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Guion de Practicas 08 09
Guion de Practicas 08 09
Guion de Practicas 08 09
Asignatura: BIOQUMICA
1 Licenciado en Qumica 08/09
Universidad de Huelva
FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES
Departamento de Qumica y Ciencia de los Materiales, Prof. JC Vlchez Martn
rea de Bioqumica y Biologa Molecular
INDICE
INTRODUCCIN
1. CULTIVO EN MEDIO SOLIDO DEL ALGA VERDE UNICELULAR C. reinhardtii.
1.1 Preparacin del medio de cultivo lquido (para 2007/2008) con acetato y luz. 1 por
mesa cada (8 parejas). Hacer curva de crecimiento.
1.2 Preparacin del medio de cultivo slido. 1 por mesa cada (8 parejas).
1.3 Inoculacin e incubacin del cultivo
1.4 Observacin de las colonias
2. DETERMINACIN DE LOS COMPONENTES CELULARES EN HOJAS DE
ESPINACA
2.1. Determinacin del contenido en agua de la hoja de espinaca
2.2. Determinacin del contenido en clorofila
-2.2.A. Extraccin de pigmentos en hoja de espinaca
-2.2.B. Determinacin de clorofila
2.3. Determinacin del contenido en protenas y carbohidratos
-2.3.A. Preparacin de un extracto crudo de hojas de espinaca
-2.3.B. Determinacin del contenido en protenas
-2.3.C. Determinacin del contenido en carbohidratos
3. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA FOSTATASA ALCALINA
DE INTESTINO DE TERNERA
3.1. Variacin de la actividad enzimtica con la concentracin
3.2. Clculo de la Km y la Vmax
INTRODUCCIN
El objetivo de estas prcticas es el de familiarizar al alumno de primer curso en el
conocimiento y manejo de algunas tcnicas y aparatos de uso comn en un laboratorio
de Bioqumica. Se ha diseado para ello, utilizando organismos fotosintticos como
material biolgico de partida, un esquema de prcticas que permitir al alumno realizar
determinaciones cuantitativas de molculas biolgicas mediante tcnicas
colorimtricas, aprendiendo a usar un espectrofotmetro UV/Vis. Conocer, de esta
forma, cmo realizar una recta de calibrado e interpolar los resultados obtenidos.
Aprender asimismo a preparar un ensayo de actividad enzimtica, y a evaluarla
mediante determinaciones espectrofotomtricas. Tendr tambin que preparar un
cultivo de clulas de Chlamydomonas reinardtii en medio slido
CMO HACER REGRESIONES LINEALES
Durante el desarrollo de las prcticas obtendremos series de datos experimentales.
Para hacer clculos habr que asignar datos al eje de las x y datos al eje de las y y
representamos grficamente unos frente a otros obteniendo puntos entre los que
existe una relacin lineal y que pueden unirse mediante una lnea recta.
El problema general consiste en encontrar la recta que mejor se ajusta a los puntos
obtenidos. Este ajuste puede dejarse a la iniciativa de cada experimentador (mtodo
libre de ajuste de curvas) o definir la curva de ajuste mejor como aquella que tiene la
propiedad de que la suma de los cuadrados de las desviaciones de la curva real
respecto a los valores experimentales es mnima. Una recta con esa propiedad se
llama recta de mnimos cuadrados siendo la ecuacin de la recta:
y ax b
Y X 2 X XY
n X X
2
n XY X Y
n X
KPO4H2....................................................................................... 0.36 g
K2PO4H....................................................................................0.72 g
Disolucin de MgSO47H2O (61 mg/ml)................................0.5ml
Disolucin de CaCl22 H2O (20 mg/ml)................................0.5 ml
Trazas Hutner.............................................................................2.5 ml
NH4Cl...............................................................................................0.25g
- Completar hasta aproximadamente 0.5 L con agua destilada
- Agitar hasta disolucin
1.2 Preparacin del medio de cultivo slido. 1 por mesa cada (8 parejas).
-
1.3.
- Tomar con el asa estril una pequea cantidad de clulas de la placa con clulas que
se nos entregue.
- Extender suavemente (para evitar la rotura del agar) sobre la placa con agar
haciendo uno o varios zig-zag con el asa para aislar colonias.
- Toda la operacin de inoculacin debe hacerse con rapidez, sin hablar o respirar
sobre la placa para evitar contaminacin con bacterias u otros microorganismos.
- Entregar al profesor que colocara en la cmara de cultivo donde se incubar durante
48h
1.4. Observacin de las colonias
Transcurrido el tiempo de incubacin aparecern colonias de la microalga C. reinhardtii
de color verde y probablemente otras colonias de bacterias u hongos del ambiente.
% H 2 O A 100
Hh
- Centrifugar el filtrado durante 5 min para separar los restos de arena y partculas en
suspensin.
2.2.B. Determinacin de clorofila
- Tomar 1 ml del sobrenadante en un tubo de ensayo
- Aadir 4 ml de acetona y medir la absorbancia a 652 nm.
