ELECTROFORESIS AVANZADA

Ref.ELECAVANZADA (4 prcticas)
1.OBJETIVO DEL EXPERIMENTO
El objetivo de este experimento es introducir a los alumnos en el conocimiento de la teora
electrofortica y familiarizarse con los procedimientos implicados en la electroforesis en gel de
agarosa para separar molculas biolgicas.
En este caso se utilizarn fragmentos de ADN reales, marcadores de peso molecular donde se
podr observar como los fragmentos de menor tamao migran ms rpidamente por el gel de
agarosa y ADN genmico que debido a su alto peso molecular migrar lentamente.
Se introducir tambin en las tcnicas de visualizacin de los fragmentos de ADN en el gel de
agarosa, para ello se utilizar un mtodo desarrollado por BioTed y que no es txico a
diferencia de los mtodos tradicionales utilizados (bromuro de etidio).
2. INTRODUCCION
La electroforesis en gel de agarosa es un procedimiento utilizado en varias reas de la
Biotecnologa, es un procedimiento analtico utilizado en laboratorios de investigacin,
biomdicos y forenses. De los existentes tipos de electroforesis, la electroforesis en gel de
agarosa es el mtodo ms comn y ms utilizado. Es un mtodo de separacin frecuentemente
utilizado para analizar fragmentos de ADN generados por enzimas de restriccin, PCR, etc , y
es un mtodo analtico conveniente para determinar su tamao en un rango de 500-30.000 pares
de bases. Tambin puede ser utilizado para separar otras biomolculas como colorantes, ARN y
protenas.
Existen algunos tipos de electroforesis en gel de agarosa pero la electroforesis horizontal es el
ms utilizado para separar molculas de ADN en agarosa. Otros tipos como la electroforesis
vertical se utiliza para separar protenas y utiliza geles de poliacrilamida.
El aparato de electroforesis horizontal es esencialmente una caja con electrodos en cada
extremo, estos electrodos son de platino ya que tiene una conductividad elctrica muy buena,
debido a que los electrodos de platino son caros y frgiles se debe tener cuidado cuando se
manejan equipos de electroforesis.
El medio de separacin es un gel de agarosa, la agarosa es un polisacrido derivado del agar.
Originario de las algas, la agarosa es altamente purificada para eliminar todas las impurezas. Se
extrae de la misma alga que se utiliza para obtener el agar utilizado en microbiologa y del
utilizado en alimentacin. Es una sustancia no txica pero no debe ser ingerido.
El gel se realiza disolviendo la agarosa en un tampn llevado a ebullicin. La solucin es luego
enfriada aproximadamente a 55C y se aade al molde para realizar el gel. Un peine con
pocillos es colocado en el gel para que forme los pocillos donde se sembrarn las muestras.
Despus que el gel ha solidificado, el gel se coloca en la unidad de electroforesis y se sumerge
con un tampn adecuado para llevar a cabo la electroforesis. La unidad dispone de un electrodo
positivo en un extremo y un electrodo negativo en el otro extremo. Las muestras se preparan
con un tampn de carga que contiene glicerol para darles densidad y de esta forma se
mantienen en el pocillo sin salirse. Las muestra se siembra en los pocillos con una micropipeta.

Una fuente de corriente es conectada al aparato de electroforesis y se genera una corriente

