NORMA TCNICA

COLOMBIANA

NTC
4516
2009-11-18

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS

DE ALIMENTACIN ANIMAL.
MTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIN Y
ENUMERACIN DE COLIFORMES TCNICA DEL
NMERO MS PROBABLE

E:

MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING

STUFFS. HORIZONTAL METHOD FOR THE DETECTION
AND ENUMERATION OF COLIFORMS. MOST PROBABLE
NUMBER TECHNIQUE

CORRESPONDENCIA:

esta norma es idntica (IDT) con

respecto a su documento de
referencia, la norma ISO 4831-2006.

DESCRIPTORES:

microbiologa de alimentos; alimentos

para consumo humano; alimentacin
animal; mtodo horizontal; deteccin
de coliformes; mtodo de NMP.

I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproduccin

Primera actualizacin
Editada 2009-11-25

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica
est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo
caracterizado por la participacin del pblico en general.
La NTC 4516 (Primera actualizacin) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-11-18.
Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
travs de su participacin en el Comit Tcnico 25 Microbiologa.
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A.
ALCALDA DE BOGOT - ARCHIVO
BOGOT
AVESCO S.A. -KOKORIKOBASIC FARMA S.A.
BIFAR EU
CARULLA VIVERO S.A.
COMPAIA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A.
ENZIPAN LABORATORIOS S.A.
FILTRACIN Y ANLISIS LTDA.

GAE LTDA.
INDALPE LTDA.
IVONNE BERNIER LABORATORIO
LABCONTROL E.U.
LABFARVE
LABORATORIOS SFC LTDA.
PURIFICACIN Y ANLISIS DE FLUIDOS
LTDA.
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES - LEMA-

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las

siguientes empresas:
ACEGRASAS S.A.
ACUAGYR S.A. E.S.P.
ALGARRA S.A.
ANNAR DIAGNOSTICA IMPORT LTDA.
AQUALAB
AREPAS DOA ALEJA
ASBIOQUIM LTDA.
ASEBIOL
ASINAL
ASOCIACIN COLOMBIANA DE CIENCIA
Y TECNOLOGA COSMTICA -ACCYTECASOCIACIN
COLOMBIANA
DE
MICROBIOLOGA

BAVARIA S.A.
BECTON DICKINSON DE COLOMBIA
LTDA.
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA.
CASA LUKER
CERVECERA LEONA S.A.
COLOMBIANA S.A.
CONGELAGRO S.A.
CONSERVAS COLOMBINA S.A. -LA
CONSTANCIACORPOICA -CORPOLABCORPORACIN PARA EL AVANCE DE LA
MICROBIOLOGA Y LA MICROSCOPIA

MICROS
DUPONT QUALICON
EMPRESA
DE
ACUEDUCTO
Y
ALCANTARILLADO DE BOGOT E.S.P.
FABRICA
DE
ESPECIAS
Y
CONDIMENTOS EL REY S.A.
FRUGAL S.A.
JOHNSONDIVERSEY
KLIK S.A.
LA CAMPIA
LABORATORIO A.B.B.A.
LABORATORIO BIOCONTROL LTDA.

LABORATORIO
DE
GENTICA
Y
BIOLOGA MOLECULAR
LESNIAK EU
MICROBIOLOGOS ASOCIADOS LTDA.
MULTIDIMENSIONALES S.A.
NESTL DE COLOMBIA S.A.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
QUIK LTDA.
ROCHE DIAGNOSTICS
SERVICIOS DE LABORATIO CLINICO LTDA.
UNIVERSIDAD MANUELA BELTRN

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIN DE NORMALIZACIN

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

CONTENIDO

Pgina

INTRODUCCIN...........................................................................................................................1

1.

ALCANCE .........................................................................................................................1

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS .......................................................................................2

3.

TRMINOS Y DEFINICIONES .........................................................................................2

4.

