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Sisntesis Pla
Sisntesis Pla
Araya-Cloutier et al.
Diciembre de 2010
Sntesis de cido lctico
1. INTRODUCCIN
Aproximadamente 3,5 billones de toneladas de desechos de la agricultura son
producidos por ao en el mundo [1]. Estos desechos representan un desafo ambiental y tienen
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altos costos de disposicin [2]. La pia (Ananas comosus) es el segundo producto agrcola en
importancia exportable de Costa Rica [3]. Los desechos de la industrializacin de la pia
constituyen hasta el 65% del fruto [4], de manera que existen grandes volmenes de desechos
que podran ser aprovechados de formas alternativas. La utilizacin de los residuos de pia
para la produccin biotecnolgica de cido lctico es una opcin interesante para reducir el
costo de produccin de este producto qumico y, a la vez, permite dar valor agregado a un
desecho agroindustrial, que presenta un alto contenido de carbohidratos fermentables [5]. El
cido lctico es uno de los compuestos qumicos con mayor demanda a nivel mundial (130150 mil TM/ao) por tener gran aplicabilidad en la industria alimentaria, qumica y
farmacutica [1]. El inters en la produccin biotecnolgica de cido lctico ha incrementado
debido a las nuevas tendencias ambientalistas. Por un lado, ofrece una alternativa a la
contaminacin causada por las industrias qumicas al utilizar recursos renovables para su
produccin [6]; y por otro, puede ser utilizado como materia prima para la produccin de
plsticos biodegradables [7]. El cido polilctico es un polmero biodegradable derivado del
cido lctico que se produce a partir de fuentes 100% renovables. Este polmero presenta
muchas propiedades iguales o incluso mejores que algunos plsticos tradicionales, por lo que
representa una alternativa como material de empaque bastante innovadora y prometedora [8].
En el presente estudio se evalu la fermentacin de un sustrato a base de un desecho
de una industria procesadora de pia para la produccin de cido lctico. Sin embargo, en
fermentaciones de sustratos a base de banano y melazas con L. casei sub. rhamnosus, la
utilizacin de la sacarosa ha sido incompleta [9], mientras que la hidrlisis enzimtica con
invertasa ha mejorado el crecimiento celular y la produccin de cido lctico [10]. De manera
que se estudi tambin el efecto de la hidrlisis enzimtica con invertasa del medio de cultivo
simultnea a la fermentacin, sobre el proceso de produccin de cido lctico.
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1. Microorganismo y preparacin del cultivo bacteriano. El microorganismo
utilizado en este estudio fue Lactobacillus casei subespecie rhamnosus ATCC 11443, bacteria
lctica homofermentativa, obtenida de Hansen (Horsholm, Dinamarca). La bacteria
liofilizada se activ a 37C por 18 h en 5 mL de caldo De Man Rogosa Sharpe (MRS). El
cultivo madre se prepar tomando 1 mL del cultivo y enriqueciendo en 100 mL de caldo MRS
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por 24 h a 37C. El inculo se prepar transfiriendo 1,00 mL del cultivo madre a 100 mL de
caldo MRS e incubando durante 18 horas a 37C, para inocular el sustrato a base de pia con
0,5% (v/v) del cultivo de L. casei.
2.2. Enzima. La enzima utilizada para la hidrlisis del medio de fermentacin fue
Invertase (E.C. 3.2.1.26), obtenida de Novozymes (Lund, Suiza). La determinacin de la
actividad de la enzima invertasa se midi agregando 0,5 mL de una solucin enzimtica al
0,01% (m/v) a 5 mL de una solucin de sacarosa al 5,4% (en buffer de acetato 0,1 M, pH 4,5)
e incubando a 35C por 10 minutos, tomando muestras cada minuto. Al finalizar el periodo de
incubacin la enzima se inactiv a 85C por 10 minutos. La glucosa residual, producto de la
hidrlisis de la sacarosa, se cuantific mediante el mtodo colorimtrico descrito por Trinder
[11]. La actividad enzimtica obtenida fue 36.800 UE/g de enzima; en donde una unidad
enzimtica (UE) se defini como los miligramos de glucosa producidos por minuto, bajo las
condiciones experimentales usadas.
2.3. Materia prima. La materia prima utilizada fue desecho de pulpa de pia (Ananas
comosus), obtenido de la planta Florida Products (Heredia, Costa Rica). Este desecho
primeramente se prens para obtener jugo y posteriormente se someti a tratamiento trmico
(75C/5 min) para su estabilizacin.
