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Sem RMN
Sem RMN
Nn
Spin
Par
par
0 Inactivos
Par
Impar
Impar
Par
1/2 3/2
Impar
Impar
1, 2
Un ncleo sin espn, tiene un momento magntico igual a cero porque no tiene carga circulando. Estos ncleos
tienen un valor de espn igual a cero, I=0. Todos los ncleos que poseen un nmero msico(N) y un nmero de carga (Z)
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par tienen un nmero de espn igual a cero (ej: C y O). Los ncleos que poseen un nmero impar de neutrones y
protones generalmente tienen un nmero cuntico de espn entero distinto a cero porque el nmero total de nucleons
(creo que se refiere a los neutrones y protones desapareados) desapareados es par, y cada uno contribuye en al nmero
cuntico. Tambin estn los ncleos que tienen un nmero par de protones y un nmero impar de neutrones, o viceversa,
que poseen un nmero de espn no entero (tienen nmero fraccionados) porque poseen cantidad de nucleons
desapareados impares.
Dentro de este ltimo grupo de ncleos, se encuentran ncleos con importancia biolgica como
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H, C, N, F y P que tienen nmero de espn igual a , I=1/2. En el modelo, actan como cuerpos
esfricos con carga uniformemente distribuida en su superficie que giran sobre un eje provocando la
circulacin de la carga, y esto genera un campo magntico que da como resultado un momento
magntico nuclear. Que tenga un I=1/2 significa que cualquier carga que se aproxime al ncleo va a
experimentar el mismo campo magntico sin importar la direccin por la cual se acerca. Esto da como
resultado, un momento elctrico cuadripolar igual a cero (igual que en los ncleos con I=0); este
parmetro describe la forma efectiva que tiene la distribucin de la carga del ncleo elptico.
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Sin embargo, la mayora de los ncleos magnticos actan como cuerpos que
giran sobre un eje con la carga distribuida de forma no esfrica, estos son ncleos con
nmeros de espn igual 1 o igual a mltiplos enteros de . El modelo, los describe como
elipsoides que giran sobre su eje principal. Estos pueden tener forma de prolato o de
oblato, ambos presentan un campo magntico anisotrpico (diferentes caractersticas
segn la direccin), es decir, que el trabajo electroesttico al traer una carga a una dada
distancia es distinto segn la direccin a la cual se aproxime. Por esta razn, tienen momentos elctricos cuadripolares
2
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distintos a cero, por convencin, el prolato tiene un valor mayor a cero ( H y N) y el oblato menor a cero ( O, S y Cl).
Nmero Magntico Cuntico
Una propiedad macano-cuntica del espn nuclear es que el valor promedio del vector del momento magntico
sobre una direccin dada toma valores especficos descriptos por un grupo de nmeros cunticos magnticos, m=2I+1,
integrado desde +I a I. (I= valor de spin)
1/2
El vector del momento angular del espn, I, tiene magnitud igual a [I(I+1)] , y su componente en z es m. Tanto la
direccin como la magnitud del vector del momento angular de espn estn cuantizados (slo pueden tomar valores
determinados). En la ausencia de un campo magntico externo, este vector no tiene una direccin preferencial y el eje z
es arbitrario; pero cuando se aplica un campo magntico externo, la direccin de este determina el eje z. El momento
angular de un ncleo con espn dentro de un campo magntico externo, tiene dos direcciones posibles, Iz=+-1/2 (m =
2.+1= 2); mientras que un ncleo con espn igual a 1 tiene tres orientaciones posibles, Iz=0,+-1/2 (m = 2.1+1= 3).
Energa
aplicada
Magnetizacin Nuclear
Un ncleo cargado que gira sobre un eje crea un campo magntico y el momento magntico () resultante est
orientado sobre el eje del espn y es directamente proporcional al vector del momento angular (I).
= I
es la cte giromagntica. Para un dado B, determina la diferencia de energa entre los dos estados de espn
El momento magntico de un ncleo es paralelo al momento angular de espn si la cte giromagntica es positiva, y
es antiparalelo si la cte giromagntica es negativa.
En ausencia de un campo externo B0, todas las orientaciones 2I+1 de un ncleo con espn I tienen la misma energa.
Esta situacin cambia cuando se aplica un B externo, donde la energa del momento magntico est dada por,
E= - . B0 (producto escalar)
Debido a que el eje z deja de ser arbitrario, y coincide con la direccin z del B,
E=-z B0
Por lo mencionado antes, sabemos que:
Iz=m
E= B0
z=Iz
Los ncleos con espn dan lugar a dos posibles estados: m=+1/2, -1/2. La diferencia de energa entre ambos est
dada por,
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E= - B
E= + B
E= B0
= h/2
E= h = B0 h/2
= B0 /2 [Hz]
sensibilidad
Cada ncleo absorbe a una
dada
Si la cte giromagntica es positiva, el estado de menor energa es +1/2; pero si la cte es negativa este es el estado
de mayor energa.
En RMN se trabaja principalmente con ncleos que tienen I=1/2 porque, adems de estar presentes en las
molculas biolgicas, son ms sencillos debido a que, en presencia de un B estos espines van a tener slo dos
orientaciones posibles (a favor y en contra de B) y por lo tanto dos niveles de E. La situacin ms favorable, el estado de
menor E (E), va a ser a favor del B; mientras que la situacin menos favorable, el estado de mayor E (E), va a ser en
contra del B.
Distribucin del ncleo entre los distintos estados energticos
Cuando se aplica un B, los ncleos tienden a alinearse con el campo adquiriendo el estado energticamente ms
favorable; esta alineacin se opone a la agitacin trmica de las partculas en general. El porcentaje de ncleos en cada
estado cuntico se puede calcular por la distribucin de Boltzmann:
N
N
=e
E
kT
=e
h
kT
Debido a que h <<kT a la temperatura que se realiza un experimento de RMN, hay solamente un pequeo exceso
de espines en el estado de menor energa, en otras palabras, en las condiciones de experimentacin de RMN la diferencia
de energa entre los estados es muy chica, entonces el estado de mayor energa est poblado. Por esta razn, la tcnica de
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RMN no es sensible comparada con otras espectroscopias (la relacin seal/ruido en RMN es baja). Para solucionar este
problema se pueden usar campos magnticos ms fuertes y se pueden sumar muchos espectros (sumar scans) de manera
que las seales se van sumando mientras que el ruido aleatorio se va cancelando; adems, es preferible usar ncleos con
1
ctes giromagnticas altas y que tengan abundancia natural, ej: H.
