Atlas de Pruebas Bioquimicas para Identificar Bacterias-Libre PDF

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UNI VERSI DAD NACI ONAL AUTNOMA UNI VERSI DAD NACI ONAL AUTNOMA UNI VERSI DAD NACI ONAL AUTNOMA UNI VERSI DAD NACI ONAL AUTNOMA
DE MXI CO DE MXI CO DE MXI CO DE MXI CO

FACULTAD DE ESTUDI OS SUPERI ORES ZARAGOZA FACULTAD DE ESTUDI OS SUPERI ORES ZARAGOZA FACULTAD DE ESTUDI OS SUPERI ORES ZARAGOZA FACULTAD DE ESTUDI OS SUPERI ORES ZARAGOZA

Q.F.B. Luca Bailn Lira

Q.F.B. Roberto Cruz Gonzlez Melndez

M. en C. Armando Cervantes Sandoval
2003. Universidad Nacional Aut noma de Mxico
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2
CONTENI DO
Pgina

I nt r oduccin 7

Gener alidades de bact er ias 9
Mor f ologa y est r uct ur a 9
Nut r icin 10
Quimiohet er t r of os 12
Aut t r of os 12
Fot oaut t r of os 12
Fot ohet er t r of os 12
Repr oduccin 13
Tr ansf or macin 14
Conj ugacin 14
Tr ansduccin 15

I dent if icacin bact er iana 16
Medios de cult ivo 16
Medios bsicos 18
Medios enr iquecidos 19
Medios select ivos, dif er enciales y
de enr iquecimient o 20
Medios especiales 22
Clasif icacin por consist encia 23
Slidos
Semislidos
Lquidos
Clasif icacin por composicin 23
Sint t icos
No sint t icos

3
Tcnicas de inoculacin 24
En placa 26
Est r a cr uzada
Est r a en Z
Est r a simple
Siembr a masiva
Vaciado en placa
En t ubo: medio semislido 27
Siembr a en medios lquidos 28
En t ubo: medios slidos 29

I ncubacin de los medios 30

Mor f ologa colonial 31

I dent if icacin basada en car act er st icas 35
met ablicas: Pr uebas bioqumicas
Fer ment acin de car bohidr at os 35
Pr ueba de cit r at o 42
Licuef accin de gelat ina 48
Pr ueba de leche con t or nasol 52
Reduccin de leche con azul de met ileno 59
Pr ueba de f er ment acin y oxidacin (O/ F) 63
Pr ueba de ur easa 69
Pr ueba de Voges - Pr oskauer 73
Pr ueba de r oj o de met ilo 78
Reduccin de nit r at os 82
Pr ueba de f enilalanina 87
Sulf ur o, indol y movilidad: SI M 92
Agar hier r o t r iple azcar : TSI 102
Agar lisina hier r o: LI A 112
Movilidad, indol y or nit ina: MI O 116

4
Met abolismo 125
Pr oduccin de ener ga 128
Va de degr adacin de las hexosas
Gluclisis 130
Ent ner -Duodor of f 134
Pent osa f osf at o 135
Ciclo de Kr ebs 139
Fer ment acin 142
Lct ica 143
Het er olct ica 144
Alcohlica 144
Pr opinica 146
cido mixt a (f r mica) 147
De met ano 148
But ilenglucolt ica (acet onica) 148
Respir acin anaer bica con acept or es 149
inor gnicos de hidr geno
Fij acin de nit r geno 149
Reduccin de sulf at os 151

Mt odos par a el aislamient o e ident if icacin de bact er ias
Ent er obact er ias 153
Copr ocult ivo 155
Familia Micr ococaceae 157
Est af ilococos 158
Est r ept ococos 160
Ur ocult ivo 162
Hemocult ivo 163
Exudado f ar ingeo 164

Ref er encias 165
Dir ecciones elect r nicas 168

5
NDI CE DE FI GURAS

No. Figura Ref erencia Pg.
1 Mor f ologa bact er iana Enciclopedia Encar t a, 2002 9
2 For mas de nut r icin de bact er ias Enciclopedia Encar t a, 2002 11
3 Repr oduccin bact er iana Enciclopedia Encar t a, 2002 13
4 Repr oduccin bact er iana: Tr ansf or macin Enciclopedia Encar t a, 2002 14
5 Repr oduccin bact er iana: Conj ugacin Enciclopedia Encar t a, 2002 15
6 Super f icie de placas de agar EMB que ilust r a el br illo ver de
pr oducido por miembr os de las Ent er obact er ias que f er ment an
vidament e lact osa: Escher ichia coli.
Koneman, 1992 16
7 Placa de agar soya - t r ipt icasa, inoculado con una bact er ia que
pr oduce un pigment o amar illo. La pr oduccin de pigment o es una
impor t ant e car act er st ica dif er encial par a ident if icar bacilos
Gr am negat ivos no f er ment ador es.
Koneman, 1992 18
8 Super f icie de placas de agar EMB que ilust r a cult ivo mixt o de
Escher ichia coli y Shigella sp.
Koneman, 1992 19
9 Mor f ologa colonial en agar sangr e. Enciclopedia Encar t a, 2002 20
10 Super f icie de placas de agr a EMB que ilust r a el br illo ver de
pr oducido por Escher ichia coli.
Koneman, 1992 21
11 Agar BCYE Koneman,1992 31
12 St r ept ococcus sp. Museun of Hist or y Nat ur al 37
13 Pr uebas bioqumicas: Fer ment acin de car bohidr at os 38
14 Pr uebas bioqumicas: Cit r at o 45
15 Pr uebas bioqumicas: Licuef accin de gelat ina 50
16 Micr ococcus sp Sullivan, 2002 51
17 Pr uebas bioqumicas: Leche con t or nasol 57
18 Pr uebas bioqumicas: Leche con azul de met ileno 61
19 Salmonella sp. Enciclopedia Encar t a, 2002 62
20 Pr uebas bioqumicas: Oxidacin/ f er ment acin 66
21 I nt er pr et acin O/ F 67
22 Pr uebas bioqumicas: Ur ea 71
23 Salnonella t yphi Enciclopedia Encar t a, 2002 72
24 Pr uebas bioqumicas: Voges - Pr oskauer 76
25 Escher ichia coli Pr skznki, 2002 77
26 Pr uebas bioqumicas: Roj o de met ilo 80
27 Escher ichia coli, obser vese pili 81
28 Pr uebas bioqumicas: Reduccin de nit r at os 85
29 Pr uebas bioqumicas: Fenilalanina desaminasa 91
30 Salmonella t yphi Univer sit y of east Anglia
Nor wich, 2002
96
31 Pr uebas bioqumicas: SI M 99
32 Salmonella t yphi 101
33 Escher ichia coli Pf eizer , 2002 101
34 Pr uebas bioqumicas: TSI 107
35 Salmonella sp. 107
36 Fundament o: TSI Koneman, 2002 110
37 Pr uebas bioqumicas: LI A 114
38 Pr uebas bioqumicas: MI O 121
39 Shigella Museum of Hist or y Nat ur al,
2002
124
40 Pr oduccin de quesos Black, 1996 144
41 Pr oduccin de vino Black, 1996 145

6
ndice de Tablas

No. Tabla

Pg.
1 Repor t e de r esult ados: pr ueba de oxidacin y f er ment acin 68
2 Repor t e de r esult ados: Sulf ur o, indol y movilidad (SI M) 98
3 Aplicaciones: SI M 101
4 Aplicaciones: TSI 111
5 Aplicaciones: LI A 115
6 Repor t e de r esult ados: MI O 123
7 Aplicaciones: MI O 124
8 Car act er st icas bioqumicas de bacilos Gr am negat ivos 154
9 Car act er st icas bioqumicas de la Familia Micr ococcaeae 157
10 Car act er st icas bioqumicas de St aphylococcus 159
11 Car act er st icas bioqumicas de St r ept ococcus 161

ndice de Esquemas

No. Esquema

Pgina
1 Gluclisis 133
2 Va de Hexosa monof osf at o 138
3 Ciclo de Kr ebs 141
4 Copr ocult ivo 155
5 Aislamient o de bact er ias pat genas de heces 156
6 Aislamient o de St aphylococcus 158
7 Ur ocult ivo 162
8 Exudado f ar ingeo 164

7
I nt r oduccin

Como est udiant e la licenciat ur a de Q.F.B. la cual abar ca en
gr an par t e el est udio bact er iolgico he obser vado que la
mayor a de las veces, los alumnos al r ealizar las pr uebas
bioqumicas par a la ident if icacin de bact er ias no t ienen un
conocimient o r eal o suf icient e de los pr incipios o bases par a
r ealizar las as como las pr ecauciones e inconvenient es que se
pr esent an en cada pr ueba bioqumica.

Par a poder conocer los pr incipios, bases bioqumicas, mt odos,
aplicaciones, int er pr et acin y pr ecauciones as como los
r esult ados esper ados en cada pr ueba es necesar io a menudo
r ecur r ir a muchas r ef er encias bibliogr f icas y publicaciones
que no siempr e se encuent r an a disposicin de los alumnos o
micr obilogos en gener al.

En est e at las de pr uebas bioqumicas se han seleccionado las
pr uebas que se ut ilizan a lo lar go de la licenciat ur a de Qumico
Far macut ico Bilogo en la Facult ad de Est udios Super ior es
Zar agoza. Por lo t ant o el usuar io encont r ar la inf or macin
suf icient e y necesar ia per o sobr e t odo, sencilla y amena de
cada pr ueba, su pr incipio f undament al, bases bioqumicas,
medios de cult ivo, r eact ivos empleados, r esult ados,
int er pr et acin, r epor t e de r esult ados, pr ecauciones y
obser vaciones, t cnicas de inoculacin y condiciones de
incubacin as como r ef er encias bibliogr f icas. Est as han sido
r eunidas al f inal par a per mit ir , cuando se desee una
pr of undizacin acer ca de un aspect o det er minado de algn
8
t ema, donde se podr t ambin obser var dif er ent es imgenes
de algunas especies bact er ianas. En las ilust r aciones a color de
los r esult ados de cada pr ueba t ambin se incluyen medios no
inoculados par a una mej or y mayor compar acin par a los
lect or es.

Ant es de la par t e dedicada a la explicacin de las bases par a
cada pr ueba bioqumica se encont r ar n t ambin clasif icaciones
concr et as y ej emplos de los medios de cult ivo, as como las
t cnicas de inoculacin ms empleadas.

No se ha t r at ado de simplif icar en exceso (per o t ampoco se ha
pr of undizado en cada pr ueba), sino de hacer que est e at las
r esult e t il especialment e par a los est udiant es no solo de la
licenciat ur a de Q.F.B., sino t ambin par a ot r as car r er as,
labor at or ios de anlisis clnicos y por que no, par a ot r as
inst it uciones.

Est e at las de color es y t ext o de micr obiologa ha sido descr it o
con el obj et o de pr opor cionar a est udiant es de micr obiologa,
t ecnlogos mdicos, r esident es de pat ologa y ot r os
int er esados en micr obiologa clnica, una int r oduccin pr ct ica
a la ident if icacin de labor at or io de los agent es micr obianos
asociados con enf er medades inf ecciosas y de las pr uebas
bioqumicas ms empleadas o las mnimas necesar ias par a su
ident if icacin.

9

1. Mor f ologa y est r uct ur a.
Las bact er ias son micr oor ganismos pr ocar iot as de
or ganizacin muy sencilla. La clula bact er iana const a
de:
! Cit oplasma. Pr esent a un aspect o viscoso, y en
su zona cent r al apar ece un nucleoide que
cont iene la mayor par t e del ADN bact er iano, y
en algunas bact er ias apar ecen f r agment os
cir cular es de ADN con inf or macin gent ica,
disper sos por el cit oplasma: son los plsmidos.

Figura 1. Morfologa bacteriana
10
! La membr ana plasmt ica pr esent a
invaginaciones, que son los mesosomas, donde
se encuent r an enzimas que int er vienen en la
snt esis de ATP, y los pigment os
f ot osint t icos en el caso de bact er ias
f ot osint t icas. En el cit oplasma se encuent r an
inclusiones de diver sa nat ur aleza qumica.
! Muchas bact er ias pueden pr esent ar f lagelos
gener alment e r gidos, implant ados en la
membr ana mediant e un cor psculo basal.
Pueden poseer t ambin, f imbr ias o pili muy
numer osos y cor t os, que pueden ser vir como
pelos sexuales par a el paso de ADN de una
clula a ot r a.
! Poseen ARN y r ibosomas car act er st icos, par a
la snt esis de pr ot enas.
! Par ed celular r gida y con molculas exclusivas
de bact er ias.

2. Nut r icin
El xit o evolut ivo de las bact er ias se debe en par t e a su
ver sat ilidad met ablica. Todos los mecanismos posibles de
obt encin de mat er ia y ener ga podemos encont r ar los en las
bact er ias.

11
Segn la f uent e de car bono que ut ilizan, los ser es vivos se
dividen en aut t r of os, cuya pr incipal f uent e de car bono es el
CO
2
, y het er t r of os cuando su f uent e de car bono es mat er ia
or gnica.
Por ot r a par t e segn la f uent e de ener ga, los ser es vivos
pueden ser f ot t r of os, cuya pr incipal f uent e de ener ga es la
luz, y los or ganismos quimiot r of os, cuya f uent e de ener ga es
un compuest o qumico que se oxida.

Figura 2. Formas de nutricin de las bacterias
12
At endiendo a las ant er ior es cat egor as, ent r e las bact er ias
podemos encont r ar las siguient es f or mas, como puede
apr eciar se en el esquema:
1. Las bact er ias quimiohet er t r of as, ut ilizan un
compuest o qumico como f uent e de car bono, y a su vez,
est e mismo compuest o es la f uent e de ener ga. La
mayor par t e de las bact er ias cult ivadas en labor at or ios
y las bact er ias pat genas son de est e gr upo.

2. Las bact er ias quimioaut t r of as, ut ilizan compuest os
inor gnicos r educidos como f uent e de ener ga y el CO
2

como f uent e de car bono. Como por ej emplo,
Nit r obact er yThiobacillus.

3. Las bact er ias f ot oaut t r of as, ut ilizan la luz como
f uent e de ener ga y el CO
2
como f uent e de car bono.
Bact er ias pur pr eas.

4. Las bact er ias f ot ohet er t r of as, ut ilizan la luz como
f uent e de ener ga y biomolculas como f uent e de
car bono. Ej emplos como Rhodospir illum y Chlor of lexus.

13
3. Repr oduccin
Gener alment e las bact er ias se r epr oducen por
bipar t icin, como se ve en el siguient e esquema:

Tr as la duplicacin del ADN, que est a dir igida por la ADN-
polimer asa que se encuent r a en los mesosomas, la par ed
bact er iana cr ece hast a f or mar un t abique t r ansver sal
separ ador de las dos nuevas bact er ias.
Per o adems de est e t ipo de r epr oduccin asexual, las
bact er ias poseen unos mecanismos de r epr oduccin sexual o
par asexual, mediant e los cuales se int er cambian f r agment os
de ADN. Est e t ipo de r epr oduccin puede r ealizar se por :
Figura 3. Reproduccin bacteriana
14
! TRANSFORMACI ON:
Consist e en el
int er cambio gent ico
pr oducido cuando una
bact er ia es capaz de
capt ar f r agment os de
ADN, de ot r a bact er ia
que se encuent r an
disper sos en el medio
donde vive.

! CONJ UGACI N: En est e pr oceso, una bact er ia
donador a F+ t r ansmit e a t r avs de un puent e o
pili, un f r agment o de ADN, a ot r a bact er ia
r ecept or a F-. La bact er ia que se llama F+ posee
un plsmido, adems del cr omosoma bact er iano.

Figura 4. Reproduccin bacteriana: Transformacin
15

! TRANSDUCCI N: En est e caso la t r ansf er encia
de ADN de una bact er ia a ot r a, se r ealiza a
t r avs de un vir us bact er if ago, que se
compor t a como un vect or int er mediar io ent r e las
dos bact er ias. (Bi bli ot eca de Consult a Micr osof t Encar t a 2002. 1993-2001 Micr osof t Cor por at i on.)

