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DOI: http://dx.doi.org/10.3926/oss.5
ISBN versin on-line: 978-84-695-4746-5
ISBN versin impresa: 978-84-940234-8-4
DL: B-26402-2012
Diseo portada y contraportada: OmniaScience
Fotografa portada: Joshua Resnick - Fotolia.com
ndice
NDICE
NDICE DE TABLAS
NDICE DE ILUSTRACIONES
PRESENTACIN
CAPTULO 1
BIOLOGA DEL SEMEN
1.1
Anatoma
1.2
Citologa
1.2.1. El espermatozoide
1.3
Fisiologa
1.3.1.
1.3.2.
1.3.3.
1.3.4.
1.3.5.
1.4
La eyaculacin
Movilidad del espermatozoide
Capacitacin del espermatozoide
Espermatogenesis
Regulacin de la funcin gonadal testicular
Patologa
1.4.1.
Esterilidad de la pareja
CAPTULO 2
PREANALTICA
2.1
Factores que afectan a la calidad de la muestra
2.2
Recogida de las muestras
2.3
Recogidas especiales
2.4
Transporte
2.5
Recepcin
2.6
Conservacin: Criopreservacin
CAPTULO 3
EVALUACIN INICIAL DEL SEMEN
3.1
Evaluacin inicial macroscpica
3.2
Evaluacin inicial microscpica
CAPTULO 4
ESTUDIO BSICO DEL ESPERMIOGRAMA
Recuento
4.1
4.1.1.
4.2
4.3
4.3.1.
4.3.2.
4.4
4.5
Criptozoospermias y azoospermias
Morfologa
Vitalidad
Test de los colorantes supravitales
Test hipoosmticos
Anticuerpos antiespermatozoides
Otras clulas
4.5.1.
4.5.2.
Leucocitos
Clulas de la espermatognesis inmaduras
CAPTULO 5
PRUEBAS ANALTICO-CLNICAS DE SEGUNDA INTENCIN
5.1
Caracteres funcionales de los espermatozoides
5.1.1.
5.1.2.
5.1.3.
5.1.4.
5.1.5.
5.1.6.
5.2
Bioqumica seminal
5.2.1.
5.2.2.
5.2.3.
5.3
5.3.1.
5.3.2.
CAPTULO 6
ESTUDIO DEL SEMEN EN VASECTOMAS Y VASOVASOSTOMAS
6.1
Semen de postvasectoma
6.1.1.
6.1.2.
6.1.3.
6.2
6.3
Anlisis en fresco
Anlisis sedimento
Expresin de los resultados
Semen de prevasovasostoma
Semen posvasovasostoma
6.3.1.
CAPTULO 7
CAPACITACIN DEL SEMEN
Campo de aplicacin
7.1
7.2
Objetivos de las tcnicas de preparacin de semen
7.3
Tipo de muestra
7.3.1.
7.3.2.
7.4
7.5
7.5.1.
7.5.2.
7.5.3.
7.5.4.
7.6
7.7
Semen fresco
Semen congelado
Mtodo de lavado
Migracin
Gradientes de densidad
Mtodo de filtrado
CAPTULO 8
INFORME DEL LABORATORIO
8.1
Resultados
8.2
Valores de referencia
8.3
Comentarios
CAPTULO 9
BIBLIOGRAFA
SOBRE LOS AUTORES DEL LIBRO
SOBRE LOS REVISORES DEL LIBRO
ndice de tablas
Tabla 1. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen
Tabla 2. Clculo de la profundidad de campo para el estudio microscpico
Tabla 3. Diferencias aceptables entre dos porcentajes, calculados a partir de dos recuentos de
200 spz (400 spz)
Tabla 4. Clculo de la dilucin necesaria segn el recuento estimado
Tabla 5. Clculo del volumen de cada unidad de rejilla
Tabla 6. Diferencias aceptables entre dos porcentajes, calculados a partir de dos recuentos de
200 spz (400 spz)
Tabla 7. Origen glandular de los parmetros bioqumicos del plasma seminal
Tabla 8. Procedimiento de laboratorio para anlisis del semen en estudio de fertilidad.
Espermiograma
Tabla 9. Procedimiento de laboratorio para el anlisis del semen en intervenciones quirrgicas
Tabla 10. Ventajas de los mtodos de capacitacin ms empleados
Tabla 11. Procedimiento de laboratorio para la capacitacin del semen
Tabla 12. Valores y lmites de referencia
Tabla 13. Nomenclatura de la calidad del esperma
ndice de ilustraciones
Ilustracin 1. Diferentes partes y grados de aglutinacin entre los espermatozoides
Ilustracin 2. Tipos de movilidad de los espermatozoides
Ilustracin 3. Procedimiento para facilitar el contaje de la movilidad
Ilustracin 4. Grfica del intervalo de confianza del 95% para dos porcentajes
Ilustracin 5. Detalles de la cmara Neubauer improved
Ilustracin 6. Ejemplo de recuento en cmara Neubauer improved
Ilustracin 7. Grfica del intervalo de confianza del 95% para dos recuentos
Ilustracin 8. Tcnica para realizar una extensin de semen
Ilustracin 9. Clasificacin de los defectos morfolgicos de los espermatozoides
Ilustracin 10. Ejemplo del test de vitalidad con Eosina/Nigrosina
Ilustracin 11. Ejemplo del test de vitalidad con Sol. hiposmtica
Ilustracin 12. Parmetros de la trayectoria del espermatozoide, medidos por ordenador
Ilustracin 13. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin de la L-carnitina en plasma
seminal
Ilustracin 14. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin de la fructosa en plasma
seminal
Ilustracin 15. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin del citrato en plasma
seminal
Ilustracin 16. Esquemas grficos de los principales mtodos de capacitacin para
recuperacin de espermatozoides mviles
Ilustracin 17. Algoritmo diagnstico de la azoospermia
Presentacin
Presentacin
El problema de la esterilidad e infertilidad en las parejas hoy da est poniendo en riesgo la
capacidad de reemplazo generacional en Europa. Segn la Organizacin Mundial de la Salud
(OMS), alrededor del 10 al 15% de las parejas en edad de procrear consultan al mdico por
problemas de esterilidad, habitualmente despus de unos dos aos de no lograr concebir; de
hecho, se calcula que hay alrededor de 60-80 millones de parejas estriles en el mundo. Es por
ello que la demanda de evaluacin y tratamiento por esterilidad e infertilidad ha aumentado
drsticamente. Por otra parte, ante la dificultad de comparar resultados entre distintos
laboratorios y los resultados dispares de diferentes estudios, la OMS ha editado en 2010 el 5
Manual de laboratorio para el examen y procesamiento del semen humano, para unificar
criterios y establecer los lmites inferiores de referencia de nuestra era.
El objetivo de este manual es actualizar los conocimientos y adiestrar en los procedimientos para
evaluar la calidad del semen y capacitarlo, con el fin ltimo de ayudar al diagnstico de la
subfertilidad y esterilidad de origen masculino (casual o provocada por vasectoma) y al
tratamiento de la pareja mediante la preparacin del semen para las tcnicas de reproduccin
asistida.
Va dirigido al personal en formacin y a profesionales del mbito sanitario, principalmente del
laboratorio (tcnicos y analistas) pero tambin a los clnicos prescriptores (urlogos y
gineclogos).
Para la elaboracin del manual nuestro grupo de trabajo ha realizado una revisin completa y
actualizada del anlisis y preparacin del semen sobre la que se han desarrollado unos
Procedimientos de Laboratorio de forma detallada y esquematizada, de cada uno de los pasos
del proceso analtico: recepcin de muestras, anlisis del semen, capacitacin e informe de
laboratorio.
Julio 2012
Captulo 1
Anatoma
El aparato reproductor masculino est formado por varios rganos que segn su funcin se
podran clasificar en cuatro grupos:
o
Dos testculos: tienen una doble funcin, por una parte producen los
espermatozoides mediante un proceso llamado espermatognesis y por otra ejercen
una importante regulacin endocrina, tanto a nivel reproductor como sobre otros
rganos y funciones de nuestro cuerpo.
Las vas seminales, que tambin son dobles hasta su conexin con la prstata:
transportan los espermatozoides a lo largo del sistema reproductor.
Las glndulas accesorias: aportan una serie de sustancias vitales para la funcin
reproductora porque forman el lquido seminal, y adems tienen una funcin nutritiva
o reguladora.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustracin 20)
http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm#sistema_masculino
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_01a.jpg
A) Testculos
Los testculos se hallan en la regin perineal, tras la base del pene, en el interior de la bolsa
escrotal.
El escroto no tiene grasa y sus msculos reaccionan al calor extendiendo o contrayendo la piel.
Las dos gnadas (testculos) no ocupan el mismo nivel, ya que en la mayora de los hombres el
testculo izquierdo baja un poco ms que el derecho.
o
El escroto y el hecho de que estn alojados fuera del abdomen, hacen que se
mantenga la temperatura unos dos grados centgrados por debajo de la temperatura
corporal. Esto ser de vital importancia para el mantenimiento de la
espermatognesis.
El testculo y el epiddimo estn envueltos por la tnica albugnea, que es una capa fibrosa de
tejido conjuntivo blanco, denso y elstico.
Los conductos o tbulos seminferos son los conductos productores de los espermatozoides. Se
encuentran dentro de los lobulillos testiculares (hay entre 200 y 300 por testculo) formados por
los septos testiculares, que parten desde la tnica albugnea y se unen en el mediastinum testis.
Cada lobulillo contiene de 1-4 tbulos seminferos productores de espermatozoides.
Los tbulos seminferos desembocan a travs de los tbulos rectos en las cavidades
denominadas rete testis en el mediastinum testis.
En cuanto a la vascularizacin, los testculos estn irrigados por las arterias espermticas (la
arteria deferencial y la arteria funicular). Del drenaje sanguneo estn encargadas las venas
espermticas y cuando se obstruyen producen el varicocele.
A partir de la pubertad, los tbulos seminferos, desarrollan una pared gruesa y compleja
llamada epitelio germinal, compuesta por dos tipos de clulas:
o
Una lmina basal separa el epitelio seminfero del intersticio gonadal. El intersticio gonadal est
formado por tejido conjuntivo, tejido linftico, por capilares sanguneos y por clulas de Leydig
productoras de testosterona.
Las clulas de Sertoli se caracterizan por:
o
Las clulas germinales tienen distinto grado de diferenciacin dependiendo de la zona del
epitelio germinal en donde se localicen:
o
La barrera hematotesticular:
o
Acta de barrera entre la luz del tubo y el espacio intersticial. Esta barrera es
dinmica, permite la migracin de espermatocitos de la zona basal a la adluminal, y es
infranqueable por clulas perteneciente al sistema inmunitario como son los
linfocitos.
La barrera asla el espermatozoide, para que no sea reconocido como propio por el
sistema inmune.
Hay una actuacin muscular que regula la cercana de los testculos al cuerpo.
Por ltimo hay una regulacin sangunea, de forma que la sangre arterial que entra en
los testculos se enfra por la sangre venosa que sale de ellos.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustraciones de la 1 a la 10)
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_02.jpg
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_04.jpg
B) Vas seminales
Las vas seminales estn constituidas por: tubos rectos, rete testis, conductos eferentes,
epiddimo, conductos deferentes, ampolla deferencial y el conducto eyaculador.
Los extremos terminales de los tbulos seminferos, revestidos slo por clulas de Sertoli, se
estrechan y forman los tubos rectos, los cuales unen el tbulo seminfero con la rete testis.
La rete testis es una red de delicados tbulos, situado en el hilio del testculo, mediastino
testicular, que lleva los espermatozoides desde los tbulos seminferos a los vasos eferentes. En
la rete testis el lquido seminal se reabsorbe, concentrando los espermatozoides.
Los conductos eferentes unen la rete testis con la cabeza del epiddimo.
La luz de los tubos se reviste de dos tipos celulares:
o
Por la musculatura lisa que produce movimientos peristlticos para transportar los
espermatozoides.
La va seminal contina con los conductos deferentes. Estos ltimos transportarn el semen
durante el coito desde la cola del epiddimo hasta la ampolla deferencial.
La ampolla deferencial es una dilatacin del conducto deferente, que almacena espermatozoides
durante el coito. Est situada antes del conducto eyaculador.
El conducto eyaculador:
o
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustraciones de la 22 a la 24)
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_03a.jpg
C) Glndulas accesorias
Las glndulas accesorias se refieren a: las vesculas seminales, la prstata, las glndulas
bulbouretrales de Cowper y las glndulas uretrales de Littr. Vierten a las vas seminales el 80%
del volumen del eyaculado. Contribuyen de esta forma muy decisivamente a la formacin del
plasma seminal, cuya funcin es ser: medio nutritivo, vehculo de transporte y proteccin del
tracto urinario.
Las vesculas seminales estn situadas en la base de la prstata y unidas a ella por su extremo
inferior. Cada una est asociada al deferente y al conducto eyaculador. El eyaculado que
segregan se caracteriza por:
o
Las glndulas bulbouretrales o glndulas de Cowper: son glndulas del tamao de un guisante y
situadas a ambos lados del bulbo uretral. Vierten de manera gradual a la uretra, ante la
estimulacin ertica, actuando como lubricante de sta ante el paso del semen a gran velocidad.
