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Nm.

EneroFebrerode2009

InformacionessobreAnlisisMicrobiolgicosporPCR

La extraccin y purificacin del ADN para el anlisis por PCR.

Mitos y realidades
De los tres pasos Introduccin
En PCR, el cido desoxirribonucleico (ADN) es
crticos que comel analito. Por tanto, una buena muestra impliponen el anlisis de ca siempre un correcto proceso de obtencin de
esta molcula a partir de material biolgico.
patgenos por
La extraccin de ADN consta de una etapa de
PCR, la extraccin lisis, que consiste en romper las estructuras
confinan el citoplasma y liberar al medio su
de ADN es quizs que
contenido y otra de purificacin, que implica la
el ms desconoci- retirada de la solucin final de la mayora de
elementos que pueden interferir en la PCR.
do...
...las suspensiones
densas de bacterias
gramnegativas
pueden liberar su
ADN en condiciones bastante suaves...

Lavado del pellet. Se realiza con alcohol

fro volviendo a centrifugarse

Recuperacin. El sedimento se puede resuspender en agua o tampn Tris tras ser

secado completamente.

La confirmacin de la presencia de ADN se

lleva a cabo mediante electroforesis en un gel
de agarosa i posterior tincin con bromuro de
etidio y observacin con luz UV o directamente
al espectrofotmetro mediante espectro de
absorcin de 200 a 350 nm. El ADN purificado
De los tres pasos crticos que componen el an- se puede cuantificar con un espectrofluormetro
lisis de patgenos por PCR (Fig. 1), la extrac- mediante el uso de fluorforos especficos
cin de ADN es quizs el ms desconocido y (Picogreen, Molecular Probes)
sobre el que ms control podemos ejercer.
El paso 3 puede realizarse con la ayuda de mi-

Enriquecimiento

ExtraccinADN

DeteccinPCR

Figura1.LaextraccindeADNesunpasoclaveenlosanlisismicrobiolgicosporPCR

La extraccin del ADN de las clulas o virus

donde se halla confinado es un paso previo en
muchos procedimientos analticos y diagnsticos.

EtapasenlaextraccindeADN

La incorporacin
de controles internos de amplificacin en los kits
permite el control
del nivel de inhibicin de las reacciones...

nicolumnas equipadas con una membrana de

slica que retiene especficamente el ADN permitiendo el paso de las molculas y sales que
acompaan la reaccin de lisis. Finalmente se
lava con alcohol y se eluye el contenido

Los pasos necesarios para una correcta extrac- InhibidoresdelaPCR

cin y purificacin del ADN mediante un proce- Se trata de substancias que interfieren con las
dimiento qumico son:
ADN polimerasas termoestables ya sea mediante el bloqueo directo total o parcial de su activi1. Lisis de las clulas o virus. Las sales caotr- dad cataltica o mediante la unin directa al
picas ayudan a romper la estructura tridi- ADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas
mensional de macromolculas como las substancias interaccionan con los iones Mg2+
protenas o los cidos nucleicos consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un Tabla 1. Principales substancias inhibidoras de la PCR
detergente como el SDS es necesaria a meInhibidor
Origen
nudo para eliminar las membranas.
2. Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adicin
de una proteasa. La fraccin proteica puede
precipitarse mejor con la ayuda de sales
como el acetato de amonio o el acetato
sdico.
3. Purificacin. Consta de 3 fases:

Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fro o isopropanol i recuperar
mediante una centrifugacin. El alcohol
del sobrenadante se llevar las sales aadidas previamente.

Sales biliares

Heces

Polisacridos complejos

Heces, material vegetal

Colgeno

Tejidos

Grupo hemo

Sangre

cidos hmicos

Suelo, material vegetal

Melanina y eumelanina

Pelo, piel

Mioglobina

Tejido muscular

Proteinasas

Leche

Iones de calcio

Leche, huesos

Urea

Orina

Hemoglobina, Lactoferrina

Sangre

Inmunoglobina G (IgG)

Sangre

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(un cofactor crtico de la actividad cataltica) o disminuyen su

disponibilidad pudiendo inhibir la PCR.
En la tabla 1 se recogen algunas de las principales substancias
inhibidoras conocidas.
Otra importante fuente de inhibicin son los propios reactivos
que se usan en el proceso de extraccin de ADN, como por
ejemplo, el exceso de KCl, NaCl y otras sales, detergentes inicos, etanol e isopropanol, fenol y otros.
Los inhibidores pueden eliminarse mediante purificacin
qumica del extracto (pasos 3 a 6) o fsica mediante columnas
de slica.

