PCR

Anlisis de la Presencia de Organismos
Genticamente Modificados en Muestras de

Alimentos
Sesin n 6
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
M. Somma, M. Querci
WORLD HEALTH ORGANIZATION

REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBRO FR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE

BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

ndice
Sesin n 6
Introduccin
Componentes, estructura y replicacin del ADN
Principios de la PCR
Instrumentacin y componentes para la PCR
12
Diseo de cebadores para la PCR
18
PCR especializada
22
La PCR en la prctica
24
Bibliografa
32
Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos
Sesin n 6
Introduccin
La invencin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus
colaboradores en 1985 ha revolucionado la biologa molecular y la medicina
molecular (Saiki et al., 1985). La reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica
in vitro utilizada para amplificar enzimticamente una regin determinada de ADN
situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes
solo podan obtenerse cantidades mnimas de un gen especfico, ahora incluso un
nico ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un milln de
ejemplares en tan solo unas pocas horas.
Las tcnicas de PCR se han hecho indispensables para muchos procedimientos
comunes, como la clonacin de fragmentos especficos de ADN, la deteccin e
identificacin de genes para diagnstico y medicina legal, y en la investigacin de
modelos de expresin de los genes. Ms recientemente, la PCR ha permitido la
investigacin de nuevos campos, como el control de la autenticidad de los alimentos,
la presencia de ADN modificado genticamente y la contaminacin microbiolgica.
Para comprender los principios de la PCR y sus aplicaciones, debe atenderse en
primer lugar a la naturaleza de la molcula del ADN, por lo que en la seccin
siguiente se describen la estructura y la replicacin del ADN.
Componentes, estructura y replicacin del ADN

Componentes. Una molcula de ADN consta de dos cadenas en hlice,
complementarias y antiparalelas, formadas por unidades alternantes de cido
fosfrico y desoxirribosa, con uniones transversales de bases pricas y pirimidnicas,
lo que constituye una estructura helicoidal dextrgira, y lleva la informacin gentica
codificada en la secuencia de las bases. En las clulas eucariticas, la mayor parte
del ADN se encuentra en el ncleo y se conoce como ADN cromosmico. Est
separado del resto de la clula (citoplasma) por una membrana de dos capas
(membrana nuclear). Por otra parte, puede haber ADN extracromosmico en las
mitocondrias y cloroplastos.
Los elementos estructurales del ADN, llamados nucletidos, son los siguientes:
dATP, desoxiadenosina-trifosfato;
dGTP, desoxiguanosina-trifosfato;
dTTP, desoxitimidina-trifosfato;
dCTP, desoxicitidina-trifosfato.
Sesin n 6
Para mayor facilidad, estos cuatro nucletidos se denominan dNTP (por las siglas en
ingls de desoxinuclesido-trifosfato). Un nucletido est formado por tres grandes
partes: una base prica (adenina, A, o guanina, G), o una base pirimidnica (citosina,
C, o timina, T), un azcar pentosa (desoxirribosa) y un grupo trifosfato. Como se
muestra en la figura 1, una base prica o pirimidnica est unida a un anillo de
pentosa por un enlace N-glucosdico, y un grupo fosfato est unido al tomo de
carbono 5' del azcar por un enlace dister. En el cido ribonucleico, ARN, la timina
est sustituida por el uracilo (U) y la molcula de desoxirribosa por la ribosa.
Nucletido
azcar + fosfato
Desoxiadenosina trifosfato = dATP
Desoxiguanosina trifosfato = dGTP
Desoxicitidina trifosfato : dCTP
Desoxitimidina trifosfato = dTTP
Figura 1. Componentes de los nucletidos (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Estructura. La figura 2 indica cmo forman los nucletidos una cadena de ADN. El
ADN se forma uniendo los nucletidos entre el grupo fosfato de un nucletido (que
se sita en el tomo de C n 5 de la molcula de azcar) y el hidroxilo del tomo de
C n 3 de la molcula de azcar del nucletido anterior. Para efectuar este enlace,
se separa un grupo difosfato, con liberacin de energa. Los nuevos nucletidos se
aaden siempre en el extremo 3 de la cadena. Como se indica en la figura 3, el
ADN es bicatenario (excepto en algunos virus) y las dos cadenas o hebras se
aparean entre s de forma muy precisa. Cada base de una cadena se aparea con un
solo tipo de base de la cadena contraria, formando un par de bases (pb): A siempre
Sesin n 6
se une con T mediante dos puentes de hidrgeno, y C siempre se une con G

mediante tres puentes de hidrgeno. De esta manera, las dos cadenas son
mutuamente complementarias y una de las cadenas puede servir de ADN molde
para formar la otra.
Extremo 5
Extremo 3
Figura 2. Formacin de una cadena de ADN a partir de los distintos nucletidos

(imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Las bases forman un ncleo hidrfobo dentro de la doble hlice. Los azcares y los
grupos fosfato (en su forma aninica) constituyen la capa hidrfila exterior de la
molcula. En condiciones fisiolgicas, la hlice de ADN bicatenario es ms estable
que una hlice de ADN monocatenario.
Sesin n 6
Genoma= total de todos los cromosomas

Mitocondria
Fragmento de cromosoma
Membrana plasmtica
Retculo endoplsmico
Aparato de Golgi
Citoesqueleto filamentoso
Cromosoma
Ncleo
Lisosoma
Gen
Pares de bases de los

nucletidos
Esqueleto de azcar y fosfato

Puente de hidrgeno
Base
Figura 3. Estructura del ADN de una clula (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Sesin n 6
Replicacin. El ADN contiene toda la informacin gentica que define la estructura

y la funcin de un organismo. Hay tres procesos diferentes encargados de la
transmisin de la informacin gentica:
replicacin;
transcripcin;
traduccin.
Durante la replicacin, un cido nucleico bicatenario se duplica para formar copias
idnticas. Con este proceso se perpeta la informacin gentica. Durante la
transcripcin, un segmento de ADN que constituye un gen se lee y se transcribe en
una secuencia monocatenaria de ARN. El ARN pasa del ncleo al citoplasma.
Finalmente, durante la traduccin, la secuencia de ARN se traduce a una secuencia
de aminocidos que forman una protena (Alberts et al., 1983).
La replicacin del ADN es el proceso en que se basa la amplificacin por PCR, y se
va a describir en detalle.
Durante la replicacin, la molcula de ADN se desenrolla y cada cadena se convierte
en un ADN molde para la sntesis de una cadena complementaria nueva. Cada
molcula hija, consistente en una cadena nueva y una vieja de ADN, es una copia
exacta de la molcula madre.
Hebra original
Hebra nueva
Cebador de ARN
Hebra
retrasada
Hebra adelantada
Las flechas indican la direccin de

