Bioqumica Experimental

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Santa Rita Cruz Arroyo.

ANTECEDENTES.
El grado de ionizacin del agua es una propiedad reversible, se describe mediante una
constante de equilibrio, al llevarse a cabo se obtiene un in hidrgeno (protn) y un in
hidroxilo.
+

H2O H + OH

Cuando se disuelven en agua cidos dbiles, aportan H por ionizacin; las bases consumen
+
H al protonarse. El pH de la solucin es la concentracin total de in hidrgeno y se puede
medir experimentalmente. Para determinar el estado de ionizacin de los solutos en agua se
debe determinar la constante de equilibrio. Aunque el producto de disociacin del agua es
+
normalmente conocido como H , los protones libres no existen en disolucin, stos iones
+
hidrgenos son hidratados rpidamente a iones hidronio (H3O ).
La disociacin de protones es instantnea debido a los puentes de hidrgeno que se forman
entre las molculas de agua. Existe un movimiento de los iones hidronio e hidroxilo en el
campo elctrico, esto debido al salto de protones, causando un movimiento neto de un protn a
+
una gran distancia en un tiempo muy corto. Por la rpida movilidad del H y del OH (pero
en direccin opuesta), las reacciones cido-base en las disoluciones acuosas son en general
rpidas. La importancia de lo anterior radica en las reacciones de transferencia de protn
biolgicas.
El grado de ionizacin del agua en trminos cuantitativos est determinado por constante de
equilibrio (Keq), misma que se ha definido en funcin de la concentracin de los reactivos [A y
B] y de los productos [C y D].
Keq =

[C] [D]
[A][B]

La unidad de concentracin que se utiliza en el clculo del Keq es la molaridad. La constante

de equilibrio es fija para cada reaccin qumica a una temperatura dada, define la composicin
de la mezcla final, independiente de las cantidades iniciales de reactivos y productos. Por lo
tanto Keq se puede calcular si se conocen las concentraciones en el equilibrio de todos los
reactivos y productos.
La constante de equilibrio para la ionizacin reversible del agua es:
+

Keq =

[H ] [OH ]
[H2O]
El resultado de sta se denomina producto inico del agua.
+

Una solucin est a un pH neutro cuando hay concentraciones idnticas de H y OH a este

+
pH se puede calcular la concentracin del H y OH a partir del producto inico del agua:
+

+ 2

Kw = [H ] [OH ] = [H ]
+

-14

[H ] = Kw = 1 x 10
+

-7

[H ] = [OH ] = 10
+

-7

-7

Siempre que [H ] sea mayor que 1 x 10 , [OH ] ser menor que 1 x 10 , y viceversa.
+
Cuando
la [H ] es muy alta como en una solucin de cido clorhdrico, [OH ] ser muy

37

pequea. A partir del producto inico del agua se puede calcular [H ] si conocemos [OH
] o viceversa
Escala de pH.

Su base la constituye el producto inico del agua, es una forma indicada de designar la
+
+
concentracin de H , en una solucin acuosa de 1.0 M de H y 1.0 M de OH . Se define pH
de la siguiente manera: logaritmo negativo de la concentracin del in hidrgeno:
pH = log

1 = -log [H ]
+
[H ]

Las soluciones que tienen un pH superior a 7 son alcalinas o bsicas; la concentracin de

+
OH es mayor que la de H , las soluciones inferiores a pH 7 son cidas.
La escala de pH es logartmica no aritmtica, es decir cuando entre dos soluciones hay una
+
diferencia de 1 unidad de pH, esto significa que una solucin tiene una concentracin de H
diez veces mayor a la otra.

pH

[H+]

0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

10 0

[OH+]

Moles X Litro

CIDO

NEUTRO

ALCALINO

10 -1
10 -2
10 -3
10 -4
10 -5
10 -6
10 -7
10 -8
10 -9
10 -10
10 -11
10 -12
10 -13
10 -14

10 -14
10 -13
10 -12
10 -11
10 -10
10 -9
10 -8
10 -7
10 -6
10 -5
10 -4
10 -3
10 -2
10 -1
10 0