Figura 5. Reproduccin bacteriana: Conjugacin
16

En la nat ur aleza los micr oor ganismos se encuent r an
f or mando poblaciones mixt as de una gr an var iedad de t ipos
dif er ent es. Sin embar go, el desar r ollo de la micr obiologa se
ha conseguido mediant e el est udio de especies aisladas,
cr ecidas en medios despr ovist os de cualquier ot r a f or ma de
vida cont aminant e.

Los micr oor ganismos necesit an nut r ient es apr opiados as
como condiciones ambient ales f avor ables. En pr imer lugar el
medio de cult ivo debe cont ener aquellos nut r ient es
esenciales par a el cr ecimient o de una det er minada especie.

Como la mayor par t e de los est udios en el labor at or io se
r ealizan los cult ivos pur os (una sola especie bact er iana), se
debe est er ilizar el medio de cult ivo y mant ener lo en
condiciones est r iles hast a que sea ut ilizado.

Un medio de cult ivo es cualquier
sust ancia que puede ser usada par a el
cult ivo de micr oor ganismos, puede ser
llamada un medio o, dicho con mayor
pr ecisin un medio de cult ivo.
Figura 6. Crecimiento de Escherichia coli en agar EMB
17

Los medios sir ven par a dos pr opsit os pr incipales:

a) Foment ar el cr ecimient o micr obiano en f or ma que
puedan compr obar se las car act er st icas de cult ivo.
b) Facilit ar algunas r eacciones bioqumicas que luego
puedan ser demost r ables por obser vacin dir ect a, o
bien, indir ect ament e por la r eaccin en pr esencia de
algunos r eact ivos adicionales.

Todas las r eacciones de cult ivo as como las bioqumicas,
dependen de la composicin del medio y de la nat ur aleza del
cult ivo que se est udie. Los medios de cult ivo se pueden
clasif icar en cuat r o t ipos dif er ent es:

1. Medios bsicos
2. Medios enr iquecidos
3. Medios select ivos, dif er enciales y de
enr iquecimient o
4. Medios especiales

18
1. Medios bsicos

Solo cont ienen algn ext r act o de car ne u ot r a inf usin
simple, pept ona, sal y agua.

El ext r act o o la inf usin de car ne pr opor cionan al or ganismo
los aminocidos, vit aminas, sales, y pequeas cant idades de
car bono, nit r geno, hidr geno y ot r os element os.

Las sales (usualment e clor ur o de sodio) sir ven par a obt ener
isot onicidad r equer ida par a el mant enimient o de pr esiones
osmt icas const ant es.

El agua sir ve como disolvent e, como medio de t r anspor t e, o
par a ambos f ines (siempr e se debe usar agua dest ilada par a
pr epar ar los medios de cult ivo).

Los medios de cult ivo que solo cont ienen ext r act o de car ne,
pept ona, sal y agua, son lquidos; par a el est udio de las
car act er st icas de las colonias es indispensable el uso de
medios slidos.

La solidif icacin se consigue
agr egando agar , gelat ina, albmina
de suer o o de huevo, a los ot r os
ingr edient es.

Figura 7. Agar Soya - tripticasa
19

Es pr ef er ible ut ilizar el agar , ya que es un medio slido que
no se desint egr a por los medios f sicos usados en el cult ivo
de la mayor a de los micr oor ganismos.

Ej emplos de st e t ipo de medios son los siguient es:

1. Caldo y agar nut r it ivo
2. Caldo de t r ipt ona y soya
3. Caldo de inf usin de cer ebr o y
cor azn
4. Agar de inf usin de cer ebr o y
cor azn
5. Caldo de inf usin de cor azn
6. Agar y ext r act o de hgado
7. Dext r osa de Sabor aud

2. Medios enriquecidos

Son aquellos medios bsicos que han sido complement ados
con lquidos cor por ales, vit aminas especf icas, aminocidos,
pr ot enas y ot r os nut r ient es clar ament e def inidos como
t ales.

Figura 8. Agar EMB con cultivo mixto
de Escherichia coli y Shigella sp.
20

Ej emplos:
1. Agar pr ot eosa
2. Agar sangr e
3. Agar chocolat e
4. Caldo de suer o
5. Agar con suer o
6. Suer o de Loef f ler con
sangr e
7. Medios inclinados con
suer o
8. Agar de Bor det Gengou
9. Medio de Levint hal
10.Agar de Mueller -Hint on
11.Agar inf usin de
cer ebr o cor azn
12.Agar sangr e

3. Medios select ivos, dif erenciales y de
enriquecimient o

Los medios select ivos son usualment e medios de agar bsico,
o enr iquecidos, a los cuales se les han agr egado cier t os
r eact ivos que impiden el cr ecimient o de la mayor a de las
bact er ias, per mit iendo por lo t ant o el aislamient o de unas
cuant as, seleccionadas en los especimenes que cont engan
gr andes nmer os de or ganismos indeseables.

Los medios dif er enciales son medios bsicos o enr iquecidos,
a los cuales se les han agr egado cier t os r eact ivos que
r eaccionar n con algunos t ipos especf icos de bact er ias en
cier t a f or ma obser vable.

Figura 9. Morfologa colonial en Agar sangre
21
Los medios de enr iquecimient o son por lo gener al medios
lquidos enr iquecidos, que cont ienen algunas sust ancias
inhibidor as, con lo que se cr ea un ambient e especialment e
f avor able par a lmit es ms bien est r echos de bact er ias.

Ej emplos:

1. Medio de Thayer
Mar t in
2. Agar con f enilet anol
3. Agar con sangr e y bilis
al 40%
4. Agar con esculina y bilis
5. Agar con sangr e y
t elur it o
6. Medio de Tinsdale
modif icado
7. Agar con Lowenst ein
J ensen en t ubos
inclinados
8. Agar con cit r at o y
desoxicolat o
9. Agar de sulf it o de
bismut o
10.Caldo selenit o de sodio
11. Agar XLD ( xilosa,
lact osa, desoxicolat o)
11. Agar sangr e con azida
12. Agar con sal y manit ol
13. Agar de Mc Conkey
14. Agar Salmonella -
Shigella
15. Agar con eosina y azul
de met ileno (EMB)
16. Agar de bilis y r oj o de
violet a
17. Agar dext r osa y
t r ipt icaseina
18. Agar ent r ico Hekt oen
19. Agar S-110
20. Agar t er git ol 7
21. Agar ver de br illant e
22. Agar Vogel J honson
23. Agar Bair d-Par ker

Figura 10. Crecimiento de Escherichia coli en Agar EMB
22
4. Medios especiales

Son los medios que no pueden ser f cilment e agr upados
baj o alguno de los ant er ior es gr upos.

La mayor a de ellos ser n medios empleados par a
compr obar una o ms a car act er st icas bioqumicas.

Ej emplos:

Pr uebas bioqumicas

1. Fer ment acin de car bohidr at os
2. Pr ueba de cit r at o
3. Pr ueba de leche con t or nasol
4. Reduccin de leche con azul de met ileno
5. Pr ueba de oxidacin y f er ment acin: Hugh-Leif son
(O/ F)
6. Pr ueba de ur easa
7. Pr ueba de Voges Pr oskauer
8. Pr ueba con r oj o de met ilo
9. Reduccin de nit r at os
10. Pr ueba de f enilalanina
11. Pr ueba de Sulf ur o, indol, movilidad: SI M
12. Agar hier r o y t r iple azcar : TSI
13. Descar boxilacin de la ar ginina y lisina: LI A
14. Descar boxilacin de la or nit ina: MI O

23

Ot r as clasif icaciones de los medios de cult ivo son las
siguient es:

De acuerdo a la consist encia

1. Medios slidos. Son t iles par a el cr ecimient o, aislamient o y
obt encin de cult ivos pur os de bact er ias y hongos.

2. Medios semislidos. t iles par a la obser vacin de
met abolismo, as como la pr opagacin y obt encin de cult ivos
de bact er ias anaer bicas.

3. Medios lquidos. Per mit en la dif usin del micr oor ganismo.

De acuerdo a la composicin

1. Medios sint t icos

Es aquel en el que se conoce la composicin qumica exact a
de los ingr edient es.

2. Medio no sint t ico

No se conoce de una maner a def inida la composicin
pr ecisa de alguna o de t odas las sust ancias nut r it ivas.
24

El desar r ollo o cosecha de micr oor ganismos obt enido en
algn medio se designa como un cult ivo. Cuando las
bact er ias de un cult ivo son t odas de la misma especie, se
dice que son cult ivos pur os; cundo dos o ms especies de
bact er ias s desar r ollan en un medio como un cult ivo mixt o.
Si un cult ivo cont iene accident alment e ms de una especie
de bact er ias se habla de un cult ivo cont aminado.

Las bact er ias se cult ivan en alguno de los siguient es t ipos
de mat er ial de vidr io, una vez limpios y est er ilizados.
1. Tubos de ensayo
2. Caj as o placas de Pet r i
3. Mat r aces de Flor encia y Er lenmeyer
4. Tubos de f er ment acin

Ant es de su est er ilizacin, un t ubo que cont iene medio de
cult ivo se t apa gener alment e con algodn o con un t apn de
caucho o plst ico. As se evit a la ent r ada de nuevos
cont aminant es a la vez que se per mit e el libr e int er cambio
de air e o gases.

Par a sembr ar un cult ivo bact er iano en un medio est r il, un
cier t o nmer o de clulas: inculo, se t r ansf ier en (se
inoculan) al medio con pr ecauciones especiales par a
conser var la pur eza del cult ivo.
25
En el pr ocedimient o de inoculacin el asa de cult ivo o aguj a
de siembr a, debe calent ar se al r oj o sobr e la llama
inmediat ament e ant es y despus de hacer la t r ansf er encia.
La f lama dest r uye cualquier f or ma de vida sobr e la
super f icie de la aguj a o del asa. Se mant iene la aguj a hacia
abaj o sobr e la f lama, par a calent ar la t ot alidad de la aguj a y
la par t e inf er ior del mango.

Dur ant e la siembr a, se mant iene el t ubo en la mano izquier da
y se sost iene el t apn o capuchn ent r e los dedos meique y
anular de la mano der echa. NO DEBE NUNCA
DEPOSI TARSE EL TAPN sobr e la mesa. Mant ener el t ubo
lo ms cer ca posible de la f lama dur ant e la siembr a. Las
bocas de los t ubos de donde t omamos los cult ivos y las de
aquellos donde van a ser t r ansf er idos deben t ambin
f lamear se inmediat ament e ant es y despus de que la aguj a
sea int r oducida y sacada. Adems de dest r uir cualquier
or ganismo del bor de del t ubo, la f lama t iende a cr ear
cor r ient es de conveccin hacia f uer a, decr eciendo as el
r iesgo de cont aminacin.

Despus de inocular , un cult ivo bact er iano se conser va o se
incuba en un lugar apr opiado par a el cr ecimient o. En est e
caso cr ecimient o, signif ica el desar r ollo de una poblacin
de clulas a par t ir de una o pocas clulas. La masa de las
clulas hij as llega a ser visible a simple vist a, bien como una
opacidad ent ur bamient o, en medio lquido; o como una
poblacin aislada colonia en medio slido, donde el aspect o
de st as of r ece un medio par a dif er enciar especies.
26

La inoculacin pr imar ia puede hacer se con un asa, hisopo u
ot r os disposit ivos adecuados.

# Diseminacin en placas:

a) Est r a
1 Cr uzada
2 En Z
3 Simple (en ngulos r ect os)
4 Masiva

b) Vaciado en placa

En el caso de la est r a cr uzada el inculo se disemina con
un movimient o hacia at r s y hacia delant e en cada
cuadr ant e gir ando la placa a 90. El asa o alambr e debe
est er ilizar se en cada diseminacin ent r e cada cuadr ant e.

El pr opsit o de est a t cnica consist e en diluir el inculo en
f or ma suf icient e en la super f icie del agar par a que sea
posible obt ener colonias.

El mt odo de dilucin o vaciado en placa pr opor ciona por lo
gener al placas con un nmer o apr opiado de colonias, y se
basa en una dilucin apr oximadament e cuant it at iva de la
muest r a or iginal en un medio slido.

27
Una t cnica muy comn en medicina consist e en obt ener
especies de micr oor ganismos en un aplicador de algodn
(hisopo). Si se ut iliza el aplicador inf ect ado par a sembr ar
dir ect ament e en caj a pet r i se obt iene una mezcla complej a
de or ganismos sin ninguna colonia aislada, lo cual no r epor t a
ningn benef icio. Par a r esolver est o exist e una t cnica que
per mit e aislar una colonia pur a de un algodn inf ect ado, par a
lo cual; debe t r azar con el hisopo unas lneas, inoculando una
pequea zona en el bor de de una placa. Cubr a la caj a y queme
el aplicador en el mecher o. Est er ilice el asa y psela en el
sect or inoculado con el algodn par a r ecoger algunas
bact er ias, luego inocule con ellos la ot r a zona en la misma
caj a (est r a cr uzada).

# I noculacin de medios semislidos en t ubo

Por picadur a en f or ma ver t ical

La inoculacin de est e t ipo de medios se descr ibe en el
At las int er act ivo.

El agar inclinado es un t ubo cont eniendo un medio con agar
que, dur ant e su enf r iamient o, se coloc inclinado. El
cont enido de un t ubo as inclinado const it uye un medio
adecuado par a el desar r ollo de bact er ias, especialment e de
aer obias y anaer obias f acult at ivas. Algunas car act er st icas
de los cult ivos, como la f or macin de pigment os se
obser van ms f cilment e sobr e cult ivos inclinados.

28
Cuando se inocula agar semislido en un t ubo par a pr uebas
de mot ilidad (aunque no sea la nica pr ueba que se valor a),
es impor t ant e que el asa de inoculacin sea r et ir ada a lo
lar go del mismo camino que se us par a at r avesar
inicialment e el medio. Solo se pica el agar con un
movimient o unif or me y r ect o y par a ello se ut iliza el asa
r ect a.

# I noculacin de medios lquidos (t ubo)

El cr ecimient o bact er iano en medios lquidos se obser va de
la siguient e maner a:
1. Ent ur bamient o, opacidad ms o menos densa.
2. For macin de velo, pequea masa de clulas que
f lot an en la par t e super ior del cult ivo.
3. Sediment o, depsit o de clulas que per manece en la
par t e inf er ior del cult ivo, per o que se pone
nuevament e en suspensin si el t ubo se sacude
suavement e.

Dif usin

Los medios lquidos pueden inocular se como en el mt odo
ilust r ado (At las int er act ivo); el t ubo debe inclinar se
apr oximadament e 30, con un asa de inoculacin se t oca la
super f icie int er na del vidr io, exact ament e por encima del
punt o donde la super f icie del medio f or ma un ngulo agudo.
Se debe ut ilizar el asa con ar illo.

29
Post er ior ment e se vuelve a colocar el t ubo en posicin
r ect a, as el r ea de inoculacin queda sumer gida en el
medio.

Agit ar suavement e cada t ubo. No dej ar que el lquido
salpique la t apa del t ubo. Por lo comn es suf icient e un solo
inculo par a inocular una bat er a de 8 a 10 t ubos.

Cuando se inocula una bat er a con una misma especie de
bact er ia no hay necesidad de pasar por la llama ent r e cada
inoculacin.

Cuando se ut iliza una aguj a o asa par a inocular una bat er a
con un solo inculo, el t r aspaso de azcar es de un t ubo a
ot r o es t an inf init o que no hay pr oblema de que un t ubo
cont enga una mezcla de car bohidr at os.

Cuando se inocula una bat er a no es necesar io obser var en
f or ma apr eciable el inculo en cada uno de los t ubos. Un
solo inculo espeso t omado de cult ivo cont iene millones de
bact er ias que son suf icient es par a inocular cada t ubo con
un nmer o apr eciable de bact er ias necesar ias par a que se
pr oduzca el met abolismo.

# I noculacin de medios slidos (t ubo): Pico de f laut a o
cola de pescado
a) Por puncin (picadur a)
b) Por est r a
c) Por puncin y est r a
30
Los picos de f laut a (planos inclinados) de agar se inoculan
de la siguient e f or ma: pr imer o se at r aviesa t odo el f ondo
del agar con el asa r ect a de inoculacin, est o cuando sea
necesar io ya que no t odos los medios lo r equier en,
post er ior ment e st e se r et ir a con un movimient o en S a
t r avs del agar que se disemina el inculo. Se ut iliza el asa
r ect a.