- Para la determinacin de clorofila, utilizar el valor de 34.5 mg-1.ml.cm-1 como
coeficiente de extincin (), y referir el resultado a peso hmedo de hojas:
Clorofila ( mg / ml extracto)
A652
x 5ml
34.5
Vextracto (ml )
peso de hojas ( gr )
Blanco
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Agua
0.8
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
Bradfod
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
Agitar suavemente
Esperar 15 min al desarrollo del color
Medir la absorbancia a 595 nm frente al blanco anotando los valores obtenidos en
la hoja de resultados.
Representar grficamente absorbancia a 595 nm frente a la concentracin de
protena patrn en cada tubo, calculada segn la ecuacin
Concentracin de proteina patrn 0.02 mg / ml x
M1
M2
M3
Muestra
0.1
0.2
0.3
Agua
0.7
0.6
0.5
Bradford
0.2
0.2
0.2
M1, M2 y M3 son tres diluciones distintas de la misma muestra. Esto suele hacerse con
las muestras problema por si alguna se saliera de escala
-
ml de extracto
g de hoja
En cualquier caso se promedian los valores de protena obtenidos para M1, M2, M3.
Expresar la cantidad de protena (peso) referida a peso hmedo de hoja y al volumen
de extracto crudo.
-2.3.C. Determinacin del contenido en carbohidratos
Se toman 1 ml del extracto crudo y se diluyen hasta 10 ml con agua destilada. Esta
dilucin ser la muestra de la cual tomaremos distintos volmenes, tal y como se indica
en la siguiente tabla:
PRECAUCIN: Agitar tras la adicin del reactivo de fenol
Volumen (ml)
M1
M2
M3
Muestra
0.2
0.4
0.6
Agua
0.5
0.3
0.1
Fenol
0.3
0.3
0.3
2.5
2.5
2.5
AGITAR
Sulfrico
A485
Vtotal
x
10
87.5 Vmuestra
ml de extracto
g de hojas
INTRODUCCION
La funcin fisiolgica de esta enzima es hidrolizar el enlace fosfoster de
compuestos orgnicos fosforilados, liberando el grupo fosfato terminal:
R O Pi R OH + Pi
La fosfatasa alcalina recibe este nombre porque presenta su mxima actividad
a pH alcalino.
Como sustrato de esta enzima utilizaremos un compuesto artificial, el pnitrofenil-fosfato (NPP), que puede ser reconocido por la enzima puesto que posee una
estructura orgnica a la que se encuentra unido el grupo fosfato:
O 2N
Pi
Fosfatasa alcalina
O 2N
Nitofenol fostato
(NPP)
OH
Pi
Nitofenol
(NP)
Concentracinde de NP (mM )
A410
A410
Vensayo ( ml )
micromoles NP
t (min) v enzima
Actividad enzimtica (U / ml )
A410 Vensayio
1
Venzima t ( min)
0,5
1,5
2,5
2,5
1,5
0,5
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
15
15
15
15
15
15
15
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
10
V NPPo
Vtotal
11
HOJA DE RESULTADOS
PAREJA N ................
APELLIDOS Y NOMBRE
................................................................................................
APELLIDOS Y NOMBRE
................................................................................................
TITULACIN
...............................................................................................
GRUPO TEORA..................................................................
GRUPO PRCTICAS............................................................
Aadir todas las hojas adicionales con grficas, o comentarios adicionales que
consideres necesarias
12
13
RESULTADO
Contenido en agua (CA) = .........................gr
Contenido en agua=.......................................%
2.2. Determinacin del contenido en clorofila
DATOS
Peso de Hojas = ............................. grs
Volumen de extracto = ................... ml
Absorbancia (652nm) = ..................
CLCULOS
RESULTADO
Contenido en clorofila = ................................ mg Chl / ml extr
Contenido en clorofila = ................................ mg Chl / gr hoja
2.3. Determinacin del contenido en protenas de hojas de espinaca
DATOS
Peso de hojas = ............................................. grs
Volumen de extracto crudo = ....................ml
14
vol. (ml)
Blanco
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Agua
0.8
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
Bradford
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
BSA patrn
Abs. 595 nm
Hacer la representacin grfica en papel milimetrado:
X , Conc. Prot (mg/ml)
Y, A595
y = .................................
M1
M2
M3
Muestra
0.1
0.2
0.3
Agua
0.7
0.6
0.5
Bradford
0.2
0.2
0.2
Abs. 595 nm
CLCULOS
15
M1
M2
M3
Muestra
0.2
0.4
0.6
Agua
0.5
0.3
0.1
Fenol
0.3
0.3
0.3
AGITAR
Sulfrico
2.5
2.5
2.5
Abs. 485 nm
CLCULOS
REACTIVOS
0,5
1,5
2,5
Tampn
Tris-HCl
0.1M
pH=8
Fosfatasa Alcalina (mL)
2,5
1,5
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
15
15
15
15
15
15
15
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
ABSORBANCIA 410nm
2.- Clculo de la concentracin de NPP en cada uno de los tubos de ensayo
[NPP] (mg/ml)
3.- Clculo de los valores de actividad para cada uno de los tubos de ensayo con
distintas concentraciones de NPP (sustrato) siendo:
Vensayo = volumen total de la reaccin = ... .mL
Venzima = volumen de preparacin enzimtica = .. mL
t = tiempo de incubacin = ............ min
B
U/mL
17
18
Valor de Vmax
Valor de la Km
Pendiente .........................
Valor de Km
19