la replicacin del ADN
Fragmento de Okazaki
Figura 4. La horquilla de replicacin.
Sesin n 6
Para desenrollar la doble hlice y sintetizar una nueva hebra de ADN hacen falta
varias enzimas. La topoisomerasa y la helicasa se encargan de desenrollar el ADN
rompiendo la estructura superenrollada y cortando una sola hebra de ADN. A
continuacin, una primasa (parte de un agregado de protenas denominado
primosoma) une un pequeo cebador de ARN al ADN monocatenario, para actuar
como extremo 3'OH a partir del cual la ADN polimerasa inicia la sntesis. Este
cebador de ARN es eliminado finalmente por la ribonucleasa H y el hueco se rellena
mediante la ADN polimerasa I. En esta fase, la ADN polimerasa avanza a lo largo de
una molcula monocatenaria de ADN (una hebra sencilla), recogiendo dNTP libres
para unirlos mediante puentes de hidrgeno a los dNTP complementarios situados
en dicha hebra sencilla de ADN (A con T y G con C), y mediante un enlace
fosfodister covalente al nucletido anterior de la propia hebra nueva. La energa
conservada en el trifosfato se utiliza para unir covalentemente cada nuevo nucletido
a la segunda hebra en crecimiento. Hay diferentes formas de ADN polimerasa, pero
es la ADN polimerasa III la que se encarga de la sntesis progresiva de nuevas
hebras de ADN. La ADN polimerasa acta solo desde el extremo 5 hacia el 3.
Como una de las hebras de la doble hlice tiene el sentido 5-3 y la otra el 3-5, la
ADN polimerasa sintetiza una segunda copia de la hebra 5-3 (hebra retrasada) a
tramos (fragmentos de Okazaki) (Ogawa y Okazaki, 1980). La sntesis de las nuevas
copias de la hebra 5-3 se muestra en la figura 4. La otra hebra, la hebra
adelantada, puede avanzar directamente con la sntesis, desde el extremo 5' al 3',
segn se va desenrollando la hlice. La ADN polimerasa no puede empezar la
sntesis ex novo a partir de una hebra sencilla desnuda, sino que necesita la
presencia de un cebador con un grupo 3OH libre al que pueda unir un dNTP.
Una ligasa cataliza la formacin de un enlace fosfodister entre un extremo 3OH y
un 5fosfato, libres y adyacentes. As puede rellenarse el hueco que queda cuando
se elimina el cebador de ARN. Ha de sealarse la importancia de la presencia de
protenas de unin a ADN monocatenario para mantener la estabilidad de la
horquilla de replicacin. El ADN monocatenario es muy lbil, o inestable, y estas
protenas se unen a l mientras es monocatenario, protegindolo as de la
degradacin.
Sesin n 6
Principios de la PCR
La PCR se basa en el mecanismo de la replicacin in vivo del ADN: el ADN
bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a
enrollar. Esta tcnica consiste en ciclos repetitivos de:
desnaturalizacin del ADN por fusin a temperatura elevada, a fin de convertir el

ADN bicatenario en ADN monocatenario;
unin (anillamiento) de dos oligonucletidos, utilizados como cebadores, al ADN

diana;
extensin de la cadena de ADN por adicin de nucletidos a partir de los

cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones
Mg2+.
Los oligonucletidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas,

que son diferentes entre s y complementarias de los sitios de reconocimiento que
flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de
desnaturalizacin del ADN molde, anillamiento del cebador y extensin del cebador
constituyen un ciclo del mtodo de amplificacin por PCR. La figura 5 ilustra las
tres fases principales del proceso de amplificacin por PCR.
30-40 ciclos de 3 fases
Fase 1: desnaturalizacin
Fase 2: unin
Cebadores directos
e inversos
Fase 3: extensin
Slo dNTPs
Figura 5. Fases de la amplificacin por PCR (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Sesin n 6
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Tras cada ciclo, las hebras de ADN recin sintetizadas pueden servir de ADN molde
para el ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto principal de esta
reaccin exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen
definidos por los extremos 5 de los oligonucletidos cebadores y cuya longitud viene
dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de
amplificacin efectiva son molculas de ADN de diferentes tamaos, cuyas
longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unin de los dos
cebadores. En la segunda ronda, estas molculas generan hebras de ADN de
longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de
amplificacin y constituyen los productos dominantes de la reaccin. As, la
amplificacin, que es el nmero final de ejemplares de la secuencia diana, se
expresa con la siguiente ecuacin:
(2n-2n)x
(1)
donde n es el nmero de ciclos, 2n es el nmero de molculas del primer producto

obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo
ciclo con longitud indefinida, x es el nmero de ejemplares del ADN molde original.
Tericamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habr una amplificacin de 220 veces,
suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento de una
PCR vara de un ADN molde a otra y depende del grado de optimizacin que se
haya conseguido.
En los prrafos siguientes se encuentra una descripcin pormenorizada de las tres
fases de la amplificacin por PCR (desnaturalizacin del ADN molde, anillamiento
del cebador y extensin) (Sambrook et al., 1989).
4 ciclo
gen deseado
3er ciclo
2 ciclo
1er ciclo
35 ciclo
ADN plantilla
4
8
16
32
ejemplares ejemplares ejemplares ejemplares
68000 millones de
ejemplares
Figura 6. La amplificacin exponencial del ADN mediante PCR.
Sesin n 6
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Desnaturalizacin del ADN molde

Durante la desnaturalizacin, la hebra doble se funde, abrindose para dar ADN
monocatenario, y se detienen todas las reacciones enzimticas (es decir, la
extensin de un ciclo anterior). Las dos cadenas complementarias se separan por el
aumento de la temperatura, lo que se denomina desnaturalizacin. Para obtener la
desnaturalizacin del ADN, la temperatura suele aumentarse hasta unos 93 - 96C.
De esta manera se rompen los fuertes puentes de H y aumenta el nmero de bases
desapareadas. La reaccin se completa cuando todo el ADN bicatenario se
convierte en monocatenario. La temperatura a la que la mitad del ADN bicatenario
ha pasado a monocatenario se denomina temperatura de fusin, Tf. El proceso de
desnaturalizacin depende del tipo de disolvente, de la concentracin salina y del pH
utilizado; por ejemplo, la temperatura de fusin desciende al bajar la concentracin
salina, al subir el pH y en presencia de disolventes orgnicos como el formaldehdo.
El valor de la Tf tambin se puede ver afectado por la concentracin de G/C y T/A.
La Tf de una estructura de ADN que contiene una elevada proporcin de G/C es ms
alta que la de un ADN ms rico en T/A. Por ejemplo, Serratia marcescens tiene
aproximadamente un 60 % de G/C y una Tf de unos 94 C, mientras que
Pneumococcus tiene aproximadamente un 40 % de G/C y una Tf de unos 85 C.
Anillamiento del cebador
La unin o rehibridacin de las hebras de ADN se efecta a una temperatura inferior
(generalmente, entre 55 y 65 C). Una vez se ha reducido la temperatura, las dos
hebras complementarias de ADN monocatenario tienden a formar de nuevo una
molcula de ADN bicatenario. En esta fase, los cebadores se mueven libremente y
es continua la formacin y la ruptura de puentes de hidrgeno entre el cebador
monocatenario y el ADN molde tambin monocatenaria. Los enlaces ms estables
duran un poco ms (los cebadores que se corresponden exactamente con el ADN
molde) y es en ese pequeo fragmento de ADN bicatenario (ADN molde con
cebador) donde puede fijarse la polimerasa y empezar a copiar el ADN molde.
Cuando se han introducido unas cuantas bases, el enlace inico entre el ADN molde
y el cebador es tan fuerte que ya no se rompe.
Extensin del cebador
En esta fase, los cebadores se extienden a lo largo de la secuencia diana utilizando
una ADN polimerasa termoestable (frecuentemente se trata de la ADN Taq
polimerasa) en presencia de dNTP, lo que produce la duplicacin del material diana
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12
inicial. La temperatura de trabajo ideal para la ADN polimerasa Taq es de 72 C.

