MICROBIOLOGA

DE ALIMENTOS
Resumen de las prcticas de
Microbiologa de Alimentos

1 Ingeniero Tcnico Agrcola

Industrias Agrarias y Alimentarias
CURSO 2004-2005

Profesora: Cristina Solano Goi

e-mail: cristina.solano@unavarra.es
Tfno. Contacto: Instituto de Agrobiotecnologa
948-168024

RECUENTO DE AEROBIOS MESFILOS

(ISO 4833, 2003)

10 g muestra
90 ml caldo peptona
Dilucin 10-1

Homogeneizar
(2 min Stomacher)

Filtrar y preparar diluciones seriadas

10-2

1 ml

10-3

1 ml

X2
Aadir PCA 15-20 ml, 45-50 C
Agitar homogeneizando

30 1 C
72 3 h

10-4

1 ml
Suspensin madre:
45 min a T amb
como mximo, antes
de aadir el medio

Recuento placas
Colonias 15-300

RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS EN PLACA

(ISO 7402, 1993)
10 g muestra
90 ml caldo peptona
Dilucin 10-1
Homogeneizar
(2 min Stomacher)

Filtrar y preparar diluciones seriadas

10-2

10-3

1 ml

10-4

1 ml

1 ml
Suspensin madre:
45 min a T amb
como mximo, antes
de aadir el medio

X2
Aadir VRBG 15-20 ml, 45-50 C
Agitar homogeneizando
Aadir doble capa

37 1 C
24 h

Recuento placas
Colonias tpicas 15-300

(colonias color violeta con

halo de precipitacin)

Confirmacin 5 colonias
pase a Agar nutritivo
Colonias
confirmadas
como
Enterobacterias

oxidasa
KIA + (fermentacin
glucosa)

37 1 C
24 h

de

37 1 C
24 h
Si es oxidasa
Se siembra un KIA

RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

(NF ISO 7954, 1988)

10 g muestra
90 ml caldo peptona
Dilucin 10-1

Homogeneizar
(2 min Stomacher)

Filtrar y preparar diluciones seriadas

10-2

1 ml

10-3

1 ml

X2
Aadir OGA 15-20 ml, 45-50 C
Agitar homogeneizando

25 1 C
5 das

10-4

1 ml
Suspensin madre:
15 min a T amb
como mximo, antes
de aadir el medio

Recuento placas
Colonias 15-300

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA

(NF ISO 4832, 1991)

10 g muestra
90 ml caldo peptona
Dilucin 10-1
Homogeneizar
(2 min Stomacher)

Filtrar y preparar diluciones seriadas

10-2

1 ml

10-3

1 ml

10-4

1 ml

X2
Aadir VRBL 15-20 ml, 45-50 C
Agitar homogeneizando
Aadir doble capa

37 1 C
24 h

Suspensin madre:
45 min a T amb
como mximo, antes
de aadir el medio

Recuento placas
Colonias tpicas 15-300

(colonias
color
violeta
rodeadas o no de halo de
precipitacin)

INVESTIGACIN DE Escherichia coli: PRESENCIA/AUSENCIA

10 g muestra
90 ml caldo peptona
Dilucin 10-1
Homogeneizar
(2 min Stomacher)

Filtrar a un tubo estril

10 ml de muestra
10 ml caldo EC (DC) con campana Durham
precalentado a 44 C
44 C
24-48 h
POSITIVO: Presencia de gas
en 1/10 parte de la campana
Confirmacin
Prueba del indol

NEGATIVO: Ausencia de gas

en 1/10 parte de la campana
AUSENCIA

0,1 ml
Caldo de triptona
44 C
24 h

POSITIVO: anillo rojo

PRESENCIA

Aadir 3 o 4 gotas del reactivo de Kovacs

NEGATIVO: no anillo rojo AUSENCIA

RECUENTO DE Staphylococcus coagulasa positivo EN PLACA

(ISO 6888, 1999)
10 g muestra
90 ml caldo peptona
Dilucin 10-1
Homogeneizar
(2 min Stomacher)

Filtrar y preparar diluciones seriadas

10-2

10-3

0,1 ml

0,1 ml

10-4

0,1 ml
Baird Parker

X2
Extender el inculo con perlas de vidrio estriles
37 1 C
24 + 24 h

CATALASA
Opcional

Placas 15-150 colonias tpicas y no

tpicas. Confirmacin: inocular tubos de
BHI con 3 colonias tpicas y 3 colonias
no tpicas
37 1 C
20-24 h

Coagulasa
0,1 ml de cultivo (BHI) + 0,3 ml plasma de conejo

+
37 1 C
20-24 h
Coagulasa
positivo

Dilucin 10-1
Homogeneizar
(2 min Stomacher)

0,1 ml

37 1 C
18 2 h

1 ml

RVS (10 ml)

MKTTn (10 ml)

41,5 1 C
24 3 h

37 1 C
24 3 h

BGA

XLD
M.K.

M.K.

