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PRACTICA N 5

DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS EN ALIMENTOS.

Carotenoides totales y nitritos.

I.

INTRODUCCIN: En espectrofotometra se usa como fuente luminosa la

luz blanca natural o artificial (espectro continuo entre el rojo y el ultra
violeta). Las mediciones se realizan por medio de un espectrofotmetro.
La ventaja principal de los mtodos espectrofotomtricos consiste en que
se pueda determinar con mayor exactitud y de una manera simple, trazas
de sustancias en cuyo caso los procedimientos gravimtricos y
volumtricos daran errores relativamente mayores puesto que las
cantidades absolutas de las sustancias que se van a determinar son
demasiado pequeas. Por lo tanto, el mtodo espectrofotomtrico es
especialmente adecuado para la determinacin de micro y semimicro
cantidades de componentes.
En caso contrario se prefieren los procedimientos gravimtricos y
volumtricos, por cuanto son ms exactos. Se debe tener muy presente
que an en los casos ms favorables, la espectrofotometra comn no da
una exactitud mayor del 1%, aproximadamente.

II.

PIGMENTOS NATURALES: CAROTENOIDES TOTALES.

A. Fundamento:
El mtodo se fundamenta en la medicin de la absorbancia de un
extracto de los carotenoides presentes en el alimento y luego mediante
1%
el uso de una curva de calibracin o la aplicacin E1cm
se calcula el

contenido de carotenoides en la muestra.

B. Reactivos:
1. ter de petrleo
2. Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)
3. Solucin concentrada de beta-caroteno en alcohol isopropilico/
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cloroformo (25:75) (80mg/ ml).

4. Solucin diluida de beta-caroteno (10 ml de solucin concentrada +

ter de petrleo en cantidad suficiente para 100 ml)
4. Acetona.
NOTA: RECUERDE QUE DURANTE LA PRACTICA SE TRABAJA
CON SOLVENTES VOLATILES MUY INFLAMABLES Y QUE POR LO
TANTO NO DEBE FUMAR, NI ENCENDER MECHEROS, ETC.
C. PROCEDIMIENTO:
1. Curva patrn:
Tomar 5 tubos de ensayo y enumerar del 1 al 5. Colocar en cada
uno de ellos las cantidades de reactivos que se especifican a
continuacin:
Tubo N
ml de solucin diluida de
beta- caroteno
ml de solvente puro
(ter de petrleo)

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Agitar con cuidado los tubos y determinar la absorbancia de cada

solucin a la longitud de onda mxima.
Construir la curva de calibracin trazando un grafico de la
absorbancia correspondiente contra la concentracin de betacaroteno contenida en cada una de las soluciones patrn.
2. Determinacin del contenido de carotenoides totales en el
alimento:
1.

Pesar aproximadamente 1g de muestra fresca de zanahoria

previamente pelada y cortada en trozos pequeos.

2.

Homogenizar en una licuadora con 60 ml de acetona por unos

3 minutos.

3.

Decantar y agregar ms acetona para realizar una extraccin.

Repetir el proceso hasta extraer completamente los pigmentos.

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4.

Filtrar y lavar el residuo que queda en el papel de filtro con

unos 20-30 ml de acetona.

5.

Concentrar en campana con un bao de Mara (o en plancha

elctrica) hasta pequeo volumen.

6.

Agregar 60 ml de ter de petrleo.

7.

A la solucin etrea que contiene los carotenoides agregar

una pequea cantidad de Na2SO4 anhidro. Dejar la solucin
con

el

agente

desecante

unos

15

minutos,

agitar

ocasionalmente.
8.

Transferir cuantitativamente la solucin etrea a un matraz

aforado de 100 ml y llevar a volumen con ter de petrleo.

9.

Tomar con una pipeta 2 ml de esta solucin ( o un volumen

que pueda medirse la intensidad de color) y transferir a un
tubo.

10. Agregar 8 ml de ter de petrleo y medir la absorbancia a la

longitud

de

onda

de

mxima

absorcin

encontrada

previamente.
D. Clculos:
1.

Determinar por medio de la curva estndar la cantidad de

carotenoides totales presentes en la muestra. Expresarlos
como mg de beta-carotenos/100 g de muestra.

2.

Calcular la cantidad de carotenoides totales expresados como

1%
beta-caroteno utilizando la constante E1cm

3.

I.

Comparar ambos resultados.

COMPUESTOS NO COLOREADOS: NITRITOS

A. Fundamento:
Cuando se hacen reaccionar soluciones de cido sulfanlico y alfanaftilamina en cido actico diluido con cido nitroso, se produce una
coloracin roja. El cido sulfanilico se transforma en el diazo
compuesto correspondiente que se copula con la alfa-naftilamina-

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pazobenceno-p-sulfonico, azocolorante rojo.

B. Reactivos:
1. Reactivo de Greiss (modificado)
Disolver 0,5 g de cido sulfanilico en 150 ml de cido actico al 15
% (V/V).
Hervir 0,1 g de alfa-naftilamina o 0,125 g de clorhidrato en 20 ml de
agua hasta disolver; agregar, en caliente, a 150 ml de cido actico
al 15 % (V/V).
Mezclar las dos soluciones. Filtrar si es necesario y guardar en
frasco ambar.
2. Solucin estndar de nitrito de sodio (1 mg / ml)
3. Solucin de ferrocianuro de potasio (10 %)
4. Acetato de zinc dihidratado (22 %)
5. Solucin de Brax decahidratado
C. Procedimiento:
1. Curva patrn.
1.

Diluir volmenes adecuados de la solucin estndar de nitrito

en matraces aforados de 50 ml.

2.

Aadir 2 ml de reactivo de Greiss.

3.

Dejar desarrollar color por 15-20 minutos.

4.

Leer a 520 nm y llevar a un grafico los valores de Absorbancia

vs. concentracin de cada una de las soluciones patrones.
Concentracin de los estndares: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 y 0,5
ppm.

2. Determinacin de nitritos en carnes curadas.

1.

Pesar 5 g de carme finamente homogenizada en un vidrio de

reloj.

2.

Pasarlos a un vaso precipitado de 250 ml con 150 ml de agua

aproximadamente.

3.

Aadir 5 ml de brax.

4.

Colocar en bao de Maria durante 45 minutos. Agitar

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ocasionalmente

5.

Transferir cuantitativamente a un baln aforado de 250 ml

6.

Aadir 2,5 ml de solucin de ferrocianuro y 2,5 ml de acetato

de zinc, mezclar.

7.

Enfriar a temperatura ambiente, llevar a volumen con agua y

mezclar cuidadosamente.

8.

Filtrar

9.

Medir una alcuota de 25 ml (o un volumen que permita medir

la intensidad de color desarrollado) en un matraz aforado de
50 ml y llevar a volumen.

10. Mezclar y dejar desarrollar color por 15-20 minutos

11. Leer a 520 nm la absorbancia (A) de la solucin contra un
blanco preparado aadiendo 2 ml de reactivo de Greiss a 50
ml de agua.
NOTA: EL AGUA A USAR EN ESTAS DETERMINACIONES DEBE
ESTAR LIBRE DE NITRITOS.
3. Clculos:
Calcular el contenido de nitritos presentes en la muestra por medio
de la curva estndar. Reportar como ppm.
Comparar el resultado obtenido con valores reportados en libros de
anlisis o Norma Venezolana COVENIN.

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