CARPETA DE BIOLOGA

PROFESOR:
DR.FRANKLIN
ARGUELLO
TEMA:
*ENDONUCLEASAS
*CLONACIN DEL ADN
*SONDAS
GRUPO 1 SEGUNDO
SEMESTRE
ALUMNO: JAVIER
AGUSTN LANEZ MITE

2014-2015
ENDONUCLEASAS
Las endonucleasas son enzimas que catalizan la ruptura de enlaces
fosfodister en diferentes regiones ubicadas en el interior de una cadena
polinucleotdica. Esto las diferencia de las exonucleasas, que catalizan la
escisin de enlaces fosfodister en los extremos de las cadenas.
Algunas endonucleasas, tales como la Desoxirribonucleasa I, cortan al
ADN en forma relativamente inespecfica (esto es sin consideraciones en
cuanto a la secuencia de bases), mientras que muchas, llamadas
tpicamente enzimas de restriccin, o endonucleasas de restriccin,
provocan rupturas nicamente en determinadas secuencias de
nucletidos muy especficas.
Tpicamente un sitio de restriccin es una secuencia palindrmica de
entre cuatro a seis nucletidos de extensin. La mayor parte de las
endonucleasas de restriccin escinden a la molcula de ADN bicatenario
en forma desigual, dejando extremos complementarios de cadena
simple. Estos extremos pueden luego reconectarse a travs de un
proceso de hibridacin, por lo que son denominados "extremos
adhesivos". Una vez apareados, los enlaces fosfodister de los
fragmentos pueden ser unidos por medio de una ADN ligasa.
Existen cientos de endonucleasas de restriccin conocidas, cada una de
las cuales ataca un sitio de restriccin diferente. Los extremos de ADN
escindidos por un misma endonucleasa de restriccin pueden ser
emparejados juntos sin importar el origen del ADN. Estas molculas de
ADN formadas por trozos de orgenes diferentes se denominan ADN
recombinante; es decir ADN formado por la unin de diferentes genes
para crear nuevas combinaciones. Las endonucleasas de restriccin
(enzimas de restriccin) se dividen en tres categoras, Tipo I, Tipo II, y
Tipo III, de acuerdo a su mecanismo de accin.

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN
Un enzima de restriccin (o endonucleasa de restriccin) es aquella que
puede reconocer una secuencia caracterstica de nucletidos dentro de
una molcula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado
sitio o diana de restriccin, o en un sitio no muy lejano a este. Los sitios
de restriccin cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son
reconocidos.
El mecanismo de corte de ADN se realiza a travs de la ruptura de dos
enlaces fosfodister en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos
de DNA. stos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o
Cohesivos/escalonados. Estos ltimos tienen tendencia a volver a unirse
de modo espontneo, ya que los extremos se pueden unir a otros
extremos coincidentes que pueda haber en la cercana (Apareamiento
de Watson & Crick).
Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras
enzimas llamadas ligasas.
El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbilogos
Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de
las endonucleasas de restriccin lo que condujo al desarrollo de la
tecnologa de ADN recombinante. El primer uso prctico de su trabajo
fue la manipulacin de la bacteria E. coli para producir insulina humana
para los diabticos.

Uno de los campos en los que las enzimas de restriccin han tenido
mayor implicacin ha sido el diagnstico de enfermedades genticas
relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones
puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si stas se producen
en un sitio de reconocimiento de la enzima de restriccin, al producirse
eliminarn o agregarn nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al
gen de una persona sana y una enferma se deberan observar distintas
cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.

CLONACIN DEL ADN

La estrategia que se emplea consiste en colocar un fragmento de ADN
portador del gen en cuestin dentro de una molcula de ADN
extracromosmico autorreplicante (por ejemplo un plsmido bacteriano),
acompaado de genes que permitan la seleccin de las molculas
hbridas, en el interior de una bacteria, que puede multiplicarse a gran
velocidad formando un clon (grupo de clulas con los mismos genes) y
permitir que la maquinaria de la bacteria transcriba y traduzca el
segmento de ADN que le hemos introducido.