Cuando los cebadores se han extendido unas cuantas bases, ejercen una atraccin
inica ms fuerte sobre el ADN molde, lo que reduce la probabilidad de que se
invierta el proceso. Los cebadores que no se corresponden exactamente se vuelven
a soltar (debido a la temperatura elevada) y no dan lugar a la extensin del
fragmento. Las bases (complementarias del ADN molde) se unen al cebador en el
extremo 3 (la polimerasa aade dNTP desde 5 hacia 3, leyendo el ADN molde
desde 3 hacia 5). La duracin del tiempo necesario para las fases de extensin del
cebador puede aumentar si es larga la regin de ADN que se va a amplificar; sin
embargo, en la mayora de experimentos de PCR es suficiente un tiempo de 1 min
para conseguir una extensin completa.
Instrumentacin y componentes para la PCR

Instrumentos
El proceso de la PCR ha podido automatizarse gracias a dos importantes avances:
a) el uso de ADN polimerasas termoestables, que resisten a la inactivacin a
temperaturas elevadas; as pues, es posible que una alcuota inicial de
polimerasa se mantenga a lo largo de muchos ciclos del protocolo;
b) el desarrollo de baos termostatizados que pueden subir y bajar rpidamente su
temperatura
de
forma
automatizada
programada;
se
denominan
termocicladores o mquinas de PCR.

Se utilizan diversos diseos de termocicladores como, por ejemplo, calentamiento y
refrigeracin por fluidos, calentamiento por resistencia elctrica y refrigeracin por
fluidos, y calentamiento por resistencia elctrica y refrigeracin por semiconductores.
En la figura 7 se muestra un perfil tpico de los ciclos de temperatura de un protocolo
de tres fases.
Sesin n 6
13
Fase 1 :
Desnaturalizacin de la ADN
Temperatura (C)
Fase 3 :
Extensin
del cebador
Un ciclo
Fase 2 :
Hibridacin del
cebador
Minutos
Figura 7. Perfil de ciclos de temperatura de la PCR.

Para que la PCR tenga xito son fundamentales los parmetros ya mencionados de
los ciclos trmicos, en sus fases de desnaturalizacin, anillamiento del cebador y
extensin del cebador, as como los componentes utilizados y el nmero de ciclos
descritos en los prrafos siguientes.
ADN diana
En principio puede efectuarse la amplificacin por PCR si est presente al menos un
ejemplar intacto del gen diana. Si el nmero de ejemplares del gen diana es mayor,
tambin lo ser la probabilidad de que tenga xito la amplificacin del ADN.
Cualquier alteracin, como una muesca en el ADN diana, puede bloquear la
amplificacin por PCR. El tamao de la secuencia diana puede variar entre < 0,1 y
unas cuantas kilobases. La cantidad total de ADN utilizada normalmente para la
PCR est entre 0,05 y 1,0 g, lo que permite la deteccin de ejemplares solos de la
secuencia diana. Aunque las muestras no tienen que estar muy purificadas, s es
necesario eliminar algunos contaminantes, como la heparina, el formol, los agentes
quelantes de Mg2+ o los detergentes, para evitar que inhiban el proceso de
amplificacin.
Cebadores
Generalmente se utilizan cebadores de 16 a 30 nucletidos de longitud, lo que
permite que la temperatura de anillamiento sea razonablemente elevada. Los
cebadores no deben tener tramos de secuencias con una polibase (p. ej., poli-dG) ni
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motivos repetidos, ya que podran hibridarse de forma inadecuada con el ADN

molde. Deben evitarse las secuencias repetidas invertidas, a fin de prevenir la
formacin de estructuras secundarias del cebador, que impediran su hibridacin con
el ADN molde. Tambin deben evitarse las secuencias complementarias de otros
cebadores utilizados en la PCR, para prevenir la hibridacin entre cebadores o la
formacin de dmeros de cebadores (esto es especialmente importante en relacin
con el extremo 3 del cebador). Siempre que sea posible, conviene que el extremo 3
del cebador tenga gran proporcin de bases G y C para aumentar la hibridacin del
extremo que se quiere extender. La distancia entre cebadores debe ser inferior a 10
kb en longitud. Normalmente se observa una importante reduccin del rendimiento
cuando los cebadores se encuentran a ms de unos 3 kb de distancia entre s. La
concentracin usual de oligonucletidos para la PCR es de 1 M. Esto resulta
suficiente para al menos 30 ciclos de amplificacin. La presencia de oligonucletidos
a una concentracin superior puede provocar la amplificacin no deseada de
secuencias distintas de la diana.
Por el contrario, la PCR no es eficaz si la
concentracin del cebador es limitante.
ADN polimerasa
El mtodo original de PCR utilizaba el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de
E. coli (Saiki et al., 1985). Sin embargo, esta enzima se desnaturaliza a
temperaturas inferiores a las necesarias para desnaturalizar la mayora de ADN
molde bicatenario. As pues, en los primeros experimentos era necesario aadir ms
enzima a la reaccin tras cada ciclo. Por otra parte, haba que trasladar las muestras
desde un bao a una temperatura hasta otro a otra temperatura para permitir el
desarrollo de las distintas fases de desnaturalizacin, anillamiento y polimerizacin.
Evidentemente, el uso de una ADN polimerasa termorresistente ha facilitado el
proceso porque ha dejado de ser necesario aadir enzimas tras cada fase de
desnaturalizacin. En principio, las ADN polimerasas solo pueden incorporar
nucletidos al extremo 3 de un polinucletido. La primera ADN polimerasa
termoestable utilizada fue la ADN polimerasa Taq, aislada de la bacteria Thermus
aquaticus (Saiki et al., 1988). Aunque esta enzima es probablemente la ms utilizada
a efectos de la PCR, en el comercio pueden encontrarse algunas otras ADN
polimerasas. En el cuadro 1 se recogen las propiedades de algunas ADN
polimerasas termoestables que se utilizan actualmente para la PCR (Newton y
Graham, 1994).
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Cuadro 1. Caractersticas de algunas ADN polimerasas utilizadas para la PCR.
Fuente
Aplicacin
T de actividad
a 95 C (min)
Actividad
exonuclesica
de 5 a 3
Actividad
exonuclesica
de 3 a 5
Procesividad
Velocidad de
extensin
(nt/s)
Extremos de
ADN
resultantes
PM en kDa
Taq/
AmpliTaq
Vent
DeepVent
Pfu
Tth
UITma
Thermus
aquaticus
Thermococcus
litoralis
Pyrococcus
GB-D
Pyrococcus
furiosus
Thermus
thermophilus
Thermotoga
maritima
Taq: natural
AmpliTaq:
para
ingeniera
gentica
Para
ingeniera
gentica
Para
ingeniera
gentica
Natural
Para
ingeniera
gentica
Para
ingeniera
gentica
40
1380
400
>120
20
> 50a
No
No
No
No
No
No
50-60
30-40
75
>80
60
>33
3A
> 95 %
romos
> 95 %
romos
3A
Romos
94
92
94
70
ADN polimerasa Taq/AmpliTaq. Como ya se ha indicado, esta enzima se aisl de

