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Departamento de Bioqumica
INTRODUCCIN
El material que aqu se presenta est dirigido a los estudiantes de licenciatura, en especial
aquellos que buscan introducirse en la bioqumica y como material de apoyo para los
estudiantes del curso Bioqumica experimental (0141) de la Facultad de Qumica.
Se presenta de manera sencilla y resumida las tcnicas de mayor uso en la bioqumica y la
biologa molecular. Comenzando con las partes del mtodo cientfico y como realizar un
reporte, tarea que aunque los alumnos han ido llevando a lo largo de sus cursos en la
Facultad de Qumica, es distinta, en el curso de la Bioqumica experimental se les introduce
al manejo y presentacin de la informacin que obtendrn de un experimento de manera
similar a como se hace en los artculos cientficos.
Despus se avanza sobre los conocimientos bsicos de bioqumica, como por ejemplo la
introduccin en el uso de la espectroscopa y la curva patrn para determinar biomolculas.
Se presenta una gua para realizar la purificacin mediante el seguimiento secuencial de
varios pasos de purificacin como la precipitacin por salado, desalado, cromatografa de
intercambio inico y de afinidad. Para reconocer si el proceso de purificacin fue ptimo se
les introduce sobre los conceptos de pureza y rendimiento, los cules son el resultado del
monitoreo del proceso de purificacin el cual proviene de la determinacin de protenas, el
corrimiento electrofortico de las diferentes fracciones de la purificacin y la medicin de la
actividad enzimtica de ests fracciones. Adicionalmente, los alumnos contaran con la
informacin mnima necesaria para determinar los parmetros cinticos de una enzima y la
influencia de los inhibidores. Es pues, que en est primera parte se presentan los conceptos
sobre la estructura, propiedades y funcin de las protenas.
Por ltimo, encontraran que la expresin gentica se modifica por varias circunstancias, en
particular se revisa el caso del opern lac.
Si bien existen numerosos y excelentes libros en los que los estudiantes pueden encontrar
est informacin, la mayor parte de los libros estn escritos para especialistas en el campo,
en este escrito se presentan aquellos aspectos que llevaran al estudiante a comprender
como en la prctica se realiza la purificacin de protenas o bien la introduccin de un
transgen a un organismo como E. coli.
CONTENIDO
Seccin
I
Nombre
Introduccin al laboratorio de Bioqumica
Parte I: Reporte cientfico
Parte II: Revisin de mtodos espectroscpicos y elaboracin de curva
estndar de protenas
II
III
Actividad enzimtica
Parte I. Curvas temporales de actividad enzimtica de la lactato
deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino.
Parte II. Factores que modifican la actividad de las enzimas: Efecto de
la concentracin de sustrato y de un inhibidor.
Anexo I. Deduccin de la ecuacin de Michaelis-Menten.
IV
Figura 1.1. Diagrama que representa el mtodo cientfico. Es importante recordar que el llamado
mtodo cientfico no es una serie de pasos a seguir, sino una estrategia flexible que no
necesariamente debe seguir este orden. Utilizamos este esquema porque es til para entender cmo
se puede dar sentido y estructura a una investigacin cuando debemos escribir un reporte cientfico.
Reporte cientfico
Como se coment con anterioridad, el principal propsito de escribir un reporte cientfico es
el de comunicar la informacin que ha sido compilada como resultado de la investigacin, la
experimentacin y el anlisis de los datos. Estos reportes generalmente se publican en
revistas cientficas arbitradas, es decir, en revistas en las que los cientficos ms reconocidos
en cierto campo revisan todos los trabajos y valoran si deben publicarse o no. Los reportes
cientficos cubren una gran variedad de tpicos pero usualmente se enfocan en transmitir la
informacin con un propsito claro y para una audiencia especfica. Un buen reporte es un
6
documento preciso, objetivo y completo. Debe tambin estar bien escrito, claramente
estructurado y ser ameno, para que el lector mantenga la atencin en l. Generalmente, el
valor de una investigacin se evala a travs del reporte, es decir, el reporte escrito es el
nico producto tangible de cientos de horas de trabajo. Es por esto que el reporte debe ser
de gran calidad.
Reflexiona:
A qu crees que se refiere cuando se dice que un reporte cientfico debe ser objetivo?
Investiga:
Investiga el nombre de tres revistas arbitradas que utilicen los bioqumicos como
referencia para su campo de trabajo.
Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido,
introduccin
o
antecedentes,
mtodos,
resultados,
discusin,
conclusiones,
recomendaciones o perspectivas y referencias. La inclusin de recomendaciones
generalmente ocurre en reportes para la industria y son determinantes para la toma de
decisiones por parte de los directivos. A continuacin se da una breve descripcin de cada
una de las secciones que conforman un reporte cientfico.