Sustituyendo ,
N
N
=e
hB0
2kT
En presencia de un B0, los spines no estn orientados totalmente a favor o en contra del campo, sino que estn
inclinados un cierto ngulo y estn precesando alrededor de la direccin del campo con una velocidad B0=w0. si el B0 esta
en la direccin z, los spines estarn distribuidos como un abanico. Luego, existe un vector a favor del B0 que va a tener
mayor magnitud porque es mayor la poblacin de spines Magnetizacin resultante.
En el equilibrio, un diagrama de energa representando la distribucin de Boltzmann para 2n ncleos incluye los
momentos magnticos individuales distribuidos en dos conos sobre el eje +z y el z. Dependiendo del signo de la cte
giromagntica uno de los dos ejes va a estar un poco ms poblado que el otro dando lugar a una magnetizacin neta en
esa direccin. Por ejemplo, si es positiva, una cantidad mayor de ncleos van a estar alineados con el campo, y la
magnetizacin resultante tendr direccin +z. Si escribimos la ecuacin anterior como una serie de Maclaurin slo hasta el
segundo trmino, obtenemos un importante resultado: N/N=1-hB/2kT
La relacin entre los ncleos en un estado y en el otro est relacionada linealmente con el campo magntico; esto
demuestra que la intensidad de la seal de RMN incrementa linealmente con la fuerza del campo magntico.
Descripcin Mecnica Clsica
Si consideramos un solo espn, es necesario hacer un anlisis mecnico cuntico porque los fenmenos atmicos no
se comportan bajo las leyes clsicas (no obedecen la mecnica de Newton). Sin embargo, la seal observada en un
experimento de RMN proviene de un gran conjunto de espines, entonces la seal detectada (el valor de la magnetizacin
en el eje x o y) s se comporta de manera clsica. Esto es obvio si tenemos en cuenta que la muestra que utilizamos en un
experimento de RMN es un objeto clsico, entonces se espera que se comporte como tal.
Ahora consideramos una muestra compuesta por muchos ncleos idnticos con un I=1/2. Se puede representar un
1/2
momento angular con una longitud igual a [I (I+1)] y su componente en z es m. El principio de incertidumbre no nos
permite especificar las componentes x e y del momento angular, slo sabemos que est en algn lugar en el cono
alrededor del eje z. En usencia de un campo magntico B0, la muestra est compuesta por el mismo nmero de espines de
distinta energa con sus vectores ubicados a ngulos () al azar sobre el cono. Los ngulos () son impredecibles, y en este
paso consideramos los vectores de los espines como estacionarios. La magnetizacin de la muestra (M), su momento
nuclear neto, es cero. (M=0).
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Procesos de Relajacin
Hay dos tipos de procesos de relajacin en RMN
1. El primero est relacionado con el establecimiento del equilibrio trmico debido a la asociacin de imanes
nucleares con diferentes energas. Suponiendo que la frecuencia de Larmor es similar para todos los ncleos, estos se
encuentran en fase y pueden intercambiar energa. El sistema vuelve a su equilibrio trmico de forma exponencial, con
una cte de tiempo denominada tiempo de relajacin longitudinal, Tl . Esta cte refleja la eficiencia de acoplamiento entre un
espn nuclear y su entorno (lattice), por eso tambin se denomina tiempo de relajacin spin-lattice. Tl es una medida de la
regeneracin de la componente en Mz, la cual es funcin del intercambio de energa. Este proceso depende de cmo la
muestra le puede ceder energa al medio; por esto es un proceso conservativo. Este proceso de relajacin es un efecto
-3
2
energtico, que toma valores entre 10 a 10 s para lquidos y un rango mayor para slidos. Un valor de Tl menor implica
un acoplamiento efectivo, y viceversa.
El T1 dar informacin acerca de:
Tiempo de correlacin rotacional (r)
Acoplamiento dipolar
2. El segundo proceso est relacionado con la perdida de fase de algn ncleo con respecto a todos los ncleos que
estn precesando a la misma frecuencia. Si por cualquier proceso los ncleos pierden su coherencia de fase, va a haber
tantos componentes negativos como positivos en el plano xy dando como resultado un vector que se mueve hacia el eje z.
Este proceso que involucra la cada de las componentes xy de la magnetizacin a cero, ocurre exponencialmente con una
cte de tiempo denominada tiempo de relajacin transversal, T2. Esta relajacin se debe a procesos no conservativos
porque son procesos que dependen de la entropa del sistema. T2 est relacionada con el ancho de banda espectral: 1/2=
1/ T2. Los valores tpicos de T2 en RMN de protn son del orden de los segundos, que corresponde a un ancho de banda
de 0.1Hz. Hay que tener en cuenta que en la prctica el campo magntico no es homogneo, y ests diferencia son las que
ms afectan a la frecuencia de Larmor y por ende al ancho de banda.
Se puede dar por:
Interacciones spin-spin por desfasajes en Mxy
Imperfecciones en la homogeneidad del magneto
No puede ser mayor que T1
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T2 1/ r
Ancho de banda r
Para MM de PM, r ancho de banda
BAJA RESOLUCION
Molculas grandes, como la protenas, tiende a relajarse lentamente debido a la gran interaccin con el medio,
dando como resultados Tl grandes. Hay que tener en cuenta que distintas regiones pueden tener distintos tiempos de
relajacin, lo que indica diferencias en la movilidad de la molcula.
r: tiempo de correlacin rotacional
Segn las medidas de r se pueden dividir a las protenas en:
-11
-2
wH r=2,5 10
wH r=250
1/ T2= r
MM > r > nuevo problema
en protenas (MM), mucho .
El T1 y el T2 dependen de cada tomo, por lo que nos dan informacin sobre la movilidad.
Efectos del medio ambiente nuclear en RMN
La frecuencia de Larmor de un dado ncleo est fuertemente afectada por su entorno qumico. Como
consecuencia, el espectro de RMN de una protena da informacin que permite elucidar su estructura qumica. El
corrimiento en la frecuencia de absorcin de un ncleo debido a su entorno qumico se denomina Desplazamiento
Qumico (Chemical shift). Otro efecto que tiene el entorno nuclear sobre los ncleos es el Desdoblamiento spin-spin.
Mientras que el primer efecto es dependiente de la fuerza del campo magntico, el segundo efecto no lo es.