la bacteria Thermus aquaticus que vive en una fuente caliente del parque nacional
de Yellowstone, de EE.UU., a temperaturas prximas a los 85 C. La temperatura
ptima de funcionamiento de esta enzima es de 70 a 80 C, a la que la bacteria
sintetiza ADN a la velocidad de 35 100 nucletidos/segundo. Se conoce como
procesividad el nmero medio de nucletidos que incorpora una enzima al ADN
antes de separarse del ADN molde. La ADN polimerasa AmpliTaq es un enzima
modificada genticamente expresada por E. coli. Como AmpliTaq es recombinante,
su pureza y reproducibilidad son superiores a las del tipo silvestre. Sin embargo, es
posible que durante la amplificacin del ADN se produzca contaminacin con
algunas secuencias homlogas de E. coli. En tal caso, se recomienda el uso de una
ADN polimerasa que no se haya expresado con E. coli como organismo hospedador.
Tanto la ADN polimerasa Taq como la AmpliTaq poseen actividad exonuclesica de
5 a 3, con lo que eliminan nucletidos por delante de la cadena en crecimiento.
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ADN polimerasas Vent, DeepVent, Pfu y UITma. Estas enzimas tienen actividad
exonuclesica de 3 a 5, que les permite eliminar los residuos mal apareados hasta
que se forme un extremo con bases correctamente unidas. Sin embargo, la actividad
exonuclesica de 3 a 5 puede provocar la degradacin de los cebadores. Por tanto,
la enzima solo debera aadirse una vez iniciada la reaccin, o bien habra que
utilizar cebadores modificados qumicamente.
ADN polimerasa AmpliTaqGold. Esta enzima consiste en una ADN polimerasa

AmpliTaq, inactiva a temperatura ambiente, y que solo puede activarse durante un
periodo de incubacin a 94 C. En este caso, el programa del termociclador debe
incluir un tiempo de pre-incubacin a la temperatura de 92 95 C. En caso de PCR
con liberacin gradual es posible suprimir el tiempo de pre-incubacin, pero deben
efectuarse al menos 10 ciclos ms que con la PCR clsica.
Tampones de reaccin y MgCl2 en las PCR
Adems de los reactivos que participan directamente en la reaccin, la PCR necesita

un tampn adecuado, cuya composicin depende del tipo y de las caractersticas de
la enzima utilizada. La mayora de los proveedores proporcionan normalmente un
tampn 10x para utilizarlo con la enzima respectiva. El tampn de reaccin ms
comn utilizado con la ADN polimerasa Taq/AmpliTaq contiene:
Tris 10 mM, pH 8,3
KCl 50 mM
MgCl2 1,5-2,5 mM.
En la PCR es fundamental la presencia de cationes divalentes. La concentracin de

MgCl2 en la mezcla final de reaccin suele estar entre 0,5 y 5,0 mM, y la
concentracin ptima se determina empricamente (Innis y Gelfand, 1990).
Los iones Mg2+:
forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para la

incorporacin de estos;
estimulan la actividad polimersica;
aumentan la Tf de la interaccin cebador / ADN molde (con lo que estabilizan la

interaccin entre las dos cadenas).
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Generalmente, una concentracin baja de Mg2+ provoca un rendimiento bajo (o

incluso nulo), mientras que una concentracin elevada de Mg2+ hace que se
acumulen productos inespecficos (errores de cebado). Es importante evitar que en
la solucin de ADN molde haya una concentracin elevada de agentes quelantes,
como el EDTA, o de grupos inicos con carga negativa, como el fosfato. En la
bibliografa actual se encuentran discusiones sobre diversos tampones y
suplementos de la PCR, como el DMSO, el PEG 6000, la formamida, el glicerol, la
espermidina y los detergentes no inicos, utilizados para aumentar la especificidad o
el rendimiento de la reaccin (Roux, 1995). Efectivamente, algunas ADN
polimerasas alcanzan su nivel ptimo de actividad solo en presencia de tales
suplementos (Rolfs et al., 1992).
Desoxirribonuclesido-trifosfatos
Para la sntesis de ADN hacen falta desoxirribonuclesido-trifosfatos libres (dNTP).

La concentracin de cada uno de los dNTP para la PCR debe estar entre 20 y
200 M, y los cuatro dNTP deben utilizarse a concentraciones equivalentes para
minimizar los errores de incorporacin (Innis et al., 1988). Hay varios fabricantes que
suministran dNTP de elevada pureza, bien como soluciones madre de cada uno de
los dNTP o bien como mezcla de los cuatro dNTP. Las soluciones madre de dNTP
(generalmente 100 mM) se deben ajustar a un pH de 7,0-7,5 con Na OH 1 M para
garantizar que el pH de la reaccin final no baja de 7,1 (Sambrook et al., 1989); sin
embargo, ahora se suministran muchas soluciones madre de dNTP con el pH ya
ajustado.
Nmero de ciclos y efecto de meseta
El nmero de ciclos de amplificacin necesarios para producir una banda visible en

un gel depende mucho de la concentracin inicial del ADN diana. A fin de amplificar
50 molculas diana se recomienda hacer entre 40 y 45 ciclos, mientras que para
amplificar 3x105 molculas hasta la misma concentracin es suficiente con entre 20 y
30 ciclos (Innis y Gelfand, 1990). Esta falta de proporcionalidad se debe al efecto
denominado de meseta, que es la atenuacin de la velocidad exponencial de
acumulacin del producto en las ltimas etapas de una PCR, cuando el producto
alcanza la concentracin de 0,3-1,0 nM. Puede deberse a una degradacin de los
Sesin n 6
18
reactivos (dNTP, enzima), agotamiento de los reactivos (cebadores o dNTP: lo