Las t emper at ur as pt imas de incubacin de las bact er ias
son dif er ent es. En labor at or ios pequeos donde es
pr obable que los r ecur sos sean limit ados, puede no ser
posible pr opor cionar t odas las t emper at ur as pt imas par a
el cr ecimient o de la t ot alidad de los aislamient os clnicos.
La mayor a de los micr oor ganismos ut ilizados en el
labor at or io as como los aislados de muest r a clnicas
cr ecen a una t emper at ur a de 35C, por ende se debe
mant ener la incubador a a 35 37C.

El cr ecimient o de muchas bact er ias se incr ement a con una
at msf er a de 5-7 % de CO
2
. Si solo se dispone de una
incubador a con air e ambient e sin CO
2
los t ubos y placas
par a cult ivos pueden colocar se en una j ar r a con una vela
encendida y cer r ar lo mej or posible la j ar r a.

31

La int er pr et acin de los cult ivos pr imar ios despus de 24
48 hor as de la incubacin r equier e de la obser vacin o
anlisis de la mor f ologa colonial. La evaluacin debe ser de la
siguient e f or ma:

1. Obser var las car act er st icas y el nmer o r elat ivo de
cada t ipo de colonia r ecuper ado en medios de agar .

2. Det er minar la pur eza,
color acin de Gr am y
mor f ologa de las
bact er ias en cada t ipo
de colonia.

3. Obser var cambios en el
medio que r odea las colonias, que r ef lej an act ividades
met ablicas especf icas de las bact er ias r ecuper adas.

La evaluacin de las car act er st icas macr oscpicas de las
colonias habit ualment e se lleva a cabo por medio de la
inspeccin visual del cr ecimient o en la super f icie de las
placas de agar .

Figura 11. Agar BCYE
32
La int er pr et acin de los cult ivos pr imar ios se lleva a cabo
sost eniendo la placa en la mano y obser vando la super f icie
del agar en busca de cr ecimient o bact er iano.

Colonias punt if or mes de bact er ias que cr ecen lent ament e,
pueden pasar se por alt o ent r e colonias ms gr andes en
par t icular si el cr ecimient o t iene t endencia a diseminar se
sobr e la super f icie de la placa.

Dur ant e el examen las placas deben inclinar se en diver sas
dir ecciones, con una iluminacin dir ect a br illant e, de modo
que la luz se r ef lej e desde var ios ngulos. Las placas de
agar sangr e t ambin deben examinar se con t r ansiluminacin
con una luz br illant e desde det r s de la placa par a det ect ar
r eacciones hemolt icas en el agar .

La mor f ologa de las colonias es una de las car act er st icas
bsicas de las bact er ias y es indispensable par a la
ident if icacin pr eliminar .

El t amao de las colonias bact er ianas es asumiendo
condiciones de cult ivo f avor ables bast ant e unif or me de
t oda una especie.

La f or ma de la colonia viene det er minada por su bor de y su
espesor . El bor de puede ser liso o ir r egular y aser r ado.
Cuando el gr osor es mucho mayor en el cent r o,
disminuyendo unif or mement e hacia el bor de, se dice que la
colonia es elevada.
33

La consist encia y t ext ur a de la masa celular t ambin son
r asgos dist int ivos de la mor f ologa de las colonias. Pueden
t ener una consist encia desde seca y f r gil a gr asient a y
cr emosa, o viscosa y pegaj osa.

La consist encia viscosa de la colonia es pr opia de las
bact er ias que t ienen cpsulas. La super f icie de la colonia
puede ser unif or me, lisa y br illant e, r ugosa y gr anular , o
est r iada y dent ada. Al examinar la con luz t r ansmit ida, la
masa celular puede par ecer de una t ext ur a amor f a o
gr anular , y var iar desde casi complet ament e t r anslucida,
quiz con un t int e azulado pasando por var ios gr ados de
opalescencia, hast a un color blanco o una opacidad
amar illent a.

No t odas las colonias bact er ianas son pigment adas: la
pigment acin es ms f r ecuent e ent r e las bact er ias
at r f icas. Debido a que la mayor par t e de los pigment os son
sust ancias car ot enoides, las clulas pueden apar ecer de
color r oj o, nar anj a o amar illo.

La dif er enciacin con un cr it er io mor f olgico de las colonias
es slo or ient at iva, y par a poder ident if icar una bact er ia se
necesit a un est udio det allado de sus car act er st icas
f isiolgicas e inmunolgicas.

34
Lect ur a de mor f ologa colonial

$ Tamao: dimet r o en mm.
$ For ma: punt if or me, cir cular , f ilament osa, ir r egular ,
r izoide.
$ Elevacin: plana, sobr e elevada, convexa, pulvonada,
umbonada, umbilicada.
$ Mar gen (bor de): ent er o, ondulant e, lobulado, lacer ado,
f ilament oso, r izado.
$ Color : blanco, amar illo, negr o, nar anj a, et c.
$ Super f icie: br illant e, opaca, er izada, r ugosa.
$ Tr ansmisin de luz: opaca, t r anslucida, t r anspar ent e.
$ Consist encia: cr emosa, seca, mucoide (viscosa),
membr anosa).

35

La mayor par t e de las pr uebas usadas par a evaluar la
act ividad bioqumica o met ablica de bact er ias (por medio
de la cual puede hacer se una ident if icacin f inal de
especie), se lleva a acabo mediant e el subcult ivo del
aislamient o pr imar io en una ser ie de medios dif er enciales,
cuyos r esult ados pueden int er pr et ar se despus de uno o
dos das de incubacin.

1. FERMENTACI N DE CARBOHI DRATOS

$ Medio de cult ivo: Caldo bsico r oj o de f enol

Composicin:
a) Pept ona 10g.
b) Ext r act o de car ne 1g.
c) Clor ur o de sodio 5g
d) Agua dest ilada 1000 ml.
e) I ndicador de pH: Roj o de f enol
! cido: Color amar illo (pH = 6.8)
! Alcalino : Color r oj o ( pH = 8.4)
! Medio no inoculado: Roj o (pH = 7.4)

36

$ Fundament o

La f er ment acin es un pr oceso met ablico de oxido-r educcin
que ocur r e en un medio ambient e anaer obio y, en lugar de
oxgeno, un sust r at o or gnico sir ve como el acept or f inal de
hidr geno (elect r ones). En los sist emas de pr ueba
bact er iolgicos, est e pr oceso se det ect a obser vando cambios
de color en indicador es de pH a medida que se f or man
pr oduct os cidos.

Las bact er ias que f er ment an un hidr at o de car bono son por
lo gener al anaer obios f acult at ivos. Por medio del pr oceso de
f er ment acin un hidr at o de car bono es degr adado y
descompuest o en dos molculas de car bono (t r iosas) que son
nuevament e degr adadas en un nmer o de compuest os de 1,
2, 3 y 4 car bonos. Los pr oduct os f inales var an con cada
especie bact er iana y depende del sist ema enzimt ico
exist ent e en la especie y las condiciones del medio
ambient e.

El ms impor t ant e ciclo f er ment at ivo de la degr adacin de
la glucosa es el ciclo de Embden - Meyer hof aun cuando
st e t ambin puede pr oducir se por la der ivacin de pent osa
o el ciclo de Ent ner - Duodor of f . Pueden ut ilizar se diver sos
hidr at os de car bono. La bact er ia usada depende de las
dif icult ades que se pr esent en par a ident if icar un or ganismo
det er minado.

37

Ut ilizando un indicador de pH con un det er minado hidr at o
de car bono puede det er minar se si una bact er ia ha
degr adado el mismo en var ios pr oduct os t er minales,
obser vando un cambio de color visible en el medio.

Bact er ia
I ndicador de pH + CHO H
2
CO
2

(aldehdos) gluclisis +
cambio de color

$ Consist encia del medio

Lquido

$ I noculacin

Por dif usin, inculo denso

$ Condiciones de incubacin

Tiempo: 24 - 48 hor as

Temper at ur a: 35 - 37C

Figura 12. Streptococcus
38

$ Result ados

$ I nt er pr et acin

Posit iva = Color amar illo (cido)

Negat iva = Color r osa - r oj izo (alcalina)
Color nar anj a

NEGATIVO
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
Figura 13. Pruebas bioqumicas de Fermentacin de Carbohidratos
39

$ Obser vaciones

Exist en ocasiones que con algunas especies de bact er ias es
necesar ia la incubacin ms pr olongada, est o se r ecomienda
cuando apar ece un color nar anj a, se incuban baj o las
mismas condiciones 24 hor as ms. S aun as se pr esent a
est e color la pr ueba se r epor t a como negat iva ya que lo
ms pr obable es que el micr oor ganismo est f or mando
pr oduct os met ablicos que no necesar iament e son por
f er ment acin por ello no alcanza el color r oj o esper ado.

El hecho de incubar por 24 hor as ms es poco pr ct ico ya
que la mayor par t e de las ocasiones se t iene el t iempo
necesar io par a la incubacin de 24 hor as, por ello en est e
manual se consider a que la pr ueba se t ome como negat iva si
pr esent a un color nar anj a.

$ Repor t e de r esult ados

A = cido
K = alcalino
G = gas

40

$ Aplicaciones

$ Micr oor ganismos f er ment ador es de car bohidr at os:

Fer ment ador es de glucosa: Todos los miembr os
de las Ent er obact er iaceae.
Fer ment ador es de glucosa y lact osa:
Escher ichia coli, Klebsiella y gr upos
Ent er obact er .
Fer ment ador es de manit ol: St aphylococcus
aur eus
Fer ment ador es de inosit ol: Pr ot eus r et t ger i
Fer ment ador es de lact osa: Neisser ia lact amica
Fer ment ador es de adonit ol: Pr ovidencia
alcaligenes.
Fer ment ador es de inulina: St r ept ococcus
salivar ius y St r ept ococcus sanguis.
Fer ment ador es de sacar osa: Yer sinia
ent er ocolit ica.
Fer ment ador es de salicina: List er ia
monocyt ogenes.

41

$ Micr oor ganismos no f er ment ador es de Car bohidr at os:

No f er ment ador es de lact osa:
Ent er obact er ias pat genas como Salmonella y
Shigella.
No f er ment ador es de manit ol: St aphylococcus
epider midis.
No f er ment ador es de salicina: Especies de
Cor ynebact er ium.
No f er ment ador es de r af inosa: Ot r as especies
de Aer omonas.
No f er ment ador es de inosit ol: Pr ot eus
mor ganii.
No f er ment ador es de adonit ol: Pr ovidencia
st uar t ii.
No f er ment ador es de inulina: St r ept ococcus
del gr upo D.
No f er ment ador es de sacar osa: Ot r as
especies de Yer sinia.

42

2. PRUEBA DE CI TRATO

$ Medio de cult ivo: Cit r at o de Simmons

Composicin:
a) Sulf at o de magnesio
b) Monof osf at o de amonio
c) Fosf at o dipot sico
d) Cit r at o de sodio
e) Clor ur o de sodio
f ) Agar
g) Agua dest ilada
h) I ndicador de pH: Azul de br omot imol (pH= 6)
Alcalino: color azul de Pr usia int enso (pH = 7.6)
Medio no inoculado: Color ver de (pH = 6.9)

$ Fundament o

Det er mina si un micr oor ganismo es capaz de ut ilizar cit r at o
como nica f uent e de car bono par a el met abolismo y
cr ecimient o, pr ovocando alcalinidad.

El medio incluye cit r at o de sodio, un anin como nica
f uent e de car bono y f osf at o de amonio como nica f uent e
de nit r geno.
43

Nor malment e el met abolismo del cit r at o compr ende una
condensacin de acet ilo con la coenzima A y oxalacet at o
par a ent r ar en el ciclo de Kr ebs. El desdoblamient o del
cit r at o compr ende un sist ema enzimt ico sin la int er vencin
de la coenzima A. Est a enzima se denomina cit r it asa o
cit r at o desmolasa.

Cit r at o Oxalacet at o + acet at o

Pir uvat o + CO
2

Los pr oduct os obt enidos del met abolismo del cit r at o
dependen del pH del medio:

pH bsico:

Cit r at o CO
2
+ cido f r mico + 2 cido act ico

pH cido:

2 Pir uvat o acet at o + CO
2
+ lact at o

2 Pir uvat o acet ona + 2CO
2

44


Slido inclinado (pico de f laut a)

$ I noculacin

Se t oma una colonia bien aislada de la super f icie del medio
de aislamient o pr imar io y se inocula como una est r a nica
en la super f icie del pico de f laut a.

$ I ncubacin

Tiempo = 24 - 48 hor as

Temper at ur a = 35 - 37C

$ Pr ecauciones

El inculo debe ser liviano.
S st e es demasiado gr ande, compuest os or gnicos
pr ef or mados dent r o de la par ed celular de las bact er ias
que est n mur iendo pueden liber ar suf icient e car bono y
nit r geno como par a dar un r esult ado f also posit ivo.

45
Cuando se inocula una ser ie de t ubos de medios de cult ivo
dif er enciales con un micr oor ganismo desconocido, es
impor t ant e sembr ar pr imer o el medio cit r at ado par a
pr evenir el ar r ast r e de pr ot enas o car bohidr at os de los
ot r os medios, aunque se supone se est er iliza el asa en cada
inoculacin.

$ Result ados

MEDIO NO INOCULADO NEGATIVO
POSITIVO POSITIVO
POSITIVO
Figura 14. Pruebas bioqumicas de citrato
46


Posit ivo: Cr ecimient o aunque no exist a cambio de color .
Cr ecimient o y el medio de color azul int enso en
pico de f laut a.

Negat ivo: No se obser va cr ecimient o y medio de color
ver de.

Si se ut iliza car bono a par t ir de cit r at o de sodio, t ambin
se ext r ae nit r geno del f osf at o de amonio cont enido en el
medio, liber ndose amoniaco. En ocasiones se det ect a un
cr ecimient o visible a lo lar go de la lnea de siembr a ant es
de la apar icin de color . Est e cr ecimient o visible t ambin
indica r esult ado posit ivo.


Negat ivo (-)

Posit ivo (+)

47

$ Aplicaciones

$ Micr oor ganismos posit ivos

Especies de:
Salmonella
Ar izona
Cit r obact er
Ent er obact er
Klebsiella
Ser r at ia licuef aciens
Pseudomonas cepacia

$ Micr oor ganismos negat ivos

Edwar siella
Yer sinia ent er ocolt ica
Escher ichia coli
Shigella
Yer sinia pseudot uber culosis
Ot r as especies de Mor axella
Pr ot eus mor ganii

48
3. PRUEBA DE LI CUEFACCI N DE
GELATI NA

$ Medio de cult ivo: Gelat ina nut r it iva

Composicin:
a) Ext r act o de car ne
b) Pept ona
c) Gelat ina
d) Agua dest ilada

$ Fundament o

Det er minar la capacidad de un or ganismo de pr oducir
enzimas de t ipo pr ot eolt ico (gelat inasas) que licuan la
gelat ina.

Las pr ot enas que se pr oducen nat ur alment e son demasiado
gr andes par a ent r ar en una clula bact er iana; por lo t ant o,
par a que una clula ut ilice las pr ot enas, pr imer o deben ser
cat abolizadas en component es ms pequeos. Las enzimas
exonuclear es de t ipo pr ot elt ico, gelat inasas, son
secr et adas por cier t as bact er ias par a desdoblar a las
pr ot enas y est a capacidad ayuda a la ident if icacin
bact er iana.

49
gelat inasas
Pr ot ena + H
2
O polippt idos
Pr ot easas

gelat inasas
Polippt idos + H
2
O aminocidos
Pept idasas individuales


Semislido

$ I noculacin

Picadur a en posicin ver t ical hast a una pr of undidad de 2 -
2.5 cm, inculo denso.