Resumen. Su funcin es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la
que el lector juzgue si le interesa leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes ms
relevantes, una frase sobre el objetivo del proyecto, una descripcin corta de los mtodos
que se usaron, los principales resultados y las conclusiones o implicaciones de los
resultados. El resumen normalmente se escribe como un solo prrafo de 100 a 200 palabras.
Introduccin. Contiene la informacin necesaria para que el lector conozca por qu es
importante el reporte, as como de qu trata. La informacin que se utiliza en la introduccin
se basa en la literatura cientfica publicada con anterioridad y va de lo general a lo especfico,
esto es, se comienza primero desde un contexto amplio del tema, lo que facilita entender los
conceptos y la importancia del tpico de la investigacin en un rea particular de estudio.
Despus, se hace un resumen de investigaciones anteriores, propias o de otros
investigadores (literatura especfica) para ayudar a justificar la presente investigacin, es
decir, se le comunica al lector qu se sabe y qu no se sabe sobre el tema en cuestin. Esto
lleva directamente a una seccin en la que se plantean las preguntas de investigacin del
trabajo, es decir, las hiptesis. En algunas publicaciones se requiere que la parte final de la
introduccin contenga los objetivos del estudio.
Mtodos. El propsito de esta seccin es describir precisamente los materiales y mtodos
usados para realizar los experimentos, siempre con suficiente detalle para que alguien ms
pueda reproducirlos. Algunas veces se debe justificar por qu se us un mtodo en
particular, ya que puede haber una variedad de mtodos alternativos para responder una
pregunta o investigar un fenmeno. La seccin de mtodos debe escribirse en pasado, ya
que describe lo que se hizo.
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Resultados. En esta seccin se describen pero no se explican los resultados, es decir, slo
presenta los hechos que sern analizados posteriormente en el reporte. La seccin de
resultados debe ser clara y precisa y generalmente contiene figuras, como diagramas,
tablas, grficas, cuadros o mapas que pueden ser muy tiles para mostrar o enfatizar la
informacin en un reporte. Las figuras deben ser usadas para compilar los datos de una
manera ordenada, son una herramienta til para ayudar a los lectores a entender datos
complejos o numerosos.
Los investigadores deben disear cuidadosamente sus figuras de manera que presenten la
informacin de manera sencilla y clara. Es esencial que las figuras estn integradas
correctamente en el cuerpo del reporte, que se indiquen claramente en el texto (con la
numeracin asignada) cuando se mencionen y siempre deben explicarse. Un error comn es
mencionar la figura y slo decir que los datos se encuentran en ella. Lo correcto es explicarle
al lector cules datos son relevantes en la figura, cmo se relacionan dichos datos con lo
descrito en otras figuras o utilizar los datos que en ella se presentan para justificar por qu se
realiz el siguiente experimento que se presenta en el reporte. La descripcin de esta
seccin al igual que la de mtodos se hace en pasado.
Discusin. La seccin de discusin tiene dos objetivos principales: 1) explicar los resultados
del estudio con base en la literatura cientfica existente y 2) evaluar si lo encontrado en el
estudio tiene un significado prctico, biolgico, y/o est relacionado con otro fenmeno. Para
ello se necesita: a) interpretar y explicar los resultados; b) evaluar si las preguntas que se
plantearon en la hiptesis han sido contestadas; c) mostrar cmo los resultados de la
investigacin se relacionan con los que han sido reportados anteriormente; d) calificar y
evaluar la importancia y significado de los resultados, esto es, si los resultados son
estadsticamente significativos, o si existi algn defecto en el diseo o en el procedimiento
que pudo afectar el resultado; e) plantear nuevas preguntas o determinar si se abrieron
nuevas reas de inters. La descripcin de est seccin se hace en presente.
Conclusiones. Esta seccin puede ser incluida como parte de la discusin o bien como una
seccin aparte. Establece de manera clara y concisa cul es la relevancia del trabajo y sus
implicaciones.
Referencias. Es necesario incluir una lista de referencias, las cuales deben estar citadas en
el cuerpo del reporte. Las referencias se pueden colocar en una lista por orden alfabtico, o
numeradas de acuerdo a como fueron apareciendo en el texto. Cada referencia debe
contener toda la informacin bibliogrfica. Existen diversas formas de citar la literatura
consultada, como la APA, Harvard o Chicago, entre otras. Cada publicacin tiene distintos
requisitos para presentar las referencias.
Referencias
Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition.