La medicin aproximada del pH de una solucin acuosa, se puede realizar experimentalmente

mediante colores indicadores como: tornasol, fenolftalena y rojo fenol su actividad se debe a
los cambios de color cuando el protn de la molcula del colorante se disocia. Se puede
realizar tambin mediante un elctrodo de vidrio permitiendo una mayor precisin, el
potencimetro amplifica la seal del electrodo de vidrio y se compara con la seal generada
por una solucin de un pH conocido con exactitud.
Breviario clnico: El pH sanguneo y de orina nos permiten ser un elemento auxiliar de
diagnstico en enfermedades como diabetes (al presentar acidosis pH inferior a 7.4); en otros
padecimentos suele presentarse un signo contrario denominado alcalosis
cidos y bases dbiles.
Los cidos se definen como donadores de protones y las bases como aceptores de protones.
Existen cidos fuertes como son el clorhdrico, sulfrico y ntrico, stos estn completamente
ionizados en soluciones acuosas diluidas y las bases fuertes como el hidrxido de sodio y
de potasio comparten la misma caracterstica de ionizacin en soluciones acuosas.
El
trmino cido y base dbil se refiere a los que no estn totalmente ionizados al disolverse en
agua, su importancia biolgica radica en el metabolismo y la regulacin del mismo. Un par
cido-base conjugado lo forman un donador de protn y su correspondiente aceptor,

38

ejemplo de ello es el cido actico (CH3COOH) como donador de protones y el anin acetato
(CH3COO ) como aceptor de protones.
+

CH3COOH H + CH3COO
HA
Keq

= Ka

H + A
= [H

] [A ]
[HA]

Los cidos pierden su protn en una solucin acuosa, si ste es ms fuerte, mayor es su
tendencia a perderlo. La constante de equilibrio (Keq) se define como la tendencia de
cualquier cido (HA) a perder un protn y formar su base conjugada (A ).
Constante de disociacin o ionizacin (Ka) , es as como ms frecuentemente se denomina
a las constantes de equilibrio de las reacciones de ionizacin. Los cidos fuertes tienen una Ka
alta, y la de los dbiles es ms baja.
Existen compuestos monoprticos (slo ceden un protn) como el cido actico; diprticos
(ceden dos protones) como la glicina y tripticos (ceden tres protones) como el cido
fosfrico. Sus reacciones de disociacin tienen lugar en un gradiene de pH, para cada una de
stas reacciones existe su constante de equilibrio o disociacin (Ka) y su pKa
(algoritmo
negativo) es anlogo al pH.
pKa = log

1 = -log Ka
Ka

Cuando es ms fuerte la tendencia a disociar un protn, ms fuerte es un cido y menor su

pKa
Titulacin.
Para determinar la cantidad de una cido en una solucin dada, se titula un volumen
determinado de cido con una solucin base fuerte (hidrxido de sodio NaOH), de la cual
conocemos su concentracin, sta base se va a ir agregando en pequeas porciones hasta
lograr
neutralizar el cido, de va determinando mediante un colorante indicador o un
potencimetro, es decir se calcul la concentracin del cido a partir del volumen y la
concentracin del NaOH agregado.
Al principio del procedimiento, el cido actico (sin haber agregado cantidad alguna de NaOH)
ya est ligeramente ionizado. Despus de ir incorporando en pequeas cantidades NaOH, el
+
OH agregado se va a combinar con el H libre en la solucin para formar H2O, para lograr un
+
equilibrio. Despus de que se elimina H libre, el HAc (cido) se disocia ms para satisfacer
su propia constante de equilibrio. En el punto medio de la valoracin, en el que
se ha
agregado exactamente 0.5 equivalentes de NaOH, se ha disociado la mitad del cido actico
original de modo que la concentracin
del donador de protones (HAc) es igual a la del
aceptor de protones (Ac ), en este punto medio existe una relacin importante: el pH de la
solucin es igual al pKa del cido actico.
Continuando con la titulacin, adicionando ms cantidad de
NaOH, el cido actico seguir
disocindose y se convertir en acetato. El punto final estar situado alrededor de un pH 7.0,
entonces el cido actico habr perdido todos sus protones, donndolos al OH , para formar
H2O y acetato. Hay en toda la titulacin una existencia compartida de equilibrios, cada una
cumpliendo con su constante de equilibrio.
Tampones biolgicos
La importancia del procedimiento de titulacin, radica al evaluar el comportamiento grfico de
un cido dbil, porque muestra que ste y su anin, un par cido base-conjugado pueden
actuar como tampones.
Los organismos multicelulares mantienen un pH citoslico especfico y constante, que permite
la opitimizacin de su funcionamiento, los fludos extracelulares
tambin deben estar
equilibrados y regulados, la constancia de pH se consigue mediante tampones biolgicos.