PRINCIPIO.........................................................................................................................3

4.1

DETECCIN DE COLIFORMES ......................................................................................3

4.2

ENUMERACIN MEDIANTE LA TCNICA DE NMP.....................................................3

5.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES..........................................................................3

5.1

GENERALIDADES............................................................................................................3

5.2

DILUYENTES ....................................................................................................................4

5.3

MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO: CALDO LAURIL

SULFATO TRIPTOSA ......................................................................................................4

5.4

MEDIO DE CONFIRMACIN: CALDO LACTOSA BILIS

VERDE BRILLANTE.........................................................................................................4

6.

EQUIPO Y VIDRIERA ......................................................................................................5

7.

MUESTREO.......................................................................................................................5

8.

PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO ..........................................................6

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

Pgina

9.

PROCEDIMIENTO ...........................................................................................................6

9.1

MTODO DE DETECCIN .............................................................................................6

9.2

MTODOS DE ENUMERACIN (NMP) ..........................................................................7

10.

CLCULO Y EXPRESIN DE LOS RESULTADOS ......................................................8

11.

PRECISIN .......................................................................................................................8

12.

INFORME DE ENSAYO....................................................................................................8

BIBLIOGRAFA ...........................................................................................................................13

DOCUMENTO DE REFERENCIA ..............................................................................................14

ANEXOS
ANEXO A (Normativo)
DIAGRAMAS DE FLUJO PARA EL PROCEDIMIENTO ............................................................9
ANEXO B (Informativo) ...............................................................................................................12

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS DE ALIMENTACIN ANIMAL.

MTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIN Y ENUMERACIN DE COLIFORMES
TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE

INTRODUCCIN
Debido a la gran variedad de alimentos y productos de alimentacin, este mtodo horizontal
puede no ser adecuado en todo detalle para algunos productos. En este caso, se pueden
utilizar mtodos diferentes especficos para tales productos, si es absolutamente necesario por
razones tcnicas justificadas. Sin embargo, se debera realizar todo el esfuerzo para aplicar
este mtodo horizontal en la medida de lo posible.
La tcnica descrita en esta norma permite realizar un examen microbiolgico en una porcin de
ensayo ms grande permitiendo as la deteccin de un nmero ms bajo de coliformes por
gramo o mililitro de producto.
Para los propsitos de un mtodo de ensayo factible, la definicin de "coliformes" indicada en la
seccin 3 y utilizada como base para el procedimiento, no necesariamente es idntica a las
definiciones correspondientes indicadas en otros textos publicados. Una proporcin de las
cepas de los microorganismos descritos en otros textos publicados como "coliformes"
(incluyendo Escherichia coli) no produce suficiente gas para ser detectable mediante la
utilizacin de un tubo Durham (es decir, las "cepas anaergenas"). Por lo tanto, el mtodo
descrito en esta norma no detecta a todas las cepas de los microorganismos a los que se hace
referencia en otras publicaciones como "coliformes (presuntivo)" (por ejemplo, algunas cepas
de Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella) (vase referencia [2]).

1.

ALCANCE

Esta norma suministra directrices generales para la deteccin y la enumeracin de coliformes.

Se aplica a:
-

productos destinados para consumo humano y para alimentacin de animales, y

muestras ambientales en el rea de produccin y manipulacin de alimentos.

La enumeracin se realiza mediante el clculo del nmero ms probable despus de la

incubacin en un medio lquido a 30 C 1 C o 36 1 C.

1 de 14

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

NOTA
La temperatura est sujeta al tipo de producto. En el caso de la leche y los productos lcteos, la
temperatura de incubacin es de 30 C 1 C.

Este mtodo de enumeracin se aplica cuando se espera que el nmero que se busca est en
el rango entre 1 ml y 100 por ml o por gramo de muestra de ensayo.
Una limitacin en la aplicabilidad de esta norma est impuesta por la susceptibilidad del
mtodo a un amplio grado de variabilidad. La informacin suministrada en el numeral 11 brinda
directrices sobre la aplicabilidad del mtodo y sobre la interpretacin de los resultados.

REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicacin de

este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica nicamente la edicin citada.
Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin del documento normativo referenciado
(incluida cualquier correccin).
NTC 4092, Microbiologa de alimentos y productos para alimentacin animal. Requisitos
generales y directrices para anlisis microbiolgicos.
NTC 4491 (todas las partes), Microbiologa de alimentos y alimentos para animales
Preparacin de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los
anlisis microbiolgicos. Parte 1. reglas Generales para la preparacin de la suspensin inicial
y de diluciones decimales
GTC 78, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. gua para la preparacin y
produccin de medios de cultivo. gua general para el aseguramiento de la calidad para la
preparacin de los medios de cultivo en el laboratorio.
GTC 171, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Gua para la preparacin de
medio de cultivo. Gua general para los ensayos de desempeo de medios de cultivo.
ISO FDIS 6887-5:200 9, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs - Preparation of Test
samples, Initial Suspension and Decimal Dilutions for Microbiological Examination - Part 5:
Specific Rules for the Preparation of Milk and Milk Products.

3.

TRMINOS Y DEFINICIONES

Para los propsitos de esta norma, se aplican los siguientes trminos y definiciones.
3.1 Coliformes. Bacterias Gram negativas que, a una temperatura especificada (30 C 1 C o
36 C 1 C, segn producto), produce fermentacin de la lactosa con produccin de gas, bajo
las condiciones de ensayo que se especifican en esta norma.
3.2 Deteccin de coliformes. Determinacin de la presencia o ausencia de estas bacterias, en
una cantidad particular de producto, cuando se realizan ensayos de acuerdo con el mtodo que
se especifica en esta norma.
3.3 Enumeracin de coliformes. Nmero ms probable de coliformes hallados por mililitro o
por gramo de muestra de ensayo, cuando el ensayo se realiza segn el mtodo que se
especifica en esta norma.
2

NORMA TCNICA COLOMBIANA

4.

PRINCIPIO

4.1

DETECCIN DE COLIFORMES

NTC 4516 (Primera actualizacin)

4.1.1 Un tubo con caldo de enriquecimiento selectivo se inocula con la porcin de ensayo y se
incuba a 30 C 1 C o 36 C 1 C (segn producto) durante 24 h o 48 h.
4.1.2 Un tubo con medio de confirmacin se inocula con el contenido del tubo obtenido del
numeral 4.1.1 cuando se ha observado la formacin de turbidez o gas o ambos, y se incuba a
30 C 1 C o 36 C 1 C (segn acuerdo) durante 24 h o 48 h.
4.1.3 La presencia de coliformes se confirma en el caso en que se haya observado la
formacin de turbidez y gas despus del examen del tubo obtenido del numeral 4.1.2.
4.2

ENUMERACIN MEDIANTE LA TCNICA DE NMP

4.2.1 Tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo lquido con doble concentracin se
inoculan con una cantidad especfica de la muestra de ensayo, si el producto inicial es lquido,
o con una cantidad especfica de una suspensin inicial en el caso de otros productos.
4.2.2 Tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo lquido con una concentracin
sencilla se inoculan con una cantidad especfica de la muestra de ensayo, si el producto inicial
es lquido, o con una cantidad especfica de una suspensin inicial en el caso de otros
productos. Despus, bajo las mismas condiciones, se inoculan con diluciones decimales de la
muestra de ensayo o de la suspensin inicial tubos adicionales que contengan medio con una
concentracin sencilla.
4.2.3 Los tubos que contienen el medio de enriquecimiento selectivo con doble concentracin
se incuban a 30C 1 C o 36 C 1 C (segn acuerdo) durante 24 h, y los tubos que
contienen el medio con concentracin sencilla se incuban durante 24 h o 48 h, despus de este
periodo estos tubos se examinan para determinar la formacin de gas o la turbidez que presume la
deteccin de la formacin de gas.
4.2.4 Una serie de tubos con el medio de confirmacin se inoculan con los cultivos
provenientes de los tubos del medio de enriquecimiento selectivo con doble concentracin y
con los cultivos de los tubos con medio de enriquecimiento selectivo de concentracin sencilla,
en los cuales se ha observado la formacin de gas o la turbidez que presume la deteccin de la
formacin de gas.
4.2.5 Los tubos que se obtienen en el numeral 4.2.4 se incuban a 30 C 1 C o 36 C 1 C
(segn acuerdo) durante 24 h o 48 h y se examinan para determinar la formacin de gas.
4.2.6 Se calcula el nmero ms probable de coliformes por mililitro o por gramo de muestra
(es decir, el NMP) a partir de la cantidad de tubos en la serie nueva (vase el numeral 4.2.5)
que muestran formacin de gas. Se utiliza una tabla para determinar el nmero ms probable.

