TRABAJO PRCTICO N 6

Grupos sanguneos ABO y Rh: pruebas de Coombs

FUENTE: CTEDRA HEMATOLOGA CLNICA UNLP
A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO
POR SEDIMENTACION
a) Preparar una suspensin de hemates de grupo sanguneo desconocido, al 2 % en
salina fresca (vase ms abajo el apartado C. Preparacin de la suspensin globular
al 2%).
b) Agregar una gota de la suspensin globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B,
anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn.
c) Simultneamente controlar cada antisuero contra hemates A1, B y O al 2%
d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
e) Leer primero los controles y luego los problemas microscpicamente en visor y
macroscpicamente.
f) Scores de lectura:
+++ un gran aglutinato
++ varios aglutinatos grandes
+ muchos aglutinatos pequeos
pequeos aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo
- negativo no se observan aglutinatos
B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO
a) Tomar una muestra de suero libre de hemates.
b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensin al 2%,
de los siguientes hemates:
1) hemates A conocidos
2) hemates B conocidos
3) hemates del propio individuo
4) hemates O conocidos
c) Incubar 1 hora a ta o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
d) Leer primero los controles y luego los problemas, microscpicamente en visor y
macroscpicamente.
C. PREPARACIN DE LA SUSPENSIN GLOBULAR AL 2%
a) Separar los hemates del plasma y trasvasar una porcin de los mismos a un tubo de
Kahn.
b) Llenar el tubo con solucin fisiolgica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1
minuto.
c) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces ms, teniendo la precaucin
de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de
solucin fisiolgica.
d) Tomar una gota de culot (50 l) y agregarle 0,5 ml de solucin fisiolgica. Se tendr
as la suspensin al 2%.

D. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA

a)
b)
c)
d)

Colocar una cantidad de sangre total igual a de gota.

Agregar una gota de anti-A absorbido1 y mezclar bien con una varilla de punta fina.
Al terminar de mezclar, disparar el cronmetro.
Rotar la placa en forma circular y observar la aparicin de aglutinacin dentro del
minuto.

Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados:

Glbulos rojos
problema

Suero problema

Anti A
+
+

Anti B
+
+

Anti AB
+
+
+

Grupo ABO
A
B
O
AB

GR A
+
+
-

GR B
+
+
-

GR AB
+
+
+
-

Grupo ABO
A
B
O
AB

E. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh

a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn.
b) Adicione una gota pequea de suspensin de glbulos o en su defecto de sangre
entera de la muestra.
c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm.
d) Desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se har microscpicamente
con un visor y macroscpicamente.
e) Proceda de la misma manera con los tubos controles.
E.1 Controles
a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D
b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D
c) Control de seudoaglutinacin: muestras de sangre + plasma de persona AB.
E.2 Reacciones

Positiva: los hemates D(Rho) positivos permanecern aglutinados al querer

desprender el culot globular.

Negativa: los hemates (Rh-rh) se suspendern nuevamente sin evidenciar

aglutinacin.

Tambin se puede utilizar un monoclonal anti-A1

F. PRUEBA PARA DETECTAR Du

Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer
reacciones negativas frente a sueros anti D. Siempre debe descartarse la posibilidad de
estar en presencia de un individuo Du. Para ello es necesario aplicar la prueba de
Coombs.
Coloque dos gotas de suero anti D(Rho) en un tubo de Kahn2.
Agregue 1 gota de una suspensin sangunea al 2% en salina.
Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37C.
Lave los hemates 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el
volumen del tubo). Centrifugue y elimine el sobrenadante.
5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana.
6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a
1500 rpm, desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se har macro y
microscpicamente.
1)
2)
3)
4)

F.1 Reacciones

Positiva: los hemates Du (Rhou) positivos permanecern aglutinados luego de

intentar desprender el culot globular.

Negativa: los hemates Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspendern y no

aglutinarn.