39

Tampn biolgico: mezclas de cidos dbiles y bases conjugadas, sistemas acuosos,

resisten cambios en su pH cuando se aaden cantidades pequeas de cidos o bases. Como
se explic anteriormente en el apartado de Titulacin, una mezcla de igual concentracin de
cido actico y de in acetato, en el punto medio de su curva, cuando pH = pKa, es un
sistema tampn.
Breviario clnico: La principal funcin de la hemoglobina es transportar oxgeno desde los
pulmones a los tejidos, una pequea disminucin del pH de los tejidos debido a la produccin
de dixido de carbono y de hidrogeniones como resultado de la activa respiracin hstica,
facilita la descarga del oxgeno cuando y donde se requiere. La descarga de oxgeno va
acompaada de la incorporacin de protones por parte de la hemoglobina, con lo que
simultneamente ayuda a tamponar el sistema.

Ecuacin Henderson-Hasselbalch.
Para comprender la accin de los tampones y el equilibrio cido-base en las reacciones
fisiolgicas, debemos comprender la ecuacin de Henderson-Hasselbalch, es una forma
ms sencilla de la expresin de la constante de disociacin de un cido.
+
Para el caso de una disociacin de un cido dbil HA en H y A , la ecuacin de HendersonHasselbach se deduce as:
Ka

= [H

] [A ]
[H A]

1. Se despeja [H ]

[H ] = Ka

= [HA]
-

[A ]

2. Tomando el logaritmo negativo en ambos miembros:

+

-log [H ] = -log Ka - log [HA]

[A ]
+
3. Sustituyendo -log [H ] por -log Ka por pKa
pH = pKa - log [HA]
[A ]
-

4. Invirtiendo ahora - log (HA)/ (A ), lo que implica cambiar su signo, se obtiene la ecuacin
de Henderson-Hasselbalch :
-

pH = pKa + log [A ]
[HA]

5. Se enuncia en forma general:

pH = pKa + log [aceptor de protones]
[donador de protones]
Esta se ajusta a la curva de valoracin de todos los cidos dbiles.
Muestra que el pKa de un cido dbil es igual al pH de la solucin en el punto medio de su
valoracin. Es decir [HA] = [A ] y de ah:
pH = pKa + log 1.0 = pKa + 0 = pKa

40

La ecuacin de Herdenson- Hasselbalch permite 3 cosas importantes:

1. Calcular el pKa
protones.

a partir del pH y la relacin molar entre donador y aceptor de

2. Calcular el pH a partir del

protones.

pKa

y la relacin molar entre donador y aceptor de

3. Calcular la relacin molar entre donador y aceptor de protones, conocidos el pH y el

pKa

Ejemplo para la utilizacin de la ecuacin de Henderson-Hasselbalch.

Calcular el pKa del cido lctico, si su concentracin en forma libre es de 0.010 M y la

concentracin de lactato es de 0.087 M, con un pH de 4.80.
pH = pKa + log

pKa = pH - log

[lactato]
[cido lctico]

[lactato]
[cido lctico]

= 4.80 log

0.087
0.010

= 4.80 log 8.7

= 4.80 0.94
= 3.86

PROTOCOLO.
Para la realizacin de la segunda prctica de laboratorio de la asignatura de Bioqumica,
Titulacin cido-Base es importante el conocimiento de las medidas de seguridad requeridas
antes, durante y despus de su realizacin.