Phoenix, AZ: Oryx Press, 1994.
Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New
York: Longman, 2000.
donde:
Absorbancia
Podemos construir una grfica para observar cmo vara la absorbancia de una especie en
solucin a una longitud de onda dada en funcin de su concentracin. A esta grfica se le
llama curva de calibracin o curva estndar y para construirla se mide la absorbancia de
varias soluciones de concentracin conocida, llamadas disoluciones estndar. Es una lnea
recta y de acuerdo con la ecuacin 3 la pendiente es b.
Pendiente = b
Concentracin (mol/L)
Figura 1.2. Curva estndar.
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11
D.
E.
F.
G.
H.
Clulas a las que se les introdujo un gene que codifica una protena proveniente de otro organismo,
a travs del uso de tcnicas de biologa molecular. Ver seccin 4 del manual.
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Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con un radio r (expresada en mm).
El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posicin intermedia del tubo.
La fuerza centrfuga creada puede ser tan pequea como 600 Xg (600 veces la gravedad) o
tan grande como 300,000 Xg. En el primer caso se sedimentan fragmentos de tejido, clulas
intactas y ncleos, entre otros. Si la fuerza aplicada es intermedia (13,000 Xg), podemos
separar los organelos celulares y, cuando la fuerza es muy grande (100,000 Xg), la mayor
parte de las molculas solubles que componen el citosol permanecen en solucin y las
molculas aglomeradas en las membranas sedimentan (denominada fraccin microsomal).
Como puedes ver, dependiendo de la fuerza aplicada, la sedimentacin vara. Esto implica
que podemos realizar un proceso llamado centrifugacin diferencial, en el que el
homogeneizado se somete a una serie de centrifugaciones a distintas fuerzas para ir
desechando gradualmente los contaminantes de la muestra y avanzar en la purificacin de la
protena de inters.
Investiga:
Busca el diagrama de una centrfuga de laboratorio y seala cules son sus partes.
SEGUNDA FASE
El objetivo principal es remover los contaminantes ms pequeos, de una forma especfica.
stos pueden ser protenas, cidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los mtodos ms
utilizados para eliminar protenas contaminantes es la precipitacin. Para que una protena
precipite debemos modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en
la superficie de una protena pueden interaccionar tanto con las molculas de agua como con
los iones que se encuentran en solucin. Existen varias estrategias para precipitar a las
protenas tales como cambio de pH, incremento en la temperatura, adicin de disolventes, de
molculas cargadas, etc. El mtodo ms comnmente empleado es la precipitacin por
salado con (NH4)2SO4.
Las protenas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentracin de iones,
fenmeno denominado de salting in. Pero cuando se eleva en exceso la concentracin de
iones, disminuye la solubilidad de las protenas y precipitan (salting out). La mayor parte
de las protenas presentan en su superficie una capa de agua (capa de solvatacin) que al
incrementar la concentracin de los iones disminuye. El mecanismo de salting-out se basa en
la exclusin del cosolvente, es decir la sal establece puentes de hidrgeno con el agua y al
hacerlo sustrae el agua de la protena. Por lo anterior, la conformacin de la protena se
modifica para evitar la exposicin de sus residuos apolares con el solvente, dando como
resultado nuevas interacciones y por lo tanto lleva a la formacin de plegamientos o
asociaciones nuevas que pueden llevar a su precipitacin. El mtodo del salting out es uno
de los ms utilizados en la purificacin de protenas, ya que permite deshacerse de una gran
cantidad de contaminantes de una forma econmica. Es por esto que se han diseado tablas
y frmulas en las que se pueden determinar las cantidades de (NH4)2SO4 slido o en
solucin, que se deben aadir a una mezcla de protenas para obtener una concentracin
dada de sal. La precipitacin de una protena a una concentracin dada de sal depende las
propias caractersticas inicas y de contenido de residuos polares, por lo que cada protena
precipita a cierta concentracin y tipo de sal. Para establecer est concentracin se deben de
realizar pruebas. Adems, se tiene que determinar si la protena permanece activa o pierde
su actividad biolgica al ser precipitada.
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Despus de la precipitacin hay que retirar el agente precipitante, que es comnmente la sal.
Una manera es diluir la solucin para reducir la concentracin del compuesto, otras formas
pueden ser la dilisis, la ultrafiltracin o bien, el paso por una columna de exclusin
molecular. A continuacin se describen brevemente estas tcnicas.
La dilisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo de dilisis, que es una
membrana semipermeable de celulosa o celofn con un tamao de poro determinado. Se
coloca la muestra dentro del tubo de dilisis y ste se sumerge en una solucin que contiene
al menos 30 veces ms volumen que la muestra a dializar. Lo anterior aumenta las
probabilidades de que la alta concentracin de sal en el tubo migre hacia la solucin en la
que se encuentra baada el tubo y cuando se alcance el equilibrio, la concentracin de sal en
la muestra y la solucin de dilisis sea muy baja. Existen dos desventajas de la dilisis: el
costo de la membrana de dilisis y que el proceso incluye la agitacin del tubo de dilisis a
4 C durante toda la noche.
Por su parte, la filtracin en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna empacada
con Sefadex-G25 puede usarse para eliminar molculas de peso molecular menores a 5000
daltones. La muestra se coloca en la columna, y al aadir el amortiguador de elucin, las
molculas de menor tamao se meten entre los poros de la matriz de Sefadex y se retienen
all, mientras que las grandes no se retienen y salen ms rpidamente de la columna.
Posteriormente eluyen o salen las de peso molecular menor. En un simple paso la muestra
se desala, concentra, cambia de amortiguador y pierde protenas o molculas contaminantes.
Investiga:
Cmo es un equipo para dilisis?
Qu es el Sefadex-G25 y cules son sus propiedades?
Cmo es una columna de filtracin en gel?
Qu es un amortiguador de elucin?
Qu significa eluir?
Dibuja:
Cmo te imaginas que ocurre la filtracin en gel a nivel microscpico? Dibuja la matriz de
Sefadex con sus poros, las molculas grandes y las pequeas y cmo salen stas de la
columna.
TERCERA FASE
El objetivo de esta fase es obtener una protena pura o con mnimas trazas de contaminantes
proteicos. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinacin de varios mtodos
cromatogrficos, como la cromatografa de exclusin molecular, de intercambio inico,
interaccin hidrofbica y de afinidad. A continuacin slo se describen las dos tcnicas que
se usarn en el laboratorio.
La cromatografa de intercambio inico es una tcnica que separa las biomolculas de
acuerdo con su carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una protena interaccionan
con los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria.
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Figura 2.1.Separacin por cromatografa de intercambio inico. Los soportes o resinas de cromatografa pueden estar
cargados positiva o negativamente. De esta carga depende cules son las molculas que interaccionarn con la resina.
Figura 2.2. Comparacin entre las molculas de Cibacrn blue 3GA y el NAD+. A) Los colorantes de triazina como el
Cibacrn blue 3GA son comnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de purificacin por
cromatografa de afinidad. La molcula es estable, fcil de remover, barata y varias compaas las tienen disponibles para
realizar purificaciones de protenas que unen nucletidos de piridina B) NAD+.
Referencias
Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and
ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, New
York, USA.
Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science 4.1.14.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA.
Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John
Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4
Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden.
Code number 18-1132-29 Pp 94.
Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd.
Pp 1-7. Consultar la pgina www.els.net
Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences.
John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net
Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York,
USA. Pp 71-104
Sitio del que se tomo parte de la metodologa para la extraccin de la lactato deshidrogenasa
de pollo http://www.acad.carleton.edu/curricular/BIOL/classes/bio380/lab_protocol.html autor:
John Tymoczko y actualizada por Rebecca Bryant
Sitios recomendados para
1.
Aprender sobre las caractersticas y propiedades de las protenas
http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.html pgina desarrollada por el Dr. Rogelio
Rodrguez Sotres.
2.
Calcular la concentracin de sulfato de amonio a aadir a una muestra.
http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm
http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl
3.
Calcular la fuerza centrfuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa.
http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htm
4.
Macro-Prep Ion Exchange Supports. Instruction manual (2000).
Biorad www.bio-rad.com
5.
Aprender sobre cromatografa
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm
6.
Realizar una autoevaluacin sobre los fundamentos de la cromatografa
http://www4.ujaen.es/~acarrera/TBQ_HotPot/T3_TBQ_VF/T3_TBQ_VF.htm
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(4)
Cuantificacin de protenas por un mtodo colorimtrico.
La determinacin de protenas por el mtodo de Bradford es ampliamente usada ya que
es simple, rpida, barata y sensible. Es necesario construir una curva de calibracin para
determinar la concentracin de las muestras. El mtodo se basa en la unin especfica del
colorante azul de Coomassie brillante G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y
Phe de las protenas. El CBBG se une a los residuos de las protenas produciendo una
absorbancia mxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una absorbancia mxima
a 470 nm. A diferencia del mtodo de Lowry (otra tcnica colorimtrica para determinar
protenas) que es muy sensible a la composicin de la solucin que acompaa a las
protenas, el mtodo de Bradford slo es afectado por algunos detergentes. Una de las
desventajas de este mtodo es que el colorante CBBG se une fuertemente a las celdas de
cuarzo. Por esto se recomienda usar celdas de vidrio o de polipropileno. Al usar celdas de
polipropileno se facilita su limpieza con un poco de alcohol.