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Parmetros en RMN:
Desplazamiento qumico
Acoplamiento spin-spin: Escalar y Dipolar
T1
T2
Desplazamiento Qumico
Este fenmeno ocurre porque el campo magntico, B, que experimenta el ncleo atmico difiere ligeramente del
campo magntico externo aplicado, B0. B es un poco ms pequeo que B0 (B< B0) debido al apantallamiento que producen
los electrones cercanos. El campo externo induce la circulacin de los electrones alrededor de las orbitas atmicas, que
4
5
genera un pequeo campo magntico B opuesto en direccin al B. B es tpicamente unas 10 -10 veces menor que B. El
campo que siente el ncleo esta dado por,
B= B - B = B (1-)
Donde es la cte de apantallamiento, y es muy sensible al entorno qumico, depende del medio.
La frecuencia de resonancia se transforma en,
= B(1-)/2 la frecuencia de resonancia
de un ncleo en su tomo es
menor que la del mismo ncleo desnudo.
El desplazamiento qumico no puede compararse con resultados de diferentes equipos porque depende de las
propiedades del campo magntico. Adems, la cte de apantallamiento no es una medida conveniente para calcular el
corrimiento. Por estas razones, se define el desplazamiento qumico en trminos de la diferencia de resonancias entre el
ncleo de inters y un ncleo de referencia (ej: tetrametil silano, TMS):
= (x-ref)/o [ppm] o es la frecuencia del campo
es independiente del B0
De esta forma, este parmetro es independiente del equipo que se use.
El desplazamiento qumico depende de muchos factores, pero el ms importante y significativo es la densidad
electrnica del entorno. Una alta densidad electrnica causa un gran efecto de apantallamiento (B), lo que implica que el
campo magntico aplicado debe ser incrementado para obtener resonancia. Esto da lugar a un corrimiento de la seal a
regiones de mayor campo y menor .
B se debe B0
Lo contrario sucede si la densidad electrnica es baja. Por ejemplo, si un protn est unido directamente a un
tomo electronegativo como un grupo carbonilo, que tiene una densidad electrnica baja, el desplazamiento qumico ser
grande y tendr valores de altos.
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A
g
u
a
Arom
ati
co
Amina/da
10
HC,
Protones = 4 y 6 ppm
0
HN backbone
Acoplamiento dipolar
Se transmite a travs de una distancia < 5
Depende de la orientacin
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Hay un orden de J:
Primer orden: interaccin entre 2 ncleos unidos por un enlace. Si este enlace es CC J si paso a un enlace
doble o triple.
Segundo orden: ncleos separados entre 2 enlaces. Ej: HCH
Tercer orden: Acoplamiento de tres enlaces: es el acoplamiento escalar ms til para analizar estructuras
moleculares. El valor de este acoplamiento esta dado por la ecuacin de Karplus:
2
J () = A cos + B cos + C
Donde es al ngulo diedro entre protones. Los valores de A, B y C son parmetros experimentales. Los valores
tpicos son A=2Hz, B=-1Hz y C=10Hz.
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Esta ecuacin muestra como a partir de la constante de acoplamiento entre el NH y el C se puede obtener
informacin conformacional del backbone de la protena a travs de su ngulo diedro. Los dos mayores componentes de la
estructura secundaria de una protena, hlices y lminas :
-hlice tiene un =120 J< 6Hz
-sheet tiene un =180 J= 7Hz
Tcnica de irradiacin selectiva
1
Se utiliza para averiguar que H estn acoplados con otros.
HA esta acoplado con HM y HX veo 2 dobletes, uno con JAX y el otro con
JAM.
En un experimento de irradiacin selectiva:
1 se realiza un espectro de RMN 1D (normal) de protn para obtener
todas las seales y saber a que frecuencia absorben.
2 se realiza un espectro de protn, en el que adems de excitar todas las
bandas, se excita selectivamente al ncleo que absorbe a 8,5 ppm. Excitando
No se tienen en cuenta porque se
continuamente a la frecuencia de absorcin del ncleo x, hago que se igualen las
intercambian muy rpido con el solvente
poblaciones y como resultado la seal desaparece. Se hace que HA tenga
transiciones muy rpidas a favor y en contra del campo B0 de modo que ahora HA ve un promedio y el doblete desaparece.
El acoplamiento dipolar se presenta a travs del espacio, es decir, que se requiere proximidad espacial y depende
de la orientacin del campo magntico externo. Este acoplamiento se presenta como la influencia que ejerce el campo
magntico de un ncleo activo sobre otro ncleo activo cercano.
15
15
1
El B en N en la direccin del B0, puede o en relacin a B0 dependiendo de la orientacin del vector N H y
1
del spin H.
B0
Solo la componente paralela al campo magntico externo lleva a la interaccin. La componente z del campo dipolar
del ncleo I cambia la frecuencia de resonancia del ncleo S por una cantidad que depende en la distancia internuclear r y
en el ngulo .
B0
1
C
15
Los acoplamientos dipolares ensanchan el espectro de RMN, en estado solido son muy anchos.
En solucin, este acoplamiento no se observa dado que el promedio de los diferentes acoplamientos en molculas
que se encuentran en movimiento aleatorio con respecto a B se promedian obteniendo un valor cero, debido a que las
molculas se reorientan muy rpido. Entonces se ve un promedio en el tiempo, as, se resuelve mejor, pero se pierde
informacin si hay un poco de alineamiento Residual Dipolar Coupling (RDC). Pese a esto, este acoplamiento se
manifiesta a travs del efecto nuclear Overhauser (NOE). Este efecto es un cambio de intensidad que nace de esta
interaccin dipolar. La intensidad de la seal debido al NOE guarda una relacin con la distancia entre los ncleos
interactuantes:
6
I (NOE) = k / (rAB)
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DD
= j k h / 4<rjk >
TCNICAS EXPERIMENTALES
Transformada de Fourier
Tradicionalmente, se utilizaban espectrmetros de onda continua, lo que implicaba largos experimentos y una
recopilacin de datos muy lenta. Luego se utilizaron espectrmetros con muchos canales, lo que permita la medicin
simultnea de numerosos puntos; pero el instrumento tiene como lmite la cantidad de canales que puede tener. No fue
hasta que se crearon los instrumentos de pulso de Fourier que se pudo utilizar la tcnica de RMN de manera sensible y de
alta resolucin. Como se tienen que resolver diferencias de energa muy chicas, se necesitara mucho tiempo; para cada
valor de frecuencia hay que hacer muchos espectros se excita a TODAS las frecuencias con un pulso que dure poco
tiempo. La intensidad que corresponde a cada frecuencia se obtiene analizando cmo vuelven al equilibrio los momentos
magnticos luego del pulso.
