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las
protenas son liberadas de las clulas. El mtodo de eleccin depende del tejido de procedencia, as como
la localizacin de las protenas en la clula. Si la protena se localiza en el citosol, su liberacin slo
requiere la apertura de la clula por ruptura (lisis), es el mtodo ms sencillo y suave de efectuar. Ya
separada la protena de su entorno natural, debe de controlarse todas las fases del proceso de purificacin.
Existen diferentes mtodos de purificacin como por ejemplo la cromatografa de intercambio inico, la
cromatografa sobre papel, la cromatografa de afinidad, la cromatografa de resolucin elevada (HPLC), la
electroforesis, etc.
El Western Blot es un mtodo para identificar protenas en una mezcla compleja de protenas,
transfiriendo las protenas separadas mediante el peso molecular, de un medio gelificado a una membrana
de nitrocelulosa de unin de las protenas para su anlisis.
MATERIAL Y MTODOS.
Extraccin de protena
Determinacin de protenas
SOLUCIONES
Extraccin de Protenas
BUFFER DE LISIS Para 25 ml.
TRIS-HCl 50 mM
0.197 g
NaCl 120 mM
0.1753 g
IGEPAL 0.5 %
0.125 l y aforar
Ajustar pH 8.0 y agregar
NaF 100 mM
0.105 g
NaVO3 200M
0.006 g
Finalmente por 1 ml de buffer agregar 80 l de cocktail anti-proteasas (1 pastilla en 2 ml de agua)
Preparacin del Gel
Solucin Acrilamida-Bis
Solucin 1.5 M tris-HCl pH 8.8
Acrilamida
14.6 g
Tris-base
18.5 g
Bis-acrilamida
0.4 g
Agua desionizada
100 ml
Agua desionizada
50 ml
Ajustar a pH 8.8 con HCl almacenar a 4 C
SDS al 10 %
Solucin 0.5 M tris-HCl pH 6.8
SDS
10 g
Tris-base
6g
Agua desionizada
100 ml
Agua desionizadas
100 ml
almacenar a temperatura ambiente
Ajustar a pH 6.8 con HCl
almacenar a 4 C
Persulfato de Amonio al 10%
Persulfato de amonio 1g
Agua dest.
10 ml
(preparar slo lo necesario o guardar por 10 das a 4C)
Metanol absoluto.
TBS
2.42 g de Tris-HCl (20 mM)
8 g de NaCl (137 mM)
Ajustar el pH a 7.6
Aforar a 1 litro
Western Blot
TBS-Tween 20 0.05%
1.0 ml Tween 20 en 1000 ml de TBS.
Albmina 0.1%
0.4 g de albmina en 40 ml de TBS-Tween 20
Leche al 5 %
2 g de leche descremadaen 40 ml de TBSTween 20
DISEO EXPERIMENTAL
I.-Condiciones de cultivo y tratamiento de las clulas.
1. Se sembrarn 2.5 x 106 clulas en cajas de Petri de 6 cm 2 con medio Williams-completo, dejndolas
estabilizar por 24 horas.
2. Despus de este tiempo se lavaran las clulas con PBS. Posteriormente se cambiar el medio por uno
libre de SFB por 3-24 horas, pasado este tiempo se retirar el medio y se remplazar con medio sin SFB
junto con el reactivo para el tratamiento elegido (etanol, acetaldegdo, factores de crecimiento, etc.) y
tiempo de exposicin.
II.- Extraccin de Protenas
1. Las clulas se lavarn con PBS y se resuspendern en 250 l de buffer de lisis con inhibidores de
proteasas y se incubarn en hielo por 15 min.
2. Despus, las clulas
d) Posteriormente, preparar en otro vial la solucin para el gel concentrador (cuidado al agregar el
persulfato, ya que gelificar casi inmediatamente) y colocar el peine, dejar reposar de 10-15 min.
De Corrida
10 %
Agua desionizada
Concentrador
15 %
ml
4.02
2.34
Agua desionizada
ml
3.05
2.5
2.50
1.25
SDS 10 %
ml
0.1
0.1
SDS 10 %
50
Archilamida-Bis
ml
3.33
Archilamida-Bis
650
TEMED
l
10
10
TEMED
l
10
Persulfato de amonio l
50
50
Persulfato de amonio
25
Volumen total
10
10
Volumen total
ml
ml
e) Una vez que est listo el gel, se recomienda hacer una corrida previa a 200 volts. durante 30 min,
antes de agregar las muestras de protenas para correr la electroforesis.
V.-Preparacin de las Protenas.
1. Colocar en cada eppendorf de 200 l (tantos segn las muestras que se tengan) 10 l de buffer de
muestra. Considerar adems la muestra del estndar de protenas que llevar 10 l.
2. Agregar el volumen de la protena equivalente a 50 g .
3. Hervir en B.M. a 95oC por 5 min.
4. Hacer lo mismo con 8-10 l del estndar de P.M. con 20 l de buffer de muestra.
5. Cargar la muestra, con jeringa de 50 l, y lavarla con agua caliente en cada toma de muestra.
VI.- Electroforesis
1. Una ves hechos los geles, quitar los peines a cada uno, con mucho cuidado para mantener los carriles
de los pozos.
2. Colocar los geles en la cmara de electroforesis y llenar con el Buffer de Corrida en el interior y exterior
de los geles.
3. Cargar cada una de las muestras en los carriles del gel, para ello utilizando la jerina Hamilton, cuidar
de lavarla cada que se coloque una nueva muestra.
4.
lavar la
Realizarlo en cuarto obscuro. Colocar la membrana en la placa reveladora cubierta con plstico y
exponerla a una pelcula Kodak por 30 seg.
Revelar y fijar la pelcula, Dependiendo de la intensidad de las bandas, exponer ms o menos tiempo.
Nota: Para normalizar la cantidad de protena de las bandas, se estripea la membrana (se lava de las
protenas adheridas) y se repiten los puntos del 3 al 7 del paso VIII, pero utilizando como anticuerpo
primario a la Actina y como anticuerpo secundario
Solucin de estripeado
Tris-Base 50 mM pH=2.0
X.- Estripeado.
Lavar la membrana con Tris-Base pH= 2.0, por 2 h, cambiando la solucin cada 30 min.
Nota: considerar siempre en que est hecho el anticuerpo primario para usar correctamente el
anticuerpo secundario.
Anticuerpo Primario
policlonal de conejo, Sta. Cruz.
Actina goat polyclonal
Anticuerpo Secundario
Goat anti-rabbit, Sta. Cruz
Mouse anti-goat