primero con productos cortos y lo segundo con productos largos), inhibicin por el
producto final (formacin de pirofosfato), competencia por los reactivos por parte de
productos inespecficos, competencia por la unin con el cebador mediante nueva
hibridacin del producto concentrado (10 nM) (Innis y Gelfand, 1990). Si no se
obtiene el producto deseado tras 30 ciclos, debe tomarse una pequea muestra (1
l) del producto amplificado, la cual se mezclar y volver a amplificar durante 20 o
30 ciclos en una nueva mezcla de reaccin, en lugar de prolongar la tanda haciendo
ms ciclos. En algunos casos en que es limitante la concentracin del ADN molde,
esta nueva amplificacin puede proporcionar un buen producto, mientras que la
extensin de los ciclos a ms de 40 no lo hace.
Diseo de cebadores para la PCR

Es posible que el parmetro ms crtico para tener xito con la PCR sea el diseo de
los cebadores. A igualdad de todos los dems factores, un cebador mal diseado
puede hacer que fracase una PCR. La secuencia del cebador determina varios
aspectos, como la posicin y la longitud del producto, su temperatura de fusin y
finalmente el rendimiento (Innis y Gelfand, 1994). Un cebador mal diseado puede
hacer que se consiga poco producto o incluso ninguno, debido a una amplificacin
inespecfica o a la formacin de dmeros de cebador, lo que puede llegar a competir
con la formacin de producto hasta suprimirla. El objetivo de la presente nota de
aplicacin es dar normas que deben seguirse en el diseo de cebadores para la
PCR. En otras publicaciones puede encontrarse un tratamiento ms completo de
este tema (Dieffenbach et al., 1995).
Seleccin del cebador
Al disear cebadores para PCR hay que tener en cuenta diversas variables. Entre
ellas cabe destacar:
la longitud del cebador;
la temperatura de fusin (Tf);
la especificidad;
las secuencias complementarias del cebador;
el contenido de G/C y los tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G);
Sesin n 6
19
la secuencia del extremo 3.
En las secciones siguientes se habla de cada uno de estos elementos crticos.
Longitud del cebador

Dado que la especificidad, la temperatura y el tiempo de hibridacin dependen en
parte de la longitud del cebador, este parmetro es crtico para que tenga xito la
PCR. En general, los oligonucletidos que tienen entre 18 y 24 bases presentan una
especificidad extrema de secuencia, siempre que la temperatura de hibridacin sea
ptima. La longitud del cebador tambin influye en la eficacia de la hibridacin. En
general, cuanto ms largo sea el cebador, menos eficaz ser la hibridacin. Al
cebarse menos ADNs moldes en cada fase, esto puede hacer que disminuya de
forma significativa la cantidad de producto amplificado. No obstante, los cebadores
tampoco deben ser demasiado cortos, salvo que la aplicacin lo exija
especficamente. Como se comenta ms abajo, el objetivo debe ser disear un
cebador con una temperatura de anillamiento de al menos 50 C.
La relacin entre temperatura de hibridacin y temperatura de fusin es una de las
cajas negras de la PCR. Una regla emprica general es utilizar una temperatura de
hibridacin inferior en 5 C a la temperatura de fusin. Con frecuencia es posible que
la temperatura de hibridacin determinada de esta forma no sea ptima y haya que
efectuar experimentos de tanteo para determinar la verdadera temperatura ptima.
La manera ms fcil de hacerlo es con un termociclador de gradiente.
Temperatura de fusin (Tf)
Es importante no olvidar que son dos los cebadores que se aaden a una PCR en
relacin con un sitio o diana. Los dos cebadores oligonucleotdicos deben disearse
de forma que tengan temperaturas de fusin similares. Si los cebadores no se
ajustan bien en cuanto a su Tf, la amplificacin ser menos eficaz o incluso podr no
darse en absoluto, ya que el cebador con la Tf ms elevada funcionar mal a
temperaturas ms bajas y es posible que el cebador con la Tf ms baja no trabaje a
temperaturas ms elevadas. La forma ms precisa de calcular las temperaturas de
fusin de los oligonucletidos es utilizar clculos termodinmicos del vecino ms
prximo con la frmula:
Tfcebador = H [S+ R ln (c/4)] -273,15C + 16,6 log 10 [K+]
(2)
Sesin n 6
20
donde H es la entalpa y S es la entropa de la formacin de la hlice, R es la

constante molar de los gases y c es la concentracin de los cebadores.
La forma ms fcil de hacerlo es con paquetes de programas informticos de
diseos
de
cebadores
Afortunadamente,
con
que
la
existen
frmula
en
el
siguiente
mercado
puede
(Sharrocks,
calcularse
1994).
una
buena
aproximacin de trabajo de este valor (vlido generalmente para oligonucletidos de

entre 18 y 24 bases):
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
(3)
donde A, T, G y C son las bases pricas y pirimidnicas.

El cuadro 2 muestra los valores correspondientes a cebadores de diversas
longitudes que se han calculado mediante esta ecuacin (denominada frmula de
Wallace) y suponiendo un contenido de GC del 50 % (Suggs et al., 1981).
Cuadro 2. Clculo de la longitud de los cebadores con la ecuacin de Wallace.
Longitud del
cebador
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
Longitud del
cebador
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
12C
22
66C
18C
24
72C
24C
26
78C
10
30C
28
84C
12
36C
30
90C
14
42C
32
96C
16
48C
34
102C
18
54C
36
108C
20
66C
38
114C
Las temperaturas calculadas segn la frmula de Wallace son imprecisas en los

extremos de este cuadro. Al calcular las temperaturas de fusin de los cebadores,
ha de velarse por que la temperatura de fusin del producto sea suficientemente
baja como para obtener el 100 % de fusin a 92 C. Este parmetro ayuda a
Sesin n 6
21
conseguir una PCR ms eficaz, aunque no siempre es necesario para que la PCR
tenga xito. En general, los productos que tienen entre 100 y 600 pares de bases se
amplifican de forma eficaz en muchas PCR. En caso de duda, la Tf del producto
puede calcularse con la frmula siguiente:
Tf =81,5 + 16,6 (log10 [K+] + 0,41 (% G+C)-675/longitud
(4)
Especificidad
Como ya se ha indicado, la especificidad del cebador depende al menos