El lquido seminal que segregan es:
o
Las glndulas uretrales de Littre estn situadas a lo largo de la uretra, vierten un fluido viscoso,
que acta limpiando y lubricando la uretra, favoreciendo el paso de los espermatozoides.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustraciones 21 y de la 25 a la 28)
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_09.jpg
D) Pene
El pene est formado por tres grandes cilindros de tejido erctil, rodeados por una vaina
elstica. Cada cilindro se rellena de sangre durante la excitacin sexual.
o
Los dos cilindros superiores, llamados cuerpos cavernosos, son los responsables de la
rigidez e incremento de volumen y longitud durante la ereccin.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustraciones 29 y 30)
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_10.jpg
1.2
Citologa
1.2.1. El espermatozoide
El espermatozoide maduro es una clula altamente diferenciada. Est formado por:
o
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustracin 17)
http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm#sistema_masculino
A) Cabeza
La cabeza del espermatozoide es de forma oval al observarla frontalmente, y piriforme cuando la
observacin es lateral, siendo ms gruesa en la base y adelgazando hacia la punta. Su tamao
aproximado oscila entre 3,7 y 4,7 micras de longitud y 2,5 a 3,2 micras de anchura, por 1 a 1,5
micras de espesor. La razn longitud/anchura vara entre 1,3 y 1,8. En la cabeza del
espermatozoide se sitan el ncleo y el acrosoma, recubiertos ambos por la membrana
plasmtica.
El ncleo ocupa la mayor parte de la cabeza. Es una masa de DNA haploide que se fusionar con
el ncleo del ovocito en el momento de la fecundacin. Su cromatina se ha condensado
intensamente a fin de disminuir el volumen de la cabeza, lo que facilita la movilidad del
espermatozoide a travs de los diferentes fluidos y estructuras que debe atravesar. Adems
protege al genoma de daos durante el trayecto.
o
El acrosoma se forma a partir del aparato de Golgi y contiene una gran concentracin de
hidratos de carbono y enzimas lisosmicas como la hialuronidasa. Hay tambin una enzima
8
B) Cuello
El cuello es la unin entre la cabeza y el flagelo y es una zona compleja y de gran importancia,
que soporta algunas estructuras esenciales:
o
A partir del capitel se extienden hacia atrs 9 densas columnas segmentadas de 1 a 1,5 micras de
largo, que forman una especie de embudo, y se continan en sus extremos con las nueve fibras
externas densas del flagelo.
El centriolo proximal est situado bajo la placa basal y a la entrada de ese embudo, pero
formando un ngulo de 70-80 grados con el eje del flagelo. Posee la estructura tpica de nueve
tradas tubulares. El par central de microtbulos del axonema flagelar puede llegar por delante
hasta el interior de la pieza de conexin, incluso hasta el centriolo proximal. Generalmente en
los espermatozoides maduros falta el centriolo distal, el orientado segn el eje del flagelo, pero
residuos de sus nueve tripletes pueden estar unidos a la cara interna de las columnas
segmentadas.
En la regin del cuello, y por fuera de la pieza de conexin pueden encontrarse algunas
mitocondrias orientadas longitudinalmente, que a veces emiten prolongaciones que se
extienden entre las columnas segmentadas.
C) Flagelo
El flagelo es una larga estructura filiforme de aproximadamente 50 m de longitud. Est
recubierto por una vaina fibrosa en su primera fraccin y luego solo por la membrana flagelar.
Posee una constitucin interna comn a la mayora de los flagelos del reino animal. En el eje est
el axonema formado por dos microtbulos centrales nicos, rodeados por nueve pares de
microtbulos regularmente distribuidos. Son los microtbulos A y B. Esta estructura se conoce
como axonema 9+2. Cada microtbulo A posee dos brazos en gancho formados por la protena
dineina, la cual puede hidrolizar las molculas de ATP, produciendo la energa necesaria para
impulsar el espermatozoide. Pero el flagelo de los espermatozoides humanos se diferencia de
otros en que el axonema est rodeado por nueve fibras densas externas, lo que lo convierte en
un modelo 9+9+2. Se considera que el axonema es el componente motor y que las fibras densas
externas son estructuras que dan firmeza al flagelo.
El flagelo se diferencia en tres regiones:
1.3
1.3.1.
La pieza intermedia mide de 5 a 7 m. El axonema est en esta regin rodeado por las
fibras densas. Se caracteriza por una vaina de mitocondrias orientadas circularmente
y dispuestas extremo con extremo para formar una espiral cerrada. Las mitocondrias
producen la energa necesaria para el movimiento en forma de ATP.
La pieza terminal est formada slo por el axonema, recubierto por la membrana
flagelar. Adems el axonema pierde su disposicin circular para hacerse desordenada.
Fisiologa
La eyaculacin
10
Primera fraccin del eyaculado, donde vierten las secreciones de la prstata que
contribuye al eyaculado con un porcentaje entre el 15 y el 30% del volumen final y las
procedentes del testculo y epiddimo que aportan entre un 5 y un 10%.
Citrato: es el anin principal y acta como quelante de cationes. Existe una estrecha
correlacin entre las concentraciones de zinc y citrato.
Zinc: es un catin especfico del plasma seminal dotado de poder bactericida. Su papel
sera estabilizar la condensacin de la cromatina. Es transportado por el citrato y las
protenas.
Fosfatasa cida: es una enzima activa en la desfosforilacin de los steres ortofosfricos. La isoenzima hallada en el esperma es especfica de la prstata.
L-carnitina
o
Es el marcador del cuerpo y la cola del epiddimo, pero no es secretada por las
clulas de la cabeza. Existe una pequea secrecin extraepididimaria del orden
del 15 al 20%.
Es una hidrolasa que est en dos formas en el esperma: una forma cida de
origen prosttico y una neutro epididimaria.
11
c)
En la cabeza y porcin proximal del cuerpo del epiddimo siguen siendo inmviles o
tienen movimientos vibratorios muy dbiles. Algunos tienen un batido flagelar
vigoroso, pero sin efecto progresivo.
En la parte media del cuerpo predomina este movimiento flagelar vigoroso, pero son
pocos los espermatozoides con movimiento progresivo.
12
1.3.3.
Los espermatozoides de todos los mamferos placentarios son incapaces de fecundar el ovocito
directamente desde el eyaculado, y deben experimentar un proceso en el que se producen
cambios moleculares denominados capacitacin. Los espermatozoides adquieren la capacidad
de fecundar el ovocito despus de haber permanecido durante un tiempo en el tracto genital
femenino.
Una definicin ms exacta seria aquella que describe la capacitacin como la serie de cambios
bioqumicos y fisiolgicos requeridos por el espermatozoide para liberar el contenido acrosomal.
Dichos cambios son tales como:
o
En condiciones in vivo los espermatozoides mviles se separan del resto del eyaculado por
migracin activa a travs del moco cervical. La capacitacin de los espermatozoides se puede
conseguir in vitro, si son sometidos durante el tiempo necesario, a unas condiciones de cultivo
que faciliten y aporten los cambios y las seales de transduccin de forma semejante a las
condiciones in vivo.
En la capacitacin, el espermatozoide adquiere tres caractersticas:
o
o
o
Reaccin acrosmica.
Unin a la zona pelucida del ovocito.
Hipermovilidad.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm#fecundacion
a) Reaccin acrosmica
El acrosoma es una organela tipo lisosoma localizada en la regin anterior de la cabeza del
espermatozoide por debajo de la membrana plasmtica, como un casquete sobre el ncleo. El
13
acrosoma contiene muchas enzimas que quedan al descubierto con la reaccin acrosmica, que
consiste en la liberacin del contenido acrosomal imediatamente antes de la fecundacin. Esta
reaccin es de exocitosis, la fusin de una vescula intracelular de almacenamiento con la
superficie interna de la membrana celular, seguida de la liberacin del contenido de la vescula.
Esta reaccin requiere la entrada de iones calcio, la salida de iones hidrogeno, un aumento del
pH y la fusin de la membrana plasmtica con la membrana del acrosoma, lo que permite el
contacto con las enzimas y favorece la salida de las retenidas por la membrana interna del
acrosoma. Para que un componente de la zona pelucida del ovocito provoque la reaccin
acrosmica es necesario el contacto del espermatozoide con dicha estructura ovocitaria. Se cree
que este componente es un receptor de glicoproteinas espermticas que tendra una doble
funcin: unirse al espermatozoide e inducir la reaccin acrosmica.
b) Unin espermatozoide-vulo
La capacidad de unin de la membrana plasmtica del espermatozoide con la del ovocito se
desarrolla durante o tras la reaccin acrosmica. El contacto inicial entre espermatozoide y
ovocito es un proceso mediado por receptores. La zona pelucida est compuesta por
glucoproteinas secretadas por el ovocito llamadas ZP1, ZP2 y ZP3 de las cuales la ms abundante
es ZP3 y el principal fijador para el espermatozoide. Para que el espermatozoide se una es
necesario que reconozca el componente carbohidrato de la molcula fijadora de las
glucoproteinas especificas para la especie. Despus de la unin, el componente peptdico de la
glucoproteina receptora desencadena la reaccin acrosmica. Al menos uno de los receptores
de la cabeza del espermatozoide es una tirosinquinasa activada por la unin a la glicoproteina
ZP3 y que inicia la reaccin acrosmica. Esta interaccin sigue los principios generales de la
unin y actividad hormona-receptor. En el caso del espermatozoide y el ovocito, en el
reconocimiento interviene una enzima de la superficie del espermatozoide que queda expuesta
en el proceso de capacitacin.
c)
Hiperactivacin espermtica
Espermatogenesis
14
Por ltimo las espermatogonias del tipo B siguen siendo clulas diploides, la
cromatina nuclear es granulosa y oscura y se dividen produciendo ms
espermatogonias B. Por maduracin producen espermatocitos primarios o
espermatocitos preleptotene (fase de preparacin de la meiosis).
b) Fase de maduracin
En la fase de maduracin se produce el fenmeno de la Meiosis. Es un proceso de divisin
celular en el cual una clula diploide (2n) experimenta dos divisiones nucleares y citoplasmticas
sucesivas. La primera conocida como Meiosis I y la segunda como Meiosis II, generando al final
cuatro clulas haploides. Previo a la meiosis ocurre un proceso preparatorio similar a la mitosis.
Tanto la Meiosis I como la II estn a su vez divididas en cuatro fases: Profase, Metafase, Anafase
y Telofase.
o
15
consecuencia, los cromosomas, que hasta el momento tenan una sla cromtida,
eran 2n de dotacin gentica, ahora tiene dos, lo que podramos llamar 2nx2.
c)
Fase de diferenciacin
Desarrollo del acrosoma. El aparato de Golgi, del cual deriva el acrosoma, forma
vesculas proacrosmicas que se unen y desplazan junto al ncleo hacia el extremo
apical de la cabeza.
El desarrollo del flagelo se inicia cuando los centriolos emigran hacia la periferia. Del
centriolo distal se origina el axonema. Conforme se alarga, los centriolos se invaginan
y las mitocondrias se disponen helicoidalmente alrededor del flagelo, formando la
pieza intermedia.
La barrera hematotesticular est formada por las clulas de Sertoli, que se extienden desde la
membrana basal hasta la luz de los tbulos seminferos. Estas clulas conectan entre ellas
mediante fuertes complejos de unin, formando un anillo sin solucin de continuidad dentro de
16
cada tbulo seminfero. Estos complejos de unin aparecen durante la pubertad, coincidiendo
con el comienzo de la espermatognesis. Durante la espermatognesis las clulas germinales se
van desplazando desde el compartimento basal hasta el adluminal. Esto es posible gracias al
carcter dinmico de la barrera, con aparicin y desaparicin de los complejos de unin. De esta
manera se crea un ambiente nico para el desarrollo de la meiosis y espermatognesis. Por otra
parte las clulas de Sertoli retienen parte del citoplasma de las espermtides que salen a la luz
tubular, formando los cuerpos residuales, que son fagocitados posteriormente.
En la cintica de la espermatognesis hay que destacar varios aspectos peculiares.
o
Hay 6 tipos de asociaciones diferentes, conocidas como Estados. Los estados se van
sucediendo. Una seccin del tbulo ir pasando por los diferentes estados, del I al VI.
Cada estado dura 16 das, por lo que la duracin total de la espermatognesis ser de
4,5 estados.
Adems en una seccin determinada no slo encontramos un estado, sino varios, que se
superponen. Esto se debe a que en el testculo se desarrollan en el tiempo, tres ciclos a la vez.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.
htm (Ilustraciones de la 11 a la 16)
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_05.jpg
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_04b.jpg
1.3.5.
La FSH acta sobre las clulas de Sertoli, unindose a receptores especficos y siguiendo la va
AC-AMPc. Las clulas de Sertoli producen: protenas transportadoras, proteasas y antiproteasas,
otras protenas y factores de crecimiento, entre ellos la inhibina. Las clulas de Sertoli inducen la
proliferacin y divisin celular en periodos prenatal y neonatal. Aumentan el metabolismo
lipdico y energtico, incorporando glucosa y produciendo lactato y piruvato para las clulas
germinales. Promueven la sntesis y secrecin de numerosos productos.
o
Activador de plasmingeno.
Catepsina L.
Metalproteasas.
Alfa2 macroglobulina.
Los factores de crecimiento actan sobre las clulas de Sertoli, clulas de Leydig,
clulas mioides peritubulares y clulas germinales. Intervienen en el crecimiento,
funcin y diferenciacin celulares. Entre ellos encontramos:
o
Las Citocinas.
La Activina.
