I.

OBJETIVOS:

Conocer los efectos de los factores que modifican la actividad enzimtica

de la amilasa salival sobre el almidn.

Medir la actividad enzimtica por la desaparicin del sustrato.

Conocer el efecto de la concentracin de la enzima, de la temperatura y del

Ion cloro sobre la actividad la amilasa salival.

Conocer el efecto del pH sobre la amilasa salival.

II. MARCO TEORICO:

Las enzimas son protenas que ayudan a que las reacciones qumicas ocurran
con mayor rapidez. Presentan las siguientes caractersticas:
1) Son efectivas en pequeas cantidades
2) No sufren modificaciones qumicas irreversibles durante la catlisis. Es decir
que luego de la reaccin enzimtica, las molculas de enzimas que
reaccionaron son indistinguibles de las que no lo han hecho, (la estructura de
la molcula se mantiene, al principio y final de la reaccin, exactamente igual).
3) No afectan la posicin de equilibrio de la reaccin que catalizan. El estado
inicial y final de la reaccin es el mismo, solo que se llega al equilibrio mucho
ms rpidamente.
4) Son termolbiles y su actividad depende en ciertos casos del pH del medio.
5) El reconocimiento de la enzima con el reactivo a procesar (denominado
sustrato) es altamente especfico.
Factores que modifican la actividad enzimtica:
Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica
En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por
cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones
catalizadas por enzimas siguen esta ley general.
La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura
ptima.
Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a
la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la
desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta
anularse.

TEMPERATURA OPTIMA

Efecto de los inhibidores sobre la actividad enzimtica

Ciertas molculas pueden inhibir la accin cataltica de un enzima: son los
inhibidores. Estos inhibidores bien pueden ocupar temporalmente el centro activo
por semejanza estructural con el sustrato original (inhibidor competitivo) o bien

alteran la conformacin espacial del enzima, impidiendo su unin al sustrato

(inhibidor no competitivo).
Efecto del ph sobre la actividad enzimtica
Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH 2;
tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH
del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra.
Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas
elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la
actividad cataltica. Este es el llamado pH ptimo. La mayora de los enzimas son
muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o
por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. As, la
pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo
tiene a pH 10. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalizacin
de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas ms o menos complejos
para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiolgicos.

Efecto de las concentraciones sobre la actividad enzimtica

La velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin de
sustrato. La Figura muestra la velocidad de una reaccin enzimtica a 6
concentraciones distintas de sustrato. Adems, la presencia de los productos
finales puede hacer que la reaccin sea ms lenta, o incluso invertir su sentido.

III. DESARROLLO EXPERIMENTAL:

EXPERIMENTO B
Efecto de la Concentracin del Sustrato sobre la Actividad de la Amilasa
Salival
1) Rotular los tubos y preparar de la siguiente manera:
Tubos No.
Solucin de almidn 1%
Buffer fosfato pH 6,6
Solucin salina (NaCl 1%)
Agua destilada

I
1ml
2ml
2ml
5ml

II
2ml
2ml
2ml
4ml

III
3ml
2ml
2ml
3ml

IV
4ml
2ml
2ml
2ml

V
5ml
2ml
2ml
1ml

2) Mezclar bien los tubos. Hacer un control con la solucin yodada con todos los
tubos (5) de la misma manera que se hizo en el experimento anterior (tomar
de referencia) y leer las absorbancias de dichos controles a 650nm.
Tubos No.
HCL 0.05N
Solucin de los tubos de
Reaccin correspondientes
Solucin yodada

I
5ml

II
5ml

III
5ml

IV
5ml

V
5ml

0.5ml
0.5ml

0.5ml
0.5ml

0.5ml
0.5ml

0.5ml
0.5ml

0.5ml
0.5ml

Luego, en otros tubos le agregamos las cantidades indicadas por este

cuadro, generando ac el control por la solucin yodada

Tubos de ensayo
I
II
III
IV
V

Absorbancia
0.955
1.919
2.464
2.735
2.675
Lecturas Iniciales

3) Luego aadir 1ml de solucin de enzima a cada tubo y colocarlos en el agua

en bao mara a 37C por 20 minutos.