F.2 Controles utilizados

Se utilizan tres controles para
1. Probar la bondad del suero
2. Comprobar su especificidad
3. Para seudoaglutinacin
Para el primer control positivo deben emplearse hemates Rh positivos de dador
conocido OR1r (Cde/cde). Es aconsejable usar esos hemates y evitar emplear
eritrocitos D(Rho) positivos con el antgeno E(rh) presente ,dado que, en tales hemates
el factor D(Rho) es mas reactivo.
El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que
contenga aglutininas inespecficas para el antgeno en cuestin (por ejemplo: anti-A y/o
anti-B no absorbidos durante la preparacin del suero). Estos dos primeros controles
sirven para demostrar que el suero a emplear es especfico y no posee ningn
contaminante que pueda falsear los resultados.
El tercer control, es de seudoaglutinacin y para ello se reemplaza el suero anti D por
suero de persona de grupo sanguneo AB, se lo enfrenta con los hemates que estn
siendo tipificados.

La deteccin de Du tambin se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du.

G. COMPROBACIN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES

MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS.
G.1 Prueba de Coombs indirecta
1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensin de
hemates de grupo O Rh+ al 2%. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el perodo
de incubacin de 1 hora a 37 C. Proceder de la misma manera con un tubo control
que contiene 2 gotas de solucin fisiolgica y 2 gotas de suspensin de hemates O
Rh+ al 2%.
2) Centrifugar, quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solucin fisiolgica,
eliminando completamente el sobrenadante en el ltimo lavado.
3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2
4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.
5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm.
Leer microscpicamente con visor y microscpicamente.
G.2 Prueba de Coombs directa
6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensin al 2% de hemates problema.
Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensin de hemates O Rh+
sensibilizados al 2%.
7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2
8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.
9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm.
Leer microscpicamente con visor y microscpicamente.

Anti-A, Anti-B o Anti A,B

Monoclonal
Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos ABO

SIGNIFICACION CLINICA
En el ao 1900 Landsteiner descubri que los glbulos rojos humanos podan ser clasificados en A, B, AB u O de
acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antgenos altamente reactivos en su superficie.
Tambin demostr que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfgenos A y B y que el suero de un individuo no
contiene anticuerpos para el antgeno presente en sus propios glbulos rojos pero s contra los que no posee.
Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas observaciones
revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la prctica transfusional. Por este motivo, la tipificacin de los
grupos sanguneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los dems ensayos pretransfusionales.
FUNDAMENTOS DEL METODO
Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal. Si existen en
la superficie de los eritrocitos los antgenos correspondientes, se producir una aglutinacin visible
macroscpicamente. La ausencia de aglutinacin en todos los casos, implica grupo O.
REACTIVOS PROVISTOS
Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados
por lneas celulares de hibridomas de ratn.
REACTIVOS NO PROVISTOS
De acuerdo a la tcnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente:
- Solucin fisiolgica
- Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfatos (PBS)
- Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS)
- Albmina Bovina 30% de Wiener lab.
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Los Reactivos se proveen listos para usar.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS
Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo.
MUESTRA
Glbulos rojos o sangre entera
a) Recoleccin: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa) CPD
(citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de
Wiener lab.
c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD,
CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin
dentro de los 7 das de obtenida la muestra.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Centrfuga
- Tubos de hemlisis
- Placas
- Palillos mezcladores descartables
PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro".
PROCEDIMIENTO

En las siguientes tcnicas la suspensin de glbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solucin fisiolgica, PBS
o LISS.
I- TECNICA EN PLACA
Preparar una suspensin de glbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una suspensin al 35-45% en
plasma del mismo paciente o sangre entera.0
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en una placa limpia, agregar 1 gota de
suspensin de glbulos rojos.
2) Mezclar el Reactivo y los glbulos con un palillo descartable cubriendo un rea circular de 2 cm de dimetro y
balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Observar aglutinacin visible microscpicamente hasta los 2
minutos. No debe emplearse microscopio.
II- TECNICA EN TUBO (por centrifugacin)
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemlisis, agregar 1 gota de
suspensin de glbulos rojos al 3-5%.
III- TECNICA EN TUBO (por sedimentacin)
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemlisis, agregar 1 gota de
suspensin de glbulos rojos al 3-5%.
2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
3) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la aglutinacin.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas utilizadas) indica una reaccin positiva.
Grupo sanguneo
A
B
0
AB
Variants dbiles del
grupo A como Ax