2.4. Preparacin del medio de cultivo. El medio bsico de fermentacin consisti de:
jugo de pia (80% v/v en agua), con una concentracin de azcares iniciales de 77 g/L,
enriquecido con extracto de levadura (5 g/L), sulfato de magnesio hepta-hidratado (0,60 g/L),
sulfato de manganeso monohidratado (0,03 g/L), acetato de sodio (1 g/L), bifosfato de potasio
(0,5 g/L) y monofosfato de potasio (0,5 g/L) [12, 13]. El medio de cultivo se esteriliz en una
autoclave a 121C, 20 psi (1,36 atm.) por 15 minutos. Las sales de fosfatos se esterilizaron en
un erlenmeyer por aparte y se adicionaron al sustrato ya estril para evitar la precipitacin de
las mismas por reacciones con el resto de sales. El volumen de sustrato utilizado en todas las
fermentaciones fue de 2,0 L.
2.5. Fermentaciones y toma de muestras. Las fermentaciones se llevaron a cabo en
biorreactores Bioflo 110 New Brunswick mediante un sistema como se describe en la Figura 1.
El sustrato a base de pia se calent a 35C y se inocul con 20 mL del cultivo de
L.casei preparado como se describi anteriormente, para iniciar la fermentacin. Para evaluar
el efecto de de la hidrlisis enzimtica, se inyectaron 2,5 mL de una solucin de invertasa al
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se inyect 20 L de muestra utilizando H2SO4 0,005 mol/L como fase mvil, flujo isocrtico
de 0,9 mL/min, temperatura 35C, longitud de onda de 210 nm y presin 90 kgf/cm2 (87,11
atm).
2.7. Anlisis estadstico. Utilizando el programa estadstico de JUMP 4, se realiz una
prueba t de student para determinar la existencia de diferencias significativas (p < 0,05) entre
los dos tratamientos evaluados utilizando la productividad total (PT) y mxima (Pmax), el
rendimiento (R), azcares consumidos (AC), concentracin final de acido lctico (AL), tiempo
de fermentacin (TF) y tiempo de fase lag (LAG), como variables respuesta.
El clculo de los parmetros de eficiencia se presenta en las ecuaciones 1 a 5:
PT (g/h) =
(1)
Pmax (g/L*h) =
(2)
R (%m/m) =
(3)
AC (%) =
(4)
AL (g/L) =
(5)
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sacarosa fue prcticamente nulo; la bacteria no entr en una segunda fase de adaptacin para
consumir este azcar, dando como resultado en una concentracin residual de 15 g/L de
sacarosa en el medio de cultivo. El microorganismo no logr consumir toda la sacarosa
presente (slo un 23%) an despus de 50 horas de haber iniciado la fermentacin. Este
resultado fue el mismo obtenido por Nancib et al. [15], en la fermentacin de jugo de dtil
donde L.casei sub. rhamnosus consumi la glucosa y fructosa paralelamente mientras que la
sacarosa no fue metabolizada; y por Chan-Blanco et al. [9], que obtuvo slo un 27% de
consumo de sacarosa presente en un medio enriquecido a base de pur de banano con L. casei,
al trmino de 70 horas de fermentacin. Este resultado no es favorable si se piensa en la
utilizacin del cido lctico en un proceso de sntesis de cido polilctico ya que la calidad de
la materia prima es uno de los factores determinantes. La presencia de sacarosa aunque sea en
niveles muy bajos, puede provocar la caramelizacin impidiendo el desarrollo de la reaccin
de polimerizacin [16].
En este caso, se alcanz una concentracin de cido lctico de 64 g/L (127 g) despus
de 35 horas de fermentacin, con un periodo de fase lag de aproximadamente 11 horas.
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observar como la concentracin inicial de glucosa y fructosa es mayor (35 g/L en promedio)
por la inversin de la sacarosa, en comparacin con el medio control (30 g/L en promedio).
En este caso se logr alcanzar una concentracin mxima de 75 g/L (150 g) de cido lctico
en un tiempo de fermentacin de 40 horas, y la bacteria se adapt ms rpido al medio con
nicamente azcares simples al reducir el tiempo de fase lag de 11 a 7 horas. Dado que la
concentracin de azcares fermentables es mayor por la hidrlisis de la sacarosa, el tiempo de
fermentacin aument aproximadamente 5 horas. Sin embargo, la hidrlisis de la sacarosa
simultnea a la fermentacin permiti producir un 15% ms de cido lctico, en comparacin
con la fermentacin del medio sin hidrlisis adems de eliminar la sacarosa la cual es
interferencia en el proceso de polimerizacin [16].