5.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

5.1

GENERALIDADES

Vase la NTC 4092 con respecto a la preparacin, produccin y ensayo de desempeo de los
medios de cultivo.
3

NORMA TCNICA COLOMBIANA

5.2

NTC 4516 (Primera actualizacin)

DILUYENTES

Vase la NTC 4491 (la parte correspondiente), DE 027-08 o la norma internacional especfica
para el producto que se est examinando.
5.3

MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO: CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA

5.3.1

Composicin
a) Medio con doble
concentracin

b) Medio con
concentracin sencilla

Producto de la digestin enzimtica de la leche y

protenas animales

40 g

20 g

Lactosa (C12H22O11 H2O)

10 g

5g

Fosfato hidrgeno de dipotasio (K2HPO4)

5,5 g

2,75 g

Fosfato dihidrgeno de potasio (KH2PO4)

5,5 g

2,75 g

Cloruro de sodio

10 g

5g

Lauril sulfato de sodio

0,2 g

0,1 g

1 000 ml

1 000 ml

Agua

5.3.2

Preparacin

Disuelva los diferentes componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante

calentamiento, si es necesario.
Ajuste el pH segn la NTC 4092, si es necesario, de manera que despus de la esterilizacin
est en 6,8 0,2 a 20 - 25 C.
Dispense el medio en cantidades de 10 ml en tubos con dimensiones aproximadas de 16 mm
x 160 mm (vase el numeral 6.4) que contengan tubos Durham (vase el numeral 6.5) en el caso
del medio concentracin sencilla, y en tubos con dimensiones aproximadas de 20 mm x 200 mm
(vase el numeral 6.4) [que no contengan tubos Durham (vase el numeral 6.5)] en el caso del
medio con doble concentracin.
Esterilice en autoclave ajustado a 121 C durante 15 min. Los tubos Durham no deben
contener burbujas de aire despus de la esterilizacin.
5.3.3

Ensayo de desempeo para el aseguramiento de la calidad del medio de cultivo

Con respecto a las definiciones de selectividad y productividad, consulte la GTC 171. El ensayo
de desempeo con respecto al caldo lauril sulfato triptosa se encuentra en la GTC 171,
5.4

MEDIO DE CONFIRMACIN: CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE

5.4.1

Composicin

Producto de la digestin enzimtica de la casena

10 g

Lactosa (C12H22O11H20)

10 g

Bilis de buey deshidratado

20 g
4

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

Verde brillante

0,013 3 g

Agua
5.4.2

1 000 ml
Preparacin

Disuelva los diferentes componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante

calentamiento, si es necesario.
Ajuste el pH, segn la NTC 4092, si es necesario, de manera que despus de la esterilizacin
est en 7,2 0,2 a 20 - 25 C.
Dispense el medio en cantidades de 10 ml en los tubos de ensayo de aproximadamente 16 mm
x 160 mm (vase el numeral 6.4) que contienen los tubos Durham (vase el numeral 6.5).
Esterilice en autoclave ajustado a 121 C durante 15 min. Los tubos Durham no deben
contener burbujas de aire despus de la esterilizacin.
5.4.3

Ensayo de desempeo para el aseguramiento de la calidad del medio de cultivo

Con respecto a las definiciones de selectividad y productividad, consulte la GTC 171. El ensayo
de desempeo con respecto al caldo lactosa bilis verde brillante se encuentra en la GTC 171.

6.

EQUIPO Y VIDRIERA

Equipo comn de laboratorio de microbiologa (vase la NTC 4092), en particular, el siguiente.

6.1

Equipo para estilizacin en seco (horno) o para esterilizacin en hmedo

(autoclave).

Vase la NTC 4092.