parcialmente de su longitud. Es evidente que hay muchos ms oligonucletidos
distintos con 24 bases que con 15. Dicho esto, los cebadores han de elegirse de
forma que tengan una secuencia nica dentro del ADN molde que debe amplificarse.
Un cebador diseado con una secuencia muy repetitiva dar como resultado un
borrn al amplificar ADN genmico. Sin embargo, el mismo cebador puede dar una
sola banda si se amplifica un solo clon de una genoteca. Como la ADN polimerasa
Taq es activa en una amplia banda de temperaturas, la extensin del cebador se
producir a las temperaturas inferiores de hibridacin. Si la temperatura es
demasiado baja, podr darse un cebado inespecfico, que podr ser extendido por la
polimerasa si hay una corta homologa en el extremo 3. En general, los mejores
resultados se obtienen con una temperatura de fusin de 55 a 72 C (lo que
corresponde a una longitud del cebador de entre 18 y 24 bases, segn la regla de
Wallace).
Secuencias complementarias del cebador
Es absolutamente necesario que el diseo de los cebadores no incluya ninguna

homologa interna del cebador de ms de 3 pares de bases. Si un cebador tiene
alguna de estas zonas de auto-homologa, pueden formarse estructuras con
cambios bruscos u horquillas, parcialmente bicatenarias, capaces de interferir con la
hibridacin al ADN molde. Otro peligro relacionado es la homologa entre cebadores.
Una homologa parcial en las regiones centrales de dos cebadores puede interferir
con la hibridacin. Si la homologa se produce en el extremo 3 de cualquiera de los
cebadores, pueden formarse dmeros de cebadores, que en general impiden la
formacin del producto deseado por un mecanismo de competencia.
Sesin n 6
22
Contenido de G/C y tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G)
La composicin de bases de los cebadores debe ser de entre un 45 y un 55 % de

GC. La secuencia del cebador debe elegirse de forma que no haya tramos de poli-G
ni poli-C que puedan favorecer la hibridacin inespecfica. Tambin deben evitarse
los tramos de poli-A y poli-T, ya que pueden respirar y abrir tramos del complejo
cebador-ADN molde, lo que puede reducir la eficacia de la amplificacin. Tambin
deben evitarse los tramos de polipirimidina (T, C) y polipurina (A, G). Lo ideal es que
el cebador tenga una mezcla casi aleatoria de nucletidos, un contenido de GC del
50 % y una longitud aproximada de 20 bases. De esta manera, la Tf estar en la
banda de 56 62 C (Dieffenbach et al., 1995).
Secuencia del extremo 3
Se ha visto claramente que la posicin terminal 3' de los cebadores de la PCR es

fundamental para evitar errores de cebado. Ya se ha explorado el problema de las
homologas de cebadores en estas regiones. Otra variable importante es la inclusin
de un residuo de G o C en el extremo 3 de los cebadores. Este cepo de GC
contribuye a que sea correcta la unin en el extremo 3, debido a la mayor fortaleza
del puente de hidrgeno de los residuos de G/C. Esto tambin ayuda a mejorar la
eficacia de la reaccin por minimizar las eventuales aberturas que pudiera haber.
PCR especializada
Adems de la amplificacin de una secuencia diana de ADN por los procedimientos
normales de PCR que se han descrito, se han desarrollado varios tipos
especializados de PCR para aplicaciones especficas.
PCR anidada
Pueden utilizarse conjuntos anidados de cebadores para mejorar el rendimiento de

la PCR de la secuencia diana de ADN (Newton y Graham, 1994). La PCR con
Sesin n 6
23
cebadores anidados se efecta haciendo entre 15 y 30 ciclos con un primer conjunto

de cebadores y despus otros 15 a 30 ciclos con un segundo conjunto de cebadores
respecto a una regin interna del producto de ADN amplificado en primer lugar. As
pues, el fragmento ms largo producido en la primera ronda de PCR se utiliza como
ADN molde para la segunda PCR. El mtodo de PCR anidada puede aumentar
espectacularmente la sensibilidad y la especificidad de la amplificacin del ADN.
Mejora particularmente la especificidad porque esta tcnica elimina casi siempre los
eventuales productos de amplificacin inespecficos que perturban el proceso. Esto
se debe a que tras la primera ronda de PCR es poco probable que los eventuales
productos inespecficos sean suficientemente complementarios de los cebadores
anidados y puedan servir de ADN molde para la amplificacin posterior, y as lo que
se amplifica preferentemente es la secuencia diana. No obstante, un inconveniente
de esta extrema sensibilidad es el mayor riesgo de contaminacin, y deben
extremarse las precauciones cuando se realiza esta PCR, sobre todo en un
laboratorio de diagnstico.
PCR Mltiplex
Mientras que la PCR normal utiliza en general un solo par de cebadores para
amplificar una secuencia especfica, la PCR Mltiplex utiliza mltiples pares de
cebadores para amplificar muchas secuencias simultneamente. La presencia de
muchos cebadores de PCR en un solo tubo puede causar muchos problemas, como
el aumento de la formacin de productos de PCR con errores de cebado, dmeros de
cebadores y la discriminacin de la amplificacin de fragmentos ms largos de ADN
(Atlas y Bey, 1994).
Para este tipo de amplificacin por PCR, se eligen cebadores con temperaturas de
hibridacin similares. Las longitudes de los productos amplificados deben ser
similares; si hay grandes diferencias entre las longitudes de los ADN diana se
favorece la amplificacin de la diana ms corta respecto a la ms larga, lo que
implica diferencias en el rendimiento de los productos amplificados. Por otra parte,
los tampones de PCR Mltiplex contienen un aditivo de la polimerasa Taq, que
reduce la competencia entre amplicones y la discriminacin de fragmentos ms
largos de ADN durante la PCR Mltiplex.
Los productos de la PCR Mltiplex pueden seguir hibridndose con una sonda
especfica del gen con fines de verificacin.
Sesin n 6
24
La PCR en la prctica
Como ya se ha visto en secciones anteriores, la utilizacin de la PCR est muy
difundida porque se trata de una tcnica potente de anlisis y preparacin. No
obstante, dada la naturaleza de este procedimiento, es posible que cantidades traza
de ADN contaminante sirvan de ADN molde, lo que provocara la amplificacin de un
cido nucleico distinto del diana (falsos positivos). As pues, resulta fundamental
realizar la amplificacin por PCR en un entorno libre de ADN. El riesgo de
contaminacin se reduce si se dispone de zonas de trabajo fsicamente separadas y
dotadas de su propio material. El requisito previo ms importante para reducir al
mnimo la tasa de falsos resultados positivos es el cumplimiento estricto de las
normas de descontaminacin (descontaminacin de cidos nucleicos, prevencin de
la formacin de aerosoles, etc.). La contaminacin de la PCR puede deberse a
fuentes diversas, como las siguientes:
mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar contaminados con