ExtraccindeADNensuspensionesbacterianas
De todas las muestras biolgicas que podemos someter a un
proceso de extraccin de ADN, las suspensiones bacterianas,
son quizs las que ofrecen menos problemas por la homogeneidad y riqueza del material. En particular, las suspensiones
densas de bacterias gramnegativas pueden liberar cantidad
suficiente de ADN en condiciones bastante suaves como pueden ser una simple ebullicin, congelacin o una combinacin
de ambas (frezze & thaw).

do, pero muy poco eficacia en bacterias grampositivas.

2. Ebullicin (combinado con congelacin). Algunos fabricantes incorporan un paso de ebullicin de la muestra
previo a la PCR como nica accin para extraer el ADN de
la muestra. Si bien esto puede ser usado en suspensiones
con nmeros elevados de bacterias gramnegativas, su baja
eficiencia especialmente con organismos grampositivos,
reduce notablemente el nivel de deteccin del mtodo.
3. DNAready (Microbial) Se trata de un tampn de lisis
que incorpora los elementos necesarios para buscar un
equilibrio entre eficiencia y pureza que adems est desarrollado para ser especialmente efectivo con bacterias
grampositivas.

Conclusiones
En Microbiologa de los alimentos, los inhibidores de la PCR
provienen principalmente de la matriz alimentaria analizada o
de los medios utilizados para el enriquecimiento. La incorporacin de controles internos de amplificacin en los kits permite conocer el nivel de inhibicin de las reacciones.

Las bacterias no suelen contener substancias inhibidoras, por

lo que en la mayora de casos una extraccin primaria (lisis y
liberacin del ADN) es suficiente para tener resultados satisEl laboratorio de Microbiologa que decide incorporar la PCR factorios. Esto no significa necesariamente que se puedan
a sus mtodos de investigacin de bacterias patgenas en siempre usar mtodos poco drsticos, pues stos no son efectialimentos, lo hace buscando rapidez y simplicidad. La purifi- vos para extraer el ADN de las bacterias grampositivas.
cacin del ADN tras el proceso de lisis y liberacin tiene como
ventaja la obtencin de un analito sin inhibidores a cambio de La utilizacin de mtodos de purificacin post-extraccin
un sensible aumento del tiempo de anlisis y de los pasos de como por ejemplo las minicolumnas de slica implica un aumento en el coste y en el nmero de manipulaciones (Tabla 2)
manipulacin.
lo que hace que slo sea aconsejable en aquellas matrices en
Analizar directamente un caldo de enriquecimiento tras un las que los mtodos primarios no pueden eliminar los inhibiproceso de extraccin primaria de ADN (lisis celular) suele dores.
producir resultados satisfactorios para la mayora de matrices
alimentarias por lo que un paso
Tabla 2. Comparacin del material, tiempo y costes asociados a diferentes mtodos de extraccin de
de purificacin no es estricta- ADN comnmente utilizados.
mente necesario. Adems, los
kits de anlisis de patgenos
por PCR incorporan detectores Caracterstica
Macherey-Nagel DNAready
Chelex
F&T
de inhibicin (controles inter6
1
2
2
nos de amplificacin). Sola- Pasos centrifugacin
mente aquellas matrices cuya Pasos pipeteo
10
2
3
3
presencia de inhibidores no
3
1
2
2
pueda ser contrarrestada dilu- Cambios de tubo
yendo el extracto de ADN obli- Coste por reaccin ()
>3
<1,5
<1,5
<1,5
garn a plantear la adopcin de
2h 30min
1h
1h 20min
1h 30min
tcnicas de extraccin de ADN Tiempo (h)*
que aseguren un extracto puro.
Cambios T
2
3
3
7

EsnecesarialapurificacindeADNenladeteccin
depatgenosenalimentosporPCR?

ObtencindeADNsinpasodepurificacin.

Cada casa comercial acompaa a sus detectores con un mto- Bibliografa

Rdstrm, P. et al. (2004) Pre-PCR processing: Strategies to
do de extraccin de ADN. stos son fundamentalmente tres:
generate PCR-compatible samples. Mol. Biotechnol. 26, 133
1. Chelex. El uso de una resina de slica ayuda a separar 46.
selectivamente el ADN de la solucin. Es un mtodo rpi-

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