4) Sacar los tubos y hacer un control con solucin yodada de cada uno. Las
lecturas de absorbancia se tomarn ahora como lecturas finales.
Tubos de
ensayo
I
II
III
IV
V

Absorbancia
0.071
0.026
0.952
1.423
0.814
Lecturas Finales

5) Hacer la diferencia:
Actividad enzimtica = Lectura inicial - Lectura final
El resultado de esta diferencia se tomar como actividad enzimtica
Actividad enzimtica: I: 0.955 - 0.071= 0.884
II: 1.919 0.026= 1.893
III: 2.464 0.952= 1.512
IV: 2.735 1.423= 1.312
V: 2.675 0.814= 1.861
6) Determinar el Km experimental de la amilasa para el almidn a partir de una
grfica de actividad enzimtica contra [S] (Ecuacin de Michaelis-Menten) y
una grfica de dobles inversas: 1/actividad enzimtica contra 1/ [S] (Ecuacin
de Lineweaver-Burk).Graficar en papel milimetrado.

IV. DISCUSIN DE LOS RESULTADOS:

Las mezclas se realizaron de manera correcta, se hizo el control con la

solucin yodada y sin la presencia de alguna solucin enzima, fueron tomadas
las absorbancias en el espectrofotmetro. Dichas medidas se tomaron como
lecturas iniciales una vez realizado este procedimiento se agrego 1 ml de
solucin de enzima y fue llevado a bao mara por 20 minutos pasado el
tiempo se tomo lectura de las absorbancias cuyos resultados fueron menores
con respecto a los primeros.

Cuando se mide la aparicin de producto o bien el consumo de sustrato en

funcin del tiempo de la reaccin catalizada por enzimas, se obtendr una
curva cuya pendiente en cada punto es numricamente igual a la reaccin en
ese instante.

Los resultados indican la actividad enzimtica, la cual tienen como unidad a

las lneas de densidad ptica o unidades de absorbancia, las cuales se
hallaron de la resta de las ltimas lecturas de las primeras.

La regulacin enzimtica se refiere a la posibilidad que tienen las enzimas de

variar la velocidad de las reacciones que aquellas catalizan al producirse
determinados cambios en el medio; esa posibilidad viene dado por
caractersticas estructurales de las enzimas y que son una vez ms
manifestaciones del vnculo que existe entre la estructura y la funcin de las
biomolculas.

Los cambios de velocidad observados durante el proceso de adaptacin son

debido a cambios cuantitativos o cualitativos de los centros activos, y
atendiendo a esto las formas bsicas de la regulacin enzimtica se
manifiestan por variacin en la cantidad o la actividad de las enzimas.

V. CONCLUSIONES:

Concluimos que uno de los factores que modifican la actividad enzimtica

en nuestro experimento fue la temperatura a travs de la exposicin de los
tubos de ensayo al bao Maria.

La diferencia de los resultados obtenidos tanto en el espectrofotmetro

como los del bao mara fue la actividad enzimtica es decir la velocidad
con la que acta la enzima en las soluciones empleadas.

En la curva para calcular el Km, al principio no hay actividad, pero

posteriormente va aumentando. El proceso se acomoda poco a poco hasta
alcanzar la saturacin.

Al aumentar la temperatura se acelera la velocidad, pero si se aumenta

mucho ms entonces se desnaturaliza la enzima y ya no llega a presentar
actividad.

VI. RECOMENDACIONES:

Rotular adecuadamente los tubos, para que no exista confusin al momento

de agregar las soluciones.

Mantener la temperatura ptima cuando se someta a los tubos con las

soluciones en el bao mara, ya que si no se tiene cuidado se puede
desnaturalizar la enzima.

No olvidar agitar ligeramente el tubo de ensayo para mezclar la enzima con el

sustrato.

VI. CUESTIONARIO
1. Cul es la importancia del Km?
La constante de Michaelis-Menten es caracterstica de una enzima y particular
para un substrato. Reflejar la afinidad de la enzima por ese substrato, es una de
sus grandes importancias. Km es numricamente igual a la concentracin de
substrato a la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la Vmax (K m= Vmax/2).
Este parmetro, Km no vara con la concentracin de enzima.
Esta constante es definitivamente importante porque representa (para enzimas
que exhiben una cintica de Michaelis-Menten simple), la constante de
disociacin (la afinidad del complejo enzima-sustrato (ES) por el sustrato). Valores
bajos indican que el complejo ES est unido muy fuertemente y raramente se
disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto.
As para estos casos, se obtendr una diferente KM, segn el sustrato especfico,
en que acte cada enzima (como sucede en el caso de enzimas que actan en
sustratos anlogos); y las condiciones de reaccin en que se realice las
mediciones.