La bata en el laboratorio es imprescindible para evitar deterioros en la ropa por

quemaduras, manchas, etc. Deber ir siempre abrochada.
Las quemaduras por cidos o bases concentrados se tratan lavando la zona
afectada con agua durante 3-4 minutos, pudindose aplicar despus una
disolucin diluida de bicarbonato sdico o cido actico, respectivamente.
No deben olerse directamente los vapores desprendidos
No fumar ni comer en el laboratorio.
No introducir pipetas, varillas de vidrio ni cualquier otro objeto en los frascos de los
reactivos, porque se contaminan.
No depositar en ningn caso papeles o productos slidos a las tarjas.
Una vez terminada la prctica deje el lugar ocupado perfectamente limpio.
Antes de abandonar el laboratorio, compruebe que el agua y el gas estn
completamente cerrados.
Al abandonar el laboratorio se lavarn las manos.

41

HIPTESIS.

Si el cido actico es una cido dbil entonces su constante de disociacin es muy

alta.

Si el cido actico no es un cido dbil entonces su constante de disociacin no es

muy alta.

Si el punto medio de la titulacin del cido actico se logra al haber aadido .5

equivalentes de hidrxido de sodio (NaOH) entonces se ha disociado la mitad de
ste por lo tanto la concentracin del donador de protones es igual a la del aceptor
de protones.

Si el punto medio de la titulacin del cido actico no se logra al haber aadido 0.5
equivalentes de NaOH entonces no se ha disociado la mitad de ste, por lo tanto la
concentracin del donador de protones no es igual a la del aceptor de protones.

Si el par cido-base conjugado como cido actico-acetato tienden a resistir un

cambio en el pH cuando se aaden cantidades pequeas de la base logrando el
restablecimiento de su equilibrio de disociacin, entonces el par cido acticoacetato acta como sistema tampn.

Si el par cido-base conjugado como cido actico-acetato no tienden a resistir un

cambio en el pH cuando se aaden cantidades pequeas de la base logrando el
restablecimiento de su equilibrio de disociacin, entonces el par cido acticoacetato no acta como sistema tampn.

DISCUSION.
En la prctica las disoluciones tampn generalmente consisten en una mezcla de un cido o
base dbil y su sal, ejemplo de esto es el cido actico y el acetato sdico que a decir de la
nomenclatura de Brnsted y Lowry es una mezcla de un cido y base dbiles conjugados.
-

En esta disolucin del cido dbil que se representa como (HA) y de su sal (A ), los iones
hidrgeno aadidos son neutralizados por los aniones de la sal, la cual va a actuar por lo tanto
como una base dbil y a la inversa, los iones hidroxilo (OH) que se fueron aadiendo
gradualmente resultan eliminados por neutralizacin del cido. De todo lo anterior resulta claro
que la capacidad de tamponamiento de una determinado cido y su base conjugada ser
mxima cuando sus concentraciones sean iguales, esto es, cuando el pH es igual al pKa del
cido, reportado en la literatura que el cumplimiento de esta situacin es a un pKa igual a 4.76
del cido actico.
La capacidad de tamponamiento depender de la concentracin total, as como de la relacin
entre el cido y la sal, es decir cuanto mayor sea la concentracin total, mayor ser la
capacidad de tamponamiento. La concentracin usual del cido y de la sal en las disoluciones
-3
tampn se ha reportando que se ubica en el orden de 0.5-0.20 molXdm y generalmente la
mezcla posee una capacidad de tamponamiento aceptable dentro del rango pH = pKa +1.
Existen criterios acerca de las amortiguadores o tampones adecuados para que stos puedan
o no ser utilizados como parte de un procedimiento en la investigacin bioqumica, se citan a
continuacin:
- Deben poseer la adecuada capacidad de tamponamiento en al gama de pH
requirido (6.0 a 8.0)
- Deben ser asequibles con una alto grado de pureza.
- Deben ser muy solubles en el agua e impermeables a las membranas
biolgicas.
- Deben ser enzimtica e hidrolitcamente estables.

42

Su pH debe ser minmamente influenciable por su concentracin, por su

temperatura y por la composicin inica o efecto salino del medio.
No deben ser txicos ni inhibidores biolgicos.
Sus complejos con los cationes deben ser solubles.
No deben absorber luz de las regiones visibles y ultravioletas.