Referencias
Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.
Pgina web para consultar mtodos para determinar protenas:
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.html
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3. ACTIVIDAD ENZIMTICA
PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA
LACTATO DESHIDROGENASA DE MSCULO ESQUELTICO DE POLLO.
Introduccin
Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reaccin y no se
consumen o modifican durante sta. Sin su presencia muchas de las reacciones bioqumicas
celulares no podran proceder a la velocidad requerida o incluso no se llevaran a cabo. La
velocidad de reaccin en presencia de las enzimas se incrementa de 106 a 1012 veces con
respecto a la reaccin en ausencia de stas. Otra propiedad de las enzimas es su alto grado
de especificidad, es decir, solamente catalizan la reaccin en la que participa un sustrato
determinado (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas caractersticas
qumicas y geomtricas comunes (especificidad de grupo).
La enzima, al ser una protena, tiene una estructura geomtrica caracterstica y la porcin de
la enzima que especficamente une o reacciona con el sustrato se denomina centro
cataltico o sitio activo. Muchas enzimas catalizan las reacciones utilizando nicamente los
residuos de aminocidos de su sitio activo, pero para otras es indispensable que se unan a
un cofactor, que es un ion metlico como el Fe2+, Zn2+, Mo2+ para llevar a cabo la catlisis
Otras enzimas necesitan una coenzima, es decir una molcula orgnica con caractersticas
no proteicas, que generalmente se sintetiza a partir de vitaminas. La coenzima funciona
como un cosustrato, ya que se une transitoriamente al sitio activo de la enzima y se libera al
medio durante cada ciclo cataltico. ste es el caso de las deshidrogenasas, como la que
purificaste anteriormente y con la que trabajars en esta prctica, cuya coenzima es el NAD+.
Algunas coenzimas no se liberan durante el sitio cataltico y se unen fuertemente a la
enzima, ya sea por medio de enlaces covalentes o interacciones no covalentes, en este caso
se les da el nombre de grupo prosttico.
Diseo de un ensayo enzimtico
Durante el aislamiento y purificacin de una enzima es necesario realizar un ensayo para
determinar la cantidad y pureza de la misma, as como evaluar sus caractersticas cinticas,
es decir la velocidad con la que se lleva a cabo la reaccin en distintas condiciones. Para el
diseo de un ensayo enzimtico se requiere conocer la reaccin que se analiza, es decir: a)
cules son las especies que se requieren (sustrato, coenzimas, cofactores, entre otros); b) la
estequiometra de la reaccin completa; y c) los efectos del pH, temperatura y fuerza inica
sobre la actividad de la enzima.
Adicionalmente, se debe contar con un mtodo para identificar y monitorear el progreso de la
reaccin. Esto se puede llevar a cabo monitoreando los cambios fsicos, qumicos o
biolgicos que ocurren durante la conversin del sustrato a producto. Para determinar los
cambios en las concentraciones de sustrato o producto se pueden utilizar distintas tcnicas,
como la espectrofotometra, la fluorometra, la titulacin cido-base y el conteo radiactivo. La
eleccin de la tcnica de deteccin depende esencialmente de las caractersticas
estructurales del sustrato y/o producto, as como de la qumica de la reaccin (modificacin
del pH por efecto de la actividad de la enzima, reversibilidad de la reaccin, la influencia del o
los productos de la reaccin, entre otros).
21
Figura 3.1 Curva temporal de formacin de producto en una reaccin enzimtica. La acumulacin de producto
generalmente presenta tres fases. La fase 1 no dura ms de 1 segundo, la fase 2 corresponde a la fase de
velocidad inicial y la fase 3 en la que ya se empieza a acumular el producto y/o a acabar el sustrato.
En la segunda fase, denominada fase de velocidad inicial, la concentracin de producto se
incrementa linealmente conforme el tiempo transcurre (Figura 3.1). La velocidad inicial de
una reaccin ocurre en los primeros minutos de la reaccin; una relacin lineal que se
mantiene cuando el consumo de sustrato no va ms all del 5% de la concentracin inicial.
Esta fase es en la que se enfoca la mayor parte de los estudios cinticos y es la que
seguiremos en el experimento de curvas temporales de actividad de la lactato
deshidrogenasa. Por ltimo, la fase 3 se produce generalmente debido al decremento en la
concentracin de sustrato, aunque tambin puede ocurrir la desnaturalizacin de la enzima o
su inhibicin causada por la alta concentracin de producto de la reaccin. En esta fase la
concentracin de producto no cambia con respecto al tiempo.