Para ello se necesitan:

Vectores
de
clonacin:
son
pequeas
molculas
de
ADN
autorreplicantes. Deben tener, adems, sitios de rotura con enzimas de
restriccin y genes de resistencia a antibiticos, u otro gen que nos
resulte til para distinguir qu bacterias han incorporado el ADN que
queremos clonar y cules no. Pueden usarse como vectores plsmidos
bacterianos, partculas virales y cromosomas eucariticos de levadura
(YAC). Su empleo viene determinado por el tamao del fragmento que
se desea clonar y por la facilidad de expresin del ADN en un vector o en
otro. Si el vector se requiere como vector de expresin, debe tener
tambin un promotor fuerte para que haya transcripcin de las
secuencias insertadas. Entendemos por promotor la secuencia del gen
que induce a la fabricacin de la protena buscada. Para lograr la unin
del fragmento de ADN y el vector, se rompen ambas molculas con la
misma enzima de restriccin. Si sta genera extremos cohesivos, en
condiciones de reasociacin, ambas molculas tendern a juntarse. La
enzima ADN ligasa facilita la formacin del enlace fosfodister, que
asegura la continuidad en cada cadena del ADN hbrido formado.

Seleccin del ADN que se va a clonar. Puede ser un segmento de ADN de

secuencia conocida que contenga el gen de inters. En muchos casos,
cuando se trata de ADN de clulas eucariticas, la presencia de intrones
hace muy difcil que la bacteria pueda procesar el ARN antes de
traducirlo, ya que le falta la maquinaria enzimtica adecuada. En estos
casos resulta provechoso aislar el ARN mensajero que codifica a la
protena de inters, y hacer una copia de ADN del mismo mediante la
transcriptasa inversa. Esta copia se llama ADNc (ADN complementario),
no tiene intrones y expresa la protena correctamente dentro de
bacterias.
Introduccin de las molculas hbridas en el husped. Las molculas
hbridas generadas se introducen en bacterias o clulas de levadura
para su replicacin, previa permeabilizacin de las mismas por
tratamientos qumicos.
Seleccin de los clones con molculas hbridas. Los clones hbridos se
seleccionan por alguna propiedad que el investigador ha introducido en
las molculas, por ejemplo, resistencia a un antibitico o tras detectar
hibridacin positiva con oligonucletidos complementarios a las
secuencias de ADN exgeno.
Expresin de protenas de inters. La bacteria o el husped eucaritico
no distinguen el ADN extrao del propio, y la maquinaria celular
contina el programa gentico de replicacin, transcripcin y traduccin
de los genes que se han introducido. En algunos casos, se ha logrado
una expresin de una protena hasta el 1 por 100 del total de protenas
del husped. Utilizando tcnicas de ingeniera gentica, se puede lograr
que la bacteria secrete la protena al exterior de la bacteria. De este
modo se pueden conseguir rendimientos de protena extraordinarios en
procesos industriales.
Actualmente, el factor VIII (protena que requieren los hemoflicos), la
hormona de crecimiento, la insulina humana y algunas vacunas
antivirales se obtienen por este procedimiento.

VECTORES EUCARIOTICOS
El cromosoma artificial de levaduras o YAC (Yeast artificial chromosome)
forma parte de los vectores de clonacin de alta capacidad siendo, de
hecho, el de mayor capacidad (200 kb - 3.000 kb). Fueron descritos por
primera vez en 1983 por Murray y Szostack.
Es un vector que pretende imitar las caractersticas de un cromosoma
normal de una levadura (eucariota), portando un centrmero y
telmeros
terminales.
Esto
permite
clonar
en
levaduras
(microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un milln de
pares de bases o ms, al comportarse como un cromosoma propio de la
levadura.
Son utilizados en construccin de genotecas genmicas, siendo muy
extendido su uso en los primeros aos del Proyecto Genoma Humano.
Sin embargo, son ms inestables que otros vectores como BACs
(cromosoma artificial bacteriano), que han acabado imponindose.

TRANSFECCIN
La transfeccin consiste en la introduccin de material gentico externo
en clulas eucariotas mediante plsmidos, vectores vricos u otras
herramientas para la transferencia. El trmino transfeccin para
mtodos no virales se usa en referencia a clulas de mamfero, mientras
que el trmino transformacin se prefiere para describir las
transferencias no virales de material gentico en bacterias y clulas
eucariotas no animales como hongos, algas o plantas.
La transfeccin de clulas animales generalmente se lleva a cabo
abriendo poros o "agujeros" transitorios en la membrana plasmtica de
las clulas mediante electroporacin, para permitir el paso del material
gentico (como construcciones de DNA superenrollado o siRNA) aunque
pueden ser transfectadas incluso protenas (como anticuerpos, por
ejemplo). Adems de la electroporacin, se pueden utilizar otras
tcnicas para efectuar la transfeccin, como por ejemplo liposomas
producidos mediante la mezcla de lpidos catinicos con el material
gentico, que se fusionarn con la membrana plasmtica celular y
depositarn su carga adentro.
El significado original de "transfeccin" era "infeccin por
transformacin", es decir, introduccin de DNA o RNA desde un virus
procaritico bacterifago en las clulas, resultando en una infeccin. Al
tener el trmino transformacin otro sentido en biologa celular animal
(un cambio gentico que permite la propagacin durante largos periodos
de clulas en cultivo, o la adquisicin de propiedades tpicas de las
clulas cancergenas), el trmino transfeccin adquiri, para clulas
animales, su actual signifiado de cambio en las propiedades celulares
por la introduccin de material gentico.