elctrica. Las molculas cargadas de la muestra entrarn en el gel a travs de la pared del
pocillo de siembra. Las molculas con una carga negativa migraran hacia el electrodo positivo
(nodo) mientras que las molculas con una carga positiva migrarn al electrodo negativo
(ctodo). El tampn sirve como conductor de la electricidad y controla el pH, lo cual es
importante para la estabilidad de las molculas biolgicas. Como el ADN tiene una carga
negativa a pH neutro migrar a travs del gel hacia el electrodo positivo durante la
electroforesis.
Si la electroforesis se realiza con muestras de colorantes que simulen fragmentos de ADN, la
migracin de varias molculas puede ser visualizada directamente en el gel durante la
electroforesis y no requiere una tincin posterior del gel. No obstante, las molculas pequeas
de colorante pueden ser susceptibles de difusin fuera del gel, de este modo se debe vigilar
cuando se produce la separacin completa de los colorantes.
El gel de agarosa contiene poros microscpicos que acta como un tamiz molecular separando
las molculas segn su carga, forma y tamao. Estas caractersticas junto con las condiciones
del tampn, concentracin del gel y voltaje, afectarn a la movilidad de las molculas en el gel.
La separacin ocurre porque las molculas ms pequeas pasan a travs de los poros del gel
ms fcilmente que las de mayor tamao. Si el tamao de 2 fragmentos son similares o
idnticos, migrarn juntos en el gel. Si el ADN genmico es digerido varias veces, habr un
rango amplio de fragmentos que producir un smear en el gel. Los fragmentos lineares de
ADN migrarn ms rpido a travs del gel.
Dos molculas con el mismo peso molecular y forma, migrar ms rpido la que mayor carga
tenga. Las molculas que se unan ms fuertemente a la agarosa migrarn ms lentamente.La
movilidad de las molculas durante la electroforesis tambin se puede ver influenciada por la
concentracin del gel de agarosa, a mayor concentracin de agarosa la electroforesis durar
ms.
Para que las molculas de ADN sean visibles en el gel de agarosa se requiere una tincin ya
que el ADN en s no tiene color. El mtodo ms comn de tincin para visualizar el ADN
utiliza bromuro de etidio debido a su elevada sensibilidad. El bromuro de etidio es un mutgeno
y debe ser manejado con mucho cuidado. Tambin se necesita para la visualizacin una fuente
de luz ultravioleta (transiluminador de UV). Actualmente existen otros colorantes, diferentes
empresas han desarrollado diferentes tipos de colorantes para aumentar la sensibilidad y con un
poder mutagnico muy inferior al bromuro de etidio.
En nuestro caso utilizaremos un mtodo NO TOXICO que nos permitir visualizar los
fragmentos de ADN de color azul, se podrn observar durante el proceso electrofortico
pero ser necesario una tincin posterior para poder observar todas las bandas.

3. COMPONENTES

Tampn de electrofresis
Agarosa
Micropipeta 20 microlitros
Rack de puntas
Microtubos de muestras
Probeta de 50 ml
DanaBlue 0.1 %
DanaBlue 0.02 %

1 litro
1.5 gr
1
1
16
1
400 l
125 ml

Para cualquier duda o consulta adicional, por favor , contacte con nosotros
bioted@arrakis.es

4. PRACTICA
4.1 PREPARACION GEL DE AGAROSA
A) Preparacin del molde
Coger el molde para hacer los geles y cerrar los extremos con los topes para que no se salga la
agarosa. Despus colocar el peine para formar los pocillos

B) Preparacin del gel de agarosa

1.b) Utilizar un vaso o erlenmeyer de 100 ml para preparar la solucin del gel:
2.b) Aadir 32 ml de Tampn de electroforesis + 0.30 gr de agarosa +80 l de DanaBlue
0.1 % (para ello cargar 4 veces con la micropipeta de 20 microlitros) Agitar la mezcla para
disolver los grumos de agarosa.
3.b) Calentar la mezcla para disolver la agarosa, el mtodo ms rpido es la utilizacin de un
microondas, tambin puede utilizarse un placa calefactora, en ambos casos, para que la agarosa
se disuelva se ha de llevar la solucin a ebullicin. La solucin final debe aparecer clara sin
partculas aparentes.
4.b) Enfriar la solucin de agarosa ms o menos a 55C (para acelerar el proceso se puede
enfriar colocando el envase debajo de un grifo de agua y agitar). Si se produce mucha
evaporacin del lquido, aadir tampn de electroforesis.

5.b) Aadir la solucin de agarosa al molde.

6.b) Permitir que el gel solidifique. Para acelerar el proceso se puede sembrar el gel en una
nevera. (si la electroforesis se realizar al da siguiente, conservar el gel a 4C).
C) Preparacin del gel para la electroforesis
1.c) Despus que el gel se ha solidificado con mucho cuidad sacar los topes.
2.c) Colocar el gel en la cmara de electroforesis correctamente orientada con los pocillos ms
cerca del polo negativo (color negro).

3.c) Llenar la cmara de electroforesis con 300 ml de Tampn de electroforesis. El tampn

de electroforesis se puede utilizar para 2 experimentos de electroforesis, una vez terminada la
electroforesis guardar este tampn utilizado en un envase diferente al suministrado para
utilizarlo en una nueva electroforesis.
4.c) Asegurarse que el gel est completamente cubierto de tampn.
5.c) Sacar el peine que ha formado los pocillos con mucho cuidado de no romper ningn
pocillo.
6.c) Proceder a la siembra del gel y llevar a cabo la electroforesis.

4.2 SIEMBRA DEL GEL Y ELECTROFORESIS

Nota: Si usted no esta familiarizado con la siembra de geles de agarosa, es recomendable que
practique la siembra antes de llevar a cabo el experimento, o llevar a cabo el experimento
completo antes de realizarlo con los alumnos.