Por otra parte, tanto Testosterona como inhibina actan como feedback negativo,
actuando sobre el hipotlamo y adenohipfisis y regulando de esta forma la
produccin de FSH y LH.
19
Ilustraciones recomendadas:
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_07.jpg
1.4
Patologa
1.4.1.
Esterilidad de la pareja
Segn el 5 manual de OMS, la esterilidad no debe tratarse como un problema individual, sino
que es un problema de pareja.
o
Se entiende por estril la pareja que tras 12 meses de relaciones sexuales sin mtodos
anticonceptivos, no queda gestante.
Infrtil es aquella pareja que presenta incapacidad para llevar a trmino las
gestaciones. Se embarazan, pero abortan.
20
Cuestionario
El cuestionario permite la investigacin de los factores de riesgo de la infertilidad. Tiene que ser tan
completo como sea posible, ya que, excepto causas especficas, no olvidar que una patologa
general puede repercutir en la espermatognesis. Hay que considerar:
o
los antecedentes de embarazo o hijos con la pareja actual o con otras parejas
2.
Examen clnico
Bioqumicos
o
Bioqumica seminal.
22
B) Vasectoma y vasovasostoma
La vasectoma est considerada como uno de los mtodos ms efectivos y populares de control
de la natalidad. Esta tcnica es de eleccin, sobre todo para parejas estables que ya tienen hijos
y no desean tener ms. La incorporacin de nuevas tcnicas quirrgicas que han sustituido la
mera ligadura y sutura del conducto deferente, ha aumentado la eficiencia de la vasectoma, que
se considera el mejor mtodo anticonceptivo. La evidencia cientfica actual considera el anlisis
de semen como la mejor metodologa de valoracin de la efectividad de la tcnica quirrgica, ya
que hay que considerar que existe un riesgo bajo, pero no nulo, de complicaciones o de que se
recanalice el conducto seccionado.
La vasectoma es una operacin simple que tiene una duracin media de 30 minutos y que se
realiza en el mbito ambulatorio, con la utilizacin de anestesia local. Tiene como fundamento la
oclusin quirrgica de los conductos deferentes. Inmediatamente despus de la vasectoma,
todas las eyaculaciones pueden contener en teora espermatozoides potencialmente frtiles, por
lo que se debe aconsejar continuar con otros mtodos anticonceptivos hasta que se demuestre
la eficacia de la intervencin. La experiencia del cirujano, junto con el nmero de
vasectomas/ao que realice, ha demostrado ser el factor ms importante en el xito de la
operacin y la posible aparicin de complicaciones.
La recanalizacin espontnea puede ser precoz (antes de los 4 meses) o tarda. La recanalizacin
precoz presenta una incidencia entre 0,36-0,75% segn los diferentes estudios y una posterior
paternidad de 0-0,08% y la tarda presenta una incidencia aun menor del 0,1%. Todo paciente
que vaya a ser sometido a una vasectoma debe ser informado por el clnico de estos datos.
Debe existir un equilibrio entre la realizacin del anlisis de los controles que demuestren la
eficacia de la tcnica y el tiempo de espera para realizar el primer control, ya que si ste se
realiza demasiado pronto, se puede tener un elevado nmero de falsos positivos (varones con la
vasectoma bien realizada que presentan espermatozoides mviles en el eyaculado). Los
espermatozoides residuales pierden capacidad de fecundacin entre los 3-8 das despus de la
intervencin y se encuentran inmviles transcurridos 15 das. El 97% de los pacientes presentan
una azooospermia a los 4 meses de la intervencin, el 3% restante puede presentar
espermatozoides residuales hasta 12 meses despus, asociado probablemente a un mayor
reservorio del tracto urogenital; aunque numerosos estudios aseguran que en estos pacientes
esto no implica un mayor riesgo de gestacin que la azoospermia. Se estima que existe un 16%
de pacientes operados que no realizan ningn tipo de control tras la vasectoma.
La vasovasostoma es una intervencin que recanaliza el conducto deferente y que requiere
microciruga con anestesia general. La incidencia de las vasovasostomas se ha descrito entre el
1-30/00 de las vasectomas y el aumento de su frecuencia en el nuevo contexto social, hace
aconsejable su incorporacin al presente documento. La operacin puede exceder de las dos
horas y si se realiza una epiddimo-vasostoma 4 o 5 horas. Respecto a la tcnica quirrgica, se
recomienda el empleo de microciruga. El conducto deferente es seccionado a ambos lados de la
sutura y la aparicin intraoperatoria de espermatozoides al final del deferente seccionado es un
ndice de buen pronstico. Posteriormente se procede a la anastomosis del vaso. Cuando existe
una obstruccin patolgica del epiddimo es necesario realizar una epiddimo-vasostoma, que
23
comporta una mayor complejidad y unos resultados ms pobres. La experiencia del cirujano y la
tcnica de microciruga empleada es un factor importante.
Se han descrito una tasa de recuperacin testicular y posterior paternidad entre el 30-65% de los
intervenidos, en funcin de los aos transcurridos desde la vasectoma. La realizacin de una
epiddimo-vasostoma est indicada cuando han transcurrido ms de 10 aos de la vasectoma.
Una alternativa actual que se debe plantear despus del fracaso de la vasovasostoma, es la
utilizacin de tcnicas de reproduccin asistida (ICSI) a partir de espermatozoides obtenidos por
aspiracin de espiddimo o biopsia testicular.
24
Preanaltica
Captulo 2
Preanaltica
2.1
La primera parte del eyaculado aporta las secreciones del testculo-epididimo (en esta
fraccin estn los espermatozoides) y las secreciones de la prstata.
Por tanto, si se derrama una fraccin de la primera parte, al faltar parte de los espermatozoides
obtendremos una concentracin irreal, ms baja; y si se derrama una fraccin de la segunda, la
fraccin que aporta ms volumen, lo que ocurrir es que obtendremos un volumen ms bajo y
una concentracin espermtica ms alta. En consecuencia, una muestra incompleta debe ser
desechada.
B) Proporcin de las diferentes secreciones
Un aumento de secrecin prosttica por infiltracin producir aumento de volumen, diluyendo
los espermatozoides y disminuyendo la concentracin.
25
C) Abstinencia sexual
En un estudio de 11 individuos que recogieron 4 muestras en 8 das (De Jonge et al., 2004;
Carlsen, Jorgen, Andersson & Niels, 2004), se observ que la abstinencia entre 1 y 8 das no
influye en la movilidad, en la morfologa, en la vitalidad ni en el pH, pero s en las
determinaciones de volumen y concentracin, que van aumentando a lo largo de los ocho das.
Por otra parte, parece que el periodo de abstinencia de la penltima eyaculacin podra
condicionar los valores de la ltima, siempre que una eyaculacin no consiga vaciar los depsitos
del epiddimo. Sin embargo, cuantificar en qu medida influye es difcil, por lo que la OMS no lo
incluye dentro de las normas a seguir en su ltimo manual.
D) Variabilidad biolgica
En otro estudio en el que participan 52 individuos a lo largo de 540 das, se puede apreciar que
hay unos considerables saltos en la concentracin espermtica, as como en el nmero total de
espermatozoides por eyaculacin, en algunos individuos se observan valores por debajo de la
normalidad.
En el trabajo de Alvarez et al., (2003), se estudian los coeficientes de variacin intraindividuales y
entre individuos de los diferentes valores seminales. Se pudo ver que el coeficiente de variacin
intraindividual oscila entre el 15-20% para la mayora de valores, y un 26.8% para la
concentracin espermtica.
Carlsen et al. (2004), tambin estudiaron el coeficiente de variacin intraindividual segn el
nmero de muestras estudiadas. Como era de esperar, la variacin disminuye drsticamente
tras 10 determinaciones en la contraccin, en cuanto a la movilidad y morfologa el coeficiente
se reduce a la tercera y cuarta muestra analizada.
Se puede concluir que es imposible caracterizar a un individuo con un solo anlisis de semen y
que es necesario realizar 2-3 anlisis para estudiar el estado basal de un individuo.
E) Frmacos
Podemos encontrar gran cantidad de principios activos que van a afectar la calidad seminal,
actuando a diferentes niveles.
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
Antipsicticos (fenotiazidas)
Antidepresivos
Antihipertensivos (alfametildopa)
Antihistamnicos
Andrgenos, esteroides anabolizantes
Antiulcerosos (ranitidina, cimetidina)
Espironolactona
Nitrofurantona
Colchicina
Quimioterapia
26
Preanaltica
Sulpiride
En el caso de que el tratamiento se prolongue en el tiempo y/o que los efectos sean
irreversibles, como en la quimioterapia, es recomendable que se conserven los espermatozoides
en un banco de semen.
F) Txicos
o
Cocana: estimula el deseo y la ereccin. Hay estudios que apoyan que afecta a la
espermatognesis.
G) Factores ambientales
ltimamente se ha descubierto que hay multitud de factores ambientales que actan como
disruptores endocrinos. Son sustancias que tienen accin estrognica o antiestrognica. Actan
en las primeras fases del desarrollo fetal, en los periodos pre o perinatal, pero sus efectos son de
aparicin tarda, pudiendo aparecer incluso en generaciones posteriores. Algunos autores
opinan que los disruptores endocrinos son los causantes del llamado Sndrome de disgenesisa
testicular, que cursa con: aumento de criptorquidia e hipospadias, aumento de cncer de
testculo y descenso en la calidad seminal.
La lista de sustancias descritas es muy amplia, pero vamos a destacar algunas para que veamos
en qu medida convivimos con ellas peligrosamente de forma ms habitual de lo que
imaginamos:
Bisfenoles resinas epoxi ............. estn en pegamentos escolares
Policarbonato............................. forma parte de los biberones
Ftalatos ...................................... en las tetinas de los biberones
Benzofenonas ............................ en las cremas solares (en los filtros UV).
H) Duracin de la espermatognesis
Otro de los factores que se ha de tener en cuenta cuando se estudie la calidad seminal es que
cualquier intervencin sobre el testculo necesitar al menos 75 das (2 meses y medio) para
ponerse en evidencia. Esto es as porque la espermatognesis del hombre dura eso, 75 das. Por
27
2.2
Ejercicio fsico
Fiebre
Estrs
Exposicin a altas temperaturas.
A) Instrucciones
Deben ser claras y si es posible por escrito. En ellas debemos detallarles:
o
o
o
o
o
o
o
o
Lugar de recogida.
Forma de recoger la muestra.
Contenedores de recogida.
Medidas higinicas.
Abstinencia.
Tiempo recogida-entrega laboratorio.
Normas de transporte al laboratorio, si se recoge en casa.
Medicacin.
B) Forma de recogida
En cuanto a la forma de recoger la muestra el manual de la OMS es muy claro:
o
Adems, hay que dar una detallada informacin al paciente acerca de: la forma de
recogida, cierre y transporte del contenedor.
28
Preanaltica
C) Abstinencia sexual
La OMS recomienda una abstinencia entre dos y siete das. Adems aconseja que en caso de
repeticin se mantengan los tiempos de abstinencia para hacerlo de esta forma en las mismas
condiciones y evitar la variabilidad.
Recordemos adems que se recomiendan entre 2 y 3 anlisis para fijar el estado basal de un
individuo, si bien algunos autores son de la opinin que si el primer anlisis es normal no es
necesario volver a repetir.
D) Contenedores de recogida
Los contenedores de recogida que utilicemos deben ser de cristal o plstico. Adems deben
estar testados para comprobar que el material no es txico. Antes de la recogida de la muestra
hay que mantenerlos atemperados entre 20-37C.
Si se quiere introducir en nuestro protocolo un nuevo contenedor, se ha de someter a un ensayo
de toxicidad:
o
E) Recogida de datos
Cuando la muestra es entregada debe ser rotulada: con nombre y apellidos, y con el cdigo de
laboratorio. Inmediatamente despus debe ser guardada en estufa a 37C.
Adems se le han de preguntar al paciente los siguientes datos:
o
2.3
Recogidas especiales
A) Anlisis microbiolgico
En el caso de que la muestra vaya a usarse para anlisis microbiolgico tenemos que tener en
cuenta que:
o
No se puede exceder ms de tres horas desde la recogida hasta el inicio del cultivo.
Se debe seguir unas normas higinicas para este tipo de recogidas: 1 orinar, con
objeto que la orina limpie la uretra de grmenes; 2 lavar genitales y manos con jabn
y agua, enjuagar detalladamente con agua y secar; y 3 recoger la muestra.
B) Bloqueos
A veces ocurren los llamados bloqueos, o la imposibilidad de recoger la muestra.
o
Cuando se trate de una recogida de muestra para una prueba diagnstica no tendr
mayor importancia. Trataremos de tranquilizar a nuestro paciente, recomendndole
dar una vuelta antes de intentarlo de nuevo. Si el bloqueo persiste se recomendar la
recogida de la muestra en casa.
Preanaltica
C) Eyaculacin retrgrada
Otro caso de recogida especial es cuando ocurre una eyaculacin retrgrada, donde la
eyaculacin de la muestra en lugar de seguir la va habitual a travs de la uretra asciende hasta
la vejiga atravesando el orificio uretrovesical.
Hay que sospecharlo en pacientes con un volumen de muestra bajo, menos de 1 ml, incluso con
ausencia de eyaculado, lo que se conoce como aspermia. Es frecuente en diabticos, en lesiones
medulares y enfermedades neurolgicas.