Anti-A
+
+
+/-

Antisuero
Anti-B
+
+
-

Anti-A,B
+
+
+
+

METODO DE CONTROL DE CALIDAD

El control de calidad puede efectuarse ensayando glbulos rojos tipificados.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Reacciones dbiles pueden observarse en las siguientes situaciones:
- Neonatos: los antgenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recin nacido. Por esta razn deben
extremarse los cuidados, sobre todo en los prematuros.
- Leucemias u otros desrdenes malignos.
- Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idntico.
- Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificacin de los grupos sanguneos
ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas, colorantes, compuestos qumicos o con partculas de slica
coloidal liberadas de vidrios de mala calidad.
- Aglutininas fras: en presencia de aglutininas fras, el lavado de los glbulos rojos 4-6 veces con solucin fisiolgica,
resulta generalmente suficiente para obtener clulas aptas para la tipificacin. En muy raras ocasiones se requiere un
calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. Como control, se coloca una gota de
estas clulas con 2 gotas de solucin
fisiolgica. No debe producirse aglutinacin.
PRESENTACION
Anti-A: frasco x 10 ml (Cd. 1443152).
Anti-B: frasco x 10 ml (Cd. 1443154).
Anti-AB: frasco x 10 ml (Cd. 1443153).
BIBLIOGRAFIA
- Moore, S. et al. Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use. Pars,
France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59.
- Widman, F.K. Technical Manual. 9th Edition, Washington, D.C. American Association of Blood Banks 1985. Chapter 8.
2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar
macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.

Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Tc.: Viviana E. Ctola
Bioqumica
Producto Inscripto M.S.
Disp. N: 1076/89 (Anti-A)
Disp. N: 1073/89 (Anti-B)
Disp. N: 1071/89 (Anti-A,B)

Anti-D (Rho)
monoclonal
Reactivo para la deteccin de antgeno D (Rho)

SIGNIFICACION CLINICA
Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el
conocimiento actual de la importancia clnica de la deteccin en el laboratorio de los anticuerpos anti-D.
Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del
antgeno D y son fcilmente estimulados cuando reciben este antgeno, ya sea por transfusin o durante el parto,
produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad
hemoltica del recin nacido.
Existen muchos otros antgenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antgeno D el que posee mayor
importancia en la clnica despus del sistema ABO.
FUNDAMENTOS DEL METODO
Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la superficie del eritrocito
el antgeno correspondiente, se producir una aglutinacin visible macroscpicamente.
REACTIVO PROVISTO
Anti-D (Rho): solucin de anticuerpos monoclonales humanos.
REACTIVOS NO PROVISTOS
De acuerdo a la tcnica empleada puede requerirse adicionalmente:
- Solucin fisiolgica.
- Suero Anti-humano (poliespecfico) provisto separadamente por Wiener lab.
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Anti-D (Rho): listo para usar.
PRECAUCIONES
El reactivo es para uso diagnstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS
Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo.
MUESTRA
Glbulos rojos o sangre entera
a) Recoleccin: obtener la sangre en forma asptica con o sin anticoagulantes.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa), CPD
(citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).
c) Sustancias interferentes conocidas: los glbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del
complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha esta situacin deber realizarse una
Prueba de Antiglobulina Directa.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC).
Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o
CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de
los 7 das de obtenida la muestra.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
Dependiendo de la tcnica que se emplee, podrn ser necesarios:
- Centrfuga
- Tubos de hemlisis
- Placa de vidrio
- Palillos mezcladores descartables

PROCEDIMIENTO
I- TECNICA EN PLACA
Preparar una suspensin de glbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autlogos, o solucin fisiolgica. Tambin
puede emplearse sangre entera.
1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia.
2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.
3) Mezclar el antisuero y los glbulos rojos con un palillo descartable en un rea de 2 cm de dimetro y balancear
constantemente la placa durante 2 minutos. Observar macroscpicamente la presencia o ausencia de
aglutinacin.

