabe de
Glucosa por hidrlisis enzimtica del almidn de yuca utilizando extractos
crudos de alfa-amilasa y glucoamilasa. Universidad de Crdoba. Programa de
Ingeniera de Alimentos.
Quintero, R. 1981. Ingeniera Bioqumica. Teora y Apliaciones. Mxico. D.F.
Alambra.
Scragg. 2002. Biotecnologa para Ingenieros. Sistemas Biolgicos en procesos
tecnolgicos. Mxico. D.F. Limusa. S.A.
Wiseman, A. 1991. Manual de biotecnologa de los enzimas. Acribia S.A.
Zasragoza.

DETERMINACIN DEL COEFICIENTE VOLUMTRICO DE

TRANSFERENCIA DE OXGENO (KLa)

1. INTRODUCCIN:
En los procesos de fermentacin aerbicos es necesario un suministro
adecuado de oxgeno que satisfaga los requerimientos metablicos de los
organismos empleados.
La oxidacin de la fuente de carbono y su
transformacin en clulas, productos y CO2 establece una demanda de oxgeno
que es esencial satisfacer a travs de la aireacin y mezclado del cultivo. Es
indispensable conocer los requerimientos de oxgeno del cultivo para
asegurarse de que su suministro sea suficiente.
En una fermentacin aerbica por lotes la masa celular y por consiguiente la
demanda de oxgeno aumenta exponencialmente.
En estas condiciones
generalmente no es posible mantener constante la concentracin de oxgeno
disuelto (CL) en el caldo de fermentacin, por la necesidad de equilibrar la
velocidad de demanda de oxgeno (VDO) con la velocidad de transferencia de
oxgeno (VTO) mediante la manipulacin de las variables de operacin.
El oxgeno suministrado usualmente mediante burbujeo de aire al caldo es
transferido desde una burbuja hacia el lquido y luego hacia la pared celular y a
travs de la pared. La mayor resistencia a la transferencia de oxgeno se
presenta en la superficie de separacin gas-lquido entre la burbuja y el
volumen del lquido. Este fenmeno se manifiesta mediante una diferencia de
concentraciones que limita la velocidad de transferencia de oxgeno:
VTO = dCL / dt = KLa. (C* - CL)
Donde, VTO: velocidad de transferencia de oxgeno g/(litro. s) ; KLa :
coeficiente volumtrico de transferencia de masa, s-1 ; C* : Concentracin de
oxgeno en el caldo, g/L

2. OBJETIVO:
Determinar y evaluar el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno
(KLa) en un caldo de fermentacin con variaciones en la velocidad de agitacin
utilizando el mtodo dinmico de desgasificacin.
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
a)

Materiales:
Fermentador de 1 Litro de capacidad
Medidor de oxgeno disuelto (Oxmetro)
Gasa
Mangueras para suministro y salida del aire
Jeringa para toma de muestras
Silicona
Cronmetro
Agitador magntico
Sistema de aireacin
Cmara de Neubauer
Microscopios

b) Reactivos:
Cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae)
Caldo de fermentacin
4. PROCEDIMIENTO:
Inocule en un 10% del volumen de fermentacin el preinculo de levadura
(24 horas de adaptacin) en el fermentador de 1L que contiene el caldo de
fermentacin estril.
Realice el arreglo correspondiente de los accesorios del fermentador
(mangueras, tapn, agitador, suministro de oxgeno, etc).
Antes de accionar el suministro de aire, realice una lectura del oxgeno
disponible con el sistema agitado.
Suministre la mayor cantidad de aire posible (1-2 vvm). Espere que el
sistema logre estabilizarse en cuanto a la concentracin de oxgeno disuelto
(10 minutos).

 Asuma el tiempo cero y comience a medir cada 10 segundos el oxgeno

disuelto durante 10 minutos continuos.
Suspenda el suministro de aire y continu midiendo la misma variable (cada
5 segundos) hasta alcanzar una concentracin de oxgeno disuelto similar a
la inicial cuando el sistema no era aireado.
Reiniciar la aireacin y anotar inmediatamente (cada 5 segundos) la
concentracin de oxgeno disuelto hasta alcanzar la concentracin del
tiempo cero.
Nota: Cada grupo de trabajo realizar la experiencia a una velocidad de
agitacin diferente: 300, 600 y 900 rpm.

MONTAJE DEL SISTEMA

Filtro

OXMETRO

Sensor
Filtro
Bomba de
Aire

Trampa de
gases
Agitador
magntico

5. CLCULOS Y CONSULTAS:
Grafique CL Vs. Tiempo. Utilice todos los resultados continuos del proceso.
Calcule la velocidad de respiracin del cultivo [(O2).x].

 Reporte las diferencias entre la transferencia de oxgeno hacia la solucin y

la demanda de oxgeno por la respiracin del cultivo [KLa.(C* - CL) - (O2).x].
Calcule el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (KLa) para el
cultivo sumergido en fermentacin batch de la Saccharomyces cerevisiae en
glucosa.
Compare el resultado obtenido con el reportado en la bibliografa. Analice
las diferencias si las hay.
Consulte las principales ventajas y desventajas que pueda tener este
mtodo en comparacin a los otros que ya usted conoce.
Qu otros factores pueden alterar el valor del KLa en un sistema de
fermentacin?. Explique.

6. REFERENCIAS:
Bayley, J., OLLIS, D. 1995. Biochemical engineering fundamentals. 2 ed. Mc
Graw Hill, 1986.
Duarte, A. 1995. Introduccin a la Ingeniera Bioqumica. Universidad Nacional
de Colombia. Departamento de Ingeniera Qumica.
Quintero, R. Ingeniera Bioqumica. 1981. Teora y Apliaciones. Mxico. D.F.
Alambra.