preparados anteriores de ADN, o con fragmentos de restriccin purificados;
contaminacin cruzada entre muestras;
productos de amplificaciones anteriores por PCR.
Esta seccin recoge algunas recomendaciones, con el fin de definir los requisitos
normales para el establecimiento y mantenimiento de un entorno limpio para
cualquier sistema de ensayo con PCR, independientemente del nmero de muestras
tratadas (Roth et al., 1997).
Mtodos fsicos de prevencin
Instalaciones de los laboratorios. Para evitar la contaminacin, debe disponerse

de zonas de trabajo separadas fsicamente de la forma siguiente:
1. Zona de preparacin de muestras
Esta sala consiste de una zona en que se efectan todas las fases previas a la
amplificacin del ADN molde (p. ej., aislamiento y purificacin del ADN).
2. Sala de disposicin de la PCR
Esta sala limpia se dedica a los procesos de preparacin de la PCR en s (p.
ej., mezcla maestra, diluciones de cebadores, etc.).
3. Zona post-PCR
Esta zona se reserva a la amplificacin de la secuencia del ADN diana, y a la
deteccin y anlisis de los productos de la PCR.
Sesin n 6
25
Por otra parte, han de seguirse las normas generales siguientes:
Todas las salas deben contener su propio material (batas, guantes, reactivos y
suministros).
Los reactivos y dems material deben etiquetarse con el nombre del contenido y
la fecha de preparacin.
Ha de utilizarse un sistema de flujo unidireccional, es decir, nunca se han de

trasladar materiales, muestras ni equipos de las zonas post-PCR a lugares prePCR.
Deben utilizarse tubos de reaccin para PCR desechables, libres de

desoxirribonucleasa y de ribonucleasa.
Han de utilizarse puntas de pipeta especiales, que impidan la formacin de

aerosoles, y los juegos de pipetas sern exclusivos (se utilizarn solo para la
PCR) y, de preferencia, del tipo de desplazamiento positivo.
Siempre que sea posible, preprese la PCR en una campana extractora dotada
de luz UV. En la campana extractora hay de poner una microcentrifuga y guantes
desechables que se utilizarn exclusivamente para la PCR.
Las mesas y estantes se lavarn peridicamente con leja al 10 %, seguida de

etanol al 70 %.
Manipulacin de las muestras
Utilcense tcnicas estriles y llvense puestos guantes recientes siempre que se

trabaje en las zonas antes descritas. Hay que cambiarse de guantes con
frecuencia, sobre todo si se sospecha que se han contaminado con soluciones
que contengan ADN molde.
Para preparar los reactivos de la PCR y el ADN molde han de utilizarse siempre
materiales de vidrio, de plstico y pipetas nuevos o esterilizados.
Pasar por autoclave todos los reactivos y soluciones que puedan sufrir este
tratamiento sin que se vean afectadas sus propiedades. Por supuesto, no deben
pasar por autoclave los cebadores, los dNTP ni la ADN Taq polimerasa.
Debe disponerse de un conjunto propio de reactivos y soluciones de PCR que

solo se utilizarn con este fin, y dichos reactivos se almacenarn en pequeas
cantidades.
Cuando se pipetea el ADN, ha de evitarse la formacin de aerosoles que puedan

transportar contaminantes.
Sesin n 6
26
Siempre han de efectuarse reacciones de control, como por ejemplo un control

negativo (sin ADN), que contenga todos los componentes de la reaccin
excepto el ADN molde, y un control positivo que se haya utilizado con xito en
PCR anteriores.
Sesin n 6
27
Mtodos bioqumicos de prevencin
Uracil-ADN glucosilasa. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) puede

amplificar una sola molcula ms de mil millones de veces. As, es posible amplificar
una cantidad incluso minscula de un contaminante, lo que dara lugar a un falso
positivo. Tales contaminantes suelen ser productos de anteriores amplificaciones por
PCR (contaminacin por arrastre). Por tanto, se han elaborado mtodos para evitar
esta contaminacin.
Una estrategia frecuente es sustituir el dTTP por dUTP durante la amplificacin por
la PCR, para formar ADN que contenga uracilo (U-ADN) (Longo et al., 1990). El UADN contaminante de la muestra se eliminar tratando las mezclas de PCR
posteriores con uracil-ADN glucosilasa (UNG) antes de la amplificacin por PCR y
descomponiendo despus los polinucletidos pirimidnicos a temperatura elevada
(95 C) en condiciones alcalinas (durante la fase de desnaturalizacin inicial) (vase
la figura 8).
UracilADN
Glucosilasa
Calor
pH alcalino
A=Adenina
U=Uracilo
G=Guanina
Figura 8. Reaccin de la uracil-ADN glucosilasa.

Por supuesto, este mtodo exige que todas las PCR del laboratorio se realicen con
dUTP en lugar de con dTTP.
Ha de tenerse en cuenta lo siguiente cuando se utilicen productos de PCR que
contengan dU en aplicaciones posteriores:
Sesin n 6
28
los productos de PCR que contienen dU funcionan tan bien como los que
contienen dT cuando se utilizan como dianas de hibridacin o como ADN moldes
para la tcnica del didesoxi;
los productos de PCR que contienen dU pueden clonarse directamente si se

transforman en hospedadores bacterianos UNG-;
un sustrato que contenga dU es digerido fcilmente por ciertas enzimas de

restriccin comunes (p. ej., EcoR I y BamH I), mientras que otras (p. ej., Hpa I,
Hind II, Hind III) presentan una actividad reducida sobre estos sustratos;
no se recomienda utilizar ADN con dU en estudios sobre la unin a protenas ni

sobre la interaccin del ADN con protenas.
Desoxirribonucleasa I, exonucleasa III. Otros mtodos bioqumicos se basan en el

tratamiento del ADN contaminado con desoxirribonucleasa I, exonucleasa III o con
una enzima de restriccin que contenga una secuencia de reconocimiento dentro del
ADN diana. Sin embargo, dadas las condiciones desfavorables en que debe
efectuarse la reaccin, estas enzimas presentan el inconveniente de reducir la
eficacia de la amplificacin por PCR.
Preparacin de la mezcla para la PCR (mezcla maestra)
Los reactivos fundamentales para la PCR son agua, el tampn de reaccin, una
ADN polimerasa termoestable, cebadores oligonucleotdicos, desoxinucletidos
(dNTP) y ADN molde (diana), as como iones de magnesio (Mg2+). En general, todos
los reactivos (excepto el ADN molde) se mezclan en un solo tubo, con un volumen
suficiente segn el nmero de reacciones que se vaya a realizar (mezcla maestra).
La mezcla maestra se reparte a continuacin en alcuotas en varios tubos y se
aade el ADN molde. El uso de una solucin maestra reduce el riesgo de
contaminacin y mejora el rendimiento de la PCR por los motivos siguientes:
se garantiza una calidad uniforme de la solucin respecto a todos los reactivos