6.2

Incubadora, con capacidad de funcionamiento a 30 C 1 C o 36 C 1 C.

6.3
Asas, de platino-iridio o nquel-cromo, con dimetro aproximado de 3 mm, o asas
desechables.
6.4

Tubos de ensayo, con dimensiones aproximadas de 16 mm x 160 mm y 20 mm x 200 mm.

6.5
Tubos Durham, con un tamao adecuado para su uso en los tubos de ensayo con
dimensiones de 16 mm x 160 mm (vase el numeral 6.4).
6.6

Pipetas de descarga total, con capacidad nominal de 1 ml y 10 ml.

6.7

pHmetro, con exactitud de 1 unidad de pH a 25 C.

7.

MUESTREO

El muestreo se debera realizar de acuerdo con la norma internacional especfica

correspondiente para el producto en cuestin. Si no existe una norma internacional, se
recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema.
5

NORMA TCNICA COLOMBIANA

8.

NTC 4516 (Primera actualizacin)

PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Prepare la muestra de ensayo de acuerdo con la NTC 4491 (la parte correspondiente), DE 027-08
o la norma internacional especfica correspondiente al producto en cuestin. Si no existe norma
internacional especfica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre
este tema.

9.

PROCEDIMIENTO (vase el Anexo A)

9.1

MTODO DE DETECCIN (vase la Figura A.1)

9.1.1

Porcin de ensayo y suspensin inicial

Vase la NTC 4491 y el DE 027-08 o la norma internacional especfica correspondiente al

producto en cuestin.
9.1.2

Inoculacin e incubacin

9.1.2.1 Dependiendo del lmite de deteccin que se requiera, se transfieren x ml de la muestra de

ensayo si es lquida, o x ml de la suspensin inicial en el caso de otros productos, a un tubo que
contengan 10 ml del medio de enriquecimiento selectivo de doble concentracin [vase el
numeral 5.3.1a)] cuando x est entre 1 ml y 10 ml, o a un tubo que contengan 10 ml del medio de
enriquecimiento selectivo de concentracin sencilla [vase el numera 5.3.1b)] cuando x 1 ml.
9.1.2.2 Deje los tubos con el medio de doble concentracin (vase el numeral 9.1.2.1) en la
incubadora (vase el numeral 6.2) ajustada a 30 C 1 o 36 C 1 C (segn acuerdo) durante
24 h 2 h.
9.1.2.3 Deje los tubos con el medio de concentracin sencilla (vase el numeral 9.1.2.1) en la
incubadora (vase el numeral 6.2) ajustada a 30 C 1 o 36 C 1 (segn acuerdo)
durante 24 h 2 h o, si no se ha observado formacin de gas o turbidez que presuma la
deteccin de dicha formacin en esta etapa, contine la incubacin por otras 24 h 2 h.
9.1.3

Confirmacin (vase la Figura A.3)

9.1.3.1 Tomando material de los tubos incubados segn el numeral 9.1.2.2, inocule con un asa
(vase el numeral 6.3) un tubo que contenga medio de confirmacin (vase el numeral 5.4).
Incube a temperatura de 30 C 1 C o 36 C 1 C (segn acuerdo) durante 24 h 2 h o, si no se
ha observado formacin de gas en esta etapa, durante 48 h 2 h.
9.1.3.2 Realice el mismo procedimiento descrito en el numeral 9.1.3.1 para los tubos incubados
segn el numeral 9.1.2.3 que muestren formacin de gas o turbidez que presuma la deteccin
de la formacin de gas, cuando cualquiera de estas caractersticas se observe primero (es
decir, despus de 24 h 2 h o despus de 48 h 2 h).
9.1.4

Interpretacin (vase la Figura A.1)

Un tubo de los suministrados segn los numerales 9.1.3.1 o 9.1.3.2 en el cual se observ la
formacin de gas despus de 24 h 2 h o de 48 h 2 h se considera un tubo positivo.