Temper at ur a: 35 - 37 C
Al t r mino de la incubacin se coloca el t ubo en un
r ef r iger ador o bao de hielo dur ant e dos hor as par a
det er minar si se ha pr oducido o no la digest in de la
gelat ina (licuef accin).
50
MEDIO NO
INOCULADO
NEGATIVO

$ Result ados


Posit ivo: Medio licuado (est ado lquido)

Negat ivo: Medio slido

El medio de gelat ina nut r it iva par a puncin no es convenient e
par a las pr uebas de r ut ina de la act ividad de la gelat inasa,
dado que muchas especies r equier en una incubacin
pr olongada ant es de que apar ezcan muest r as de licuef accin.
En los mt odos diagnst icos de r ut ina par a ident if icar
bact er ias, la dur acin de la incubacin deber alcanzar un
per iodo r azonable.
POSITIVO
Figura 15. Pruebas bioqumicas de licuefaccin de gelatina
51


Posit ivo (+)

Negat ivo (-)

$ Aplicaciones


St aphylococcus aur eus
St aphylococcus epider midis (lent a)
Ser r at ia liquef aciens
Ser r at ia mar cescens
Pseudomonas aer uginosa
Especies de Flavobact er iumm


List er ia monocyt ogenes

Figura 16. Micrococcus
52
4. PRUEBA DE LA LECHE CON TORNASOL

$ Medio de cult ivo: Medio de leche t or nasolada
Composicin:
a) Leche descr emada
b) Agua dest ilada
c) I ndicador de pH: Tor nasol
! cido: Color r oj o (pH = 4.5)
! Alcalino: Color azul ( pH = 8.3)
! Medio no inoculado: Azul pur pr eo (pH = 6.8)

$ Fundament o

Per mit e dif er enciar or ganismos sobr e la base de sus
mlt iples r eacciones met ablicas en un medio lct eo como:
f er ment acin de lact osa, caselisis, y coagulacin de la
casena. El t or nasol incor por ado a la leche es un indicador
de pH y de oxidacin-r educcin que hace que el medio pueda
indicar diver sas f unciones met ablicas. La leche cont iene
lact osa, casena, lact albmina y lact oglobulina, por lo t ant o,
un or ganismo puede most r ar una o var ias pr opiedades
met ablicas en la leche t or nasolada ayudando as a la
ident if icacin bact er iana:

1. Fer ment acin de lact osa
2. Reduccin del t or nasol
3. For macin de cogulo
4. Pept onizacin (digest in)
5. For macin de gas
53

1. Fer ment acin de lact osa

Cuando un or ganismo es capaz de f er ment ar lact osa,
pr oduce pr incipalment e cido lct ico, con una condicin
cida indicada por el cambio de color del medio que se
vuelve r oj o r osado. A veces el cido but r ico es el pr oduct o
f inal.

Cier t as bact er ias que f or man lcalis no f er ment an
lact osa, per o act an sobr e las sust ancias nit r ogenadas que
se encuent r an en la leche liber ando amoniaco, y dando en
consecuencia un pH alcalino que se manif iest a por un color
pr pur a azulado.

Lact osa glucosa + galact osa

cido lct ico
Glucosa cido pir vico cido but r ico
CO
2
+ H
2

2. Reduccin del t or nasol

El t or nasol es un indicador de pH y un indicador de
oxidacin r educcin; algunos or ganismos son capaces de
r educir el t or nasol a una leucobase.
54

3. For macin de cogulo

Las enzimas pr ot eolt icas pr ovocan la hidr lisis de las
pr ot enas de la leche lo que da como r esult ado su
coagulacin. La pr incipal enzima r esponsable de la f or macin
de cogulo es la r enina.

La f or macin del cogulo es causada por la pr ecipit acin de
la casena, por la f or macin de cidos o por la conver sin de
la casena en par acasena por la enzima r enina. La casena es
una f osf opr ot ena complej a y es la pr ot ena ms impor t ant e
de la leche.

Formacin de un cogulo cido

La pr ecipit acin de la casena pr ovocada por los cidos
or gnicos a par t ir de lact osa en condiciones cidas pr oduce
un cogulo f ir me y gelat inoso que no se separ a de las
par edes del t ubo.

Lact osa cido lct ico

caseinasa
c. Lct ico + casenat o de Ca caseingeno (pp)

55

Formacin del cogulo

Ot r a f or ma de cogulo es el coaj o, o sea el pr oceso de
coaj ado de la leche por la conver sin de la casena en
par acasena por las enzimas r enina, pepsina o quimiot r ipsina
cont enidas en la leche. La r enina pr ovoca el cuaj ado de la
leche convir t iendo la sal de casena soluble en una
par acasena insoluble que es el cuaj o o r equesn.

r enina
Casena par acasena (pp)
Ca

4. Pept onizacin (digest in)

La hidr lisis de la casena por la act ividad enzimt ica
pr oduce una conver sin f inal del pr ecipit ado caseingeno en
un lquido clar o; el pr oceso se denomina pept onizacin y se
manif iest a por una aclar acin acuosa del medio causada por
una digest in del pr ecipit ado (cogulo) y las pr ot enas de la
leche por las enzimas pr ot eolt icas de las bact er ias. Sin
embar go, solo se pr oduce una pept onizacin cuando la
bact er ia que se desar r olla en la leche t or nasolada cont iene
la enzima pr ot eolt ica caseinasa.

56

5. For macin de gas

Los gases CO
2
y H
2
se f or man como r esult ado f inal de la
f er ment acin de la lact osa.


Lquido

$ I noculacin

Dif usin


Tiempo: 18-48 hor as


57
$ Result ados


Roj o r osado: cido; f er ment acin de lact osa
Azul pur pr eo: No f er ment acin de lact osa; sin cambio del
indicador de pH.
Azul: Alcalino; Ausencia f er ment acin de lact osa. El
or ganismo at aca las sust ancias nit r ogenadas que se
encuent r an en el medio.
Blanco: Reduccin del t or nasol a una leucobase.
For macin de cogulo: Coagulacin de la pr ot ena de la
leche.
Aclar acin del medio: Digest in; se a inger ido la pr ot ena de
la leche.
Gas: Pr oduccin de bur buj as en la campana de Dur ham.

Medio no
inoculado
Fermentacin
de lactosa
Digestin
Reduccin
de tornasol
Cogulo
No fermentacin
de lactosa
Figura 17. Pruebas bioqumicas de leche con tornasol
58

En la t abla de r esult ados solo se escr ibir n las let r as que
apar ecen dent r o del par nt esis.

Roj o r osado (A)
Azul pur pr eo (SC)
Azul (K)
Blanco (Red)
Cogulo (C)
Digest in (D)
Gas (G)

$ Aplicaciones

Ayuda a la dif er enciacin de especies sobr e t odo del
gner o Clost r idium.

Sin cr ecimient o:
Clost r idium cochlear ium
C. dif f icile
C. put r ef aciens
C. t et anomor phum
St r ept ococcus equinus

Con cr ecimient o:
St r ept ococcus bovis

59
5. PRUEBA DE REDUCCI N DE LA LECHE CON
AZUL DE METI LENO

$ Medio de cult ivo: Medio de leche con azul de
met ileno
Composicin:
a) Leche descr emada deshidr at ada
b) Agua dest ilada
c) I ndicador : Azul de met ileno
I ncolor o : Est ado r educido
Azul : Est ado oxidado; medio no inoculado
(pH=6.4)

$ Fundament o

Per mit e dif er enciar or ganismos por su capacidad de r educir
el azul de met ileno en un medio con leche. El sist ema
cit ocr omo oxidasa act iva la oxidacin del cit ocr omo
r educido por el oxgeno molecular que a su vez act a como
un acept or de elect r ones en el per iodo t er minal del sist ema
de t r ansf er encia de elect r ones. Cuando exist en condiciones
aer bicas el oxgeno es el acept or f inal del hidr geno,
pr oduciendo agua o per xido de hidr geno segn la especie
bact er iana y su sist ema enzimt ico.

60
Los sust r at os ar t if iciales como el azul de met ileno, pueden
sust it uir a los acept or es de elect r ones nat ur ales en
cualquier lugar de la cadena de t r anspor t e de elect r ones,
donde act an como r educt or es del sist ema cit ocr omo.
Cuando se agr ega el color ant e sint t ico r educible, azul de
met ileno a un medio que cont enga or ganismos
met abolizant es, los elect r ones pr oducidos por un sust r at o
oxidable son desplazados de su ciclo nor mal, si se pr oduce
r educt asa y son ut ilizados par a r educir el color ant e.


Lquido

$ I noculacin

Dif usin, inculo denso

(CH
3
)
2
N
N(CH
3
)
2
N
(CH
3
)
2
N
N(CH
3
)
2
N
(CH
3
)
2
N
N(CH
3
)
2
N
S
H
Azul de metileno (estado
oxidado, color azul).
Azul de metileno (estado
reducido, incoloro).
61




$ Result ados


Posit iva: I ncolor o; r educcin

Negat iva: Azul; no hay r educcin
NEGATIVO
POSITIVO
MEDIO NO
INOCULADO
Figura 18. Pruebas bioqumicas de leche con azul de metileno
62


R = Reduccin

(-) = Negat ivo, sin cambio de color

$ Aplicaciones

Est a capacidad enzimt ica se ut iliza f undament alment e
par a dif er enciar los ent er ococos (especies de
St r ept ococcus del gr upo D) de ot r os miembr os del gner o
St r ept ococcus.

Ent er ococos (St r ept ococcus del gr upo D)

Especies de St r ept ococcus que por lo gener al no son
ent er ococos.

Figura 19. Salmonella
63

6. PRUEBA DE OXI DACI N FERMENTACI N

$ Medio de cult ivo: Medio bsico de Hugh Leif son,
medio O/ F.

Component es:
a) Pept ona
b) Clor ur o de sodio
c) Fosf at o de pot asio
d) Hidr at os de car bono (glucosa, lact osa, sacar osa,
malt osa).
e) Agar
f) Agua dest ilada
g) I ndicador de pH: Azul de br omot imol
cido : Color amar illo (pH = 6)
Alcalino : Azul de Pr usia int enso (pH = 7.6)
Medio no inoculado: Ver de (pH = 7.1)

Se deben t ener dos t ubos par a est a pr ueba uno sin sello y
ot r o con sello de par af ina.

$ Fundament o

Det er mina el met abolismo oxidat ivo o f er ment at ivo de un
hidr at o de car bono.
64

La ut ilizacin que una bact er ia hace de los hidr at os de
car bono t iene lugar por alguno de dos pr ocesos: de
f er ment acin o de oxidacin. Algunas bact er ias son capaces
de met abolizar un car bohidr at o solo en condiciones
aer bicas, mient r as que ot r as pr oducen cido t ant o
aer bica como anaer bicament e. La dif er encia pr incipal
ent r e el met abolismo f er ment at ivo y oxidat ivo depende de
los r equer imient os de oxgeno at mosf r ico y de la
f osf or ilacin inicial. La f er ment acin es un pr oceso
anaer bico que r equier e la f osf or ilacin inicial de la glucosa
pr eviament e a su degr adacin, mient r as que la oxidacin, en
ausencia de compuest os inor gnicos como nit r at o y sulf at o,
es un pr oceso est r ict ament e aer bico que compr ende la
oxidacin dir ect a de una molcula de glucosa no f osf or ilada
(inicialment e). La f er ment acin pr oduce una acidez ms
elevada que el pr oceso met ablico oxidat ivo.

El medio OF cont iene una elevada concent r acin de
car bohidr at os con una baj a concent r acin de pept ona,
pr oduciendo as una condicin alcalina que neut r aliza la ms
liger a acidez pr oducida por un or ganismo oxidat ivo. El
f osf at o de pot asio agr egado al medio f avor ece la
f er ment acin y act a como buf f er par a cont r olar el pH. La
concent r acin de agar empleado per mit e t ambin la
det er minacin de la movilidad y ayuda a la dist r ibucin por
t odo el t ubo del cido pr oducido en la super f icie del medio.
65

Son necesar ios dos t ubos de cada medio de hidr at os de
car bono par a la pr ueba. El medio en un t ubo se expone al
air e, el ot r o se cubr e con aceit e miner al o par af ina lquida
est r iles. Las bact er ias oxidat ivas pr oducen cidos solo en
el t ubo abier t o expuest o al oxgeno at mosf r ico; los
micoor ganismos f er ment ador es pr oducen cidos en ambos
t ubos; y las bact er ias no sacar olt icas son iner t es en est e
medio, que per manece con un pH alcalino despus de la
incubacin.

La pr ueba OF t iene algunas limit aciones; los bacilos no
f er ment ador es de cr ecimient o lent o pueden no pr oducir
cambios de color dur ant e var ios das, y especies que son
par t icular ment e act ivas sobr e aminocidos pueden hacer
que r eacciones cidas dbiles r evier t an con el t iempo,
conf undiendo la int er pr et acin f inal.


Semislido (t ambin per mit e la obser vacin de movilidad).

$ I noculacin

Picadur a, inculo poco denso. Picar ambos t ubos
apr oximadament e hast a 0.6 mm de f ondo.

66
MEDIO NO INOCULADO
FERMENTADOR
NO OXIDANTE NO FERMENTADOR
OXIDANTE NO FERMENTADOR

$ Condiciones de incubacin:


Temper at ur a: 35-37C

$ Result ados

Figura 20. Pruebas bioqumicas de Oxidacin / Fermentacin
67
I ncubacin

Oxidativo
No
fermentador
Fermentador No
oxidativo
No
fermentador
Figura 21. Diagrama de interpretacin de la prueba de Oxidacin / Fermentacin


Amar illo: cido
Bur buj as: Gas
Ver de: alcalino

$ Aplicaciones

1. Fundament alment e par a dif er enciar gner os
int est inales no ent r icos, Gr am negat ivos de la Familia
Ent er obact er iaceae.

68
2. Ayuda a la dif er enciacin ent r e los gner os de la
Familia Micr ococcaceae.
Micr ococcus oxida glucosa
St aphylococcus f er ment an glucosa

3. Ayuda a la ident if icacin de Ent er obact er ias
Fer ment ador as de glucosa: Escher ichia coli
Oxidat ivas de glucosa: Pseudomonas aer uginosa
No sacar olt ico: Especies de Mor axella


Met abolismo Tubo
c/ reaccin
Tubo sin sello Tubo con sello
Oxidacin (O) Abier t o Amar illo (A) Ver de (-)
Ferment acin (F) Cubier t o Amar illo (A) Amar illo (A)
Ferment acin (F) Cubier t o Amar illo (AG) Amar illo (AG)
Ni f erment acin
ni oxidacin (- )
Ninguno Azul o ver de (-) Ver de (-)
Ferment acin y
oxidacin (O+F)
Ambos Amar illo (A
AG)
Amar illo (A
AG)

Tabla 1. Reporte de resultados de O / F
69
6. REACCI N DE LA UREASA

$ Medio de cult ivo: Agar ur ea de Chr ist ensen
Composicin:
a) Pept ona
b) Clor ur o de sodio
c) Fosf at o monopot sico
c) Glucosa
d) Ur ea
e) Agar
f ) Agua dest ilada
g) I ndicador de pH: Roj o de f enol
! cido: Amar illo (pH = 6.8)
! Alcalino : Roj o r osado (pH = 8.4)
! Medio no inoculado: Amar illo (pH = 6.8)

$ Fundament o

Det er mina la capacidad de un or ganismo de desdoblar la
ur ea f or mando dos molculas de amoniaco por la accin de la
enzima ur easa pr oduciendo un cambio de color r oj o en el
medio.

La hidr lisis de la ur ea es cat alizada por la ur easa, par a dar
dos molculas de amoniaco. La ur easa es una impor t ant e
enzima micr obiana vinculada con la descomposicin de los
compuest os or gnicos.

70

H
2
N
C=O + 2 HOH CO
2
+ H
2
O + 2 NH
3
(XH
4
)
2
CO
2
H
2
N
Ur ea


Slido en pico de f laut a (cola de pescado)

$ I noculacin

Est r a en pico de f laut a (no hacer puncin).




71
$ Result ados


Posit ivo: Roj o r osado int enso en el pico de f laut a

Negat ivo: Amar illo


Posit ivo (+)

Negat ivo (-)

MEDIO NO INOCULADO NEGATIVO
POSITIVO POSITIVO
Figura 22. Pruebas bioqumicas: Urea
72
$ Obser vaciones

En muchas especies, la r eaccin posit iva de ur easa se
det ect a pr imer o por un cambio de color r oj o en la par t e de
pico de f laut a, el cual, al pr incipio se vuelve r oj o por que la
accin alcalina, r esult ado de la degr adacin de pequeas
cant idades de ur ea, es aument ada por las aminas f or madas
a par t ir de la descar boxilacin oxidat iva de los aminocidos
en la par t e del medio expuest a al air e.