En estos casos podemos recuperar los espermatozoides de la orina y utilizarlos para alguna
tcnica de reproduccin asistida, bien inseminacin o fecundacin in vitro. Para ello es necesario
alcalinizar primero la orina, cuyo pH es cido, con objeto de conseguir que los espermatozoides
sean viables. El protocolo es el siguiente:
o
Da de la recogida:
o
Se orina cada 15 minutos hasta que la osmolaridad tenga un valor entre 350-400
miliosmoles/kg, y pH = 6,5-8.
Se tiene orgasmo.
D) Anlisis postvasectmicos
o
Se deber repetir adems un segundo anlisis entre dos y cuatro semanas del
primero. Se recomienda que no se dejen los mtodos anticonceptivos hasta que estos
dos anlisis ratifiquen que las muestras son azoosprmicas.
31
2.4
Transporte
El manual de la OMS de la 5 edicin recomienda que la recogida de la muestra se haga cerca del
laboratorio, para controlar fluctuaciones de temperatura y tiempo al comienzo del anlisis. Pero
si no se puede hacer de esta forma hay que ofrecer la posibilidad de recoger la muestra en casa,
siempre que se cumpla que:
2.5
Protegerla de la luz.
Recepcin
32
Preanaltica
2.6
Conservacin: Criopreservacin
33
34
Preanaltica
Sistemas de llenado y cerrado de pajuelas: existen sistemas automticos para este fin
aunque pueden utilizarse boquillas de llenado y un termosellador para cerrar las
pajuelas hermticamente (SYMS, Cryo Bio System, Pars, Francia).
C) Mtodos de congelacin
Dependiendo de la velocidad de congelacin pueden diferenciarse varios mtodos de
congelacin:
o Congelacin lenta: la velocidad oscila entre 0,5 C y 10C/min.
o
Con el objetivo de cumplir la normativa que establece el RD 1301/2006 (trazabilidad en todos los
procesos que conlleva la congelacin y almacenamiento de semen), es fundamental el control
exhaustivo de la velocidad y la temperatura de la muestra en cada momento, por lo que
actualmente se recomienda la utilizacin de congeladores programables ms que otros mtodos
clsicos como la congelacin en vapores de nitrgeno lquido o la congelacin en pldoras en
molde de hielo seco.
La vitrificacin de espermatozoides tiene la limitacin del pequeo volumen empleado, por lo
que slo permite la criopreservacin de un nmero reducido de espermatozoides (muestras
para microinyeccin intracitoplasmtica, ICSI, exclusivamente).
A continuacin, se exponen dos ejemplos de protocolos de congelacin para espermatozoides,
uno con congelador programable y otro manual, dado que existen muchas alternativas a estos
procedimientos.
Protocolo de congelacin con congelador programable
1. Mientras la muestra completa la licuefaccin (no ms de 30 minutos), atemperar el
medio de congelacin a T ambiente.
2. Separar una alcuota de muestra para el anlisis.
3. Medir el volumen de la muestra de semen que se va a congelar y transferir a un tubo de
poliestireno; este proceso ser el mismo con muestras de espermatozoides
previamente seleccionados, procedentes de biopsia testicular o aspirado epididimario.
4. Calcular el nmero de pajuelas que sern necesarias, teniendo en cuenta la dilucin con
el medio recomendada por el fabricante (ej. 1+1 o 3+1).
5. Etiquetar las pajuelas con el cdigo de identificacin correspondiente, elegir el color
adecuado (visotubo, manchn, bandera, etc.) de las unidades de almacenamiento y
etiquetarlas. Las pajuelas deben identificarse individualmente; de esta manera, si se
retiran dos dosis del banco y se descongelan al mismo tiempo, no hay posibilidad de
error. El clsico mtodo de cdigo de barras que utiliza lneas con un rotulador de punta
fina no se recomienda.
6. Agregar el medio de congelacin lentamente, gota a gota, con movimientos suaves pero
continuos del tubo para asegurar el mezclado completo (1 gota cada 5 segundos).
7. Llenar las pajuelas conectndolas al dispositivo de succin (por ejemplo a una jeringa de
1 ml o una bomba del vaco), dejando 1 cm de aire en el extremo final de la pajuela.
Usar una boquilla de llenado para evitar que el exterior de la pajuela entre en el
contacto con el semen o las paredes del tubo.
8. Sellar los extremos de cada pajuela mediante un termosellador (SYMS,
Cryo Bio Sistema, Pars, Francia).
9. Desinfectar el exterior de cada pajuela mediante alcohol 70% (v/v) u otra solucin
descontaminante, enjuagar seguidamente con agua estril y secar.
10. Transferir las pajuelas al sistema de bandejas del congelador programable y comenzar
el ciclo de congelacin. Un ejemplo de curva genrica de congelacin sera el siguiente:
36
Preanaltica
37
Entrega de instrucciones y
contenedor
1 semana antes
Transporte
Recepcin
Conservacin
hasta su
procesamiento
Fertilidad y capacitacin
1) SEMEN EN CONTENEDOR
CUANDO
Si espermiograma previo
(fertilidad),
3 meses despus.
Si vasovasostoma,
6 meses despus.
Abstinencia
2-7 das.
MTODO
Masturbacin.
Si no, con preservativo
sin espermicida.
CONTENEDOR
Plstico o vidrio, no
txico, 20-37C.
LUGAR
Lo ms prximo al
laboratorio.
A 1 hora mximo.
IDENTIFICAR
Nombre,apellidos
N Laboratorio.
PASAR A CONSERVACIN.
2) CUESTIONARIO
Inmediato,
mximo 1h
22-37C
Protegido de
la luz.
CONFIRMAR
Totalidad de la muestra.
Masturbacin (o preservativo).
Slo una eyaculacin.
Abstinencia 2-7 das.
Si espermiograma previo: 3
meses de diferencia.
Si vasovasostoma: anotar
fecha de operacin, y muestra
6 meses despus.
30 minutos,
mximo 1h.
37C
Rotacin.
ANOTAR
Medicacin.
Hora de recogida de la muestra.
Hora de entrega al laboratorio.
38
Preanaltica
Entrega de
Instrucciones y
contenedor
1 semana antes
Transporte
Conservacin
hasta su
procesamiento
Cultivo
1) SEMEN EN CONTENEDOR
MTODO
1) Lavar y aclarar
genitales y manos.
2) Orinar.
3) Lavar y aclarar
genitales y manos.
4) Masturbacin.
CONTENEDOR
Plstico o vidrio,
estril.
Recepcin
IDENTIFICAR
Nombre,apellidos
N Laboratorio.
PASAR A CONSERVACIN.
Inmediato,
mximo 1h
2-8C.
LUGAR
Lo ms prximo al
laboratorio.
A 1 hora mximo.
2) CUESTIONARIO
Mximo 3 h
2-8C.
CONFIRMAR
Medidas higinicas, orinado y
lavado previos.
Por masturbacin.
ANOTAR
Hora de recogida de la muestra.
Hora de entrega al laboratorio.
Bloqueos
PARA DIAGNSTICO
1) Despejarse
2) Si persiste, recoger en casa.
El que corresponda.
PARA FIV
1) Despejarse
2) Levitra, Cialis o Viagra
39
Entrega de
Instrucciones
Y contenedor
1 semana antes
PREPARATIVOS
Abstinencia
2-7 das.
Noche previa:
Ingerir 2 g NaHCO3
MTODO
Recoger orina: 0h. En el
laboratorio determinan
Osmolaridad y pH.
Ingerir 4 g NaHCO3
Recoger orina:
cada 15 hasta que el
laboratorio diga si la
Osmolaridad y pH son
adecuados.
Orgasmo.
Recoger orina.
Transporte
Recepcin
Conservacin
hasta su
procesamiento
Eyaculacin retrgrada
1) LTIMA ORINA EN
CONTENEDOR
IDENTIFICAR
Nombre,apellidos
N Laboratorio.
PASAR A
CONSERVACIN
2) CUESTIONARIO
Inmediato.
22C
CONFIRMAR
Abstinencia
2-7 das.
Noche previa
2 g NaHCO3
Recogida de orina
tras alcalinizacin y
orgasmo.
CONTENEDOR DE LTIMA
ORINA
Frasco con 10 ml de
medio de cultivo.
Procesamiento
inmediato
ANOTAR
Medicacin.
Hora de recogida de
la muestra.
Hora de entrega al
laboratorio.
LUGAR
Prximo al laboratorio.
40
Preanaltica
Entrega de
Instrucciones
Y contenedor
1 semana antes
Transporte
Recepcin
Conservacin
hasta su
procesamiento
Postvasectoma
1) SEMEN EN CONTENEDOR
IDENTIFICAR
Nombre,apellidos
N Laboratorio.
CUANDO
Control 1)
4 meses despus de
vasectoma.
Control siguiente:
4 semanas despus
del previo.
Abstinencia
2-7 das.
MTODO
Masturbacin.
CONTENEDOR
Plstico o vidrio.
LUGAR
Lo ms prximo al
laboratorio.
A 1 hora mximo.
PASAR A CONSERVACIN
2) CUESTIONARIO
Inmediato,
mximo 1h
22-37C
Protegido de la
luz.
CONFIRMAR
Totalidad de la muestra.
Por masturbacin.
Slo una eyaculacin.
Abstinencia 2-7 das.
Si Control 1)
4 meses dp de vasectoma.
Si Control sig)
4 semanas dp del previo.
30 minutos,
mximo 4h
22-37C
Rotacin.
ANOTAR
Fecha de vasectoma y del
control previo.
Medicacin.
Hora de recogida de la
muestra.
Hora de entrega al
laboratorio.
41
Entrega de
Instrucciones
Y contenedor
1 semana antes
Transporte
Recepcin
Conservacin
Hasta su procesamiento
Criopreservacin
1) SEMEN EN
CONTENEDOR
PREPARATIVOS
Medicacin
(3 meses desde
quimioterapia)
Abstinencia
2-7 das
Leer y firmar
Consentimiento
informado.
MTODO
Masturbacin.
CONTENEDOR
Plstico o vidrio.
LUGAR
Lo ms prximo
al laboratorio.
A 1 hora mximo.
IDENTIFICAR
Nombre,apellidos
N Laboratorio.
PASAR A
CONSERVACIN
2) CUESTIONARIO
Inmediato
22-37C
CONFIRMAR
Totalidad de la
muestra.
Por masturbacin.
Slo una eyaculacin.
Abstinencia
2-7 das.
Si quimioterapia, 3
meses despus.
ANOTAR
Medicacin.
Hora de recogida de
la muestra.
Hora de entrega al
laboratorio.
42
Captulo 3
A) Licuefaccin
La licuefaccin se realiza mediante una simple observacin visual. Una muestra normal es una
muestra licuada, homognea, sin grumos ni cogulos.
Sin en embargo cuando se eyacula el semen se trasforma en una masa semislida coagulada, es
a los pocos minutos cuando el semen comienza a licuarse y homogeneizarse, a veces se
encuentran hilos de moco y cuerpos gelatinosos. No tienen ninguna importancia clnica, pero
dificultan el anlisis ya que son artefactos que pueden obturarnos una pipeta o impedir una
buena colocacin de un cubreobjetos sobre el porta. Hay que intentar separarlos de la muestra a
la hora de recoger alcuotas para las diferentes determinaciones.
La licuefaccin ocurre normalmente a temperatura ambiente en los primeros 15 minutos tras
recoger la muestra. Se considera anormal cuando no ocurre en 60 minutos. Habr que
researlos en el informe.
Si tenemos dudas con una simple observacin visual siempre nos queda el recurso de observar la
muestra al microscopio, donde tendremos la tpica imagen de una muestra no licuada, con
manchas que recuerdan a acmulos de grasa.
43
Cuando la muestra no lica en 60 minutos hay que recurrir a algn mtodo que nos permita
licuarla y homogenizarla porque slo de esta forma obtendremos resultados fiables.
o
El primer mtodo consiste en aadir una solucin de bromelina, que es una enzima
proteoltica que producira la licuefaccin. Esto no se puede hacer en muestras
destinadas posteriormente a reproduccin asistida, ya que estn destinadas a
ponerse en contacto con gametos femeninos. Por otra parte, al aadir bromelina se
puede afectar la movilidad, las determinaciones de bioqumica y de morfologa. Slo
debemos usarla para calcular la concentracin espermtica.
Otro sistema sera diluir la muestra con igual volumen del tampn fosfato PBS.
El tercer sistema sera el ms sencillo. Consiste en pasar la muestra por una jeringa
dotada de aguja roma con un calibre de 18-19. Hay que actuar con cuidado para no
formar burbujas que afectaran a nuestros resultados.
B) Viscosidad
Podemos utilizar dos mtodos:
o
A veces puede tener un aspecto traslcido; ello es debido a que posiblemente tenga
una baja concentracin de espermatozoides.
44
D) Volumen
Para la medida del volumen el manual de la OMS nos describe dos mtodos.
o
Lo que no debemos hacer nunca es medir el volumen mediante transferencia a pipetas, jeringas
o probetas. Estos mtodos de transferencia darn lugar a errores superiores a los dos mtodos
anteriormente descritos.
El manual establece el lmite inferior de referencia en 1,5 ml.
o
45
E) pH
El pH refleja el balance entre las diferentes secreciones, principalmente entre el pH alcalino de
vesculas seminales y el cido de la prstata.
El lmite inferior de referencia establecido es de 7,2.