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rendimiento de produccin de cido lctico de 60 a 91% mediante la inversin del medio con
invertasa. Adems, la concentracin de cido lctico alcanzada en el medio a base de pia fue
significativamente mayor (p < 0,05) con el tratamiento con hidrlisis enzimtica, producto del
consumo total de los azcares presentes en el medio de cultivo.
En cuanto a las productividades, el tratamiento con invertasa provoc una disminucin
de estos parmetros. La productividad mxima fue significativamente mayor (p < 0,05) para
el medio sin hidrlisis (5,5 g/L.h) que para el medio hidrolizado (3,9 g/L.h). Generalmente
una concentracin mayor de azcares simples en el medio puede afectar la actividad
enzimtica del microorganismo, segn el fenmeno conocido como inhibicin por sustrato
[18], lo que provoca una reduccin en la velocidad mxima de produccin de cido. De
acuerdo a Siebold et al. [19], L.casei sub. rhamnosus experimenta inhibicin por sustrato a
partir de 26 g/L de glucosa en el medio, de manera que en la pia con 77 g/L de azcares
totales, es muy probable que haya experimentado este efecto.
La productividad total de la bacteria tambin disminuy significativamente (p < 0,05)
(vase la Tabla 1) por el efecto del aumento del tiempo de fermentacin derivado de una
mayor concentracin inicial de azcares fermentables. A pesar de este resultado, una
concentracin mayor de cido lctico en el medio es preferible, sobre todo en procesos
industriales, ya que el producto requiere un proceso de concentracin menor, abaratando el
costo de purificacin posterior [17].
El tiempo total de fermentacin (tiempo en el que la produccin de cido lctico se
detiene) fue significativamente mayor para el medio con tratamiento con invertasa (40 horas)
mientras que la fase lag fue significativamente menor (7 horas), en comparacin con el medio
sin hidrlisis (35 y 11 horas, respectivamente). Esto refleja que L.casei se adapta ms rpido a
un medio ms simple con slo glucosa y fructosa como sustrato, pero la fermentacin de
dicho medio se prolonga ms porque el porcentaje de consumo de azcares es mayor.
Tambin hay que considerar que el tiempo real de fermentacin del medio sin hidrlisis es
mucho mayor de 50 horas; sin embargo, este dato no se conoce porque no se dio el tiempo
suficiente para que la bacteria consumiera la sacarosa presente. Por lo que, considerando este
aspecto, el tiempo de fermentacin con el tratamiento enzimtico de 40 horas sera menor que
el tiempo del medio sin hidrlisis.
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Probabilidad2
Control
84 2
98 1
0,0005*
64 3
75 3
0,0063*
79 2
99,9 0,5
0,0001*
5,4 0,4
4,3 0,1
0,0070*
5,5 0,3
3,9 0,1
0,0005*
34,7 0,7
11,2 0,9
40 2
7,3 0,7
0,0027*
0,0023*
Los resultados se expresan como el promedio de tres repeticiones con sus respectivos intervalos de confianza
( = 0,05). 2(*) Indica que existe diferencia significativa (p < 0,05) entre los tratamientos.
4. CONCLUSIONES
El desecho de pia utilizado representa un buen sustrato para la produccin de cido
lctico por fermentacin, por su alto contenido de azcares fermentables. Sin embargo, para
que L.casei sub. rhamnosus logre utilizar eficientemente todo el sustrato presente en el medio
a base de jugo de pia, en un tiempo prudencial, es preferible la hidrlisis enzimtica de la
sacarosa al comenzar el proceso de fermentacin. Esto permite aumentar el rendimiento,
reducir el nivel de nutrientes residuales y por lo tanto reducir el costo de produccin de
obtener cido lctico puro; aspectos deseables para un proceso de elaboracin del polmero
cido polilctico. Por supuesto, es importante hacer el estudio econmico y considerar el
costo que conlleva hacer este tratamiento enzimtico en el costo total del proceso.
Agradecimientos. Este trabajo de investigacin fue posible gracias al apoyo financiero
del Consejo Nacional de Rectores (CONARE). Tambin agradecemos a la empresa Trisan de
Costa Rica por facilitarnos la enzima Invertase de Novozyme.
BIBLIOGRAFA
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