$ Aplicaciones

1. Se usa par a dif er enciar los or ganismos Pr ot eus
r pidament e ur easa posit ivos de ot r os miembr os de las
ent er obact er ias, ot r os gner os pueden ser posit ivos
r et ar dados.

- Klebsiella (+)
- Escher ichia coli (-)
- Pr ot eus (+ r pido)
- Pr ovidencia (-)

Figura 23. Salmonella typhi
73
8. REACCI N DE VOGES- PROSKAUER (VP)

$ Medio de cult ivo: Medio de Clar k y Lubs (caldo
RM/ VP)

Composicin:
a) Polipept ona
b) Dext r osa
c) Fosf at o de pot asio
d) Agua dest ilada

$ Fundament o

Det er mina la capacidad de algunos or ganismos de pr oducir
un pr oduct o f inal neut r o, la acet ona a par t ir de la
f er ment acin de glucosa.

La r eaccin de VP se basa en la det eccin de acet ona como
pr oduct o f inal neut r o der ivado del met abolismo de la
glucosa. st a es met abolizada en cido pir vico,
int er mediar io clave en la gluclisis. A par t ir del cido
pir vico, una bact er ia puede seguir muchas vas. La
pr oduccin de acet ona (pr ecur sor de la pr oduccin de 2,3-
but anediol) que es uno de los ciclos par a la degr adacin de
la glucosa en las bact er ias. La f or macin de acet ona y
but ilenglicol es una va alt er nat iva del met abolismo del cido
pir vico. Las bact er ias que ut ilizan est a va pr oducen solo
pequeas cant idades de cidos mixt os que son insuf icient es
74
par a disminuir el pH del medio de r oj o de met ilo, lo
bast ant e como par a pr oducir un cambio de color . Por est e
mot ivo muchas de las especies de Ent er obact er ias son VP
posit ivas, con pocas excepciones son RM negat ivas y
vicever sa.

El pr imer r eact ivo agr egado a una alcuot a incubada es el
cat alizador alf a-naf t ol por que st e act a como
int ensif icador del color , lo que aument a la sensibilidad de la
r eaccin sin pr dida de su especif icidad. El segundo
r eact ivo es el KOH que cuando se agr ega al medio de VP
cont r ibuye a la absor cin de CO
2
. No debe exceder se de un
volumen exact o. El KOH r eaccionar con la pept ona dando
un color r osado salmn y con el agr egado post er ior de alf a-
naf t ol no habr alt er acin del color .

O H
+
C H 3
C O
C H O H
C H 2
C H 3
C O
C H 2
C O
+
C
N H 2
N H
N H
R
Alfa-naftol (catalizador)
Acetona
KOH
O
2
OXIDADO
Diacetilo
Ncleo de guanidina
condensacin
Color rojo rosado
75

Lquido

$ I noculacin

Dif usin




$ React ivos adicionales

a) Alf a naf t ol al 5%, int ensif icador del color
b) Hidr xido de pot asio 40%, agent e oxidant e

Agr egar dir ect ament e los r eact ivos al t ubo despus de la
incubacin en el siguient e or den:
1) 0.6ml de alf a naf t ol
2) 0.2ml de KOH
3) Agit ar el t ubo suavement e, dej ar r eposar de 10 a
15 minut os ant es de la int er pr et acin.

76
$ Pr ecauciones

El or den de adicin de los r eact ivos es impor t ant e, ya que la
inver sin de incor por acin dar como r esult ado un dbil
posit ivo o f also negat ivo.

No debe exceder se un volumen exact o de KOH ya que el
exceso puede ocult ar una r eaccin VP dbilment e posit iva.

$ Result ados


Posit ivo: Roj o r osado en la super f icie del medio (pr esencia
de acet ona).

Negat ivo: Amar illo. Puede f or mar se un color cobr izo per o
an as la r eaccin es negat iva.
MEDIO NO
INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
Figura 24. Prueba bioqumicas de la reaccin de Voges - Proskauer
77


Posit ivo (+)
Negat ivo (-)

$ Aplicaciones


- Klebsiella pneunoniae
- Yer sinia ent er ocolit ica

$ Micr oor ganismos
negat ivos

-Escher ichia coli
-K. ozaenae

Figura 25. Escherichia coli
78

9. REACCI N DE ROJO DE METI LO (RM)

$ Medio de cult ivo : Medio de Clar k y Lubs (caldo RM/ VP)

Composicin:
e) Polipept ona
f) Dext r osa
g) Fosf at o de pot asio
h) Agua dest ilada
i) I ndicador : r oj o de met ilo
PH inicial = 6.9, medio no inoculado, color r oj o.
cido: r oj o (pH = 4.4)
Alcalino: amar illo (pH = 6)

$ Fundament o

Compr obar la capacidad de un or ganismo de pr oducir y
mant ener est ables los pr oduct os t er minales cidos de la
f er ment acin de la glucosa y vencer la capacidad
amor t iguador a del sist ema. Es una pr ueba cualit at iva de la
pr oduccin de cido (det er minacin de pH). Las bact er ias
que pr incipalment e siguen la va de f er ment acin de cidos
mixt os a menudo pr oducen suf icient e cido par a mant ener
un pH menor de 4.4.

79
La pr ueba de r oj o de met ilo se basa en el empleo de un
indicador de pH par a det er minar la concent r acin de iones
hidr geno pr esent es cuando un or ganismo f er ment a
glucosa. Las bact er ias RM posit ivas pr oducen cidos
est ables mant eniendo una alt a concent r acin de iones
hidr geno hast a alcanzar cier t a concent r acin y ent onces
cesa t oda act ividad.

Los or ganismos RM negat ivo t ambin pr oducen cidos per o
t ienen una menor concent r acin de iones hidr geno por que
hay una r ever sin hacia la neut r alidad debida a la nueva
degr adacin de los cidos or gnicos en car bonat os.

La validez de la pr ueba de RM depende de un t iempo de
incubacin suf icient e como par a per mit ir que se pr oduzca la
dif er encia en el met abolismo de la glucosa. Los or ganismos
en est udio se incubar n por lo menos 2 das, lo que per mit e
que t odos los or ganismos con baj a pr opor cin gaseosa
muest r en su lmit e en la concent r acin de iones hidr geno.


Lquido

$ I noculacin

Dif usin
80


Tiempo: 48 hor as


$ React ivos adicionales par a Roj o de Met ilo

Roj o de met ilo. Adicionar 5 got as al t ubo pr eviament e
incubado.

I nt er pr et ar el r esult ado del color inmediat ament e.

Conser vacin: Guar dar el r eact ivo en r ef r iger acin (4C)
mient r as no se usa.

$ Result ados

MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
Figura 26. Pruebas bioqumicas de la reaccin de Rojo de Metilo
81
$ I nt er pr et acin de r oj o de met ilo

No debe int ent ar se int er pr et ar un r esult ado con el r oj o de
met ilo despus de menos de 48 hor as de incubacin.

Posit iva: Roj o en la super f icie del medio (pH = 4.4)
Algunas bact er ias pueden pr oducir menor es cant idades de
cido a par t ir del sust r at o por ello es posible que apar ezca
un color nar anj a. Est o indica una pr ueba posit iva.

Negat ivo: Amar illo (pH = 6) nar anj a


Posit ivo (+)
Negat ivo (-)

$ Aplicaciones

! Micr oor ganismos posit ivos

- Escher ichia coli
- Especies de Yer sinia

! Micr oor ganismos negat ivos
Ent er obact er aer ogenes
Ent er obact er cloacae
Klebsiella
Figura 27.
82

10. PRUEBA DE REDUCCI N DE NI TRATOS

$ Medio de cult ivo: Caldo con nit r at o
I ngr edient es:
b) Pept ona
c) Nit r at o de pot asio
d) Agar
e) Agua dest ilada
f) PH inicial = 7.0

$ Fundament o

Det er minar la capacidad de un or ganismo de r educir el
nit r at o en nit r it os o en nit r geno libr e.

La r educcin de nit r at o en nit r it o y en gas nit r geno t iene
lugar gener alment e en condiciones anaer obias, en las cuales
un or ganismo obt iene su oxgeno del nit r at o. El oxgeno
sir ve como un acept or de hidr geno.

Reduccin del nit r at o en nit r it o

NO
3
+ 2 e 2 H
+
NO
2
+ H
2
O
Nit r at o nit r it o

83
Nit r at o en nit r geno molecular

2 NO
3
+ 10 e + 12 H
+
N
2
+ 6 H
2
O

La r educcin de nit r at o en nit r it o est indicada por la
apar icin de color cuando el nit r it o r eacciona con los dos
r eact ivos. La r eaccin de color r esult ant e se debe a la
f or macin de un compuest o diazoico, p-sulf obenceno-azo-
alf a-naf t ilamina.

SO
2
H
NH
2
N N
P-sulfobenceno-azo-affa-naftilamina
(rojo)
(C
6
H
3
NHNH
3
) OSO
3
H
Arilhidracina
cido actico
NH
2
SO
2
H
NH
2
+ HNO
2
cido sulfanilico
(incoloro)
Alfa-naftilamina
SO2H
NH2
N N
+ CH
2
COOH
Zn
84

Lquido

$ I noculacin

Dif usin, inculo denso.



Temper at ur a 35 - 37 C

Rar ament e es necesar ia una incubacin pr olongada de hast a
5 das. La mayor a de los or ganismos capaces de r educir el
nit r at o, lo hacen dent r o de las 24 hor as.


1. Alf a - naf t ilamina 0.05 %
2. cido sulf anilico 0.8 %

Adicionar dir ect ament e al t ubo de r eaccin en el siguient e
or den:

1. Alf a - naf t ilamina 1 ml.
2. cido sulf anilico 1 ml.
85
Conser vacin: Guar dar ambos r eact ivos en el r ef r iger ador
mient r as no se usan. Por lo gener al se mant ienen est ables
dur ant e t r es meses.

$ Result ados


Se int er pr et an los r esult ados un minut o despus de adicionar
los r eact ivos.

Posit ivo: r osa a r oj o int enso

POSITIVO
NEGATIVO
MEDIO NO INOCULADO
Figura 28. Pruebas bioqumicas de Reduccin de Nitritos
86
$ Pr ecauciones

Una pr ueba negat iva indica que los nit r at os, no han sido
r educidos o que han sido r educidos a ot r os pr oduct os, como
amoniaco, nit r geno molecular , oxido nt r ico u xido nit r oso
e hidr oxilamina.

Dado que los r eact ivos de pr ueba det ect an solo nit r it os, est e
lt imo pr oceso llevar a a una lect ur a f alsa negat iva. Por
ende es necesar io agr egar una pequea cant idad de polvo de
zinc a t odas las r eacciones negat ivas.

Los iones zinc r educen nit r at os a nit r it os y la apar icin de
color r oj o despus del agr egado de zinc indica una r eaccin
posit iva.


Posit ivo (+)
Negat ivo (-)

$ Aplicaciones

Ayuda a la ident if icacin de Ent er obact er ias que por lo
gener al son posit ivas.

Todas las Ent er obact er ias, con excepcin de cier t os t ipos de
Ent er obact er agglomer ans y especies de Er winia, r educen
nit r at os a nit r it os.
87
11. PRUEBA DE FENI LALANI NA DESAMI NASA

$ Medio de cult ivo: agar f enilalanina

Composicin:
a) D-L-f enilalanina
b) Ext r act o de levadur a
c) Clor ur o de sodio
d) Fosf at o de sodio
e) Agar
f) Agua dest ilada
g) PH inicial = 7.3

$ Fundament o

Det er mina la capacidad de un or ganismo de desaminar la
f enilalanina en cido f enilpir vico por su act ividad
enzimt ica, con la consiguient e acidez r esult ant e.

El aminocido ar omt ico f enilalanina suf r e una desaminacin
oxidat iva cat alizada por un aminocido oxidasa par a pr oducir
el cido cet nico.

La desaminacin oxidat iva da como r esult ado la ext r accin
del gr upo amino del aminocido par a f or mar un doble enlace
alf a-cet ocido y libr e de amoniaco.

88
Est e es un pr oceso en dos et apas:

1. La ext r accin del hidr geno dando un aminocido y el
hidr geno se combina con el oxgeno par a f or mar agua.

2. El aminocido es hidr olizado en un cet ocido

Qumica de la accin react iva

Como la f enilalanina se encuent r a desaminada, el color
pr oducido como consecuencia del agr egado de clor ur o
f r r ico al 10 % se debe a la f or macin de un cet ocido el
CH
2 CH
NH
2
COOH
+ 1/2 O
- 2H
FLAVOPROTENA
FENILALANINA
CH
2
COOH
O
C
+ NH
2
AMONIACO
CIDO FENILPIRVICO
89
cido f enilpir vico. La r eaccin posit iva con est e r eact ivo se
debe a la f or macin de una hidr azona. El clor ur o f r r ico
act a como agent e quelant e act uando con el cido
f enilpir vico par a f or mar un color ver de.

Cuando se expone al oxgeno at mosf r ico un t ubo de cult ivo
con f enilalanina despus del agr egar el clor ur o f r r ico
aument a la pr oduccin y la int ensidad de la r eaccin
posit iva.


Slido en pico de f laut a

$ I noculacin

Est r a en pico de f laut a, inculo denso.

CH2
C
COOH
O + RNH NH2
CH2
C
COOH
N NHR
cido fenilpirvico
Hidracina
Fenilhidrazona
90


Temper at ur a 35 - 37C


Clor ur o f r r ico 10%

Adicionar de 4-5 got as a un t ubo incubado

Hacer r ot ar suavement e el t ubo par a que el cr ecimient o se
separ e.

Esper ar de 1 a 5 minut os par a leer la r eaccin.

Conser vacin: Guar dar los r eact ivos en r ef r iger acin y
colocar los en f r ascos oscur os par a evit ar la
descomposicin.

$ Aplicaciones

Est a act ividad enzimt ica es car act er st ica de t odas las
especies de Pr ot eus y del gr upo Pr ovidencia, y se usa par a
separ ar est os dos gner os de ot r os miembr os de las
Ent er obact er ias.
91

$ Result ados


Posit iva: Roj o clar o a int enso en el pico de f laut a.


Posit ivo (+)
Negat ivo (-)
MEDIO NO
INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
Figura 29. Pruebas bioqumicas de fenilalanina desaminasa
92

12. PRUEBA DE SULFURO I NDOL MOVI LI DAD
(SI M)

$ Medio e cult ivo: Medio SI M

Composicin:
b) Pept ona
c) Hier r o pept onizado (indicador de SH
2
)
d) Tiosulf at o de sodio (indicador de SH
2
)
e) Agar
f) Agua dest ilada
g) pH = 7.3

$ Fundament o

Det er minar si un or ganismo es mvil o inmvil, si es capaz de
liber ar cido sulf hdr ico por accin enzimt ica de los
aminocidos que cont ienen azuf r e pr oduciendo una r eaccin
visible de color negr o y por lt imo la capacidad de
desdoblar el indol de la molcula t r ipt f ano, adems que la
consist encia del medio per mit e la obser vacin de la
movilidad de algunas bact er ias.

1. Pr oduccin de cido sulf hdr ico
2. Pr oduccin de indol
3. Movilidad
93

1. Prueba de cido sulf hdrico

La pr ot eolisis de las pr ot enas en aminocidos (aa.)
individuales, algunas especies bact er ianas son capaces de
liber ar azuf r e enzimt icament e de los dif er ent es aa. que
las cont ienen, pr oduciendo el gas cido sulf hdr ico (SH
2
). La
pept ona, cist ena y t iosulf at o, t odos son f uent es de azuf r e,
per o las dif er ent es especies ut ilizan dist int os compuest os o
aa. que cont ienen azuf r e par a pr oducir SH
2
. La enzima
r esponsable de st a act ividad es la cist einasa.