Un pH por debajo de 7, unido a oligo o azoospermia y a un volumen bajo, nos va a sugerir la
agenesia u obstruccin de vesculas seminales y/o conductos deferentes, as como indicar
infeccin. Esto impide la salida total o parcial de secreciones procedentes del testculo
(espermatozoides) y de vesculas seminales, con un pH bsico.
Respecto a la realizacin tcnica debemos usar tiras de papel pH graduacin 6-10. Chequear el
color antes de 30 segundos. Situamos la muestra sobre el papel y antes de transcurrido ese
tiempo debemos hacer la lectura. Chequear tiras reactivas con soluciones patrn de pH para
asegurar la buena calidad de nuestro resultado.
3.2
PROFUNDIDAD DE CAMPO
P= V/A (mm)
0,020
46
orbital dentro de la estufa. Otro mtodo alternativo que nos indica el manual de la OMS es por
aspiracin 10 veces de la muestra con pipeta de plstico de 1,5 mm de dimetro.
La falta de homogenizacin de la muestra provocar que en una muestra:
o
A) Observacin a 100X
Colocamos por ejemplo, 10 l de la muestra de semen en el porta y sobre l un cubre 22x22. Lo
ponemos en el microscopio atemperado a 37C, y observamos con el objetivo de 10x.
Agregaciones
Las agregaciones son la adherencia de espermatozoides (inmviles o mviles) a clulas no
espermticas o detritos. No son especficas, no tienen ninguna significacin clnica.
Aglutinaciones
Las aglutinaciones son espermatozoides mviles adheridos a otros espermatozoides mviles. S
son especficas, por lo que pueden tener significacin clnica. No son evidencia suficiente para
deducir la presencia de anticuerpos antiespermatozoides, pero s nos sugieren investigar su
presencia.
Existen diferentes tipos, en cuanto al lugar de unin y al nmero de espermatozoides unidos.
Ilustracin 1.
47
PARTES
GRADOS
1.AISLADOS
<10 spz
2.MODERADO
10-50 spz
3.ALTA
>50 spz
4.MUY ALTA
Todos aglutinados
CabezaCabeza
FlageloFlagelo
PuntaFlagelo
CabezaCabeza +
FlageloFlagelo
CabezaFlagelo
48
49
Se debe intentar hacer el contaje con un solo golpe visual, lo que se conseguir tras un buen
adiestramiento, aunque parezca raro, esto es ideal ya que se consigue menor error que con el
sistema de ir contando uno a uno.
Se debe contar siempre a una distancia de los bordes mayor de 5mm con objeto de
prevenir artefactos. A partir de esa distancia y conforme nos acerquemos al borde, el
movimiento ir disminuyendo hasta encontrar slo espermatozoides inmviles.
(Ilustracin 3B).
Se debe hacer un doble contaje, para ello habr que preparar dos portaobjetos.
50
Hay que contar al menos 200 espermatozoides por porta. Si no se consigue contando
5 campos, se deber seguir hasta alcanzar ese nmero de 200.
Ilustracin 4. Grfica del intervalo de confianza del 95% para dos porcentajes
MEDIA (%)
0
1
2
3-4
5-7
8-11
12-16
17-23
24-34
35-65
DIFERENCIA
ACEPTABLE
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
MEDIA (%)
66-76
77-83
84-88
89-92
93-95
96-97
98
99
100
DIFERENCIA
ACEPTABLE
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Tabla 3. Diferencias aceptables entre dos porcentajes, calculados a partir de dos recuentos de
200 spz (400 spz)
Posteriormente hay que evaluar los resultados utilizando la grfica (ilustracin 4) y la tabla 3 del
intervalo de confianza del 95% para diferencias entre los dos porcentajes. Esto equivale al
mximo error esperado entre dos contajes en el 95% de los casos cuando el nico error es el
atribuible al contaje. Si el error es mayor habr que hacer dos nuevas preparaciones y empezar
de nuevo.
51
1 PREPARACIN
2 PREPARACIN
MEDIA
DIFERENCIA
VALORACION
%PR
28
35
32
7
%NP
22
29
25
7
%IM
50
36
43
14
NO VALIDO
400x
>101
16-100
<16
DILUCIN:
1/20
1/5
1/2
l semen
50
50
50
l diluyente
950
200
50
52
Captulo 4
Recuento
Bicarbonato sdico
50g
Formol (35%)
10 ml
Agua
csp 1l.
53
La dilucin se hace tomando como base el diluyente Weigman. El diluyente al estar preparado
con formol inmovilizar los espermatozoides y nos permitir contarlos ms fcilmente, cosa que
no ocurre con otro tipo de mtodos que cuentan espermatozoides vivos. Se aade
posteriormente el semen usando la pipeta de desplazamiento directo. La dilucin debe estar
perfectamente homogenizada, usando si es posible un agitador tipo vortex.
Todo hay que hacerlo por duplicado.
Cmara de contaje
La OMS recomienda cmaras que tengan al menos 100 micras de profundidad y que permitan el
contaje con muestras fijadas, sin movimiento. Sin embargo no recomienda, lo cual no quiere
decir que prohba:
o
Cmaras que utilicen muestras no fijadas, o sea que cuente espermatozoides mviles.
Segn todo esto, la mejor opcin para la OMS es la Neubauer improved. Esta cmara cumple
todos los requisitos anteriores, y es adems una cmara barata, importantsimo para la OMS ya
que uno de sus propsitos es la estandarizacin de las tcnicas que propone.
La cmara esta subdividida en dos subcmaras, lo que nos va a permitir el doble de contaje de
forma ms rpida (ilustracin 5A).
Cada una de las dos subcmaras tiene 9 rejillas, cada una de las rejillas tiene 100 nl de volumen.
Por tanto, el total de la cmara es de 900 nl (ilustraciones 5B). Cada rejilla est formada por
cuadros que llamaremos grandes, agrupados en filas. A su vez, cada cuadro grande est dividido
por una triple lnea en cuadros que llamaremos pequeos. Centrndonos en la 5, sta tiene
25 cuadros grandes y cada uno de ellos est dividido en 16 cuadros pequeos (ilustraciones 5C,
5D).
Clculo del volumen total de una rejilla:
2
N DE REJILLA
N CUADROS
GRANDES
4,6
2,8
1,3,7,9
5
20
20
16
25
VOLUMEN/CUADRO
100 nl/ n cuadros g
nl
5
5
6,25
4
N
FILAS
5
4
4
5
VOLUMEN/FILA
100 nl/ n filas
nl
20
25
25
20
Se ha de llenar la cmara de Neubauer improved con cada una de las dos diluciones
que hemos preparado.
Respecto a la triple lnea que separa los cuadrados grandes, se ha de tener en cuenta
lo siguiente (Ilustracin 6B):
o
Contar todos los espermatozoides que estn dentro del cuadro central.
55
56
Ilustracin 7. Grfica del intervalo de confianza del 95% para dos recuentos
SUMA
144-156
157-169
170-182
1083-196
197-211
212-226
227-242
243-258
259-274
275-292
293-309
310-328
DIFERENCIA
ACEPTABLE
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
SUMA
329-346
347-366
367-385
386-406
407-426
427-448
449-470
471-492
493-515
516-538
539-562
563-587
DIFERENCIA
ACEPTABLE
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
Tabla 6. Diferencias aceptables entre dos porcentajes, calculados a partir de dos recuentos de
200 spz (400 spz)
Si hemos contado 400 espermatozoides totales, el lmite mximo de diferencia entre los dos
contajes es de 39, si la diferencia superara el lmite permitido habra que empezar desde el
principio, preparando dos nuevas diluciones y realizando de nuevo el doble contaje.
Clculo final
o
Para diluciones 1/5, 1/20, 1/50, en las que se han contado las filas de los cuadros 5, 4,
6, de las dos subcmaras, se ha de tener en cuenta el volumen correspondiente de
cada fila (tabla 5):
57
58
MUESTRA
MTODO 400X
Neubauer improved
50 l semen + 950 l dil. Weigman
1
Dil.
RECUENTO
1
1 Subcmara
2 Subcmara
Suma
Diferencia
Valoracin
2
1 Subcmara
2 Subcmara
Suma
Diferencia
Valoracin
Clculo
4.1.1.
2
Dil.
3
Dilucin
4
Dilucin
170 spz/campo
205
253
458
48
No vlido
215
232
447
17
Vlido
C = (447/5)x(1/20)x20
= 89 millones spz / ml
Criptozoospermias y azoospermias
Una muestra con criptozoospermia suele ser vlida para realizar la tcnica de
reproduccin asistida ICSI.
Sin embargo, la nica posibilidad de poder realizar esa tcnica en un paciente con
azoospermia es recurrir a una biopsia de testculo. Tras tratamiento de la pieza
biopsiada se estudia la existencia o no de espermatozoides, que tras ser aislados nos
servirn para nuestra tcnica de ICSI.
En teora slo seran candidatas a biopsia de testculo y posterior ICSI las azoospermias
obstructivas. Sin embargo la popularizacin de la tcnica de biopsia de testculo ha demostrado
que en la mayora de azoospermias secretoras existen algunos focos de tbulos seminferos con
espermatognesis funcional y por tanto estos pacientes son tratados como si fuera una
azoospermia obstructiva.
59
En las azoospermias con volumen seminal muy bajo hay que descartar la existencia de una
eyaculacin retrgrada. En este caso los espermatozoides eyaculados en lugar de seguir la va
habitual son vertidos a la vejiga a travs del orificio uretrovesical. Es importante conocerlo
porque la recuperacin de esos espermatozoides posibilita la realizacin de tcnicas de
reproduccin asistida.
La forma de tratar la muestra va a depender de:
o
Si tienen o no movilidad.
Decantar el sobrenadante.
Resuspender el sedimento en 50 l.
Si tienen o no movilidad
A veces es importante saber si adems los espermatozoides son mviles. Por ejemplo si los
necesitamos para hacer una ICSI, en la cual slo trabajamos con espermatozoides mviles. Al
igual que en el caso anterior:
o
Hay que observar a 200 aumentos todo el porta (unos 1200 campos).
60
( )
Si se observan 0 espermatozoides:
El intervalo de confianza del 95% del valor 0 es 0 y 3,7, quiere esto decir que el
95% de las veces que contemos 0 el valor estar comprendido entre 0 y 3,7. El
error asociado a un contaje de 3,7 es el 52%. La concentracin de
espermatozoides cuando se cuentan 3,7 espermatozoides por el mtodo ya
descrito es 4100 spz/ ml.
La cmara Leja es desechable, est dividida en dos subcmaras, cada una de las cuales tiene
100 micras de profundidad y un volumen de 25000 nl.
Procedimiento
o
Llenar cada cmara del portaobjetos Leja con 25 l de las diluciones replicadas, una
rplica por cada cmara.
Clculo:
( )
empleado, que es de 1000 spz/ ml. Se informa por tanto que la concentracin es
menor de 1000 spz/ ml.
o
Si se observan 0 espermatozoides:
4.2
Morfologa
Elegir dos portaobjetos y limpiarlos vigorosamente con papel por ambos lados.
Identificarlos.
Hacer la extensin: con otro porta hacer un ngulo de unos 45 y tocando la gota
arrastrar en el sentido que marcan las flechas de la imagen. Hacerlo a una velocidad
tal que se tarde aproximadamente un segundo en hacer el arrastre de la gota sobre el
porta. Ilustracin 8A.
63
Despus del tratamiento, hacer una extensin usando una pipeta pasteur, tal y
como se aprecia en la ilustracin 8B.
Papanicolaou.
Shorr.
Dejar secar.
Interpretacin de la morfologa
Un espermatozoide debe cumplir los siguientes criterios estrictos (Kruger) en cada una de sus
partes para considerarse normal. Ilustracin 9.
o
Cabeza:
o
o
o
o
o
Pieza intermedia:
o
o
o
o
Flagelo:
o
o
Forma oval.
Longitud 3,7-4,7 micras.
Anchura 2,5-3,2 micras.
Relacin longitud/anchura 1,3-1,8.
Acrosmica 40-70% de la cabeza.
Restos citoplasmticos:
o
65
Defectos especiales:
o
Flagelos sueltos.
Cabezas sueltas.
66
Valoracin de la morfologa
Como en tcnicas anteriores, una vez obtenidos los resultados hay que evaluarlos utilizando la
tabla del intervalo de confianza del 95% para diferencias de dos porcentajes. Si el error es
mayor, no ser necesario repetir las dos preparaciones como en el caso de la concentracin,
pero s que se tendr que repetir el contaje de ambas.
El quinto manual de la OMS establece un valor para el lmite inferior de referencia para la
morfologa espermtica del 4%.
4.3
Vitalidad
El manual de la OMS sugiere que el test de vitalidad debe hacerse de forma rutinaria en todas las
muestras y considera que es obligatorio cuando la movilidad progresiva es menor del 40%.
Fundamento de las tcnicas para la vitalidad
El estudio de vitalidad lo podemos realizar usando diferentes tcnicas:
o
Test hipoosmticos.
Se fundamenta en estudiar la funcionalidad de la membrana plasmtica cuando est
situada en el medio hipoosmolar. Cuando la membrana est funcionalmente activa no
permite la salida de sustancias osmticamente activas y compensa el desequilibrio
osmtico captando agua, por lo que la membrana del espermatozoide se hincha y el
flagelo se riza. Se considera pues que un espermatozoide con la membrana hinchada
es un espermatozoide funcionalmente activo y por tanto vivo; sin embargo, si la
membrana no est funcionalmente activa permitir la salida de sustancias
osmticamente activas y no se hinchar, en este caso un espermatozoide se considera
no funcional.