Es importante el reconocimiento de que no todas las sustancias amortiguadores o los

tampones, cumplen con estas condiciones, los fostatos, precipitan los cationes polivalentes y
actan como metabolitos o inhibidores en algunos sistemas; el Tris suele ser txico o ejerce
tambin acciones inhibitorias. El HEPES y el PIPES actualmente satisfacen las condiciones
requeridas.
La ionizacin de los cidos y bases dbiles es de una importancia crucial en bioqumica,
debido que la mayora de los procesos relevantes van a tener lugar en una intervalo de pH de
6.5 y 8.0 que algunos autores llaman margen fisiolgico. El par cido actico-acetato
bibliogrficamente ha reportado su equilibrio de disociacin en un pH de 7.0, logrando
situarse, entonces en el llamado margen fisiolgico.
La importancia de saber aplicar correctamente la ecuacin Henderson-Hasselbalch es que nos
permite obtener la relacin de proporcionalidad entre la base conjugada/cido no disociado con
el pH y el pKa definiendo as el comportamiento de los cidos dbiles y bases conjugadas.
En el desarrollo de la prctica es importante observar que la curva par el HCl es muy
diferente a las observadas en los cidos dbiles., las curvas de la mayora de los cidos
dbiles tienen formas muy similares, como era de esperarse por la ecuacin, su diferencia est
en que se encuentran a distintos niveles en la escala de pH, la posicin de la escala ocupada
por la curva de cido dado est determinada por el valor del pKa del cido, como el pK de un
cido representa el pH de una solucin que contiene sal y cido en concentraciones iguales,
es evidente que pK representa el pH al cual el cido esta a la mitad de su titulacin.
La mayor parte de la curva de titulacin de un cido dbil se extiende por un intervalo de 4+
unidades de pH. Si una cido tiene un valor de pK 6 se titular poco a poco por debajo de pH 4
y estar titulado hasta la mitad a pH 6 y se habr convertido en sal o base a un pH de 8 o por
encima de l; pero si un cido tiene un pK de 10 empieza a formar una sal a un pH cercano a
8 est titulado a la mitad en un pH 10 y se convertir en sal a un pH de 12.
Las curvas de titulacin de los cidos dbiles o tambin en la literatura denominadas curvas de
amortiguadores se interrumpen completamente cerca de ambos extremos y son relativamente
planas en las secciones centrales.
Decimos que una solucin esta mal titulada cuando las concentraciones de base y cido son
muy diferentes y bien amortiguadas o tituladas cundo sus concentraciones se acercan en su
valor, por lo anterior podemos darnos cuenta al observar nuestra curva de titulacin y escoger
las concentraciones de base y cido que tendrn buena capacidad amortiguadora.
La importancia del uso de indicadores que cambian de color alrededor de pH 4.5 puede usarse
cuando se trata de un cido fuerte como el HCl porque ste, esta convertido en base a ese pH,
no as en el caso del cido actico porque esta solucin esta fuertemente amortiguada y el
cambio del indicador es gradual a causa del cambio lento en el pH, por lo que no puede
definirse con exactitud un punto final de titulacin. Experimentalmente esto lo pudimos
comprobar en el desarrollo de la prctica al aadir gradualmente NaOH y registrar los cambios
observados en el viraje del color del indicador y sus correspondencia inmediata con el pH
tambin registrado.
Las curvas de titulacin que se llevan a cabo como base del procedimiento experimental de
sta prctica muestran que el cambio de pH con la adicin de un cido o una base es ms
gradual en el margen cercano al pKa del cido, este es el fundamente para la preparacin de
las soluciones amortiguadoras. Las curvas de titulacin son reversibles de ah que si
tomramos la solucin final, a un pH alto y empezamos a aadir un cido fuerte como el HCl se
traza la misma curva pero en sentido opuesto, ese es su fundamento.

43

MATERIAL DIDCTICO.

PII. TITULACIN CIDO-BASE

BIBLIOGRAFA.

Williams L. Byron. Keit Wilson.

Principios y tcnicas de Bioqumica
Experimental. Ediciones Omega. Barcelona. 1989.

Nelson L.D. Cox M.M. Claudi M.C. Lehninger. Principios de Bioqumica. Ediciones
Omega. Barcelona. 2001.

Mathews K. C. Bioqumica. 3a.ed. Pearson Educacin. Madrid. 2002.