Primera et apa:

La bact er ia r eacciona con el t iosulf at o de sodio por medio
de una r eaccin de r educcin que da un sulf it o y un sulf at o.
Est e es un pr oceso de r espir acin anaer bica donde el
t omo de azuf r e sir ve como acept or de elect r ones par a la
oxidacin de los sust r at os or gnicos. El t iosulf at o
r eemplaza al sulf at o como acept or de elect r ones y es una
f uent e de azuf r e par a el or ganismo.

Segunda et apa:

El gas incolor o SH
2
r eacciona con una sal pesada, cit r at o
f r r ico de amonio par a pr oducir un pr ecipit ado negr o
insoluble, sulf ur o f er r oso.
94

Bact er ia (medio cido) + t iosulf at o de sodio gas SH
2

SH
2
+ iones f r r icos sulf ur o f er r oso (pp. negr o)

Medios para la det eccin de H
2
S

$ Agar sulf it o de bismut o
$ Agar cit r at o sulf ur o
$ Agar desoxicolat o - cit r at o
$ Medio LI A
$ Medio TSI
$ Agar acet at o de plomo
$ Agar S-S
$ Agar XLD
$ Medio SI M

2. Prueba de la produccin de indol

El t r ipt f ano es un aminocido que puede ser oxidado por
cier t as bact er ias par a f or mar t r es met abolit os pr incipales:
indol, escat ol e indolact ico. Diver sas enzimas
int r acelular es que int er vienen en st e pr oceso r eciben el
95
nombr e de t r ipt of anasa, lo que implica el sist ema complet o
de enzimas vinculadas con la pr oduccin del indol. El
pr incipal int er mediar io en la degr adacin del t r ipt f ano es
el cido indolpir vico.

La degr adacin del t r ipt f ano liber a indol, cido pir vico,
amoniaco y ener ga. El cido pir vico puede ser nuevament e
met abolizado por medio del ciclo glucolt ico o ent r ar en el
ciclo de Kr ebs par a liber ar CO
2
y H
2
O y una gr an pr oduccin
de ener ga. El NH
3
puede ser ut ilizado par a sint et izar
nuevos aminocidos empleando la ener ga que se encuent r a
par a la r eaccin anablica.

La pr ueba de indol se bas en la f or macin de un complej o
de color r oj o cuando el indol r eacciona con el gr upo aldehdo
de p-dimet ilaminobenzaldehdo (sust ancia act iva del
r eact ivo de Kovacs).

La f or macin de indol se pr oduce solament e en aquellos
or ganismos capaces de f er ment ar los hidr at os de car bono.
La elevada acidez pr oducida por la f er ment acin de la
glucosa puede impedir el cr ecimient o del or ganismo o inhibir
la enzima.

El agr egado de t r ipt f ano est imula la pr oduccin de indol
mient r as que la glucosa la inhibe.

96

3. Movilidad

Det er mina si un or ganismo es mvil o inmvil. Las bact er ias
t ienen movilidad por medio de sus f lagelos, que se
encuent r an pr incipalment e ent r e los bacilos; sin embar go
algunas f or mas de cocos son inmviles.

Las bact er ias mviles pueden cont ener un solo f lagelo o
muchos; adems su localizacin var a
con su especie bact er iana y las
condiciones de cult ivo. A veces, las
bact er ias con movilidad pr oducen
var iant es no mviles que par ecen ser
est ables y r ar ament e se r evier t en en
f or mas mviles.
N
H
COOH
NH
2
L - T r i p t f a n o
N
H
I n d o l
+
H
3
C
COOH
O
c i d o P i r v i c o
+ N H
3
A m o n i a c o
T r i p t o f a n a s a
H
2
O
D e s a m i n a c i n
Figura 30. Salmonella typhi
97

Medios para la det eccin de movilidad

1. SI M
2. MI O


Semislido en f or ma ver t ical

$ I noculacin

Picadur a en f or ma ver t ical



Temper at ur a 35 - 37C

Los cult ivos que van a somet er se a pr uebas de indol deber n
ser incubados aer bicament e el descenso de la t ensin de
oxgeno disminuye la pr oduccin de indol.

98


Prueba de indol

React ivo de Kovacs

Adicionar 5 got as y agit ar suavement e el t ubo
I nt er pr et ar inmediat ament e.

Conser vacin: Los r eact ivos deber n guar dar se en el
r ef r iger ador (4C) mient r as no se usan, su est abil idad es
var iable, por lo t ant o se har t odas las semanas un cont r ol
de calidad, desechndolos si muest r an una r eaccin dbil o
negat iva con un or ganismo posit ivo conocido.


PRUEBA POSI TI VO NEGATI VO
Sulf uro + -
I ndol + -
Movilidad + -

Tabla 2. Reporte de resultados del medio SIM
99

$ Result ados


1. cido sulf hdrico

Posit ivo: Ennegr ecimient o del medio
Negat ivo: Sin ennegr ecimient o
MEDIO SIN
INOCULAR
INDOL
NEGATIVO
INDOL
POSITIVO
H
2
S
NEGATIVO
H
2
S
POSITIVO
GAS
Figura 31. Pruebas bioqumicas del medio SIM
100

2. I ndol

Posit ivo: Anillo r oj o en la super f icie del medio.
Negat iva: No se pr oduce color
Negat iva: Color nar anj a en la super f icie del medio. I ndica
desar r ollo de escat ol, un compuest o met ilado que puede ser
el pr ecur sor de la f or macin de indol.

La r eaccin posit iva despus de 24 hor as indica una pr ueba
complet a.

Si el cult ivo de 24 hor as es negat ivo deber incubar se ot r as
24 hor as y r epet ir se la pr ueba.

3. Movilidad

Posit iva. Los or ganismos mviles migr an de la lnea de siembr a
y se dif unden en el medio pr ovocando t ur biedad.
Negat iva. Cr ecimient o bact er iano acent uado siguiendo la lnea
de siembr a.

101

$ Aplicaciones

Bact erias Produccin de
H
2
S
Produccin de
indol
Movilidad
Salmonella
t yphi
+ o - - +
Salmonella + o - - +
E. coli - + + o -
Klebsiella - + o - -
Ent erobact er - - +
Cit robact er + - +
Shigella - + o - + o -

Tabla 3. Aplicaciones del medio SIM
Figura 33. Escherichia coli Figura 32. Salmonella typhi
102

12. AGAR TRI PLE AZUCAR HI ERRO: TSI

$ Medio de cult ivo: Agar hier r o t r iple azcar (agar hier r o
de Kligler , AHK)

Composicin:
f ) Ext r act o de car ne
g) Ext r act o de levadur a
h) Pept ona
i) Pr ot easa
j ) Lact osa
k) Dext r osa
l) Sulf at o f er r oso
m) Clor ur o de sodio
n) Tiosulf at o de sodio
o) Agar
p) Agua dest ilada
q) I ndicador : Roj o de f enol
! cido: amar illo
! Alcalino: r oj o
! Medio no inoculado: nar anj a r oj izo (pH =7.4)

103
$ Fundament o

Det er mina la capacidad de un or ganismo de at acar un hidr at o
de car bono especf ico incor por ado en un medio de
cr ecimient o bsico, con pr oduccin o no de gases, j unt o con la
det er minacin de posible cido sulf hdr ico.

El agar AHK es un medio dif er encial que det er mina t ant o la
f er ment acin de los hidr at os de car bono y la pr oduccin de
cido sulf hdr ico. Las bact er ias pueden ut ilizar cualquier a de
los sust r at os incor por ados en el medio y ser met abolizados,
car act er st icas que son ut ilizadas par a la dif er enciacin de
st as, pr incipalment e par a las Ent er obact er ias.

Est e medio cont iene lact osa con una concent r acin de 1% y
glucosa 0.1%, lo cual per mit e la obser vacin de la
f er ment acin de uno o de ambos car bohidr at os por par t e de
las bact er ias, adems de la pr oduccin de gas y de cido
sulf hdr ico.

La f er ment acin es un pr oceso que se lleva acabo en
condiciones aer bicas (pico de f laut a) y anaer bicament e
(capa inf er ior ). En el pico de f laut a la glucosa (monosacr ido)
es cat abolizada inicialment e por medio del ciclo anaer bico de
Embden-Meyer hof , ut ilizado t ant o por los aer obios como por
los anaer obios par a dar cido pir vico, y post er ior ment e st e
ser degr adado a t r avs del ciclo de Kr ebs par a dar CO
2
, H
2
O
y ener ga.

104

Por ot r a par t e la lact osa (disacr ido) ser pr imer o degr adada
a sus monosacr idos cor r espondient es (glucosa y galact osa).

Bet a-galact osidasa
Lact osa glucosa + galact osa

Ciclo de Kr ebs
Glucosa o galact osa CO
2
+ H
2
O + ener ga anaer bico

El medio TSI cont iene una cant idad limit ant e de glucosa y una
concent r acin 10 veces mayor de lact osa. Las
Ent er obact er ias y los f er ment ador es de glucosa comienzan
met abolizando est e azcar , ya que las enzimas que ut ilizan la
glucosa est n pr esent es como const it uyent es de las
bact er ias, y st as pueden obt ener mayor ener ga por
ut ilizacin del azcar ms simple.

Todos los ot r os car bohidr at os deben ser conver t idos en
glucosa par a ent r ar en el ciclo de Embden-Meyer hof . La
ut ilizacin de la glucosa se r ealiza en f or ma aer obia sobr e la
est r a, donde el oxgeno pr esent e act a como acept or
t er minal de elect r ones y en la par t e t er minal de la columna en
condiciones de anaer obiosis. Una vez que una bact er ia
f er ment ador a de glucosa ha r educido t oda la glucosa
disponible a pir uvat o, comenzar a met abolizar el pir uvat o a
t r avs del ciclo aer bico de Kr ebs (sobr e la est r a), f or mando
105
pr oduct os f inales cidos. El cido en el medio hace vir ar el
amar illo del indicador de pH, r oj o de f enol. Ent onces, luego de
6 hor as de incubacin, la zona de la est r a y el f ondo del t ubo
inoculado con un f er ment ador de glucosa t endr n un color
amar illo. Si el micr oor ganismo no f er ment a la glucosa, el
f ondo per manecer r oj o (indicando que no hay var iacin del
pH) o se alcalinizar (lo que puede visualizar se por un color
r oj o algo ms int enso que del medio or iginal), demost r ando
que la bact er ia no es miembr o de la f amilia
Ent er obact er iaceae.

Despus de haber agot ado la cant idad limit ada de glucosa,
una bact er ia con capacidad par a ut ilizar la lact osa o sacar osa
comenzar a degr adar las. Como el medio cont iene 10 veces
ms lact osa que glucosa, las bact er ias encont r ar n sust r at o
suf icient e par a cont inuar la f or macin de pr oduct os f inales
cidos. Luego 18 24 hor as de incubacin t odo el medio TSI
per manecer de color amar illo. Est a r eaccin se denomina
cido sobr e cido (A/ A) y el or ganismo se ident if ica como un
f er ment ador de lact osa. La pr oduccin de gas pr ovocar la
r upt ur a de la columna de agar o la empuj ar hacia la par t e
super ior , de modo que un f er ment ador de lact osa que pr oduce
gas dar una r eaccin A/ A ms gas.

Si el or ganismo en est udio no es capaz de usar la lact osa del
medio, debe pr oducir ener ga en f or ma menos ef icient e al
ut ilizar las pr ot enas y aminocidos del medio como f uent es
nut r it ivas.

106
El met abolismo pr ot eico se pr oduce en la super f icie de la
zona inclinada donde el oxgeno es abundant e. Los pr oduct os
de la degr adacin de la pept ona (como el amoniaco) son
alcalinos y pr ovocan el vir aj e del indicador r oj o de f enol a su
color r oj o or iginal. Un TSI inoculado con una bact er ia que no
f er ment a la lact osa al cabo de 18-24 hor as de incubacin
pr esent ar la zona inclinada r oj a y el f ondo del agar
per manecer amar illo debido al met abolismo anaer obio de la
glucosa dur ant e la pr imer a et apa. Est a r eaccin se denomina
alcalina sobr e cido (K/ A).

Las bact er ias que f er ment an la glucosa t ambin pueden
f or mar pr oduct os alcalinos a par t ir de la ut ilizacin de la
pept ona, sobr e la zona inclinada. Est as r eacciones ser n K/ K.



$ I noculacin

Picadur a y est r a en pico de f laut a



Temper at ur a: 35 - 37 C

107
$ Result ados

MEDIO
NO INOCULADO
K/A
A/A
K/K
H2S
GAS
MEDIO
NO INOCULADO
K/A
A/A
K/K
H2S
GAS

Figura 34. Pruebas bioqumicas del medio TSI
Figura 35. Salmonella
108
1. Roj o en pico de f laut a: alcalino; degr adacin aer bica de
glucosa.
Amar illo en capa pr of unda: cido; degr adacin anaer bica
de la glucosa.
2. Amar illo en pico: cido
Amar illo en capa pr of unda: cido
3. Roj o en pico de f laut a: alcalino
Sin cambio de color en capa pr of unda: alcalina.
4. Pr oduccin de H
2
S: pr ecipit ado negr o
5. Pr oduccin de gases: Pr oduccin de bur buj as,
descomposicin del medio, liger a muesca del medio sobr e
el cost ado del t ubo o desplazamient o del medio del f ondo,
dej ando un espacio libr e.

$ Obser vaciones

Una bact er ia pr oduct or a de H
2
S puede dar t al cant idad de
pr ecipit ado negr o de sulf ur o f er r oso que ocult e
complet ament e la acidez pr oducida en la capa pr of unda. Sin
embar go, si se f or ma H
2
S es que exist e en la capa pr of unda
una condicin cida, aun cuando no se obser ve, y debe ser
r egist r ada como t al.

Es esencial que se int er pr et e la f er ment acin al t r mino de
18 24 hor as de incubacin, ya que una int er pr et acin
pr emat ur a o demor ada dar f or mas de f er ment acin no
vlidas que llevar n a er r or es en el agr upamient o del gner o
o especie.
109

1. K / A (Fer ment acin de glucosa solament e)
2. A / A (Fer ment acin de glucosa y lact osa)
3. K / K (No f er ment acin de glucosa y lact osa).

Los r esult ados se escr iben siempr e siguiendo un pat r n.
Pr imer o la r eaccin del pico de f laut a seguida por la r eaccin
de la capa pr of unda, separ adas por una bar r a.

$ Reacciones de TSI

Pico de f laut a alcalino / prof undidad alcalina (K/ K). No
f er ment acin de hidr at os de car bono. Car act er st ico de
bact er ias no f er ment ador as como Pseudomonas aer uginosa.

Pico de f laut a alcalino / prof undidad cida (K/ A). Glucosa
f er ment ada, lact osa no f er ment ada. Car act er st ico de
bact er ias no f er ment ador as de lact osa como especies de
Shigella.

Pico de f laut a alcalino / prof undidad cida (negra)
(K/ A/ H
2
S). Glucosa f er ment ada, lact osa no f er ment ada;
pr oduccin de H
2
S. Car act er st ico de bact er ias no
f er ment ador as de lact osa y pr oduct or as de H
2
S como:
Salmonella, Ar izona, Cit r obact er y algunas especies de
Pr ot eus.

110
Pico de f laut a cido / prof undidad cida (A/ A). Glucosa y
lact osa f er ment adas. Car act er st ico de colif or mes que
f er ment an lact osa como: E. coli y gr upo Klebsiella-
Ent er obact er .

$ Aplicaciones

Est e t ipo de pr uebas se ut ilizan pr incipalment e par a la
ident if icacin pr imar ia de los miembr os de las
Ent er obact er ias.