Bobina de
deteccin
En el instrumento de pulso de Fourier, los datos son recolectados en funcin del tiempo; pero el investigador est
interesado en la respuesta de los sistemas de espn en funcin de la frecuencia. Por suerte, estos dos dominios estn
relacionados y se pueden convertir uno en el otro usando un procedimiento denominado Transformada de Fourier. Esta
transformacin, relaciona los datos en funcin del tiempo f(t) con los datos en funcin de la frecuencia f():
+
f ( ) = f (t ) e it dt
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Esta es una transformada continua porque la integracin abarca desde infinito positivo a infinito negativo. En la
prctica puede acotarse sobre un rango de tiempo finito:
f ( ) = f (t ) e it t
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seal medida procesada en una computadora es una lnea de baja frecuencia obtenida de la diferencia entre la frecuencia
transmitida y la detectada.
La muestra es ubicada en el centro del imn cilndrico para asegurarse de que todos los ncleos magnticos
experimenten el mismo campo. El imn superconductor opera a la temperatura del Helio lquido (4K), pero la muestra
est a temperatura ambiente.
Con el objetivo de perturbar el sistema de espn con energa del orden de las radiofrecuencias, el espectrmetro
posee sofisticados programas de pulso y unidades de transmisin
que permiten la aplicacin de complejas secuencias de pulsos.
La fuente de la radiofrecuencia es un cristal oscilador
estable que funciona continuamente, y todas las frecuencias en el
espectrmetro derivan de l. La seal de onda continua
proveniente de esta fuente se controla en amplitud y fase con una
unidad de puerta.
La secuencia pulso/adquisicin/retardo se repite N veces
para aumentar la relacin seal/ruido.
Experimentos de Simple Pulso
Adquisicin y procesamiento de datos
Despus de un retardo inicial, se le aplica el pulso a la muestra con un espiral de radiofrecuencia. El detector se
enciende y, luego de un tiempo muerto corto, se mide la respuesta del sistema de espn y se almacena en la computadora.
El tiempo de adquisicin de datos debe ser largo para asegurarse de que la respuesta del sistema decay lo suficiente
hasta hacerse insignificante (un par de veces T2). Otro retardo permite que la muestra de espines vuelva completamente
al equilibrio (relajacin Tl). Cuando la frecuencia del pulso, , se iguala a la frecuencia de Larmor, el vector de
magnetizacin nuclear se inclina fuera de la direccin z. Como el pulso es sobre la direccin x, y el ngulo de inclinacin es
hacia y. Esto puede explicar por que RMN es una tcnica de resonancia. Resonancia es una condicin en la cual la energa
es trasladada de tal manera que una pequea perturbacin produce un gran cambio en algunos parmetros del sistema
perturbado. RMN es una tcnica de resonancia porque una pequea perturbacin peridica, Bl, produce un gran cambio
en la orientacin del vector de magnetizacin de la muestra. El ngulo de inclinacin est dado por,
= B l tp
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porque los ncleos pueden procesar libremente en la ausencia de Bl. FID es la sumatoria de los voltajes oscilantes
individuales provenientes de los distintos ncleos de la muestra, cada uno con su frecuencia, amplitud y T2 caracterstico.
FID es la pareja de Fourier del espectro de frecuencias de RMN.
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I = I [1-2 e
]
Si I=0 /T1 = ln 2
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El pulso inicial de 90 inclina el vector de magnetizacin sobre el eje y. Si los ejes estuvieran rotando exactamente
a la frecuencia de Larmor de los ncleos, el efecto de T2 es el gradual acortamiento de M en la direccin y. Pero como B0
no es perfectamente homogneo, algunos de los espines de la muestra precesan ms rpido (1 y 2) y otros ms lento (3 y
4) que el marco de coordenadas rotatorio; los ms rpidos se mueven en contra de las agujas del reloj mientras que los
ms lentos lo hacen en direccin de las agujas. Como resultado de esta disparidad, los vectores de los espines se dispersan
(se separan) sobre el plano xy durante 1, despus del pulso de 90. Al final de 1, se aplica un pulso de 180 que manda los
espines al eje +y. Los vectores dispersados todava precesan en la misma direccin y a la misma velocidad. Durante el 2
(misma duracin que el anterior), todos los vectores se refocalizan sobre el eje +y para dar la magnetizacin mxima en el
plano xy (este es el eco). Si se monitorea la seal de RMN durante esta secuencia 90- -180- , la seal desaparece
durante el primer y despus se recupera para dar el mximo, el eco de espn, cuando los vectores son refocalizados. La
amplitud se reduce por la relajacin T2 y por los efectos residuales del sistema espn-lattice. La cte de tiempo por la
disminucin de la magnitud del eco es la verdadera T2, porque los efectos de la prdida de homogeneidad del B0 son
eliminados en el proceso de refocalizacin.
Nuclear Overhauser Enhancement (NOE) permite medir interacciones dipolares
El NOE se ilustra como un sistema de 2 spines I y S no equivalentes y sin acoplamiento escalar (J=0). Cuando uno es
excitado (S), el dipolo magntico perturba el estado de equilibrio del otro (interaccin dipolo-dipolo), producindose lo
que se conoce como relajacin cruzada: un spin transfiere magnetizacin a travs del espacio al otro. Por tanto, la
intensidad de la seal del espn I cambia cuando se perturba el estado de equilibrio del espn vecino. La perturbacin
puede realizarse mediante saturacin o inversin con pulsos de radiofrecuencia. El cambio de intensidad que nace de
esta interaccin dipolar se denomina efecto Overhauser nuclear.
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Sistema de spin: cuando un ncleo se excita como en RMN, la diferencia de energa entre los estados fundamental
y excitado es muy pequea, entonces los ncleos permanecen bastante tiempo en el estado excitado y se relajan
lentamente. La forma de volver al estado fundamental es transfiriendo la energa a los ncleos vecinos. As, cuando se
satura un spin, este va a volver al estado fundamental transfiriendo la energa a los ncleos vecinos de tal manera que se
altera la diferencia de poblacin entre los estados fundamental y excitado de ste ltimo y esto se manifiesta como un
cambio en la intensidad de la seal.
El cambio de intensidad del espn I est gobernado por tres probabilidades de transicin: de cero, uno y doble
cuanto, denominadas W0IS, W1IS y W2IS, respectivamente. Estas describen los mecanismos de relajacin cruzada en un
sistema ideal de dos espines.