Diversos estudios (Jeyendrn, 1984; Ramirez, 1992) han demostrado que no existe un alto grado
de correlacin entre test colorantes y test hipoosmticos ya que miden efectos caractersticos
diferentes de la membrana plasmtica. Por una parte los colorantes nos estaran midiendo el
estado estructural de la membrana plasmtica y el test hipoosmtico el estado funcional. Es por
eso que el resultado del test de colorantes siempre ha de ser superior al test hipoosmtico: un
espermatozoiode vivo, no teido con el colorante, podr tener el test hipoosmtico positivo o
negativo, ser funcional o no; pero un espermatozoide muerto debe tener el test hiposomtico
negativo siempre.
67
4.3.1.
Tcnica de la Eosina
o
Solucin de Eosina:
Eosina Y .......................... 0,67 g
ClNa ................................ 0,9 g
Agua ............................... 100 ml
Disolver la Eosina y ClNa en agua purificada y calentada.
Tcnica de la Eosina/Nigrosina
o
Solucin Eosina/Nigrosina:
Nigrosina ........................ 10 g
Solucin Eosina ............... 100 ml
Mezclar la Nigrosina con la solucin Eosina, hervir, filtrar, enfriar y guardar en bote de
vidrio.
Secar las muestras y observar las extensiones a 1000 aumentos. Contar al menos
200 spz/extensin.
68
Interpretacin
Ilustracin 10. Ejemplo del test de vitalidad con Eosina/Nigrosina. A) Espermatozoide muerto,
teido; B) Espermatozoide vivo, ligeramente teido; C) Espermatozoide vivo, sin teir
4.3.2.
Test hipoosmticos
Tcnica
o
Interpretacin
La identificacin al microscopio es relativamente fcil (ilustracin 11):
o
69
Ilustracin 11. Ejemplo del test de vitalidad con Sol. Hiposmtica. El Hos(-) est intacto,
muerto; los Hos (+) que tienen el flagelo encogido en distinto grado por hinchamiento,
estn vivos
Valoracin de los resultados de ambos test de vitalidad
Al igual que en el recuento, se ha de evaluar el resultado de la vitalidad mediante la grfica o
tabla del intervalo de confianza del 95% para diferencias entre dos porcentajes. Si el error es
mayor se deber preparar y contar dos nuevas preparaciones.
El lmite inferior de referencia que marca el nuevo manual de la OMS es del 58%.
La vitalidad puede servirnos como evaluacin de los resultados de movilidad. Esto es as porque
el tanto por ciento de espermatozoides viables siempre debe ser igual o superior al de
espermatozoides mviles. Por ejemplo:
o
En cambio si por ejemplo el test de vitalidad es del 40% y el de movilidad del 35% ser
correcto, ya que esto supone que un 5% de espermatozoides vivos no se mueven,
algo absolutamente coherente.
70
Tambin se debe valorar clnicamente los casos de movilidad baja con resultados de vitalidad
aceptables:
o
El estudio de la vitalidad puede tener una utilidad teraputica, como es el caso de la tcnica ICSI.
Esta tcnica consiste en microinyectar un espermatozoide vivo dentro de un ovocito. En el caso
de que todos los espermatozoides sean inmviles, se podr realizar un test hipoosmtico y
seleccionar un espermatozoide hinchado que sera viable. Con una micropipeta se aspirara y se
inyectara dentro del ovocito. Todo esto utilizando microscopio invertido con el equipo de
micromanipulacin adecuado.
4.4
Anticuerpos antiespermatozoides
En los tbulos seminferos, las clulas de Sertoli se unen entre ellas a travs de unas
50 a 60 uniones, formando una barrera de defensa conocida como Barrera
Hematotesticular.
o
Por otra parte diversas sustancias producidas por la prstata y las vesculas seminales
actan como inmunosupresores.
Estas barreas y mecanismos de defensa a nivel tisular y de la va seminal pueden ser alterados
poniendo en contacto con el sistema inmunocompetente las estructuras del espermatozoide y
las sustancias inmunognicas del plasma seminal, producindose una autovacunacin
antiespermatozoide.
Varias patologas androlgicas pueden causar alteraciones de la barrera:
o
o
o
o
o
o
o
o
Traumas.
Intervenciones quirrgicas.
Necrosis, torsiones testiculares.
Neoplasias.
Varicoceles
Criptorquidias.
Infecciones recidivantes del tracto genitourinario.
Obstrucciones.
Una vez rota la barrera los anticuerpos producidos pueden tomar contacto con los
espermatozoides alterando su funcionalidad.
El Manual sobre Anlisis de semen de la OMS sigue manteniendo en su quinta edicin la
obligatoriedad de realizar el estudio de anticuerpos antiespermatozoides en todos los
seminogramas. Adems, es particularmente importante cuando encontramos aglutinaciones o
movilidad baja, lo cual no quiere decir que siempre que haya aglutinaciones se corresponda con
la presencia de anticuerpos antiespermatozoide.
Se considera que existe un factor inmunolgico cuando ms del 50% de los espermatozoides
mviles de un eyaculado tienen adheridos anticuerpos antiespermatozoide.
En casos positivos se estudiarn: los isotipos presentes, la intensidad de respuesta y la
localizacin del anticuerpo.
Hay que tener en cuenta que los niveles de respuesta inmune fluctan, por lo que es interesante
el seguimiento de los niveles de anticuerpos antiespermatozoide en el factor masculino
inmunolgico. Sin embargo, encontrar anticuerpos no implica necesariamente el factor
72
inmunolgico. Para ello hay que demostrar que existe una alteracin funcional mediante
pruebas funcionales.
En un eyaculado con anticuerpos antiespermatozoide generalmente hay anticuerpos de los
isotipos inmunoglobulinas G o inmunoglobulinas A. Los anticuerpos inmunoglobulinas M no
suelen encontrarse debido a su gran tamao. Cuando se encuentran inmunoglobulinas A lo
normal es que estn acompaadas por inmunoglobulinas G, siendo las inmunoglobulinas A las
que tienen una mayor importancia clnica. Habitualmente se suelen usar tcnicas que detectan
los anticuerpos inmunoglobulinas G como cribaje poblacional y en caso positivo se debe estudiar
la presencia de anticuerpos inmunoglobulinas A.
La importancia clnica de los anticuerpos antiespermatozoide depender tambin de su
localizacin a lo largo de la membrana plasmtica.
o
Por ltimo, no tienen ninguna relevancia clnica y por tanto no deben ser
considerados los anticuerpos adheridos a la punta del flagelo.
Vamos a desarrollar los test directos por ser los de primera eleccin, y con mayor detalle los
M.A.R. test directos por ser los ms implantados.
73
IB TEST DIRECTO
o
Nos permite detectar IgG e IgA tanto de origen secretor como no secretor.
3,5 l de semen completo y 3,5 l de esferas revestidas con IgG (o IgA humana).
Mezclar.
74
Como en todas las tcnicas se debe realizar la evaluacin de resultados mediante el clculo
del intervalo de confianza del 95% para diferencias de dos porcentajes. Si el error es mayor
se debe prepara y contar dos nuevas preparaciones de la muestra.
Valores normales del M.A.R. test directo
El nuevo manual sigue sin dar unos valores normales, entendiendo por ellos unos realizados
estudiando una poblacin de varones frtiles. Aunque se mantiene el valor de consenso del
50% como valor indicativo. Esto es as porque hay estudios que demuestran que la
penetracin de espermatozoides en moco cervical y fertilizacin in vivo tiende a no
correlacionar cuando los valores de anticuerpos antiespermatozoides son iguales o
superiores a 50%.
4.5
Otras clulas
Clulas epiteliales.
las diluciones empleadas suelen ser demasiado altas como para poder realizar una medida
fiable, que recordemos pasa por contar al menos 400 elementos para obtener un error que no
supere el 5%.
Por tanto, la forma ms adecuada para calcular la concentracin de clulas redondas es usando
las extensiones teidas para la realizacin de la morfologa espermtica. A la vez que se hace la
morfologa se anotar el nmero de clulas redondas visualizadas y se aplicar la siguiente
frmula:
Si se cuentan menos de 400 clulas redondas el error es superior al 5%, y aparte del
resultado hay que informar el error asociado al n de espermatozoides contados.
Ejemplo
o
Supongamos que en una de las preparaciones Diff-Quik, a la vez que vamos contando
la morfologa, contamos 16 clulas redondas por cada 200 espermatozoides. En la
otra preparacin, contamos 19 clulas redondas por cada 200 espermatozoides. En
total habremos contado 35 clulas redondas por 400 espermazotoides.
Pero no hemos contado 400 clulas redondas sino 35, con lo que el error ser mayor
del 5% y deberemos informarlo, el error ser del 17%.
El informe final ser millones clulas redondas / ml, con un error del 13%.
Se ha de tener en cuenta que al superar el milln por mililitro debe ser investigada la
presencia de leucocitos por alguno de los mtodos vlidos, como el test de la
peroxidasa.
76
4.5.1.
Leucocitos
Test de la Peroxidasa
o
Fundamento
Las peroxidasas del leucocito polimorfonuclear reaccionan con el agua oxigenada de la
solucin de trabajo desprendiendo oxgeno que reacciona a su vez con la
ortotoluidina, oxidndola y haciendo que adquiera el tono marrn.
Limitaciones
o
77
Tcnica
o
Agitar 2 minutos.
El resultado se dar con dos cifras significativas, por ejemplo si obtenemos 2,74 lo
redondearemos a 2,8.Si se cuentan menos de 400 clulas el error ser superior al 5% y junto
al resultado habr que informar el error asociado al nmero de clulas contadas.
Para calcular la sensibilidad del mtodo, suponiendo un error mximo admisible del 20%, la
sensibilidad sera 138888 PMN / ml
78
Ejemplo
o
Al haber contado 221 leucocitos deberamos obtener una diferencia mxima de unos
29, en nuestro caso la diferencia es de 17, por lo tanto nuestros resultados sern
vlidos.
Puesto que hemos contado <400 leucocitos se ha de informar el error, que sera 7%,
as el informe sera: C (leucocitos) = 1,7 millones / ml (error 7%).
MUESTRA
RECUENTO
LEUCOCITOS
1 Subcmara
2 Subcmara
Suma
Diferencia
Valoracin
Clculo
Error
0,1 ml semen +
0,9 ml Sol Peroxidasa
2 PREPARACIN
102
119
221
17
Apto
C = (N PMN/ N rejillas) x (1/100) x Factor Dil
C = (221/18) x (1/100) x 10
C = 1,2 millones PMN / ml
%SE = 100 (N/N)
%SE = 100 (221/221) = 7%
Valores de referencia
El manual no establece unos valores de referencia con la poblacin de estudio de este
manual, es decir, en parejas que han quedado gestantes en el plazo de un ao o
menos. Mientras no existan estudios, se mantiene el valor de referencia de 1 milln
de leucocitos por mililitro.
4.5.2.
79
Procedimientos
o
Test de la peroxidasa.
Espermatogonia-8 micras
Espermatocito-10 micras
Espermtida-5 micras.
Sin embargo, esto slo sirve de referencia porque la degeneracin o los periodos de divisin
afectan estos tamaos.
http://bit.ly/ThJ9p0
Aqu se puede descargar el 5 manual de la OMS (pginas 97-99: atlas de clulas).
80
Captulo 5
Estas pruebas permiten apreciar la aptitud de los espermatozoides para migrar en el moco y
adems, son esenciales en la evaluacin de la calidad funcional de los espermatozoides. La
prueba de Hhner es un examen solicitado sistemtica y precozmente en el estudio de la
subfertilidad de la pareja.
A) Prueba de Hhner o prueba poscoital
Se trata de una prueba simple, no invasiva y barata. Aporta informacin sobre la calidad del
moco cervical consecuencia de la secrecin de estrgenos y de la calidad del movimiento
flagelar de los espermatozoides. Las anomalas en la interaccin moco-esperma son
responsables del 5 al 15% de los casos de infertilidad.
Se hace en el perodo preovulatorio. Para un ciclo de 28 das, se recomienda practicarla al
decimotercer da. Los pacientes tienen que tener una relacin sexual de 2 a 18 horas antes del
examen. La paciente no tiene que hacer la limpieza ntima antes de ir al laboratorio. La primera
etapa de este examen consiste en apreciar la calidad del moco cervical por el estudio de su
volumen, su viscosidad, su filancia, su cristalizacin y su celularidad.
81
El estudio de estos parmetros permite establecer un ndice, el ndice de Insler (Insler score).
o
5.1.2.
82
Media del desplazamiento angular (grados), MAD. La media de los valores del ngulo
de giro instantneo de la cabeza de los espermatozoides a lo largo de su trayectoria
curvilnea.
Este examen se practica en muy pocos laboratorios. Los espermatozoides capacitados tienen
que ser capaces de efectuar la reaccin acrosmica con el fin de penetrar en los ovocitos. Parece
bien demostrado que el resultado de la fecundacin in vitro (FIV) est correlacionado con la tasa
de reaccin acrosmica y que un fracaso de FIV puede ser debido a la ausencia de reaccin
83
acrosmica. As, una tasa de reaccin acrosmica inducida inferior o igual al 5% sera predictiva
de una tasa dbil de fecundacin.
Este examen se solicita en el caso de presencia en el espermiocitograma de un porcentaje
importante de anomalas del acrosoma o despus de un fracaso de la FIV.