No fermentacin
pH = 7.4 Aminas Pptidos
O2
Pico de f laut a alcalino/ prof undidad alcalina
Dextrosa
cidos mixtos
Aminas Pptidos
Aminas Pptidos
O2
O2
Pico de f laut a cido/ prof undidad cida
Reaccin inicial
O2
Aminas Pptidos
Pico de f laut a alcalino/ prof undidad cida
Reaccin ret ardada
Pico de f laut a cido/ prof undidad cida

Dextrosa
cidos mixtos
Dextrosa + lactosa
cidos mixtos
No fermentador
No fermentador de lactosa
Fermentador de lactosa (sacarosa)
Figura 36. Fundamento de la Prueba bioqumica TSI
111
Especie
bact eriana
Superf icie
inclinada
Fondo Gas H
2
S
Ent erobact er A K + + -
Haf nia K A + -
Klebsiella A A + + -
E. coli A A + -
Shigella K A - -
Salmonella
t yphi
K A - +
S. parat yphi K A + -
S.
choleraesuis
K A + -
Ot ras
Salmonellas
K A + + + +
Cit robact er K A + + + +
Edwarsiella K A + + + +
Serrat ia K A - -
Prot eus
vulgaris
K A + + + +
P. mirabilis K A + + + +
P. morganii K A - -
P. ret t geri K A - -
Providencia K A + o - -

Tabla 4. Aplicaciones de la Pruba con TSI
112
13. Agar lisina hierro: LI A

$ Medio de cult ivo: Base de descar boxilasa de Moller

Composicin:
a) Pept ona
b) Ext r act o de car ne
c) Pir idoxal
d) L-lisina
e) Cit r at o de amonio
f ) Tiosulf at o de sodio
g) Glucosa
h) Agua dest ilada
i) Agar
j ) I ndicador de pH: Pr pur a de br omocr esol
! cido: color amar illo (pH = 5.2)
! Alcalino: color pr pur a (pH = 6.8)
! Medio no inoculado: color pr pur a int enso
br illant e (pH = 6.0)

$ Fundament o

Mide la capacidad enzimt ica de un or ganismo par a
descar boxilar un aminocido (lisina y ar ginina) par a f or mar
una amina, con la consiguient e alcalinidad.

113
La descar boxilacin es el pr oceso mediant e el cual las
bact er ias que poseen enzimas descar boxilasas especf icas
son capaces de at acar a los aminocidos en su gr upo
car boxilo dando una amina o una diamina y anhdr ido
car bnico. La descomposicin de los aminocidos se pr oduce
anaer bicament e. El pr oceso de descar boxilacin es
ir r ever sible, no oxidat ivo y r equier e una coenzima comn, el
f osf at o de pir idoxal.

El aminocido L-lisina suf r e la descar boxilacin par a dar
cadaver ina y CO
2
por accin de la enzima especf ica lisina-
descar boxilasa.



$ I noculacin

Por picadur a y est r a, inculo liviano.


Temper at ur a: 35 37C

Tiempo: 18 24 hor as
$ Repor t e de
r esult ados

A = cido
K = Alcalino
N = Neut r a
R = Roj o (desaminacin
oxidat iva)
114

$ Result ados

MEDIO
NO I NOCULADO
H2S K/K
K/K
K/A
GAS
H2S
MEDIO
NO I NOCULADO
H2S K/K
K/K
K/A
GAS
H2S


K/ K = azul de Pr usia / azul de Pr usia
Desaminacin oxidat iva / descar boxilacin
K/ A= azul de pr usia / lila
No desaminacin
Pr oduccin de H
2
S = Ennegr ecimient o del medio
Pr oduccin de gas = Bur buj as o levant amient o del
medio de cult ivo de las par edes del t ubo.
Figura 37. Pruebas bioqumicas con medio LIA
115
$ Aplicaciones

Especie
bact eriana
Superf icie
inclinada
Fondo Gas H
2
S
E. coli K K o N - o + -
Shigella K A - -
Salmonella
t yphi
K K - + o -
S. parat yphi K A + o - - o +
Ot ras
Salmonellas
K K o N - +
Arizona K K o N - +
Cit robact er K A - o + + o -
Edwarsiella K K - o + +
Klebsiella K K o N + o - -
Ent erobact er
cloacae
K A + o - -
E. aerogenes K K o N + -
E. haf niae K K o N - o + -
Prot eus
vulgaris
R A - -
P. mirabilis R A - -
P. morgarnii K o R A - -
P. ret t geri R A - -
Providencia R A - -

Tabla 5. Aplicaciones de la Prueba Bioqumica LIA
116

13. Movilidad, indol y ornit ina: MI O

$ Medio de cult ivo

Composicin:
a) Ext r act o de levadur a
b) Pept ona
c) L-or nit ina
d) Dext r osa
e) Agar
f ) Agua
g) I ndicador de pH: pr pur a de br omocr esol
! cido: color amar illo (pH = 5.2)
! Alcalino: color pr pur a (pH = 6.8)
! Medio no inoculado: color pr pur a int enso
br illant e (pH = 6.0)

$ Fundament o

El medio MI O se ut iliza par a la ident if icacin de
Ent er obact er ias sobr e la base de movilidad, la pr oduccin de
or nit ina descar boxilasa y de indol.

1. Descar boxilacin de or nit ina
2. Pr oduccin de indol
3. Movilidad
117
1. Descarboxilacin de ornit ina

Mide la capacidad enzimt ica de un or ganismo par a
descar boxilar un aminocido (or nit ina) par a f or mar una
amina, con la consiguient e alcalinidad.

La descar boxilacin es el pr oceso mediant e el cual las
bact er ias que poseen enzimas descar boxilasas especf icas
son capaces de at acar a los aminocidos en su gr upo
car boxilo dando una amina o una diamina y anhdr ido
car bnico. La descomposicin de los aminocidos se pr oduce
anaer bicament e. El pr oceso de descar boxilacin es
ir r ever sible, no oxidat ivo y r equier e una coenzima comn, el
f osf at o de pir idoxal.

El aminocido L-lisina suf r e la descar boxilacin par a dar
cadaver ina y CO
2
por accin de la enzima especf ica lisina-
descar boxilasa.

El aminocido L-or nit ina es descar boxilado por la enzima
or nit ina descar boxilasa par a dar la diamina put r escina y CO
2
,
pr oducidos en condiciones anaer obias.

2. Prueba de la produccin de indol

El t r ipt f ano es un aminocido que puede ser oxidado por
cier t as bact er ias par a f or mar t r es met abolit os pr incipales:
indol, escat ol e indolact ico.

118

Diver sas enzimas int r acelular es que int er vienen en st e
pr oceso r eciben el nombr e de t r ipt of anasas, lo que implica el
sist ema complet o de enzimas vinculadas con la pr oduccin
del indol. El pr incipal int er mediar io en la degr adacin del
t r ipt f ano es el cido indolpr vico.

La degr adacin del t r ipt f ano liber a indol, cido pir vico,
amoniaco y ener ga. El cido pir vico puede ser nuevament e
met abolizado por medio del ciclo glucolt ico o ent r ar en el
ciclo de Kr ebs par a liber ar CO
2
y H
2
O y una gr an pr oduccin
de ener ga. El NH
3
puede ser ut ilizado par a sint et izar nuevos
amiocidos empleando la ener ga que se encuent r a par a la
r eaccin anablica.

La pr ueba de indol se basa en la f or macin de un complej o de
color r oj o cuando el indol r eacciona con el gr upo aldehdo de
p-dimet ilaminobenzaldehdo (sust ancia act iva del r eact ivo de
Kovacs).

La f or macin de indol se pr oduce solament e en aquellos
or ganismos capaces de f er ment ar los hidr at os de car bono.
La elevada acidez pr oducida por la f er ment acin de la
glucosa puede impedir el cr ecimient o del or ganismo o inhibir
la enzima. El agr egado de t r ipt f ano est imula la pr oduccin
de indol mient r as que la glucosa la inhibe.

119
3. Movilidad

Det er mina si un or ganismo es mvil o inmvil. Las bact er ias
t ienen movilidad por medio de sus f lagelos, que se
encuent r an pr incipalment e ent r e los bacilos; sin embar go
algunas f or mas de cocos son inmviles.

Las bact er ias mviles pueden cont ener un solo f lagelo o
muchos; adems su localizacin var a con su especie
bact er iana y las condiciones de cult ivo. A veces, las
bact er ias con movilidad pr oducen var iant es no mviles que
par ecen ser est ables y r ar ament e se r evier t en en f or mas
mviles. Los or ganismos no mviles car ecen de f lagelos.

Medios para la det eccin de movilidad

3. SI M
4. MI O


Semislido en f or ma ver t ical

$ I noculacin

Por picadur a, en f or ma ver t ical
120


Tiempo: 24 48 hor as

Temper at ur a: 35 37C


Prueba de indol

React ivo de Kovacs

Adicionar 5 got as y agit ar suavement e el t ubo
I nt er pr et ar inmediat ament e.

Conser vacin: Los r eact ivos deber n guar dar se en el
r ef r iger ador (4C) mient r as no se usan su est abili dad es
var iable, por lo t ant o se har t odas las semanas un cont r ol
de calidad, desechndolos si muest r an una r eaccin dbil o
negat iva con un or ganismo posit ivo conocido.

121
$ Result ados

MEDIO NO
INOCULADO
ORNITINA POSITIVO
MOTILIDAD NEGATIVO
ORNITINA NEGATIVO
MOTILIDAD POSITIVO
INDOL
NEGATIVO
INDOL
POSITIVO


1. Ornit ina descarboxilasa

Posit ivo: color pr pur a del medio
Negat ivo: Color amar illo en el f ondo del t ubo que puede ser
pr pur a al f inal.

Figura 38. Pruebas bioqumicas del medio MIO
122
2. I ndol

Posit ivo: Anillo r oj o en la super f icie del medio.
Negat iva: No se pr oduce color
Negat iva: Color nar anj a en la super f icie del medio.

I ndica desar r ollo de escat ol, un compuest o met ilado que
puede ser el pr ecur sor de la f or macin de indol.

La r eaccin posit iva despus de 24 hor as indica una
pr ueba complet a.

Si el cult ivo de 24 hor as es negat ivo deber incubar se
ot r as 24 hor as y r epet ir se la pr ueba.

3. Movilidad

Posit iva. Los or ganismos mviles migr an de la lnea de
siembr a y se dif unden en el medio pr ovocando t ur biedad.

Negat iva. Cr ecimient o bact er iano acent uado siguiendo la
lnea de siembr a.

* Se leen las r eacciones de movilidad y de or nit ina
descar boxilasa ant es de agr egar el r eact ivo de Kovacs par a
la pr ueba de indol.*

123


Prueba Movilidad I ndol Ornit ina
Posit ivo + + +
Negat ivo - - -

$ Aplicaciones

$ Micr oor ganismos or nit ina posit ivos

Especies de Ent er obact er
Pr ot eus mir abilis
Pr ot eus mor ganii
Yer sinia ent er ocolit ica

$ Micr oor ganismos or nit ina negat ivos

Especies de Klebsiella
Ent er obact er aglomer ans
Pr ot eus vulgar is
Pr ot eus r et t ger i
Yer sinia pest is
Yer sinia pseudot uber culosis

Tabla 6. Reporte de resultados del medio MIO
124

Bact erias Produccin
de indol
Movilidad Produccin
de H
2
S
Salmonella
t yphi
- + + o -
Ot ras
Salmonellas
- + + o -
E. coli + + o - -
Klebsiella + o - - -
Ent erobact er - + -
Cit robact er - + +
Shigella + o - + o - -

Tabla 7. Aplicaciones de la Prueba bioqumica MIO
Figura 39. Shigella
125

El met abolismo se def ine como una ser ie de r eacciones
qumicas que se llevan acabo en el micr oor ganismo de t ipo
f isiolgico par a que se adapt e al medio.

Las f unciones especf icas del met abolismo son cuat r o:

1. Obt encin de ener ga qumica de las molculas
combust ibles.
2. La conver sin de pr incipios nut r it ivos exgenos en
sillar es de const r uccin o pr ecur sor es de los
component es macr omolecular es de la clula.
3. El ensamblaj e de est os mat er iales par a f or mar ,
pr ot enas, cidos nucleicos, lpidos y ot r os
component es celular es.
4. La f or macin y degr adacin de las biomolculas
necesar ias par a las f unciones especializadas de las
clulas.

Anabolismo: Snt esis de macr omolculas (cpsulas,
membr anas, pr ot enas, et c).

La biosnt esis de las molculas or gnicas a par t ir de est os,
pr ecisa del consumo de ener ga qumica apor t ada por el ATP
gener ado dur ant e el cat abolismo.

126
Cat abolismo: Degr adacin o r ompimient o de molculas
gr andes (glcidos, lpidos y pr ot enas), se degr adan par a
pr oducir molculas ms sencillas.

El cat abolismo va acompaado de la liber acin de la ener ga
qumica inher ent e a la est r uct ur a de las molculas or gnicas
o nut r it ivas y a su conser vacin en f or ma de ATP.

Las clulas pueden dividir se en dos gr andes gr upos segn la
f or ma qumica del car bono que pr ecisan t omar del ent or no:

$ Aut t r of as: (aut o aliment adas), pueden ut ilizar el
CO
2
como f uent e nica de car bono y const r uir a
par t ir de l los esquelet os car bonados de t odas sus
biomolculas or gnicas.

$ Het er t r of as: (aliment adas de ot r os), que no
pueden emplear el CO
2
y t ienen que obt ener el
car bono de su ent or no en una f or ma r educida
r elat ivament e complej a, t al como la glucosa.

El segundo cr it er io por el que pueden clasif icar se las clulas
es la nat ur aleza de su f uent e de ener ga:

$ Fot t r of as. Clulas que emplean la luz como f uent e
de ener ga.
$ Quimiot r f as. Las que emplean ener ga de las
r eacciones de oxidacin-r educcin.
127
Quimior gant r of os. Quimiot r f os que necesit an
molculas or gnicas complej as como dador es
elect r nicos, t ales como glucosa.
Quimiolit t r of os. Or ganismos que pueden emplear
dador es elect r nicos inor gnicos sencillos, t ales
como el hidr geno, sulf ur o de hidr geno, amoniaco
o azuf r e.

Los het er t r of os pueden dividir se en las siguient es clases:

$ Aer obios. Emplean oxgeno molecular como lt imo
acept or de elect r ones en sus dador es elect r nicos
or gnicos.
$ Anaer obios. Emplean como acept or elect r nico alguna
ot r a molcula en lugar del oxgeno.
$ Facult at ivos. Clulas que viven en condiciones ya sean
aer bicas o anaer bicas.
$ Anaer obios est r ict os. Clulas que no pueden ut ilizar
el oxgeno en ninguna cir cunst ancia.

Hay dos gr upos pr incipales de bact er ias: las sapr of it as, que
viven sobr e los cuer pos muer t os de animales y veget ales, y
las simbiont es, que viven en animales o plant as vivas. Las
sapr of it as son impor t ant es por que descomponen los cuer pos
de las plant as y animales muer t os en sus component es
esenciales, hacindolos accesibles par a ser ut ilizados como
aliment o por las plant as.

128
Muchas bact er ias simbiont es se encuent r an, en condiciones
nor males, en los t ej idos humanos, incluso en el t ubo digest ivo
y la piel, donde pueden r esult ar indispensables par a los
pr ocesos f isiolgicos. Est e t ipo de r elacin r ecibe el nombr e
de mut ualismo. En el comensalismo, las bact er ias simbiont es
obt ienen los nut r ient es de sus huspedes vivos causndoles
un dao consider able. Los par sit os, el t er cer t ipo, pueden
pr ovocar la dest r uccin de las plant as o de los animales en
los que viven.

Por lo gener al las macr omolculas son hidr olizadas en el
ext er ior de la clula por la accin de exoenzimas y son
int r oducidos en la clula en f or ma de monmer os o de
dmer os.

Las hexosas t r as unos pasos pr evios de t r ansf or macin son
hidr olizados en dos mit ades; los pr oduct os de est a hidr lisis
se convier t en en cido pir vico; st e lt imo ocupa un lugar
clave en el met abolismo int er mediar io y const it uye el punt o
de par t ida de numer osas vas anablicas y cat ablicas.

PRODUCCI N DE ENERG A

Las clulas en cr ecimient o r equier en una pr ovisin const ant e
de ener ga met ablica, en una f or ma que pueda ser usada
par a la biosnt esis. El mundo micr obiano ha desar r ollado
modelos pr oduct or es de ener ga ext r aor dinar iament e
129
diver sos. Algunos de ellos usan donant es de elect r ones
inor gnicos y var ios acept or es de elect r ones (oxgeno,
nit r at os, sulf at os) par a pr opor cionar ener ga dest inada a
f or mar sus pr opios const it uyent es or gnicos a par t ir del
CO
2
.