37 1 C
18 2 h

R.V.

Colonias no tpicas

R.V.

Colonias tpicas

BGA: rosas y medio rosa

XLD: rojas con centro negro

AUSENCIA

Confirmacin
Pase de 5 colonias tpicas a
Agar Nutritivo
37 1 C
18 - 24 h

Serologa -

Reacciones
bioqumicas -

AISLAMIENTO

25 g muestra
225 ml agua peptona tamponada

ENRIQUECIMIENTO

PRE--ENRIQUECIMIENTO
PRE

INVESTIGACIN DE Salmonella
(NF EN ISO 6579, 2002)

Confirmacin
serolgica

Galera de
confirmacin API

Glu+, SH2+, ure-, indol-, lys+, -gal-,

Antgeno O,H+
PRESENCIA

PRE--ENRIQUECIMIENTO
PRE

INVESTIGACIN DE Listeria monocytogenes

(NF EN ISO 11290-1, 1997)
25 g muestra
225 ml caldo Fraser-demi
Dilucin 10-1

30 1 C
24 2 h
0,1 ml

Agar Palcam
Agar Oxford
37 1 C
24 + 24 h

Caldo Fraser (10 ml)

37 1 C
18 2 h

37 1 C
24 - 48 h

Agar Palcam
Colonias tpicas

Agar Oxford
Colonias tpicas

Verde grisceas, a veces con centro

negro y rodeadas de halo negro,
deprimidas en el centro (48h)

Pequeas, grisceas, rodeadas de halo

negro. A las 48 h tienen reflejos
verdosos y son deprimidas en el centro.

Confirmacin
5 colonias tpicas
Siembra en TSAY
37 1 C
18 - 24 h
Iluminacin de Henry+
Catalasa +
Bacilos Gram positivos

Listeria spp

37 1 C
18 - 24 h

Hemlisis+
Test de CAMP +
Ramnosa+
Xilosa-

Listeria
monocytogenes

AISLAMIENTO

ENRIQUECIMIENTO

Homogeneizar
(30 seg Stomacher)

RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS Y ESPORULADAS

10 g muestra
90 ml caldo peptona
Dilucin 10-1

Homogeneizar
(2 min Stomacher)

Filtrar y preparar una dilucin seriada

desde la dilucin 10-1

1 ml

10-2

10 MIN, 80 c
(destruccin de
formas vegetativas)

Preparar una
dilucin seriada

1 ml

dilucin 10-1 :
slo han resistido las esporas
Aadir PCA 15-20 ml, 45-50 C
Agitar homogeneizando

1 ml
PCA 15-20 ml, 45-50 C
Agitar homogeneizando

37 C
24 h
37 C
24 h
9Recuento placas
Colonias 30-300
9Tincin Gram/esporas

RECUENTO
FORMAS VEGETATIVAS

dilucin 10-2

1 ml
Schaedler 15-20 ml, 45-50 C
Agitar homogeneizando
Aadir doble capa

9Recuento placas
Colonias 30-300
9Tincin Gram/esporas

37 C, JARRA ANAEROBIOSIS
24 h
9Recuento placas
Colonias 30-300
9Tincin Gram/esporas

RECUENTO
ESPOROS AEROBIOS

RECUENTO
ESPOROS ANAEROBIOS

PREPARACIN DE YOGUR

5 ml leche pasteurizada

Inocular con el cultivo iniciador

(a partir de yogur comercial)
37 C
24 h
Yogur
FERMENTACIN
LCTICA

37 C
24 h
Leche lquida

PREPARACIN DE CERVEZA

Suspensin de harina de
malta al 5% en agua

Llenar hasta el borde.

Cerrar con tapn de rosca

75 C
1h
Activacin amilasas.
Hidrlisis del almidn a
glucosa y maltosa
121 C
10 min
Enfriar tubos
T ambiente
Inocular con

Saccharomyces
cerevisiae
T ambiente
3-7 das
Cerveza
FERMENTACIN
ALCOHLICA

ANLISIS DEL AIRE

37 C
24 h

Determinacin aerobios mesfilos

ambientales

Destapar placa PCA

durante 30 min.

ANLISIS DE MANIPULADORES
placa VRBG

Tomar muestra de la
nariz con hisopo estril
Pasar dedos sin
lavarse las manos

Pasar dedos despus de

lavarse las manos con un
desinfectante

37 C
24 h

Colonias de Enterobacteriaceae:
violetas con halo

placa AMS

37 C
24 h

Colonias de S. aureus: amarillas

ANLISIS DE SUPERFICIES
HISOPO

Humedecer hisopo estril

en la solucin salina

Restregar
Plantilla papel de
aluminio con abertura
de 9 cm2

Solucin salina

Introducir de nuevo el
hisopo en la solucin salina
15-30 min

Placa PCA

Placa VRBG

37 C
24 h

ufc/9 cm2
PLACAS RODAC

37 C
24 h

Presionar placa Rodac

sobre superficie
elegida

ufc/25 cm2