5.1.4.
Permite estudiar, por una parte, la interaccin entre las membranas ovocitarias y la membrana
del espermatozoide y por otra parte, la aptitud de los espermatozoides para desarticular su
ncleo despus de su penetracin en un citoplasma ovocitario. Se hace con ovocitos de hmster
depelucidados, ya que la pelcida es una barrera interespecies. Es de realizacin delicada y slo
se hace en algunos laboratorios de Biologa de la Reproduccin.
Se valoran las cabezas expandidas por ser indicativas de que el ncleo del espermatozide, que
estaba muy contrado en el momento de entrar en el ovocito, ha conseguido entrar en l, ha
desaparecido la membrana nuclear del espermatozoide, se ha descondensado la cromatina y
expandido el ncleo dentro del ovocito. La prueba es positiva si se observa la presencia de una o
ms cabezas expandidas en ms del 10% de los ovocitos.
Cuando el porcentaje es nulo, las probabilidades de conseguir embriones en FIV convencional
son muy dbiles; en estos casos est indicada la inyeccin intracitoplsmica de espermatozoides.
Concretamente cuando se quiere realizar una inseminacin artificial y en el espermiograma se
han hallado numerosas anomalas de la cabeza de los espermatozoides (anomalas del
acrosoma, base disminuida) y la prueba de fecundidad heteroespecfica ha sido negativa, se
evita un fracaso de fijacin en la FIV convencional y se realiza en su lugar la prueba ICSI.
5.1.5.
Permite confirmar las anomalas constitucionales de los espermatozoides, como es el caso de las
disquinesias flagelares. Confirma, por ejemplo, las anomalas del axomena de los
espermatozoides (ausencia de brazos de dineina, ausencia de los tbulos centrales, anomalas
84
5.2
Bioqumica seminal
5.2.1.
Si hay obstruccin al nivel del tracto, las secreciones de las glndulas situadas ms
arriba no se pueden evacuar y se observar una disminucin del marcador
correspondiente.
Una azoospermia;
Una oligozoospermia;
Un volumen pequeo;
Una infeccin genital;
Una disminucin de la movilidad (< al 20%);
Otros: viscosidad anormal, preparacin de esperma para FIV o ICS.
PRSTATA
EPIDDIMO
o Citrato
o Zinc
o L-Carnitina
VESCULAS
SEMINALES
o Fructosa
o Fosfatasa cida
Tabla 7. Origen glandular de los parmetros bioqumicos del plasma seminal
85
5.2.2.
C) Tcnica UV a 340nm
La cuantificacin de los tres sustratos, carnitina, fructosa y citrato, se basa en el mismo principio
cuando se realiza a 340 nm. El parmetro a determinar es el primer sustrato de una cascada de
reacciones enzimticas a 37 C, es pues el parmetro limitante. La ltima reaccin es la reaccin
indicadora, que acaba en la formacin o el consumo de NADH2 o a NADPH2, que se mide por la
variacin a punto final de la absorbancia por espectrofotometra UV a 340 nm. La deteccin se
desarrolla en 2 tiempos:
o
Se incuba en primer lugar el plasma seminal con el reactivo 1 que contiene el tampn
de reaccin, los sustratos anexos necesarios y las diferentes enzimas de la cascada,
excepto la primera enzima.
86
87
Zinc. El zinc forma con el 5-Br-PAPS un complejo coloreado el cual se mide a punto
final a 560 nm.
88
Los valores normales de los marcadores seminales varan de un laboratorio a otro, en funcin de
las tcnicas utilizadas. Cada laboratorio tiene que establecer sus propios valores usuales. Tienen
que ser establecidos a partir de esperma procedente de sujetos que ya hayan procreado. Los
resultados se expresan en concentracin o en cantidad por eyaculado.
5.3
5.3.1.
5.3.2.
El doble Y(47,XYY)
Un estudio hormonal es indispensable ante una azoospermia, una oligospermia o ante una
degradacin de los parmetros del esperma. Se ha de investigar un origen secretorio de los
trastornos de la espermatognesis cuando se ha observado un hipogonadismo o una
hiperprolactinemia reveladora de un adenoma hipofisario.
89
MUESTRA
PARMETRO
MTODO
EVALUACIN INICIAL MACROSCPICA
o Visual
o Si no lica:
Licuefaccin
o Bromelina
o PBS
o Jeringa
o Pipeta
Viscosidad
o Varilla
Apariencia
o Visual
o Pesada
Volumen
o Recipiente graduado
pH
o Tiras reactivas pH (6-10)
EVALUACIN INICIAL MICROSCPICA
o Microscopio contraste de fases, pletina 37C
o Porta y cubreobjetos:
l muestra
Cubreobjetos
10
22x22
6,5
18z18
11
21x26
Agregacin
100X
Aglutinacin
100X
Cel no espermticas
100X
o Montar porta-cubre y esperar 1
o Visualizar a 5 mm del borde
o Contaje: 200X o 400X
1 Porta:
2 Porta:
Movilidad
5 campos
5 campos
200 spz
200 spz
Suma con IC = 95%
% Progresivos, % No Progresivos, % Inmviles
200x:
400x:
DILUCIN Weigman
Estimacin del
>404
>101
1/20
Recuento
64-400
16-100
1/5
<64
<16
1/2
90
MUESTRA
PARMETRO
Recuento
MTODO
ESTUDIO BSICO
o Neubauer improved
o 400x
o Contar rejilla/s: 5, 4, 6
o Filas completas
1 Subcmara:
2 Subcmara:
200 spz
200 spz
N = Suma spz con IC = 95%
C = (N/n filas) x (1/20) x Dil
Cripto y azoospermias
RECUENTO APROXIMADO: Porta y cubre
< 4 spz/campo <2 mill/ ml
0 spz/campo: contar todo el porta
- 10 l sedimento (1 ml, 15, 500g)
- 40 l si movilidad.
Criptozoospermia
RECUENTO EXACTO:
o Micr. Contraste Fases
o Micr. Fluorescencia
o 400x
o 250x
o Neubauer improved
o Cmara Leja
o Dilucin Weigman
o Dilucin Hoeschst
o Contar cmara total
o Contar cmara total
o C= N x (1/1800) x2=spz/ ml
o C= N x (1/50000)x2=spz/ ml
o %SE= 100 (N/N)
o %SE= 100 (N/N)
N
%SE
%SE
<400
Frmula
Frmula
(>5)
<400
Frmula
Frmula
(>5)
25-0
27777=S
20
25-0
1000=S
20
4100
52
150
52
91
MUESTRA
PARMETRO
o
o
o
o
Morfologa
o
o
o
MTODO
ESTUDIO BSICO
2 portas
Arrastre de 1 gota con porta 45 / 1
Si <2mill/ ml: 5-10 l sedimento (10600g)
Si viscoso: Dil Bromelina (1/2) o PBS (1/20). Extender
con pipeta
Secado al aire
Tincin: Papanicolaou, Shorr o Diff-Quik
Microscopio 1000x
1 Porta:
2 Porta:
200 spz
200 spz
Suma con IC = 95%
Segn criterio Kruger
% Normales, % Anormales
Obligatorio si PR<40%
COLORANTE SUPRAVITAL
T.HIPOOSMTICO
Vitalidad
Sol. Eosina
Porta-cubre
: semen+Eosina
400x M Contr Fas
Vivos: blancos
Muertos: rosas
IB TEST DIRECTO
Ab
Antiespermatozoide
Sol.Eosina/Nigrosina
Sol. Hiposmtica
Porta-cubre
1/10: semen+Sol
400x M Contr Fas
Vivo: flag hinch
Muerto: intacto
Porta: extensin
: semen+Eo/Nig
1000x
Vivos: blancos
Muertos: rosas
(200spz/porta) x 2
Suma IC=95%
% Vivos, % Muertos
MAR TEST DIRECTO
Semen lavado
Semen completo
Esferas de poliacrilamida
Esferas de ltex
Anti-IgG o Anti-IgA
Anti-IgG o Anti-IgA
Porta-cubre
400x Micros Contraste Fases
(200spz/porta) x 2
Suma IC=95%
3 y 10: % spz mviles + esferas
92
MUESTRA
PARMETRO
MTODO
ESTUDIO BSICO
CLULAS
REDONDAS cr
Otras
Clulas
o Tinc. Eosina/Nigr
o Test Peroxidasa
Porta: extensin
: semen+Eo/Nig
1000x
(200spz/porta).2
C cr Suma IC=95%
C=C spz x C cr/400
Neubauer imprvd
1/10: semen+D Perox
400x M Contr Fases
Rejillas completas
C=(N/rejilla).(1/100).10
N<400, %SE>5%
N=25-0, C=S=138888
o Tincin
Papanicolau
o Test
Peroxidasa
o Test Ab
frente CD45
o Tincin
acrosoma
SEGUNDA INTENCIN
Moco cervical y esperma:
o Prueba de Hhner
o Penetracin cruzada in vitro
FUNCIONAAnlisis del movimiento asistido por ordenador C.A.S.A.
LIDAD DEL
Reaccin acrosmica
ESPERMAPrueba de fecundidad heteroespecfica
TOZOIDE
Exploracin de la calidad del ncleo espermtico
Microscopia electrnica de los espermatozoides
BIOQUMICA:
Fructosa
L-Carnitina
-1,4Glucosidasa
Zinc
Fosfatasa
cida
Citrato
Sangre
CLULAS
ESPERMATOG
LEUCOCITOS
Colorimetra 405 nm
OTROS:
o Gentica
o Hormonas
93
Captulo 6
Semen de postvasectoma
Anlisis en fresco
Se recomienda que el laboratorio analice las muestras de semen lo antes posible con un lmite
mximo de 4 horas desde la eyaculacin.
La muestra se homogeneizar mediante agitacin suave y se situar una alcuota de 10 l entre
portaobjetos y cubreobjetos de 22 x 22 mm y se examinarn no menos de 20-30 campos con un
microscopio en contraste de fases.
Si se detecta la presencia de espermatozoides mviles, se especificar la concentracin y el
grado de movilidad siguiendo las recomendaciones del Manual de Anlisis Bsico de Semen de la
ESHRE o de la OMS. Si se detecta exclusivamente la presencia de espermatozoides inmviles,
bastar con mencionarlo en el informe.
94
6.1.2.
Anlisis sedimento
95
6.2
Semen de prevasovasostoma
6.3
Semen posvasovasostoma
96
Semen
reciente
MUESTRA
PARMETRO
MTODO
POSTVASECTOMA
o Pesada
Volumen
o Recipiente graduado
En Fresco:
o Semen 10 l
o Porta y cubre 22 x 22 mm
o Microscopio contraste de fases 400x
o 20-30 campos
Si 0 spz:
o Todo el semen en tubo cnico
o 1000g, 15
Recuento
o Sedimento en 100 l
o (10 l + porta-cubre (22x22))x10 veces
o Micr. contraste de fases 400x
o 40 campos
Si 0 spz:
Si se observan spz:
o No se observan spz
o Movilidad
o C<188 spz/E, %SE>5 o Se observan spz
Si se observan
spz:
o Movilidad
o Recuento como
Criptozoospermia
PREVASOVASOSTOMA
o Pesada
Volumen
o Recipiente graduado
Recuento
o
o
o
o
o
o
o
POSVASOVASOSTOMA
o Evaluacin inicial macroscpica
o Evaluacin inicial microscpica
o Estudio bsico
o (Estudios de segunda intencin: Bioqumica seminal)
97
Captulo 7
Campo de aplicacin
Es muy importante tener en cuenta que las tcnicas de capacitacin espermtica no son en s
mismas pruebas diagnsticas, sino que forman parte de los mtodos de tratamiento del semen.
Cuando los parmetros seminales son normales el recuento de espermatozoides mviles tras la
preparacin seminal (REM) no aporta informacin adicional al estudio de la pareja estril
(recomendacin de la Sociedad Espaola de Reproduccin, Sociedad Espaola de Androloga y
Asociacin para el Estudio de la Biologa de la Reproduccin). Sin embargo el REM se ha
convertido en un referente de gran utilidad para sentar la indicacin de IIU, de FIV o ICSI, ya que
el valor pronstico que aporta un seminograma anormal es insuficiente.
98
7.2
7.3
7.3.1.
Tipo de muestra
Semen fresco
La muestra de semen debe recogerse siguiendo las indicaciones del captulo de Preanaltica.
Pasados 30 minutos de la eyaculacin separar una alcuota de semen para su valoracin
siguiendo las recomendaciones de la ESHRE y la OMS.
99
7.3.2.
Semen congelado
En aquellas situaciones en las que no se puede emplear semen fresco se puede recurrir a semen
congelado. Existen dos tipos de muestras de semen criopreservadas:
o
100
Donantes de semen: Aunque es una situacin que queda fuera del alcance de este
documento queremos resear que, respecto a los donantes, debe conseguirse un
nmero mnimo de espermatozoides con movilidad progresiva post-descongelacin
para cada donante para decidir si la congelacin es factible.
7.4
Los medios de cultivo han de atemperarse antes de su uso y tener la certificacin CE.
Todos los materiales empleados as como los medios de cultivo deben ser estriles y
manejarse en condiciones de asepsia, en campana de flujo laminar.
Los medios de cultivo deben tener una osmolalidad entre 280-300 mOsm/kg.
101
Adems, los medios deben tener una concentracin de calcio, bicarbonato y protenas
especfica para que los espermatozoides adquieran la capacidad de fecundar.