A) Muestras de electroforesis
1.a) Se suministran 7 muestras diferentes presentadas en 7 tubitos cada uno de un color,
sembrar o cargar las muestras en el siguiente orden:

Pocillo
1
2
3
4

Muestra
Negro
Amarillo
Rojo
Azul

Descripcin
Marcador de peso molecular
ADN genmico
ADN genmico
Marcador de peso molecular

2.b) Sembrar 20 microlitros de cada muestra, utilizar para ello la micropipeta de volumen fijo
que se suministra con una punta de pipeta.

B) Llevar a cabo la electroforesis

1.b) Despus que se han sembrado las muestras, cuidadosamente colocar la cubierta del aparato
de electroforesis en los terminales de los electrodos.
2.b) Insertar la clavija del cable negro en la entrada de color negro de la fuente de corriente
(entrada negativa). Insertar la clavija del cable rojo en la entrada de color rojo de la fuente de
corriente (entrada positiva).

3.b) Configurar la fuente de corriente a 70 voltios de forma que la electroforesis se llevar a

cabo en unos 30 minutos.
4.b) Despus de 10 minutos empezar a observarse la separacin de los colorantes.

5.b) Despus de que la electroforesis ha terminado, apagar la fuente de corriente,

desconectar los cables y sacar la cubierta.
6.b) Colocar el gel en un transiluminador de luz blanca(si no se dispone, una hoja de papel
blanco tambin puede utilizarse). Para una correcta visualizacin de las bandas deber pasarse
al siguiente apartado que es la tincin del gel para visualizar todas las bandas correctamente.
4.3 TINCIN DEL GEL DE AGAROSA
a) Una vez se ha finalizado la electroforesis. Lavar el gel con agua destilada e incubar con la
solucin de DanaBlue 0.02 % durante 15 minutos, para ello utilizar un recipiente de plstico
que se capaz de recubrir completamente el gel con la solucin colorante. Esta solucin es
reutilizable una 10 veces ms o menos.
b) Lavar el gel con agua abundante para eliminar el exceso de colorante. En este primer lavado
colocar el recipiente con el gel debajo de un grifo de agua corriente y dejar caer el agua hasta
que el agua salga casi sin color azul.
c) Realizar varios lavados con agua en agitacin si es posible. Se observar como cada vez se
hacen ms visibles las bandas y desciende el color azul de fondo.
d) Colocar el gel en un transiluminador de luz blanca(si no se dispone, una hoja de papel blanco
tambin puede utilizarse).

5. RESULTADOS
M1

M2

M1

M2

M1: Marcador de peso molecular, en la figura anexa ver el tamao de los fragmentos de ADN
M2: Marcador de peso molecular, en la figura anexa ver el tamao de los fragmentos de ADN
1 y 2: ADN genmico

6. PREGUNTAS Y RESPUESTAS SOBRE LA PRACTICA

Una serie de preguntas se pueden realizar a los alumnos sobre la prctica:
1. Qu conclusin se puede sacar del experimento realizado? Que el ADN genmico
tiene un tamao de 20-25 Kb (25.000 pares de base) comparando a que altura se
encuentra respecto a los marcadores de peso molecular. Que el ADN genmico se
encuentra intacto, ya que aparece como una banda nica intacta, si estuviera degradado
se vera un smear todo ese pocillo hasta abajo se vera de color azul.
2. Qu es el ADN genmico? Es el ADN que se encuentra en el interior de nuestros
cromosomas y es donde est toda la informacin.
3. En base a qu la electroforesis de agarosa separa molculas? La electroforesis
separa las molculas en base a su tamao, carga y forma.
4. Explicar la migracin de acuerdo con la carga. Las molculas que tienen una carga
negativa migraran hacia el polo positivo; mientras que las molculas cargadas
positivamente migrarn hacia el polo negativo.
5. Qu sucedera si se utilizar agua destilada en lugar del Tampn de electroforesis
en la cmara de electroforesis o en la solucin del gel de agarosa? Como el agua
destilada no contiene iones esto reducir la conductividad del fluido y la movilidad de
las molculas a migrar en el gel. El tampn sirve como conductor de la electricidad y
controla el pH, lo cual es importante para la estabilidad de las molculas biolgicas.
6. El ADN hacia qu electrodo migrar? Como el ADN tiene una carga negativa a pH
neutro migrar a travs del gel hacia el electrodo positivo durante la electroforesis.