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

9.2

MTODOS DE ENUMERACIN (NMP) (vase la Figura A.2)

9.2.1

Porcin de ensayo, suspensin inicial y diluciones

Vase la NTC 4092 (la parte correspondiente), DE 027-08 o la norma internacional especfica
correspondiente al producto en cuestin.
Prepare una cantidad suficiente de diluciones para garantizar que todos los tubos
correspondientes a la dilucin final produzcan un resultado negativo.
9.2.2

Inoculacin e incubacin

9.2.2.1 Es comn que exista una combinacin de tres tubos para cada serie de diluciones. Sin
embargo, para algunos productos o cada vez que se requieran resultados de mayor exactitud,
exactitud o ambos casos, puede ser necesario inocular series que consten de ms de tres
tubos (por ejemplo de cinco tubos). En estos casos, para el clculo del nmero ms probable,
consulte las tablas correspondientes que se incluye en la NTC 4092.
9.2.2.2 Tome tres tubos que contengan medio de enriquecimiento selectivo de doble concentracin
[vase el numeral 5.3.1a)]. Utilizando una pipeta estril (vase el numeral 6.6) transfiera a cada
uno de estos tubos 10 ml de la muestra de ensayo, si es lquida, o 10 ml de la suspensin
inicial en el caso de otros productos.
9.2.2.3 Tome tres tubos que contengan medio de enriquecimiento selectivo de concentracin
sencilla [vase el numeral 5.3.1b)]. Utilizando una pipeta estril (vase el numeral 6.6)
transfiera a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra de ensayo, si es lquida, o 1 ml de la
suspensin inicial en el caso de otros productos.
9.2.2.4 Para cada una de las diluciones adicionales, contine tal como se describe en el
numeral 9.2.2.3. Utilice una pipeta estril para cada dilucin. Mezcle cuidadosamente el inculo
y el medio.
9.2.2.5 Deje los tubos con el medio de doble concentracin (vase el numeral 9.2.2.2) en la
incubadora (vase el numeral 6.2) ajustada a 30 C 1 C 36 C 1 C (segn acuerdo)
durante 24 h 2 h.
9.2.2.6 Deje los tubos con el medio de concentracin sencilla (vense los numerales 9.2.2.3 y
9.2.2.4) en la incubadora (vase el numeral 6.2) ajustada a 30 C 1 C 36 C 1 C (segn
acuerdo) durante 24 h 2 h o, si no se ha observado la formacin de gas o de turbidez que
presuma la deteccin de dicha formacin en esta etapa, contine la incubacin durante 24 h
2 h adicionales.
9.2.3

Confirmacin (vase la Figura A.3)

9.2.3.1 Tomando material de los tubos incubados segn el numeral 9.1.2.2, inocule con un asa
(vase el numeral 6.3) un tubo que contenga medio de confirmacin (vase el numeral 5.4).
Incube a temperatura 30C 1 C o 36 C 1 C (segn producto) durante 24 h 2 h o, si no
se ha observado formacin de gas en esta etapa, durante 48 h 2 h.
9.2.3.2 Realice el mismo procedimiento descrito en el numeral 9.2.3.1 para los tubos incubados
segn el numeral 9.2.2.6 que muestren formacin de gas o turbidez que presume la deteccin
de la formacin de gas, cuando se observe cualquiera de estas caractersticas (es decir,
despus de 24 h 2 h o despus de 48 h 2 h).
7

NORMA TCNICA COLOMBIANA

9.2.4

NTC 4516 (Primera actualizacin)

Interpretacin (vase la Figura A.2)

Para cada dilucin, cuente la cantidad total de tubos en los cuales se observ la formacin de
gas en el paso del numeral 9.2.3 (tubos positivos) despus de 24 h 2 h y (si se utiliza) 48 h
2 h.

10.

CLCULO Y EXPRESIN DE LOS RESULTADOS

De acuerdo con los resultados de la interpretacin (vase el numeral 9.1.4), indique la

presencia o ausencia de coliformes en la porcin de ensayo de x g o x ml de producto (vase la
NTC 4092).
Calcule el nmero ms probable a partir del nmero de tubos positivos en cada dilucin (vase
la NTC 4092).

11.