Diagrama de velocidad de reaccin y constante de Michaelis-Menten

2. Qu efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas?

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por
cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones
catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a
partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La

temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura

ptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin
debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica
debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece
rpidamente hasta anularse.

3. Cmo se clasifican las enzimas?

Las Enzimas se clasifican en:

Oxido-reductasas.- Catalizan reacciones de oxido reduccin biolgica. Es

frecuente que tengan NAD, FAD, NADP, Coenzima Q, etc como coenzimas.
Ejm: Deshidrogenada, Oxidasa.

Transferasas.- Catalizan la transferencia del grupo funcional de una molcula

a otra. Grupo metilos, acilos, fosfatos, aminos, etc.
Ejm: Transaminasa, Transcarboxilasa.

Hidrolasas.- Catalizan reacciones hidrolticas rompiendo enlaces de carbono

u otras molculas con la adicin de una molcula de agua.
Ejm: Amilasa, Peptidasa, Ureasa, Pepsina, Tripsina.

Liasas.- Catalizan la ruptura de enlaces C-C, C-S, C-N sin el ingreso de una
molcula de agua., excepto enlaces peptdicos entre dos aminocidos.
Ejm: Descarboxilasa, Aldolasa.

Isomerasas.- Catalizan reacciones transformando un ismero en otro

transfiriendo un grupo funcional de una posicin a otra.
Ejm: Epimerasa, Mutasa.

Ligasas.- Catalizan la unin de dos molculas con ruptura de una molcula de

ATP para proporcionar energa. Forman enlaces C-C, C-N, C-O y C-S

Ejm: Sintetasa, Carboxilasa.

4. A qu se llaman zimgenos e isoenzimas?

Son enzimas que realizan la misma funcin pero difieren en su estructura qumica
y propiedades cinticas.
Las formas isoenzimticas distintas pueden pertenecer a distintos tejidos
revelando sus modificaciones en el tejido que le dio origen. Generalmente son
estructuras oligomricas con varios tipos de cadenas proteicas dmeros o
tetrmeros-.
Muchas de las enzimas que se secretan, al liberarse de la clula, se hallan en un
estado inactivo. Adquieren su actividad posteriormente, en general por la accin
de otras enzimas. Tal es lo que ocurre, por ejemplo, con el tripsingeno secretado
por el pncreas (se utiliza en el intestino para la digestin de algunos alimentos).
Esta enzima se halla como precursor inactivo llamado zimgeno o proenzima- en
las vesculas secretorias situadas en el citoplasma de las clulas pancreticas. La
proenzima es activada se transforma en tripsina- en la luz del intestino mediante
la intervencin de una proteasa que corta la cadena polipeptdica del tripsingeno,
lo que permite la exhibicin de su sitio activo. Este mecanismo impide que las
enzimas digieran alas propias clulas pancreticas. Una activacin parecida de
proenzimas se observa en el proceso de coagulacin de la sangre.
5. Qu son cofactores y mencione ejemplos?
Un cofactor es un ion metlico, termoestable y de baja masa molecular necesaria
para la accin de una enzima. El cofactor se une a una estructura proteica
denominada apoenzima, y a este complejo se le denomina holoenzima.
Entre los cofactores se encuentran:
Hierro (Fe), Cobre (Cu), Potasio (K), Manganeso (Mn), Magnesio (Mg) , entre
otros.
El ion metlico puede actuar como:
1. Centro cataltico primario
2. Como grupo puente para reunir el sustrato y la enzima, formando un complejo
de coordinacin
3. Como agente estabilizante de la conformacin de la protena enzimtica en su
forma catalticamente activa.

VII. BIBLIOGRAFA:

Alvarado, Carlos; Ortiz Ureta. Bioqumica y nutricin. 2006. Lima. Per.

Brown-LeMay-Bursten. 1993. Qumica. Prentice-Hall Hispanoamericana

S.A. Mxico. Mxico.

Falen Boggie, J. 1992. Manual de prctica de Bioqumica. Lima. Per.

Informacin obtenida de los sitios web:

http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ2-2.htm#com
www.monografias.com/trabajos5/enzim
http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_de_Michaelis-Menten
http://laguna.fmedic.unam.mx
http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ1.htm