II- TECNICA EN TUBO

Preparar una suspensin de glbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autlogos, o en solucin fisiolgica.
1)
Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis.
2)
Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.
3)
Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm.
4)
Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de
aglutinacin.
Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos, luego centrifugar y volver a
leer como se describi en 4). Las muestras que an en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas
respecto al antgeno Du.
III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du
Preparar una suspensin al 3-5% de glbulos rojos en plasma o suero autlogos, o solucin fisiolgica.
1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis.
2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.
3) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos.
4) Lavar las clulas 3-4 veces con solucin fisiolgica, descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las
clulas luego de cada lavado.
5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico), mezclar, centrifugar 20 segundos a 3500 rpm.
6) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin positiva.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
La prueba para tipificacin de antgeno D (Rho) de glbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio
salino. La determinacin del Du no puede efectuarse sobre glbulos rojos sensibilizados.
Pueden obtenerse resultados ms rpidos y mejor visualizacin precalentando la placa a 45-50 oC.
PRESENTACION
Frasco x 10 ml (Cd. 1443155).
BIBLIOGRAFIA
- Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940.
- Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959.
- Widman, F.K. - Technical Manual - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of Blood Banks, Chapter 9,
1985.
- Race , R.R. and Sanger, R. - Blood Groups in Man - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific Publications, pg. 178, 1975.

Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
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Dir. Tc.: Viviana E. Ctola
Bioqumica
Producto Inscripto M.S.
Disp. N: 1074/89

Suero Anti-humano
(poliespecfico)
Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta

SIGNIFICACION CLINICA
Las experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina
Humana resultaban los mejores mtodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes.
El ejemplo descripto originalmente haca referencia a antgenos del sistema Rh.
Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la deteccin de anticuerpos en casi todos los grupos
sanguneos de importancia clnica, siendo empleadas actualmente en los siguientes casos:
Prueba Antiglobulina Indirecta
- Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos.
- Pruebas de compatibilidad previas a la transfusin.
- Fenotipo de glbulos rojos.
- Identificacin y titulacin de anticuerpos encontrados en
suero o eluatos.
Prueba Antiglobulina Directa
- Diagnstico de laboratorio de anemia hemoltica y enfermedad hemoltica del recin nacido.
- Investigacin de reacciones dudosas en una transfusin.
- Investigacin de enfermedades autoinmunes que involucran la unin de inmunoglobulinas y/o fracciones del
complemento a los glbulos rojos.
FUNDAMENTOS DEL METODO
El agregado de Suero Anti-humano (poliespecfico) a glbulos rojos que estn cubiertos de inmunoglobulinas y/o
Fragmentos de complemento (C3b, C3bi, C3dg o C3d), produce una aglutinacin de los glbulos rojos visible
macroscpicamente.
REACTIVO PROVISTO
Suero Anti-humano (poliespecfico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G
purificada y C3.
REACTIVOS NO PROVISTOS
- Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos.
De acuerdo a la tcnica a emplear puede requerirse adicionalmente:
- Solucin fisiolgica.
- Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfato (PBS).
- Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS).
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Suero Anti-humano (poliespecfico): listo para usar.
PRECAUCIONES
El Reactivo Provisto es para uso diagnstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS
Desechar el reactivo si se observa contaminacin del mismo.
MUESTRA
Glbulos rojos
a) Recoleccin: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa) CPD
(citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de
Wiener lab.