No se ven porque S
esta saturado
W0 y W2 gobiernan el
regreso al equilibrio
Si W0 domina:
La diferencia entre estas probabilidades (W2 - W0), se denomina constante de velocidad de relajacin cruzada (IS),
y describe la velocidad de las transiciones dipolo-dipolo que dan lugar al NOE. Por tanto, IS es una medida de cun rpido
crece el NOE entre los spines I y S. El otro trmino (IS), se llama constante de velocidad de relajacin dipolar longitudinal
(W0 + 2W1 + W2) y define la parte del mecanismo de relajacin responsable de restablecer el estado de equilibrio del spin
I. Por tanto, incorporando estas definiciones y considerando, por ejemplo, la saturacin del spin S, en el estado
estacionario debe cumplirse que dIZ/dt = SZ = 0, con lo que:
NOE = (W2 - W0) / (W0 + 2W1 + W2)= IS / IS
De que depende si la relajacin es por W2 o W0?
Depende del tiempo de correlacin rotacional de la protena:
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-11
-1
W0 2c /r y W2 12c/r
Por supuesto, en la realidad, no existen sistemas de espines ideales y la relajacin dipolar entre los espines I y S no
es el nico mecanismo por el que tiene lugar la relajacin.
La interaccin dipolar depende de:
tiempo de correlacin rotacional porque ste es capaz de modular la velocidad de relajacin
1
distancia entre los H interactuantes
3
Interaccin dipolar c/ r
2
El trmino f(C) muestra que el fenmeno de NOE est relacionado con la relajacin del espn.
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NOE vara como una funcin del producto de la frecuencia de Larmor y el tiempo de correlacin
-10
-12
8
9
rotacional (C). C es del orden de 10 -10 s para molculas pequeas y es del orden de 3.6x10 -3.6x10
rad/s. Entonces el producto C es aproximadamente 0.1-0.01. Igualmente,
hay que tener en cuenta que C aumenta con el tamao de la molcula y la
viscosidad del solvente.
2 2
Si el producto C<<0.1, el trmino C contribuye muy poco y el
NOE est cercano a +0.5. Pero cuando el producto C = 10 o ms, el NOE se
acerca al lmite de -1, que corresponde a la desaparicin de la seal de I.
1
13
H H H
3D
H H
15
H H
13
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perodo de deteccin, t2. Variando el tiempo de demora t1 de forma sistemtica, y manteniendo los otros
parmetros inalterados, se obtiene una matriz del tipo s(t1, t2). Haciendo una doble transformada de Fourier
obtenemos el espectro en dos dimensiones S(1, 2).
Clasificacin de los experimentos en dos dimensiones segn Ernst:
1. COSY (correlation spectroscopy), este experimento est diseado para correlacionar las
transiciones de espines acoplados por transferencia de magnetizacin transversal desde una transicin a
otra en el curso de procesos de mezclado especialmente diseados. Es un experimento en 2D a partir del
cual se obtiene informacin de la estructura 2ria y 3ria de una protena teniendo en cuenta SOLO los
acoplamientos escalares spin-spin.
2. Homonuclear or Heteronuclear Two-dimensional J-resolved Spectroscopy o Spin-echo
Spectroscopy (Espectroscopia de espn eco), estos experimentos fueron diseados para separar las
diferentes interacciones (corrimiento qumico y acoplamiento espn-espn) en dimensiones ortogonales (que
forman ngulo recto) de frecuencia, con el propsito de resolver seales que se superponen en
experimentos de una dimensin. Ests tcnicas requieren condiciones particulares para que la informacin
obtenida en el perodo de evolucin y la obtenida en el perodo de deteccin sean distintas.
3. NOESY (Nuclear Overhauser Enhaced Spectroscopy), esta tcnica se utiliza para estudiar procesos
dinmicos, como intercambio qumico, relajacin cruzada o el efecto de Overhauser transitorio.
Espectroscopia de Correlacin (COSY)
n
La secuencia de pulso es 90-kt1-90-adquisicin de datos, donde k=o,1,2.2 . El experimento se
repite k veces. Las seales de FID se miden y plotean como s(t1, t2), donde t1 y t2 son variables
independientes. Se aplica la transformada de Fourier a
los valores digitales de t1 y t2 para obtener el espectro
S(1, 2) en frecuencia.
Consideremos dos protones, A y B, que estn
acoplados escalarmente. Despus del primer pulso de
90, durante el tiempo de demora t1, cada protn
resuena a su frecuencia de Larmor, A y B; aunque en
realidad dos frecuencias estn involucradas para cada
ncleo debido al acoplamiento, A JAB y B JAB.
Despus del segundo pulso de 90, podra parecer como
que el pulso no tiene efecto sobre los espines porque siguen precesando a las mismas frecuencias de
Larmor. Alternativamente, una porcin de la magnetizacin asociada al espn A durante el tiempo t1 puede
ser transferida al espn B durante t2. Este resultado viene del proceso conocido como Transferencia
Coherente (Coherence Transfer). Coherencia significa que un grupo de espines parecidos tienen la misma
fase en el plano xy. En otras palabras, una porcin de la magnetizacin que precesaba a B durante t1 ahora
precesa a A durante t2.
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En el espectro que se obtiene hay picos que estn sobre una diagonal, estos picos son el resultado de
la evolucin de la magnetizacin que tiene frecuencias de transicin originadas por la interaccin de espines
iguales durante ambas transiciones; NO DAN INFORMACION. Los picos que estn fuera de la diagonal son los
importantes porque resultan de la interaccin de espines distintos que estn acoplados de forma escalar. El
espectro es simtrico respecto a la diagonal. Teniendo en cuenta
que los crosspeaks que se observan corresponden a protones
separados por tres o menos enlaces en la estructura de los
aminocidos (AA), el espectro de COSY permite identificar los
residuos de los distintos AA que componen la molcula. Hay una
zona del espectro denominada zona
de la huella dactilar que resulta de la
interseccin del rango 7-10ppm de los
protones amdicos con el rango 46ppm de los protones alfa. En esta
zona va a haber un crosspeak por cada
AA, excepto en el caso de la prolina,
que no tiene protn alfa, y en el caso
de la glicina, que tiene dos protones
alfa. Si quiero asignar tengo que fijarme en las zonas en las
cadenas laterales del espectro, se asignan puntos en la diagonal
empezando por la parte mas resuelta. El tiempo que lleva hacer
un 2D respecto a uno normal es mucho mayor, por lo que solo
1
es ventajoso usarlo cuando tengo muchos H.