para una serie de anlisis;
disminuye el riesgo de contaminacin de la solucin original y de las resultantes;
pueden pipetearse volmenes mayores;
hay menos etapas de pipeteado, con lo que se ahorra tiempo.
El xito en la amplificacin de la regin de inters depende de la cantidad y de la

calidad del ADN molde. La cantidad de ADN molde necesaria es funcin de la
complejidad de la muestra de ADN. Teniendo en cuenta que el tamao del genoma
Sesin n 6
29
nuclear vara segn los organismos, la concentracin de ADN debe mantenerse

constante (generalmente 10 ng/l). El cuadro 3 muestra una comparacin del
tamao del genoma de varias especies vegetales utilizadas con frecuencia en la
transformacin vegetal, as como el nmero correspondiente de ejemplares de
genoma en una cantidad definida de ADN.
Cuadro 3. Comparacin del tamao del genoma de varias especies vegetales y
nmero correspondiente de ejemplares de genoma en una cantidad definida de
ADN.
Muestra
Tamao del
Ejemplares de genoma en
Ejemplares de genoma
genoma
1 g ADN
en
1 ng ADN
Maz
5 x 109 pb
1,85 x 105
185
Soja
1,55 x 109 pb
5,98 x 105
598
Tabaco
3,8 x 109 pb
2,43 x 105
245
Arroz
4 x 10 pb
2,31 x 10
2310
Por ejemplo, en un plsmido de 4 kb con un inserto de 1 kb, la diana de inters es el

25 % del ADN aportado. A la inversa, un gen de 1 kb en el genoma del maz (5 x 109
pb) representa
alrededor
del
0,00002 %
del
ADN
aportado.
Hace
falta
aproximadamente un milln de veces ms ADN del genoma del maz para mantener
el mismo nmero de ejemplares de la diana por reaccin. Para optimizar los
resultados, deben utilizarse > 104 ejemplares de la secuencia diana como ADN
molde inicial para obtener una seal al cabo de 25 o 30 ciclos. Aunque en la prctica
es posible amplificar menos de 10 ejemplares de una secuencia diana, en este caso
podra ser necesario un nmero mayor de ciclos de PCR para detectar una seal por
electroforesis en gel. Los protocolos generales aplicados habitualmente consideran
un nmero de ciclos entre 30 y 40. Debe vigilarse un aumento del nmero de ciclos,
ya que entonces podra incrementarse la amplificacin inespecfica.
Controles
Como se sealaba en la seccin anterior, se encuentran fuentes posibles de

contaminacin por todo el laboratorio. Tanto las muestras como el personal de
laboratorio, el sistema de aire acondicionado, el equipo y los reactivos pueden ser
Sesin n 6
30
fuente de contaminacin. Entre los agentes contaminantes pueden citarse los

siguientes:
1. contaminacin por arrastre de ADN diana amplificado en PCR anteriores;
2. contaminacin cruzada entre muestras, lo que supone la transferencia de ADN
diana de una muestra a otra;
3. ADN genmico de preparados de muestras anteriores;
4. degradacin de productos por reacciones de descontaminacin.
Mientras que las tres primeras formas de contaminacin producen falsos positivos, el
ltimo tipo produce falsos negativos. Esta forma de contaminacin, observada en
primer lugar por Niederhauser y colaboradores en 1994, provoca la inhibicin de las
PCR (Niederhauser et al., 1994). De hecho, la descontaminacin con el mtodo
UNG favorece la formacin de complejos con los cebadores.
Para obtener resultados fiables, con las PCR siempre hay que utilizar controles tanto
positivos como negativos. El cuadro 4 indica algunos de los controles ms utilizados
para garantizar el resultado de los procedimientos de amplificacin de cido
nucleico.
Cuadro 4. Controles que deben introducirse en los ensayos con PCR.
Control
Mtodo
Contaminacin de los reactivos con

el ADN diana
Control negativo de la PCR sin ADN molde

(solo mezcla maestra)
Especificidad de la reaccin
Controles para detectar productos

secundarios e inespecficos
Desarrollo y sensibilidad de la
reaccin
Controles positivos y negativos para verificar

que se cumplen las condiciones y
rendimientos buscados
Integridad de la mezcla de PCR
PCR con control positivo de ADN
Controles positivos
Hay que comprobar mediante controles positivos la eficacia de la extraccin y

amplificacin del ADN. Lo ideal es dar lmites de deteccin en equivalentes
genmicos, lo que permitira la produccin de controles de sensibilidad definidos,
con pequeos nmeros de ejemplares. Como norma, debe disponerse de un
Sesin n 6
31
preparado de referencia que contenga una concentracin conocida del ADN diana
estudiado.
Controles negativos
Puede darse contaminacin (arrastre de productos amplificados o cidos nucleicos)

durante el aislamiento y la purificacin del ADN diana, as como durante la
preparacin de la mezcla de reaccin para la amplificacin. Por tanto, es necesario
introducir un control negativo con la mezcla de reaccin para la amplificacin.
Sesin n 6
32
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Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Componentes, estructura y replicacin del ADN

Instrumentacin y componentes para la PCR

Diseo de cebadores para la PCR

Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Componentes, estructura y replicacin del ADN

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Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Desoxiadenosina trifosfato = dATP

Desoxiguanosina trifosfato = dGTP

Desoxicitidina trifosfato : dCTP

Desoxitimidina trifosfato = dTTP

Figura 1. Componentes de los nucletidos (imagen: Andy Vierstraete, 1999).

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se une con T mediante dos puentes de hidrgeno, y C siempre se une con G

Figura 2. Formacin de una cadena de ADN a partir de los distintos nucletidos

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Genoma= total de todos los cromosomas

Pares de bases de los

Esqueleto de azcar y fosfato

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Replicacin. El ADN contiene toda la informacin gentica que define la estructura

Las flechas indican la direccin de

Figura 4. La horquilla de replicacin.

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desnaturalizacin del ADN por fusin a temperatura elevada, a fin de convertir el

unin (anillamiento) de dos oligonucletidos, utilizados como cebadores, al ADN

extensin de la cadena de ADN por adicin de nucletidos a partir de los

Los oligonucletidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas,

30-40 ciclos de 3 fases

Figura 5. Fases de la amplificacin por PCR (imagen: Andy Vierstraete, 1999).

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donde n es el nmero de ciclos, 2n es el nmero de molculas del primer producto

Figura 6. La amplificacin exponencial del ADN mediante PCR.

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Desnaturalizacin del ADN molde

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inicial. La temperatura de trabajo ideal para la ADN polimerasa Taq es de 72 C.

Instrumentacin y componentes para la PCR

termocicladores o mquinas de PCR.

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Figura 7. Perfil de ciclos de temperatura de la PCR.

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motivos repetidos, ya que podran hibridarse de forma inadecuada con el ADN

Por el contrario, la PCR no es eficaz si la

concentracin del cebador es limitante.

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