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Lactato deshidrogenasa
La lactato deshidrogenasa o LDH es una L-lactato: NAD+ oxidoreductasa, y su clasificacin
es EC 1.1.1.27. Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la
regeneracin del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad fsica intensa,
cuando la tensin de oxgeno disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones
aerobias, la enzima cataliza de manera reversible la conversin de lactato a piruvato (Figura
3.2). Cuando disminuye el O2 celular o bien el pH es cercano a 7.0, la enzima cataliza la
reaccin reversa, es decir, el piruvato es convertido a lactato con la concomitante conversin
de NADH a NAD+. La regeneracin del NAD+ permite que el flujo de la va glucoltica
contine. Cuando la demanda de energa cesa o cuando se acumula una gran cantidad de
lactato, la actividad de la enzima, que cataliza la reaccin de piruvato a lactato, disminuye.
Investiga
A qu se refiere la cita EC 1.1.1.27?
Figura 3.2. Reaccin que cataliza la lactato deshidrogenasa. La reduccin del piruvato para formar lactato es
reversible y dependiente de la presencia de una coenzima.
La LDH es un tetrmero cuyas subunidades tienen un peso molecular de 35 kDa cada una.
Existen varios tipos de LDH, dependiendo del tipo de subunidades que las conformen. Hay
dos tipos de subunidades, la H que predomina en el corazn y la M que predomina en el
msculo y el hgado. Las subunidades se pueden asociar formando 5 tipos de tetrmeros con
estequiometras distintas: H4, H3M1, H2M2, H1M3 y M4. Todas estas tienen actividad de
LDH, pero tienen diferentes afinidades por el lactato o el piruvato. Las enzimas que catalizan
la misma reaccin pero difieren en su estructura son llamadas isoenzimas.
mecanismos para desarrollar nuevas herramientas moleculares, por ejemplo, para combatir
enfermedades en las que se conoce a la enzima que la produce. Tambin es usual medir la
actividad enzimtica con diferentes sustratos para entender su especificidad o bien, medir la
actividad de la enzima de diferentes tejidos u organismos para entender cmo las diferencias
en actividad estn relacionadas con la funcin y/o la fisiologa del organismo del que
proceden.
B
3
2
Figura 3.3 Efecto de la concentracin de enzima en una reaccin no catalizada y una catalizada por enzimas. A)
Reaccin no catalizada por enzimas, la formacin de producto depende proporcionalmente de la [S]. B) Curva de
saturacin de una enzima. La curva se ajust a la ecuacin michaeliana. Se muestran los parmetros cinticos
caractersticos de una enzima, Km y Vmax.
A pesar de que la curva del efecto de la concentracin de sustrato en la velocidad de la
enzima es compleja, existe una ecuacin matemtica que expresa la relacin que existe
entre las variables: la hiprbola cuadrtica o tambin denominada ecuacin de MichaelisMenten (ecuacin 1), llamada as debido al trabajo pionero de Michaelis y Menten y de
Bringgs y Haldane. La deduccin de la ecuacin se describe en el ANEXO I.
24
(1)
y m* x b
Puedes observar en la ecuacin que las formas lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten
son expresiones matemticas simples y son tiles para obtener los valores de Km y Vmax. Y
son ampliamente usados para evaluar o analizar el efecto de inhibidores sobre la actividad
enzimtica.
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Figura 3.5. Efecto de los inhibidores sobre los parmetros cinticos de una enzima.
26
Referencias
Bennett NG, Gutfreund H. 1973. The Kinetics of the interconversion of intermediates of the
reaction of pig muscle lactate dehydrogenase with oxidized nicotinamide-adenine dinucleotide
and lactate. Biochemistry Journal 135, 81-85.
Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135-190.
Localizacin QP514.2
Kopperschlger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases and clinical
significance of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49.
Lehninger, A.L. 2005. Principios de Bioqumica. 4 edicin. Editorial Omega. Barcelona. pp. 191-237.
Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin QP514.2
Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233. QH345
L43
Pardo-Vzquez JP. Cap 10. Cintica enzimtica. En Bioqumica de Laguna. El Manual Moderno, SA de
CV., 2002, pP185
Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2
Sitios recomendados para
1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax
http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la pgina pulsar la tecla
kinetics_model.xls, despus regresa a la pgina inicial y contesta las preguntas que se
te hacen.
http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm
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Las simplificaciones y suposiciones para obtener la curva matemtica que mejor se ajusta a
los datos experimentales fueron las siguientes:
1. Suponer que hay un complejo central (ES), esto es que ES se rompe directamente en
E + P.
v1=k1[S] [E]
v-1=k-1[ES]
B) La velocidad de disociacin
Paso 2. Formacin de productos que depende de:
A) La velocidad de formacin
B) La velocidad de disociacin
vp=kp[ES]
v-p=k-p[E] [P]
Pero para formar el producto debemos considerar que tan rpido se rompe el
complejo ES, quedando descrito en los dos siguientes pasos:
Paso 1. En la formacin del complejo ES debemos considerar:
[E]= [E]total-[ES]
V formacin ES = k1 [S] [E]
Figura A.1. Cambios en las concentraciones de las especies involucradas en la catlisis. En el estado
estacionario la concentracin del complejo ES se mantiene pequea y constante.
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En el modelo cintico del estado estacionario, hay un intervalo de tiempo durante la catlisis
enzimtica en el que la concentracin del complejo ES es constante (Figura A.1), por lo tanto
la velocidad de formacin del complejo ES es igual al de su disociacin:
Despejando [ES]
rearreglando
y sustituimos ES,
4. Por ltimo si se considera que la [S] >> [E] (Figura A.1) la interaccin de S con E para
formar ES no afecta significativamente la [S]. La enzima est saturada de sustrato y
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mob, los cuales incluyen un sitio oriT, pero carecen de otros genes necesarios para la
conjugacin, incluyendo los que codifican para la formacin del pili.
En relacin al plsmido F, existen cuatro tipos de cepas bacterianas:
Cepa F-. Clula bacteriana que no posee un plsmido F, y que acta como clula receptora
en la conjugacin.
Cepa F+. Clula bacteriana que posee un plsmido F independiente del cromosoma
bacteriano, acta como clula donadora en la conjugacin y transfiere al plsmido
F a la clula receptora (F-) transformndola en clula F+.
Cepa Hfr (High frequency of recombination). Bacteria que posee un plsmido F integrado a
su cromosoma. Las cepas Hfr tienen la capacidad de transferir porciones de su
cromosoma
(clula donadora) y por ello confieren alta frecuencia de
recombinacin. No transfieren el plsmido F, por lo que al trmino de la
conjugacin la clula receptora permanece como F-.
Cepa F. Clula bacteriana que posee un plsmido F extracromosmico, pero que antes
estuvo integrado al cromosoma y que se escindi llevando consigo genes
bacterianos. Acta como clula donadora en la conjugacin y transfiere el factor F
junto con los genes bacterianos, transformando a la clula receptora en una clula
F , la cual ser un diploide parcial o merocigoto. Esto quiere decir que tendr dos
copias de los genes bacterianos que estn presentes en el plsmido F . A ese tipo
de transferencia se le conoce como sex-duccin.
Una bacteria Hfr transfiere los genes bacterianos a una clula F- en un tiempo constante. Se
calcula que la transferencia de todo el cromosoma de Escherichia coli de una bacteria a otra
tarda aproximadamente 100 minutos. Esta caracterstica ha sido utilizada en el mapeo
gentico, ya que permite localizar un determinado marcador gentico (es decir, una
caracterstica determinada) en un tiempo dado.
En esta prctica se comprobar la conjugacin bacteriana mediante la transferencia de un
marcador gentico: la resistencia a la kanamicina. El marcador gentico de seleccin que se
utilizar para la cepa receptora ser la resistencia a la estreptomicina.
Referencias
Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach. 2nd ed. Chapman & Hall. USA. 1992. pp
467.
Lewin B. Genes V. Oxford University Press. USA. 1994. pp 1272.
Gentica General, Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el
opern lac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002.
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se debe aadir una secuencia de poli A en la porcin 3 del gen para que el RNAm pueda
ser traducido.
Los plsmidos poseen un inters singular en la Ingeniera Gentica por ser uno de los
vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite
introducir en una clula hospedera el fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener
mltiples copias); en esta clula hospedera el vector se replica y se expresa. La molcula
que resulta de la unin de un DNA vector con el DNA de inters (inserto) se denomina
molcula vector recombinante.
Figura 4.1. Vector de clonacin pET-24a. Se muestran algunas caractersticas del vector, como el sitio origen de
la transcripcin (ori), el sitio de clonacin mltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; f1
ori, origen de replicacin f1 y el sitio que servir para controlar la expresin del transgene una vez que sea
insertado en el sitio de clonacin mltiple, el sitio de unin al represor lac I. Los vectores usualmente presentan
ms de un origen de replicacin, Ori que es el que es usado para que la bacteria se replique, mientras que f1 ori
es el origen de replicacin usado por el fago F1 y es usado para producir DNA de cadena sencilla.