Hay veces que existe una superposicin de 2 crosspeaks,
que puede deberse a:
2 ncleos interaccionando con un tercero
Ncleos sin relacin y los 2 crosspeaks caen
casualmente en el mismo lugar
Para poder discernir entre estas posibilidades se hace un
R-Cosy.
En estos experimentos, se irradia con secuencias de
pulso de tiempos intermedios donde interaccionan los spines:
COSY interaccin escalar
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Relayed COSY (R-COSY): si hay dos seales que caen en la misma zona de frecuencia, esto puede
deberse a ncleos que estn interaccionando con un tercero en comn o simplemente son ncleos que no
tienen nada que ver. Para
diferenciar entre estos dos casos, se realiza este
experimento que produce un
espectro en el cual veo crosspeaks entre ncleos
que estn interaccionando con
un tercero en comn. El crosspeak no significa
que estn interaccionando
entre ellos. De esta forma, si A y C estn
acoplados a B de forma
independiente, voy a ver un crosspeak formado
por A y C a la altura de B. si
vuelvo a tener una superposicin de picos
hago un DR-COSY o un TOCSY.
Total correlation spectroscopy (TOCSY): me permite ver ncleos que estn acoplados directamente y
ncleos que estn acoplados a un tercero en comn, es decir que es la sumatoria del COSY y R-COSY. Sirve
para caracterizar los sistemas de spin completos: hay un sistema de spin para cada AA, pudiendo
reconocerse entre que residuos estn involucrados.
RMN Heteronuclear
15
13
Se marca la protena con N o C y se estudia la interaccion HN o HC. Esto tiene la ventaja de
que estos ncleos, por lo general, tienen J de 1er orden, porque solo estn separados por un solo enlace y la
1
interaccion es muy fuerte. Adems, una protena tiene menos cantidad de N y C que de H. Estos C y N son
ms sensibles al ambiente qumico, entonces tienen ms rango de desplazamiento qumico, por lo que las
seales estn ms dispersas y menos superpuestas Resolucin.
15
Para marcar con N: se trabaja con protenas recombinantes, expresadas en una bacteria.
13
Para marcar con C: tambin se trabaja con protenas recombinantes.
En general esto posee un problema intrnseco: los heteronucleos activos son menos abundantes en la
naturaleza y tienen ctes giromagneticas muy bajas, entonces son muy difciles de observar
sensibilidad
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RMN DE PROTEINAS
En RMN se puede elegir lo que quiero ver, se hacen experimentos de secuencias de pulsos (al C, al N
o al H) para ver selectivamente algunas cosas. Los distintos experimentos lo que hacen es mandar al plano
xy lo que quiero ver y dejar perpendicular lo que no quiero ver.
Antes de hacer las asignaciones y ver estructuras por RMN es indispensable conocer la frecuencia de
AA de la protena.
Como primera medida tenemos que tener en cuenta que no TODOS los ncleos estn mutuamente
acoplados. Cada AA da lugar a un sub-espectro diferente (sistema de spin: NHCHR) que es ms simple
que el espectro completo de la protena.
Regiones del espectro corresponden a diferentes partes de los AA y la estructura terciaria incrementa
la dispersin de las resonancias, es decir, los no van a estar todos juntos en una zona sino dispersados por
el espectro.
H -H
Metil (Leu, Val, Ile)
HN-H
Interacciones del
backbone
(Tener cuidado
con la Gly y Pro)
Aromticos
1)
Lo primero que se debe hacer es la asignacin de la secuencia, es decir, poner a cada seal
una etiqueta (decir a que residuo pertenece cada C, N o H). Para esto se debe conocer la secuencia de AA.
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I. Lo que primero se hace es analizar la zona de mayor dispersin, es decir, la de los H (entre 7 y 10
N
ppm); se mira en la zona de H -H , es decir, veo el enlace peptdico. Es la zona de mayor dispersin porque
hay pocos NH y abarcan mayores desplazamientos qumicos.
COSY el acoplamiento escalar permite identificar cada sistema de spin de cada AA. (2D
HOMONUCLEAR)
acoplamiento. El H entonces se acopla con el NH y con la cadena lateral, es decir, H, H , etc esta
empaquetado en un sistema de spin NHCHR.
Las constantes de acoplamiento 3J estn restringidas a cada AA.
Los espectros suelen ser simtricos con respecto a la diagonal. Como cada AA tiene un sistema de
spin caracterstico, se puede ir sabiendo que AAs componen la estructura primaria de la protena, porque se
N
conocen los patrones de spin de cada AA. En la huella dactilar (H -H ) se cuentan los picos nmero de AA.
As: COSY (1 acoplamiento) R-COSY (2 acoplam) DR-COSY (3 acoplam) TOCSY (todos)
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Cada NH en cada lnea voy a tener el sistema de spin completo. Ventaja: no tengo que mirar la zona
de alifticos (picos muy juntos) y no se superponen.
Tambin se mira la zona de los H entre 4 y 6 ppm para ver que protones estn acoplados con que
NH. Pero para poder distinguir en que posicin estn (por ejemplo 2 Gly) se hace el NOESY.
II. NOESY se observan los picos de los residuos i a (i+1). Se mira especficamente quien es el que
tiene al lado, acoplamiento interresiduo. Los crosspeaks son para distancias < 5. La intensidad de cada pico
se relaciona con la distancia internuclear. En el NOESY no hay regiones selectivas, se ven 4 cuadrantes y las
interacciones de todos con todos. Si con el COSY ya se cuales son los protones y me anoto los
desplazamientos qumicos, voy al espectro de NOESY y miro esos protones y veo si estn cerca (crosspeak) o
estn lejos (no crosspeak), entonces, saco la DISTANCIA. Lo puedo usar cualitativamente (estn cerca o lejos)
o cuantitativamente (saco distancia a travs de la intensidad del pico).
Los experimentos NOESY pueden utilizarse para detectar acoplamientos dipolares de corto, medio y
largo alcance.
En general, lo que se hace es COSY-NOESY WALK
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Para evitar esta tarea tan ardua, tambin se puede hacer un EXPERIMENTO DE DOBLE MARCA CON
HETERONUCLEOS.
2)
Asignacin de cadenas laterales COSY
Se utiliza el COSY, pero ahora se trabaja en la zona donde interacciona el H con el resto de la cadena
lateral, por ejemplo con el H; uno corrobora con la frecuencia. Existe un diagrama de conectividad para
cada AA: los patrones de acoplamiento entre los protones de un AA van a ser siempre los mismos, van a
cambiar los desplazamientos qumicos debido a que el ambiente es distinto.