PRECISIN

Se reconoce que se pueden presentar amplias variaciones en los resultados con la tcnica del
NMP. Por lo tanto, los resultados obtenidos utilizando este mtodo se deberan utilizar con
precaucin.
Los lmites de confianza se suministran en la NTC 4092.

12.

INFORME DE ENSAYO

El informe de ensayo debe especificar:

-

toda la informacin necesaria para la identificacin completa de la muestra,

el mtodo de muestreo utilizado, si se conoce;

el mtodo de ensayo utilizado, con referencia a esta norma nacional;

el objeto del ensayo y la temperatura de incubacin utilizada;

todos los detalles operativos que no se especifican en esta norma o se consideran

opcionales, junto con los detalles de todo incidente que haya podido tener influencia en
los resultados;

los resultados obtenidos.

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

ANEXO A
(Normativo)

DIAGRAMAS DE FLUJO PARA EL PROCEDIMIENTO

Suspensin inicial (productos slidos) o muestras de ensayo (productos lquidos)

D

10 ml

1 ml

1 Tubo con medio de

concentracin doble
(9.1.2.1)

1 Tubo con medio de

concentracin sencilla
(9.1.2.1)

Proceder de la misma forma

Incubacin por 24 h
+/- 2 horas (9.1.2.2)
D+1

Incubacin por 24 h +/- 2h

o 48 h +/- 2 h (9.1.2.3)

Inoculacin (9.1.3.1)

D+2

Inoculacin
(9.1.2.3)

Incubacin por 24 h +/- 2h

o 48 h +/- 2 h

(+)

1er caso

D+3

Interpretacin
(+)
(9.1.4)

1er caso

(-)

(-)

2docaso

Incubacin por 24 h +/- 2h

o 48 h +/- 2 h

2docaso
D+4

(+)

1er caso

(-)

2docaso

Figura A.1. Mtodo de deteccin

Interpretacin
(9.1.4)

3er caso

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

Suspensin inicial (productos slidos) o muestras de ensayo (productos lquidos)

10 ml

1 ml

3 Tubos con medio de

concentracin doble
(9.1.2.2)

3 Tubos con medio de

concentracin sencilla
(9.2.2.3)

Proceder de la misma forma

Incubacin por 24 h
+/- 2 horas (9.2.2.5)
D+1

Incubacin por 24 h +/- 2h

o 48 h +/- 2 h (9.2.2.6)

Inoculacin (9.2.3.1)

D+2
Incubacin por 24 h +/- 2h
o 48 h +/- 2 h (9.2.3.1)

Inoculacin
(9.2.3.2)

(+)

1er caso

D+3

Interpretacin
(+)
(9.2.4)

1er caso

(-)

(-)

2docaso

Incubacin por 24 h +/- 2h

o 48 h +/- 2 h (9.2.3.2)

2docaso
D+4

(+)

1er caso

(-)

2docaso

Figura A.2. Mtodo de enumeracin

10

Interpretacin
(9.2.4)

3er caso

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

Antes de la incubacin
Formacin
de gas (+)

Despus de
la incubacin Turbidez No formacin
de gas (-)

Asas
(6.3)

Tubo con medio de

doble concentracin (5.3a)

Tubos con medio de

concentracin sencilla (5.3b)

Figura A.3. Detalles de la etapa de confirmacin

11

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

ANEXO B
(Informativo)

MEDIOS DE CULTIVO

Otro medios de cultivo indicados para la fase de confirmacin aparecen relacionados en la

GTC 125. Gua de referencias de mtodos horizontales de anlisis microbiolgicos para
bebidas, alimentos y alimentos para animales.

12

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

BIBLIOGRAFA

[1]

ISO 4832, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the
Enumeration of Coliforms. Colony-Count Technique.

[2]

Edward, P.R. and Ewing, W.H., Identification of Enterobacteriaceae, 3rd edn., Burgess
Publishing Company, Minneapolis, Minnesota, USA, 1972.

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NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4516 (Primera actualizacin)

DOCUMENTO DE REFERENCIA
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of Food and
Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the Detection and Enumeration of Coliforms. Most
Probable Number Technique. Geneva: ISO, 2006, 12 p (ISO 4831:2006 (E)).

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