Finalmente sealar que han sido mltiples los intentos de realizar una mejora in vitro de los
espermatozoides mediante la adicin de distintos compuestos al medio de cultivo. De ellos
destacar el uso de inhibidores de la fosfodiesterasa (pentoxifilina, teofilina, cafena, etc.) para
estimular la motilidad espermtica. La inhibicin de la fosfodiesterasa provoca un aumento de la
concentracin de adenosin monofosfato cclico (cAMP). El aumento de cAMP, mediador
intracelular, regula reacciones intracelulares que activan el metabolismo del espermatozoide
mejorando parmetros de movilidad. Muchas son las publicaciones sobre el efecto de la
pentoxifilina mientras unos autores encuentran una mejora de la motilidad al incubar la muestra
seminal con pentoxifilina otros no observan diferencia alguna de ah que no se haya implantado
como rutina en la prctica clnica del laboratorio.
7.5
Los mtodos incluyen desde la simple dilucin y centrifugacin hasta tcnicas ms complicadas.
o
Dilucin y lavado del semen. Los mtodos que utilizan solo lavado, deberan
abandonarse y emplear tcnicas ms seguras de preparacin de espermatozoides
De todos los mtodos, los que realmente tienen utilidad clnica son los de migracin y gradientes
de densidad.
7.5.1.
Mtodo de lavado
7.5.2.
Migracin
Depositar sobre el semen 500 l de medio de cultivo resbalando por las paredes del
tubo, con cuidado de que no se mezcle con el semen.
Pasado este tiempo aspirar aproximadamente 300l de medio de cultivo, con cuidado
de no aspirar semen (para lo cual durante todo el proceso se debe mantener el
ngulo del tubo). Si hay ms de un tubo de una misma muestra se unifica todo el
aspirado en un nico tubo.
Swim Up convencional
Se basa en el mismo principio pero requiere un primer paso de lavado.
o
Aadir resbalando lentamente por las paredes del tubo 500 l de medio de lavado.
Gradientes de densidad
Se preparan los tubos que sean necesarios por muestra teniendo en cuenta que no se
debe depositar ms de 1,5 ml de semen por tubo.
Dispensar 0,5 ml del gradiente de 40% en un tubo cnico, a continuacin con una
jeringa de 1 ml conectada a una aguja larga de carga, depositar 0,5 ml del gradiente
de 80% en el fondo del tubo (cono), muy despacio para que el gradiente de 40% suba
y queden bien definidas las dos capas.
Decantar el semen licuado, resbalando por las paredes de los tubos, con cuidado de
no romper la interfase. El semen debe quedar encima del gradiente de 40%.
Aspirar las distintas capas con una pipeta pasteur en la zona del menisco para evitar
alterar las interfases y las posibles contaminaciones, hasta alcanzar claramente el
gradiente de 80%, donde se encuentra el sedimento con los espermatozoides
maduros. Repetir el proceso con todos los tubos de la misma muestra.
105
Mtodo de filtrado
Esta tcnica se basa en el hecho de que los espermatozoides muertos o con importantes
disrupciones de membrana presentan una clara tendencia a la absorcin a determinados
materiales (fibra de vidrio, partculas de vidrio, etc.). Aprovechando esto pueden construirse
columnas de lana de vidrio que permitan filtrar a los espermatozoides obtenindose la fraccin
de clulas viables. Se realiza mediante una malla de fibra de vidrio en porciones de 15-20mg que
situamos en el interior de una jeringa de insulina hasta la divisin 0,06ml. A continuacin
lavamos el filtro con 2-3ml de medio para eliminar las partculas de fibra de vidrio que pudieran
estar libres y procedemos a filtrar aproximadamente 500l del semen en fresco o previamente
lavado. Despus del filtrado lavaremos el filtro de nuevo con 200-300l de medio de cultivo para
liberar los espermatozoides de buena calidad que pudieran quedar en el. Sin embargo se ha
indicado que las columnas de lana de vidrio podran daar las membranas de la cabeza de los
espermatozoides y de pequeas contaminaciones de fragmentos de fibra de vidrio.
106
7.6
Una vez terminada la tcnica hay que calcular el porcentaje de espermatozoides con movilidad
progresiva y realizar el recuento de los mismos.
Los resultados se obtienen multiplicando el tanto por ciento de espermatozoides con movilidad
progresiva, por los millones de espermatozoides recuperados y por el volumen final. Se
expresar como millones de espermatozoides recuperados con movilidad progresiva. Si el semen
se va a utilizar para inseminacin artificial se informar como millones inseminados y se
calcularn multiplicando por el volumen inseminado. En caso de utilizar parte del volumen
eyaculado, los resultados deben expresarse en funcin del volumen utilizado, y multiplicarse por
el factor de correccin.
La relacin del total de espermatozoides presentes en el eyaculado con el nmero de
espermatozoides mviles recuperados, se expresa como porcentaje de recuperacin y se calcula
con la siguiente frmula:
Porcentaje de recuperacin = [(VF x CF x REM) / (VU x CI x IEM)] x 100
VF= volumen final
CF= concentracin final de espermatozoides
REM= tasa de espermatozoides con movilidad progresiva recuperados
VU= volumen semen utilizado
CI= concentracin inicial de espermatozoides
IEM=tasa de espermatozoides con movilidad progresiva en el eyaculado
Para el correcto desarrollo de este proceso se debe tener en cuenta las siguientes
recomendaciones:
o
Aspirar siempre las diferentes fases en la zona de contacto con el tubo, donde se
forma el menisco, para no alterarlas. No mezclar plasma seminal con los
espermatozoides recuperados, puede impedir la capacitacin.
-5
107
7.7
Conclusiones
El papel de los parmetros seminales como factor pronstico en la fertilidad masculina est
actualmente sometido a debate. Se ha propuesto el test de recuperacin de espermatozoides
mviles (REM) en el estudio de la pareja estril como prueba para distinguir qu parejas se
beneficiarn de la inseminacin artificial y cules no, porque incluye la concentracin, la
movilidad as como los efectos del procesamiento de los espermatozoides.
Es difcil establecer un nmero mnimo de espermatozoides recuperados para realizar
inseminaciones intratero y obtener una tasa de gestacin adecuada. Los niveles umbral en los
distintos trabajos oscilan desde 0,8 a 5 millones. No se ha podido identificar un umbral ptimo
de REM que permita aconsejar a las parejas. Se requieren estudios adicionales para evaluar la
capacidad predictiva del REM en los estudios de fertilidad. Algunos autores proponen que cada
centro establezca su punto de corte en funcin de datos clnicos y de laboratorio de cada centro.
De las tcnicas de capacitacin anteriormente descritas las ms utilizadas en los laboratorios por
su simplicidad y eficacia son el Swim-up y los gradientes de densidad. Aunque no existe
evidencia cientfica para recomendar una tcnica de preparacin de semen, las ventajas de cada
uno de estos mtodos se recogen en la tabla 10.
MTODOS DE MIGRACIN
(SWIM-UP)
o Proceso fisiolgico.
o La muestra capacitada queda ms limpia.
o Es independiente del volumen del eyaculado.
MTODO DE CENTRIFUGACIN
(GRADIENTES)
o Mayor capacidad de recuperacin.
o Buenos resultados con muestras pobres o
congeladas.
o Menor tiempo para su realizacin.
108
Semen criopreservado
(-196C) en pajuela
MUESTRA
PARMETRO
Pretratamiento
Lavado
Migracin
MTODO
o Descongelacin
2-3, 37C
5, 10C-20C
o Retirada del agente crioprotector
Desinfeccin de pajuela y trasvase a tubo
1/5: semen/medio lavado, 10!
o Evaluacin de Eficiencia
o
o
o
o
Swim-down
Reparto en n tubos:
(500l medio)abajo
(250l semen)arriba
Incubacin:
37C, 45 inclinado
30-60
Recuperacin:
Vn: (capa d abajo)x n
Si Vn>500l
Morfolg, Recuento
Centrifugacin:
500g, 10
Sed+300-500l med
37C
109
MUESTRA
PARMETRO
Semen descongelado en
tubo
Gradientes
de densidad
Semen
reciete
Filtracin
MTODO
o Reparto en n tubos:
1. 0,5-1 ml medio 40%-45% (intermedio)
2. 0,5-1 ml medio 80%-90% (abajo)
3. 1,5 ml semen (arriba)
o Centrifugacin en gradientes: 300g, 20
o Recuperacin: (sedimento) x n + 1,2 ml medio
o Centrifugacin: 500g, 10
o Sedimento + 300-500 l medio
o Movilidad y recuento
o 37C
o Lavado: jeringa con filtro + 2-3 ml medio
o Filtrado: jeringa con filtro + 500 l semen
o Recuperacin: jeringa con filtro + 2-3 ml medio
Eficiencia de
la
capacitacin
Porcentaje de recuperacin =
[(VF x CF x REM)/(VU x CI x IEM) ]x 100
110
Captulo 8
Nombre
Identificacin laboratorio
Nmero Historia clnica
Fecha de obtencin de la muestra
Periodo de abstinencia
Volumen
Resultados
Valores de referencia
Comentarios
111
8.1
Resultados
0 ES=95%
8.2
Valores de referencia
En la ltima edicin del Manual de la OMS en lugar de hablar de valores de referencia, se habla
de Lmites inferiores de Referencia (tabla 12):
o
Que incluye al 95% de los individuos de referencia con valores superiores al percentil
5, y no en torno al percentil 50 como hasta ahora se haba considerado en los valores
de referencia del espermiograma.
Es conveniente aclarar que los lmites inferiores de referencia no son valores de referencia de
esterilidad o fertilidad:
o
Ya que ni son los valores mnimos que se necesitan para lograr un embarazo, pues
habr muchos varones con valores superiores que no puedan conseguir un embarazo
por causas estrictamente femeninas o por factores que no se ponen en evidencia en
los parmetros del seminograma.
112
Los valores de referencia deben interpretarse conjuntamente con la informacin clnica para
poder sacar algunas conclusiones.
Adems, puede haber diferencias regionales en la calidad del semen, y entre laboratorios. Estos
laboratorios debern considerar la preparacin de sus propios valores de referencia.
VALORES DE REFERENCIA DE LOS PARMETROS MACROSCPICOS DEL SEMEN
PARMETRO
Licuefaccin
Viscosidad
Apariencia
pH
Agregacin
Aglutinacin
VALOR
< 60
2 cm
homogneo, gris opalescente
7,2
Sin inters
No concluyente
VALOR
1,5
15
39
40
32
58
4
<1
< 50%
IC 95%
1,4-1,7
12-16
33-46
38-42
31-34
55-63
3-4
-
113
8.3
Comentarios
Conclusin
PARMETRO
RESULTADO
NORMAL
ALTO
BAJO
AUSENCIA
NORMAL
ALTO
BAJO
AUSENCIA
AUSENCIA en fresco y
PRESENCIA en el sedimento
BAJO
BAJO
BAJO
BAJOS
VOLUMEN
RECUENTO
MOVILIDAD
MORFOLOGA
VITALIDAD
COMBINACIONES:
INFORME
Normospermia
Hiperespermia
Hipoespermia
Aspermia
Normozoospermia
Polizoospermia
Oligozoospermia
Azoospermia
Criptozoospermia
Astenozoospermia
Teratozoospermia
Necrozoospermia
Oligo-
Recuento
Movilidad
Morfologa
asteno-
teratozoospermia
Hemos o Hematospermia
Leucos, Leucocito o Piospermia
HEMATES
LEUCOCITOS
La FSH plasmtica permite explorar el eje gonadotropo y orientar hacia una etiologa
pretesticular y testicular.
114
Si la FSH est aumentada con una L-carnitina y una 1,4 glucosidasa normales, el
origen es testicular y es una azoospermia secretoria. Esto representa cerca del 70% de
las azoospermias. La elevacin de la concentracin de FSH es proporcional al grado de
afeccin testicular. Las etiologas son numerosas: el sndrome de Klinefelter, los
defectos de maduracin de la lnea germinal, la criptorquidia, las secuelas infecciosas,
las lesiones traumticas o trmicas. Ciertas azoospermias secretoras tienen, sin
embargo, una tasa de FSH normal que complica as su diagnstico.
115
Astenozoospermias
En ciertas astenozoospermias es interesante determinar la L-carnitina y la fructosa, porque su
disminucin puede estar en relacin con una disminucin de la movilidad del espermatozoide.
La fructosa es sintetizada en las clulas epiteliales de las vesculas seminales, por conversin a
partir de la glucosa sangunea. La diabetes conlleva un falso aumento de la fructosa seminal
y puede, por ejemplo, disfrazar una bajada de este parmetro.
Otras anomalas
Los marcadores bioqumicos pueden estar alterados en los varicoceles, en los sujetos VIH...
En resumen, la exploracin completa y escrupulosa de la esterilidad y subfertilidad masculinas es
esencial. El espermiograma es un examen primordial, la bioqumica del plasma seminal lo
completa: permite explicar ciertas anomalas, en particular las azoospermias obstructivas.
El diagnstico exacto de la causa de esterilidad y subfertilidad masculinas es el resultado de un
proceso pluridisciplinar, pudiendo recurrir a numerosos exmenes complementarios ms o
menos complejos. Es muy importante, ya que condiciona la eleccin de un tratamiento o de una
tcnica de procreacin mdicamente asistida.
116
Bibliografa
Captulo 9
Bibliografa
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