c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD,
CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin
dentro de los 7 das de obtenida la muestra.
Cuando se efectan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de
la extraccin).
Si los glbulos provienen de cogulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Centrfuga
- Bao de agua a 37oC
- Tubos de hemlisis
PROCEDIMIENTO
I- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin salina de fuerza inica normal).
1) En un tubo de hemlisis colocar 2 gotas del suero a probar.
2) Agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS.
3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos.
4) Lavar los glbulos 3 veces con PBS teniendo la precaucin de descartar completamente el sobrenadante y
resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente el sobrenadante luego del ltimo
lavado.
5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico) al botn de clulas. Mezclar perfectamente y centrifugar
durante 15 segundos a 3.500 rpm.
6) Resuspender las clulas por agitacin y observar macroscpicamente. Tener en cuenta que agitaciones
demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones dbiles.
7) Los resultados negativos deben confirmarse por adicin de glbulos rojos sensibilizados con IgG dbiles.
II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin fisiolgica de baja fuerza inica).
El empleo de esta solucin permite reducir el tiempo de incubacin a 15 minutos.
Los glbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con esta solucin una
suspensin de glbulos rojos al 3%.
1) Colocar en un tubo de hemlisis 1 gota de suero a probar.
2) Agregar 1 gota de glbulos rojos a probar al 3% en LISS.
3) Mezclar e incubar a 37C durante 15 minutos en bao de agua.
Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la tcnica I).
III- PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA
Se emplea para demostrar la absorcin in vivo de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glbulos
rojos.
1) Preparar una suspensin de glbulos rojos a probar en PBS al 3%.
2) En un tubo de hemlisis colocar 1 gota de esta suspensin y continuar con los pasos 4) a 7) de la tcnica I).
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin positiva.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas:
- Contaminacin qumica o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba.
- Lavado inadecuado de las clulas.
- Tiempo o temperatura de incubacin inadecuados.
- Tiempo o velocidad de centrifugacin inadecuados.
- Concentracin inadecuada de glbulos rojos.
- Agitacin excesiva para despegar los glbulos rojos aglutinados.
Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos
a los glbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen.
PRESENTACION
Frasco x 10 ml (Cd. 1443156).
BIBLIOGRAFIA
- Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945.
- Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945.
- Widman, F.K. - Technical Manual. 9th ed. Washington D.C. American Association of Blood Banks, pg. 376, 1985.

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Bioqumica
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Disp. N: 2503/91

Determinacin de anticuerpos inmunes

A. TITULACIN DE ANTICUERPOS
A.1 Tcnica bsica de titulacin
A.1.1. Preparacin de diluciones madres.
a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el nmero de
tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario).
b) En los tubos 2 al 10, colocar 0,100 ml de solucin fisiolgica (SF). Colocar 0,300
ml de suero a titular en el tubo N1.
c) Tomar 0,100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N2.
d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. Luego se toman 0,100
ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N3. Homogeneizar y repetir la
operacin hasta completar las diluciones.
A.1.2 Titulacin
a) Se toman 10 tubos de Kahn, numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla.
Con una pipeta Pasteur para cada dilucin, colocar 2 gotas de las mismas en los
correspondientes tubos.
b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensin de hemates al 2%. Agitar la
mezcla.
c) Incubar a la temperatura apropiada , el tiempo requerido.
d) Simultneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinacin y de especificidad
del suero.
e) Leer los resultados macro y microscpicamente comenzando por los controles y
luego por el tubo de mayor dilucin. El grado de aglutinacin se considerar segn
los scores anteriormente indicados.
El ttulo es la recproca de la dilucin ms alta donde se observa aglutinacin . Si en la
ltima dilucin, con aglutinacin, el tipo de aglutinato es tr, el ttulo se determinar
promediando dicha dilucin con la precedente. Por ejemplo, si en el tubo N 5 cuya
dilucin es 1/16, el tipo de aglutinato es tr, el ttulo ser (16+8)/2=12.
a) Control de autoaglutinacin: consiste en enfrentar dos gotas de suspensin de
hemates a usarse con dos gotas del suero del dador de hemates.
b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hemates O
con dos gotas del suero a titular.