Para ser utilizado como vector de clonacin, un plsmido debe poseer al menos tres
caractersticas (Figura 4.1):
1)
2)
3)
Referencias
Tmmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences & 2005, John Wiley &
Sons, Ltd. www.els.net.
Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.745-773.
Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edicin, WH Freeman.
posiciones no simtricas del centro del palndrome y producen fragmentos con secuencias
complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos. Mientras que otras
enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de simetra, produciendo extremos
romos (Figura 4.2).
EcoRI
HindIII
HaeIII
Figura 4.2. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restriccin en una secuencia de DNA.
Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se
muestra y en el ltimo ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las
primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del gnero y especie de la bacteria de donde
se aisl y se escribe en itlicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de
Escherichia coli.
correcta y son utilizados cuando la funcionalidad de las protenas es crtica, aunque el costo
de estos sistemas es considerablemente ms alto y la tecnologa que se necesita es ms
complicada. Adicionalmente, la produccin de grandes cantidades de protenas, como
algunos productos teraputicos, se puede lograr tanto en plantas como en sistemas
animales.
Muchas compaas ofrecen una serie de diferentes vectores con capacidades de expresin
muy variadas, con o sin protenas de fusin que funcionan como etiquetas para la deteccin
y/o purificacin de la protena deseada, la presencia de marcadores selectivos de la cepa
transformante y promotores distintos.
Figura 4.3. Mecanismo de accin del IPTG en la expresin de protena mediada por el vector pET.
Los vectores de expresin como el pET son usados comnmente para la expresin de
protenas heterlogas en E. coli. En los sistemas pET, los plsmidos son clonados bajo las
seales de expresin fuerte del promotor del bacteriofago T7, quin controla la alta
expresin de la RNA polimerasa T7.
Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA
polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se estudiar con ms
detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora que para que
se exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresin de la protena de
inters, se tiene que introducir lactosa o un anlogo de sta, el ms utilizado es el
isopropil -D tiogalactosido (IPTG), anlogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como
un inductor artificial del opern de la lactosa (Fig. 4.3). El IPTG se une a la protena
represora, ocasionndole a la protena un cambio conformacional que le impide su funcin
biolgica de unirse al DNA. La actividad biolgica de la protena represora es unirse a una
secuencia de DNA denominada operador impidiendo en el caso del vector pET la
transcripcin del gen para la RNA polimerasa T7 y por tanto la transcripcin del transgene. El
efecto del IPTG de liberar de la represin del gen es denominado induccin, por lo que el
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IPTG es llamado inductor. El gen que codifica para la protena represora se encuentra
incluido en el vector, LacI, y su transcripcin ocurre a la par que todos los genes incluidos en
el vector (Fig. 4.9). As a pocas horas de induccin, la formacin del producto, es decir, de la
protena deseada, puede llegar a ser ms del 50% de la protena total en la clula.
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Figura 5.1. Componentes del opern de lactosa y su funcin. A. Genes que componen el opern de lactosa. B. Secuencia
de DNA en la que se encuentran traslapadas las secuencias del promotor con el operador (secuencia sombreada).C. En
ausencia de lactosa la protena represora se une al operador impidiendo la unin de la RNA polimerasa por lo que la
transcripcin de los genes estructurales no ocurre.
Cuando hay lactosa presente, la bacteria toma unas pocas molculas de sta y las convierte
en alolactosa que es capaz de unirse al represor, impidiendo que ste se pegue al operador.
La subsecuente unin de la RNA polimerasa al promotor ocasiona la transcripcin de los
genes estructurales y la posterior traduccin en las enzimas necesarias para la utilizacin de
la lactosa como fuente de carbono y energa. Cuando se termina la lactosa, el represor se
vuelve a unir al operador bloqueando la expresin de los genes estructurales.
La presencia o ausencia de la lactosa no es el nico factor que influye sobre la expresin del
opern de la lactosa. Si la clula tiene una fuente de glucosa suficiente para sus
requerimientos energticos, no necesita metabolizar lactosa an cuando est presente,
entonces lleva a cabo un proceso denominado represin catablica, que involucra a una
segunda protena reguladora, CAP (protena activadora de catabolito), y un segundo sitio
de unin, el sitio CAP, adyacente al promotor.
La CAP se une al sitio CAP slo en presencia de AMP cclico (AMPc), un nucletido
modificado derivado del ATP por la adenilatociclasa. La cantidad de AMPc en la clula
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