Se mira en la zona de H - H .
3)
Estructura secundaria
Este es un paso intermedio entre la asignacin y la estructura terciaria. Si se quiere ver estructura
secundaria, se puede estudiar solamente asignando el backbone, sin necesidad de las cadenas laterales,
porque toda la informacin la tengo asignando los NH y los . En el caso que tengamos protenas complejas
que no me interesa la estructura, pero quiero ver la interaccin dinmica, no necesito asignar cadenas
laterales. Se puede obtener datos de estructura secundaria a partir de: desplazamientos qumicos,
acoplamientos dipolares, acoplamientos escalares, cte de acoplamiento J y ngulos de torsin. Se puede
hacer mediante la medicin de NOEs o de J-couplings.
As para estudiar la estructura secundaria se tienen que plantear las restricciones; se puede medir:
Distancia NOESY
Desplazamiento qumicos con HETERONUCLEOS
1 1
ngulos diedros se calculan con los J 1D H- H o COSY
En cada estructura secundaria tengo geometras que se repiten, voy a tener distancias (acop dipolar)
tpicas de cada estructura secundaria y ngulos diedros (acop escalar) que se repiten en y en .
Se pueden usar los desplazamientos qumicos, sobre todo de heteronucleos, como sensores de la
estructura secundaria. Siempre los heteronucleos son mucho ms tiles porque tienen ms dispersin
intrnseca que el protn.
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Otra cosa que se puede utilizar son los NOEs, el acoplamiento dipolar. En el caso de la -hlice,
despus de una vuelta, voy a tener NOEs entre un residuo y el otro que esta 4 mas adelante en la secuencia.
Si hay un NOE entre una Gly de una punta con una Ala de la otra punta, quiere decir que es una -hlice,
nunca puede ser una hoja-. Voy a tener distancias caractersticas de las hojas- y voy a poder diferenciar
paralelas de anti-paralelas. Ventaja: voy a poder asignar residuo por residuo en que estructura esta y no solo
hablar de porcentaje como en dicrosmo.
Distancias tpicas para distinguir un -hlice de una hoja-: adems de tener un NOE entre un residuo
y el que esta 3 o 4 posiciones mas adelante, en la -hlice voy a tener un NOE muy intenso entre los NH de
residuos contiguos, mientras que en una hoja- voy a tener un NOE muy intenso entre el H y el NH de
residuos contiguos.
El otro criterio que tengo es que las constantes de acoplamiento J las puedo correlacionar con los
ngulos diedros. Valores caractersticos: un -hlice tiene una J=4hz, las hojas- J=9-10 Hz e incluso hay
diferencia entre las que son paralelas y antiparalelas.
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2. En un COSY con la protena acoplada, de modo que se pueda ver bien el coplamiento:
4)
Estructura terciaria
Para determinarla se miden los NOEs entre residuos que estn alejados en la secuencia, pero cercanos en el
espectro. Esto se denomina NOE de largo alcance: se ingresan los datos en una compu y se obtiene una
familia de estructuras posibles (DYANA).
La desviacin media estndar (rmsd) es un parmetro que da medida de la confianza que se le puede
tener a la estructura.
Un rmsd indica que hay mucha movilidad, por lo tanto, da incertidumbre. Un rmsd<1 es una buena
aproximacin a la estructura.
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Mtodos de marcado
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13
Para introducir N o C se utilizan, por lo general, mtodos biosintticos utilizando como organismo
15
13
husped a E. Coli, levaduras, etc. En general, los reactivos son: NH4Cl, [ C] glucosa y D2O.
En general:
1
H 1D: hasta 10KDa
1 15
H- N 2D: hasta 15KDa (preferible por su bajo costo)
1 15 13
H- N- C 3D: hasta 20KDa (ms caro)
Aumenta la resolucin
1 15 13 1
H- N- C- H: hasta 20-30KDa
TROSY: hasta ahora no hay lmites
1
15
15
H- N HSQC: detecta el acoplamiento escalar de un enlace ( J). Veo una seal H- N por cada
residuo, as tengo un patrn general de toda la protena. Sirve para distinguir plegamiento de protenas.
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H 1H 15N
TOCSY
HSQC
Por ejemplo: HNCA/HN(CO)CA (3D) en este caso se ve la interaccin del HN con el C del mismo
AA (intramolecular) o del AA contiguo (intermolecular), pasando por el C=O.
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1.HNCA el HN ve el C de su propio AA
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permite que el anlisis estructural sea ms fcil. Sin embargo, el estudio de protenas con ms de 200-300
AA todava resulta dificultoso. Para estos casos, la sensibilidad ha mejorado gracias a la tcnica de
2
deuteracin (marcado con deuterio, H) al azar. El nivel de deuteracin depende de la masa molecular.
Complejos moleculares grandes: las tcnicas de TROSY y CRINEPT fueron desarrolladas para estos
casos y tienen muy buenos resultados.
Interaccin protena-protena: se ha desarrollado una tcnica de RMN para estudiar residuos de la
2
interfase. sta se basa en que la protena target no est marcada mientras que el ligando proteico s ( H15
1
N), excepto por sus protones amidas. Si se aplica un campo de radiofrecuencia a los protones alifticos ( H)
de la protena target, sus protones aromticos y amidas se saturan debido a la difusin de espn (este
1
fenmeno es altamente efectivo si los espines de H se encuentran cerca). La saturacin puede ser
1 1
transferida desde la molcula target a la molcula marcada a travs de contactos cercanos entre H- H de la
interface formada por el complejo.
cidos Nuclicos:
El NOE arroja restricciones insuficientes para la determinacin de la estructura porque los c
Nuclicos tienen baja densidad de protones (0.35) y no presentan un plegamiento globular. Estas
limitaciones se superaron con el desarrollo de marcado isotrpico selectivo y el alineamiento molecular en
medios ordenados. En molculas con mltiples dominios, se puede utilizar acoplamiento dipolar para
determinar la orientacin relativa de los distintos dominios. Para aplicar esta tcnica es necesario saber la
estructura secundaria de los dominios. RMN permite una observacin directa de los puentes hidrgeno
entre las pares de bases a travs del acoplamiento escalar entre los protones aminos, el dador y el aceptor.