MTODOS:

Hay varios mtodos para introducir DNA en una clula

eucariota. Se han usado muchos materiales como vehculos para la
transfeccin, divisibles en tres tipos: polmeros (catinicos), liposomas y
nanopartculas.
Uno de los mtodos ms baratos (y fiables) es la transfeccin mediante
fosfato de calcio, originalmente descubierta por F. L. Graham y A. J. van
der Eb en 1973. Una solucin salina tamponada con HEPES y que
contiene iones fosfato se combina con una solucin de cloruro de calcio
que contiene el DNA a transfectar. Cuando ambas se combinan, se forma
un precipitado fino formado por el calcio cargado positivamente y el
fosfato cargado negativamente, que el DNA en su superficie. Esta
suspensin se aade a las clulas que se quieren transfectar
(normalmente un cultivo celular en monocapa). Mediante un proceso no
comprendido completamente, las clulas toman parte del precipitado, y
junto con l, el DNA. Otros mtodos usan compuestos orgnicos
altamente ramificados, los llamados dendrmeros, para unir el DNA e
introducirlo en la clula. Un mtodo muy eficiente es la inclusin del
DNA en liposomas, pequeos cuerpos formados de una membrana en
cierto modo similar a la membrana plasmtica de la clula y que puede
fusionarse con la misma, liberando el DNA al interior celular. Con clulas
eucariotas, la transfeccin basada en la interaccin lpido-catin es la
ms comnmente utilizada, ya que son ms sensibles a este mtodo.
Otro mtodo es el uso de polmeros catinicos (o policationes) como
DEAE-dextrano o polietilenimina. El DNA, cargado negativamente, se
une al policatin y el complejo es endocitado por la clula.
Una aproximacin directa a la transfeccin es la biolstica o gene gun
(pistola gnica), en la que el DNA se une a una nanopartcula compuesta
de algn slido inerte, generalmente oro, que es "disparada"
directamente en el ncleo de la clula diana. El DNA puede tambin ser
introducido en las clulas usando un virus como vector. En estos casos,
la tcnica es llamada transduccin, y se dice que las clulas se
transducen. Otros mtodos de transfeccin son la nucleofeccin,
electroporacin o magnetofeccin.

SONDA MOLECULAR
Una sonda es un fragmento de ADN (o raramente ARN) de pequeo
tamao (normalmente entre 100 y 1000 bases) usado en biologa
molecular como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN
de secuencia complementaria parecida o igual.
En su uso, la sonda se une a la secuencia diana monocatenaria (ADN1c
ARN) mediante un mecanismo de hibridacin que forma una estructura
bicatenaria, una de las hebras pertenece a la sonda, y la otra a la
secuencia diana. Esta unin se establece porque tanto la sonda como la
diana tienen secuencias en parte o totalmente complementarias,
formndose pares de bases complementarias.
MARCAJE: Para visualizar las molculas diana se utiliza una sonda
marcada, bien radiactivamente, bien mediante marcaje inmunolgico.
Para el uso de ADN de doble cadena primeramente es necesario
desnaturalizarlo mediante calor o en condiciones de alta alcalinidad.
Esta sonda de cadena simple marcada se une a la diana; y los lugares de
unin se detectan porque los mtodos de marcaje dejan una seal
detectable mediante fotografa. En los mtodos ms avanzados se
utilizan marcajes mediante fluorescencia que emiten seales detectadas
mediante lser, como el utilizado en la PCR a tiempo real.
RADIACTIVIDAD
Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizado nucletidos que
tengan alguno de sus tomos con un istopo radiactivo, normalmente
32P, pero tambin es frecuente el uso de tritio.
SOUTHERN Y NORTHERN

Independientemente de la naturaleza de la sonda utilizada (ADN ARN),

las hibridaciones efectuadas sobre cidos nucleicos inmovilizados en
membranas o in situ, sern de tipo Southern cuando se use ADN como
diana a detectar y de tipo northern cuando la diana a detectar sea
mayoritariamente de ARN. La sonda molecular se utiliza para la
bsqueda de genes especficos, de tal forma que construye una
molecula que hace las veces de detector de genes

BIBLIOGRAFA
www.wikipedia.com
Biologa celular y molecular G. Karp