Staunton West. Bioqumica Mdica. 4a.ed. Interamericana. Mxico. 1996.

CUESTIONARIO.
1. Iones hidrgeno e iones hidroxilo, son productos de ionizacin del?
a)cidos b) Bases c) cidos y bases dbiles d) cidos y bases fuertes e) agua
2. Se define en funcin de la concentracin de los reactivos y de los productos?
a)Ionizacin b) pH c) constante de equilibrio d) titulacin e) pKa
3. Representa el logaritmo negativo de concentracin del in hidrgeno?
a) pka b) Kw c) Keq d) pH e) ionizacin
4. Un donador de protn y su correspondiente aceptor forman?
a) par cido-base conjugado b) cido c) base d) cidos y bases dbiles
e) cidos y bases fuertes.
5. Las constantes de equilibrio de ionizacin se denominan frecuentemente?
a) Keq b) pKa c) pH d) constante de disociacin e) ionizacin
6. En la titulacin del CH3COOH, su pKa es de?
a) 3.76
b) 5.76
c) 4.67
d) 4.76
e) 3.67
7. El pKa es anlogo al ?
a) Kw
b) Keq
c) Ka d) pH e) Ka
8. Son sistemas acuosos que tienden a resistir cambios en su pH?
a) cidos b) bases d) par cido-base e) tampones f) cidos y bases fuertes
9. De acuerdo a la respuesta anterior, ejemplo de ellos son?
a) cido actico
b) sistema del fosfato y bicarbonato
c) cidos y bases fuertes
d) el plasma sanguneo e) ventilacin pulmonar
10. En la prctica de titulacin cido-base, el azul de bromotimol, es un ejemplo de?
a) solucin cida b) solucin bsica
c) solucin indicadora de pH
d) amortiguador
e) bases fuerte
11. Nos permite calcular que el pKa de una cido dbil es igual al pH de la solucin
en el punto medio de su valoracin
a) pH b) Keq c) Kw d) log Ka e) ecuacin de Herderson-Hasselbalch
12. Muestra grficamente el pKa de un cido dbil.
a) escala de pH b) salto de protones c) sistema de tamponamiento d) ionizacin
e) curvas de titulacin

44

MATERIAL DIDCTICO.

1/11

TITULACIN CIDO-BASE

2/11

INTRODUCCIN

Un par cido-base conjugado lo forman un donador de

protn y su correspondiente aceptor, ejemplo de ello es el
cido actico (CH3COOH) como donador de protones y el
anin acetato ( CH3COO-) como aceptor de protones.
CH3COOH ? H+ + CH3COOHA
Keq

H+ + A-

+
= [H ]

[A-]
[HA]

45

= Ka

3/11
Titulacin.
Para determinar la cantidad de un cido en una
solucin dada, se titula un volumen determinado
de cido con una solucin base fuerte (hidrxido
de sodio NaOH), de la cual conocemos su
concentracin, sta base se va a ir agregando en
pequeas porciones hasta su totalidad y lograr
neutralizar el cido, de va determinando mediante
un colorante indicador o un potencimetro, es
decir se calcul la concentracin del cido a
partir del volumen y la concentracin del NaOH
agregado.

4/11

Tampn biolgico: mezclas de cidos

dbiles y bases conjugadas, sistemas
acuosos, resisten cambios en su pH cuando
se aaden cantidades pequeas de cidos o
bases. Como se explic anteriormente en el
apartado de Titulacin, una mezcla de igual
concentracin de cido actico y de in
acetato, en el punto medio de su curva,
cuando pH = pKa, es un sistema tampn.

46

5/11

TITULACIN CIDO-BASE
OBJETIVO:
Realizar una curva de
titulacin de un cido fuerte y
una base dbil
6/11

MATERIAL POR EQUIPO

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7/11
SOLUCIONES

O.1 M
O.1 M

CIDO ACTICO
GLICINA

O.1 M DE NaOH
CIDO CLORHDRICO ?
AZUL DE BROMOTIMOL 1%

48

10/11

DATOS
ACIDO CLORHDRICO

pH

NaOH ml

ACIDO ACTICO

Color

pH

49

NaOH ml

Color

11/11

GRAFICAR RESULTADOS

50