Carbohidratos:
Estos compuestos presentan gran movilidad, tienen dos tipos de movimientos internos: uno consiste
en un movimiento modesto en el que el ngulo diedro se mueve 15; y el otro es un movimiento ms
pronunciado de los ngulos diedros. En este ltimo caso, el NOE no puede asociarlo a una nica
conformacin y la molcula se considera como un grupo de conformeros. El avance en RMN de alta
resolucin permite medir el acoplamiento dipolar en medios orientados. En algunos casos, se mide el
acoplamiento dipolar residual como la diferencia entre el acoplamiento en un medio orientado y el
acoplamiento en un medio isotrpico.
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Intercambio qumico
Se encuentra dentro de los fenmenos ms lentos.
Un cambio conformacional puede deberse a:
Unin de un ligando
Temperatura
Solvente
Un residuo puede protonarse y desprotonarse, por lo que se esperan 2 seales: una para la forma
protonada y otra para la protonada. Sin embargo, debido a la escala de tiempo, stas 2 seales no se
observan; se ve un promedio de las seales. Para que pueda ser visto por RMN, le velocidad de
intercambio del fenmeno tiene que ser menor que la diferencia de frecuencia de ambos.
Consideremos que tenemos una Y disuelta en agua, la cual tiene 4 H aromticos con 2 tipos de H
1
equivalentes se ven 2 seales. En una protena, obtendr 4 seales porque dejara de haber H
equivalentes; sin embargo, si T, las 4 seales pasan a 2, lo que sugerira que al T la Y empieza a tener
movilidad.
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igualmente probables, S=0; mientras que si la movilidad est completamente restringida, S=1. Esto se
15
estudia con marcado de N.
Mediante T1 y T2 puede determinarse si es la mayor movilidad la razn para los valores altos de rmsd
en una familia de estructuras.
Interaccin con un ligando
Hay experimentos que determinan si una conformacin es igual cuando se une un ligando. Se realiza
1
midiendo transferencia de NOE. Se hace un NOE entre 2 H cuando el ligando esta libre y dar una distancia,
si cambia la distancia cuando se une el ligando, entonces cambio la conformacin.
Tambin puede estudiarse por desplazamientos qumicos.
Existe otro NOE especial NOE editado que se basa en colocar filtros que seleccionan NOEs de 2
molculas con un patrn de marcado nico.
Dinmica de Protenas provenientes del intercambio del protn amida
El intercambio entre el protn amida en protenas y el solvente puede ser medido de diferentes
maneras. Los intercambios lentos (de minutos a das) son determinados siguiendo la prdida de la seal del
protn amida de una protena disuelta en D2O, y provee informacin sobre la accesibilidad relativa del
solvente a los distintos compartimentos de la estructura secundaria y terciaria. Los intercambios rpidos (5500ms) pueden ser monitoreados siguiendo el intercambio de la magnetizacin del protn amida con los
protones del agua. A pH altos, el intercambio de protones es muy rpido, y el intercambio de la
magnetizacin mide directamente la velocidad lmite de abertura conformacional que permite el acceso del
solvente.
Parmetros de dinmica de RMN
Nmero de seales por tomo: mltiple seales para intercambios lentos entre estados
conformacionales.
Ancho de banda: angostos para movimientos rpidos, anchos para movimientos lentos; depende
de la masa molecular y del estado conformacional.
Intercambio de NH con solvente: tiempos lentos. Requiere eventos de unfolding locales o globales,
los NH involucrados en enlaces se intercambian muy lentamente, las regiones flexibles o de superficie tienen
un intercambio rpido.
Mediciones de relajacin: R1, R2 y NOE heteronuclear.
La calidad de las estructuras obtenidas esta dado por rmsd (la desviacin media cuadrtica, rmsd) es
una medida utilizada con frecuencia de las diferencias entre los valores pronosticados por un modelo o un
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estimador y los valores observados de la realidad. rmsd es una buena medida de la precisin. Puedo
2
comparar los resultados de rmsd con los de S para saber si los valores altos de rmsd se deben a una alta
2
flexibilidad de la regin (S bajos).
RMN en estado slido
Obtener informacin de un espectro de RMN en estado slidos es mucho ms complicado que en
estado lquido. Es necesario aplicar secuencias de pulsos ms complicados, usar tcnicas especiales para las
muestras y aplicar energas de radiofrecuencias superiores un campo magntico externo ms fuerte.
La principal diferencia entre RMN en solucin y en estado slido es la movilidad de las molculas en la
muestra. La principal restriccin para muestras en solucin es que deben tener un movimiento isotrpico
mientras que para muestras slidas mientras ms rgidas mejor. Esto refleja diferencia entre RMN en estado
slido, donde observo sistemas anisotrpicos, y RMN en solucin, donde veo sistemas isotrpicos. El rango
de masa molecular que puede ser estudiado por RMN en estado slido no tiene lmites. En realidad los
espectros de muestras slidas ofrecen ms informacin que los otros pero esta informacin est escondida
debajo de picos anchos y solapados. Para eliminar esta imitacin, se coloca a la muestra en un ngulo
caracterstico (ngulo mgico) con respecto al campo magntico externo y de esta forma se elimina el
2
trmino 3cos -1, que est presente en el corrimiento qumico y en el acoplamiento dipolar. Esto resulta en
espectros mejor resueltos con bandas ms angostas.
Formacin de imgenes por RMN (RMN imaging)
RMI se basa en utilizar un gradiente de campo magntico con el fin de dispersar las frecuencias de
resonancia de elementos con distintos volmenes. En este experimento, se detecta la sensibilidad de cada
ncleo ante pequeos cambios en el campo magntico aplicado debido a los distintos microambientes.
Como estos cambios son muy pequeos es necesario aplicar un campo magntico homogneo y fuerte a
travs del volumen de la muestra. La intensidad de la seal es proporcional a la cantidad de espines por
unidad de volumen. Para obtener una imagen tridimensional, el objeto o el campo magntico deben rotarse
para producir distintas secciones en distintas direcciones, y luego el objeto es reconstruido usando
reconstruccin de imagen.
Tipos de experimentos:
Acoplamiento Escalar
Acoplamiento Dipolar
Homonuclear
COSY
TOCSY
NOESY
Heteronuclear
HSQC
TOCSY-HETERO
NOESY-HSQC
NOESY-HMQC
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Aspectos prcticos
B0 homogneo
Medio ambiente, temperatura, humedad, precisin
Concentracin:
1D 100M-10M
nD 400M-50M
volumen: 200-300l
pureza >95%
15
13
sensibilidad () enriquecimiento con N y C
mantener baja la fuerza inica
NO cristales
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