El f in pr imor dial de la degr adacin de los sust r at os consist e
en obt ener ener ga (ATP). Las r eacciones que van
acompaadas de una obt encin de ener ga son r eacciones
oxidat ivas. Las clulas se liber an del car bono oxidado en
f or ma de anhdr ido car bnico, los dist int os micr oor ganismos
ut ilizan dif er ent es caminos par a eliminar el hidr geno que se
va f or mando de maner a const ant e (NADH
2
), est o es, par a
r egener ar el NAD. Segn sea el acept or f inal de H
+
se
dif er encian la r espir acin, la f er ment acin y la r espir acin
anaer bica.

VI AS DE DEGRADACI N DE LAS HEXOSAS

Rut as cat ablicas:

- Gluclisis
- Pent osa f osf at o
- Ent ner -Duodor of f

130

I . Gluclisis

Se r ef ier e a la degr adacin de la glucosa hast a pir uvat o. La
gluclisis puede ocur r ir en condiciones aer obias o anaer obias.
En aer obiosis gener alment e f unciona en conj unt o con el ciclo
de Kr ebs en el cual el pir uvat o se oxida hast a CO
2
y agua. En
anaer obiosis el pir uvat o se lleva a la f er ment acin.

En la gluclisis ocur r en dos f osf or ilaciones a nivel del
sust r at o:
1) En el paso de 3-f osf oglicer at o a 2-f osf oglicer at o en
donde se sint et iza un ATP.
2) En el lt imo paso de la va, en la t r ansf or macin de
f osf oenilpir uvat o a pir uvat o, en donde se f or ma ot r o
ATP.

Secuencia de reacciones en la gluclisis

En conj unt o, la ecuacin de la gluclisis par a pr oducir lact at o
es la siguient e:

Glucosa + 2 ADP (adenosina dif osf at o) + 2 f osf at o + 2
lact at o + 2 ATP (adenosina t r of osf at o) + 2 H
2
O

131
Aunque las et apas int er medias implicadas son muchas y
complej as, una visin simplif icada podr a descr ibir el pr oceso
como:

1. La incor por acin inicial de dos gr upos f osf at o dent r o
de la molcula de glucosa de seis t omos de car bono.
Los gr upos f osf at o los pr opor cionan dos molculas de
ATP, mediant e la ut ilizacin de ener ga.
2. El compuest o int er medio de seis t omos de car bono que
se f or ma, f r uct osa 1,6-dif osf at o, se r ompe en dos
compuest os ms simples, con t r es t omos de car bono
cada uno.
3. Est os compuest os de t r es t omos de car bono, f osf at o
de dihidr oxiacet ona y glicer aldehdo-3-f osf at o, son
cada uno met abolizados par a dar pir uvat o, en una va
con numer osos pasos int er medios. Dur ant e est e
pr oceso, cada uno de los compuest os de t r es t omos de
car bono pr oduce dos molculas de ATP que se
ut ilizar on en la et apa 1. Adems se pr oducen dos
molculas del cof act or int er mediar io NADH, las cuales
pueden ser oxidadas baj o condiciones aer obias, en una
r ut a separ ada que r inde seis molculas de ATP. De est a
f or ma, la gluclisis puede pr oducir seis molculas de
ATP por cada molcula de glucosa cuando hay oxgeno
disponible, per o slo dos molculas de ATP baj o
condiciones con df icit de oxgeno.
4. Las dos molculas de pir uvat o r esult ant es pueden ser
ut ilizadas por el ciclo mit ocondr ial del cido ct r ico
despus de conver t ir se en acet il-CoA pr oduciendo
132
ot r as 30 molculas de ATP. En r esumen, se pueden
pr oducir un t ot al de 36 molculas de ATP mediant e el
met abolismo complet o de molcula de glucosa baj o
condiciones aer obias, per o slo dos molculas de ATP
baj o condiciones anaer obias.
5. Por lt imo, una de las molculas int er mediar ias de t r es
t omos de car bono, el glicer aldehdo-3-f osf at o puede
en una r eaccin lat er al, conver t ir se en 2,3-
dif osf oglicer at o.

Todas las r eacciones del sist ema son f cilment e
r ever sibles, con la excepcin de t r es de ellas: la
f osf or ilacin de la glucosa cat alizada por la hexocinasa, la
de la f r uct osa-6-f osf at o cat alizada por la
f osf of r uct ocinasa y la conver sin de f osf oenolpir uvat o en
pir uvat o cat alizada por la pir uvat o cinasa.

La coenzima esencial NAD (dinuclet ido de adenina y
nicot inamida) es necesar ia par a un pr oceso de conver sin
enzimt ica en la f or macin del pir uvat o. Cuando el oxgeno
es def icient e, est a coenzima slo puede r egener ar se por
r eoxidacin del NADH en pr esencia de oxgeno,
pr oduciendo NAD, ener ga y agua. La gluclisis puede
cont inuar en condiciones anaer obias en la f or macin de
lact at o y la r egener acin del NAD, per o a cambio de
pr oducir menos ener ga por molcula de glucosa
met abolizada.

133

GLUCLI SI S

Glucosa
Glucosa-6-fosfato
Fructosa-6-fosfato
Fructosa-1,6-bifosfato
3-fosfogliceraldehdo Dihidroxiacetonafosfato
2 1,3-bifosfoglicerato
2 3-fosfoglicerato
2 2-fosfoglicerato
2 fosfoenolpiruvato
2 piruvato ATP
ADP
ATP ADP
2 NAD
2 NADH
2 PO4
2 ADP
2 ATP
H2O
2 ADP
2 ATP
Esquema 1. Gluclisis
134

I I . Rut a de Ent ner -Duodor of f

En est a va se pr oduce slo una molcula de ATP por
cada molcula de glucosa.
Sus pr oduct os f inales son pir uvat o y glicer aldehdo-3-
f osf at o.
Est a va es mucho menos usada por los micr oor ganismos
que la r ut a de la gluclisis.
Es ms r pida que la gluclisis por la menor cant idad de
r eacciones que se llevan acabo.

En est a va la glucosa 6-f osf at o suf r e en pr imer lugar una
deshidr ogenacin y se convier t e en 6-f osf oglucnico. Por la
accin de una 6-f osf ogluconat odeshidr ogenasa se pier de una
molcula de agua y se f or ma cido 2-cet o-3-desoxi-6-
f osf oglucnico (KDPG), el cual se divide por accin de una
aldosa especf ica, en cido pir vico y 3-f osf oglicer aldehdo.

135
I I I . Hexosa monof osf at o (r ut a de pent osas- f osf at o)

Aunque la gluclisis y el cido del ciclo t r icar boxlico son las
pr incipales vas cat ablicas de la glucosa en la mayor a de los
t ej idos, algunas clulas poseen vas alt er nat ivas par a
pr oducir met abolit os t iles a par t ir de la glucosa.

La va hexosa monof osf at o es de gr an int er s por ser la
pr incipal f uent e de NADP r educido en el or ganismo (el NADP
r educido par t icipa en muchas r eacciones de snt esis,
apor t ando sus hidr genos).

Est a va compr ende una ser ie de r eacciones est r echament e
conect adas con la gluclisis, ya que ambos pr ocesos f or man
int er mediar ios comunes.

La va puede dividir se en dos f ases:

En la pr imer a, la glucosa 6-f osf at o suf r e dos oxidaciones por
deshidr ogenacin y una descar boxilacin que la t r ansf or ma
en una pent osa f osf at o. Se f or ma r ibulosa-5-f osf at o y se
liber a CO
2
y con la f or macin de la r ibulosa 5-f osf at o se
pone f in al ver dader o pr oceso oxidat ivo.

En la segunda f ase la r ibulosa-5-f osf at o da lugar a dos
ismer os dist int os. st a j unt o con la xilosa-5-f osf at o se
combina par a f or mar una t r iosa-f osf at o y una hept osa-
f osf at o, las cuales a su vez dar n una hexosa-f osf at o y una
t r iosa f osf at o.
136

En un ciclo que per mit e la oxidacin complet a de los
car bohidr at os no par ece oper ar en su f or ma complet a en
sist emas micr obianos anaer obios.

En est a r ut a se f or man pent osas y luego est as se r ompen en
unidades de 3 y 2 car bonos, dando lugar a lact at o y et anol. El
r endimient o net o en la va de las HMP es de una molcula de
ATP por cada molcula de glucosa cat abolizada.

Es la nica va o f uent e de D-r ibosa par a la snt esis de
nuclet idos. Se lleva a cabo en el cit oplasma; t odas las
enzimas que int er vienen son solubles.

Es una va ener gt ica par a micr oor ganismos aer obios
f acult at ivos.

Sus f unciones met ablicas son diver sas per o se r esumen en
lo siguient e:

1. Es una va alt er nat iva de degr adacin de la glucosa par a
obt ener ATP acoplada con la f osf or ilacin oxidat iva.
2. Es la f uent e pr incipal, sino la nica, de NADPH
cit oplasmt ico en clulas eucar it icas como f uent e de
poder r educt or , el cual es necesar io par a la biosnt esis
de cidos gr asos y ot r os pr ocesos como la r educcin
del glut at in, la biosnt esis de est er oides y las
r eacciones de hidr oxilacin.
137
3. Es la va que pr opor ciona pent osas f osf at o par a la
snt esis de r ibosa y desoxir r ibosa necesar ias par a la
biosnt esis de cidos nucleicos en gener al; adems par a
la snt esis de hist idina cuyo pr ecur sor es el
f osf or r ibosil pir of osf at o, der ivado de la pent osa.
4. Es la va de degr adacin de la r ibosa y la desoxir r ibosa,
pr ocedent es t ant o de la digest in de cidos nucleicos
como del r ecambio met ablico de nuclet idos.
5. Es la r ut a que conect a el met abolismo de las hexosas
con el de ot r os azcar es, t ales como ar abinosa, y
xilosa, component es est r uct ur ales de glucopr ot enas y
par edes celular es de veget ales, as como pr incipales
f uent es car bonadas de muchas bact er ias. Por ot r o lado
la snt esis de r ibulosa-5-f osf at o, int er mediar io de la
va de las pent osas, es f undament al en las plant as
ver des par a llevar acabo el ciclo de Calvin.
6. Es la f uent e de un impor t ant e azcar de cuat r o
car bonos, la er it r osa-4-f osf at o, pr ecur sor par a la
biosnt esis de los compuest os ar omt icos en bact er ias
y plant as.

138
Glucosa
Glucosa-6-fosfato
5-P-gluconato
Ribulosa-5-P
F
r
u
c
t
o
s
a
-
5
-
P
G
l
i
c
e
r
a
l
d
e
h
d
o
-
3
-
P
E
r
i
t
r
o
s
a
-
4
-
P
G
l
i
c
e
r
a
a
l
d
e
h
d
o
-
3
-
P
S
e
d
o
h
e
p
t
u
l
o
s
a
-
7
-
P
X
i
l
u
s
a
-
5
-
P
NADP NADPH
CO2
NADPH
NADP
R
i
b
o
s
a
-
5
-
p
F
r
u
c
t
o
s
a
-
5
-
P
G L U C O L I S I S

V A HEXOSA FOSFATO

Esquema 2. Va Hexosa - fosfato
139
CI CLO DE KREBS

Es el pr oceso de la r espir acin mediant e el cual, las clulas
aer bicas obt ienen ener ga a par t ir de la oxidacin de las
molculas combust ibles por el oxgeno molecular .

El ciclo de los cidos t r icar boxlicos es una secuencia de
r eacciones que t iene ef ect o en los or ganismos aer bicos.
Est a cat alizada por un sist ema mult ienzimt ico que acept a el
gr upo acet ilo del acet il CoA como combust ible degr adndolo
hast a CO
2
y H
+
. Est os lt imos son conduct or es a t r avs de
una secuencia de pr ot enas t r anspor t ador as de elect r ones
hast a el oxgeno molecular , que se r educe par a f or mar agua.

El pir uvat o ocupa una posicin clave en las dif er ent es r ut as
de degr adacin de car bohidr at os, es el pr incipal pr oduct o de
la gluclisis y puede suf r ir una gr an var iedad de
t r ansf or maciones, dependiendo de s el or ganismo se
encuent r a en un ambient e aer obio o anaer bico:

1. En aer obiosis el pir uvat o pasa al ciclo de Kr ebs.
2. En anaer obiosis puede ser t r ansf or mado en alcoholes o
cidos.

Mediant e la descar boxilacin del cido pir vico se f or man
compuest os con dos t omos de car bono que se unen a
cont inuacin con la molcula acept or a adecuada (cido
oxalact ico) y ent r ar a f or mar par t e del ciclo de los cidos
t r icar boxilicos (TCC) y mediant e una ser ie de r eacciones
140
escalonadas son oxidados hast a anhdr ido car bnico; los
t omos de hidr geno que se liber an en los pasos que suponen
una deshidr ogenacin ent r an a f or mar par t e de la cadena
r espir at or ia pr oduct or a de ATP (f osf or ilacin oxidat iva).

Sin embar go, ent r e los compuest os int er mediar ios del TCC
se encuent r an diver sos cidos or gnicos que const it uyen los
pr oduct os iniciales de var ias cadenas biosint t icas (cido
alf a-cet oglut r ico, cido f r mico, cido oxalact ico).

El TCC no const it uye nicament e una oxidacin t er minal de
las sust ancias nut r it ivas sino que es t ambin un gr an <<pvot >>
y como t al t ambin suminist r a los pr oduct os iniciales par a la
snt esis de los compuest os element ales de la clula. Si est os
cidos f uesen const ant ement e eliminados del ciclo, no podr a
r egener ar se la molcula acept or a y el ciclo se det endr a.

Mediant e las denominadas r eacciones complement ar ias
(secuencias anaplet r icas) se consigue que el nmer o de
compuest os int er mediar ios que se int egr an secundar iament e
al TCC iguale a la pr dida que ocasionan los pr ocesos
biosint t icos.

Oxidacin complet a

Se le conoce t ambin como ciclo de los cidos
t r icar boxilicos, sir ve par a la oxidacin complet a del pir uvat o
y const it uye un eslabn clave del met abolismo, ya que
muchos de sus compuest os int er mediar ios pueden aliment ar
141
Piruvato Acetil CoA
oxalacetato
isocitrato
malato
fumarato
succinato Succinil CoA
Alf a-cetoglutarato
citrato
NADH NAD
CO2 CoA
NADH
NAD
H2O
FAD
FADH2
CoA
CoA
CO2
NAD
NADH
NAD
NADH
CO2
CoA
GTP GDP
r ut as de biosnt esis de aminocidos, pir idinas, t et r apir r oles
y lpidos. Compr ende la f ase aer bica de la oxidacin de la
glucosa y es donde se obt iene un mayor r endimient o de
ener ga.

Sus pr oduct os f inales son: CO
2
y H
2
O. En el pat r n ms
comn el pir uvat o de la r ut a glucolt ica se oxida par a dar
or igen a una molcula de acet il-CoA y CO
2
y la acet il-CoA se
oxida en el ciclo de Kr ebs.

El balanceo net o de una molcula de glucosa que se ha
oxidado por gluclisis pr imer o y luego por el ciclo de Kr ebs
es de 38 ATP.

Adems de t ener f unciones degr adat ivas, en el ciclo de
Kr ebs se sint et izan sust ancias que act an como pr ecur sor es
de aminocidos, pir imidinas y por f ir inas.
CI CLO DE KREBS

Esquema 3
142

METABOLI SMO AEROBI O Y ANAEROBI O

Las bact er ias se int egr an en var ios gr upos segn el ef ect o
del O
2
, sobr e su cr ecimient o y met abolismo, est as
pr opiedades son impor t ant es par a la pat ogenia y par a el
aislamient o e ident if icacin de las bact er ias.

FERMENTACI ONES

En sent ido est r ict o se designan f er ment aciones aquellos
pr ocesos de consecucin de ener ga en los que el hidr geno
pasa f inalment e a un acept or or gnico de elect r ones. El
oxgeno no int er viene en los pr ocesos f er ment at ivos.

El t r mino f er ment acin hace r ef er encia al met abolismo
anaer obio de los hidr at os de car bono.

En la f er ment acin el acept or de elect r ones es un compuest o
or gnico, mient r as que en la r espir acin suele ser el oxigeno
(r espir acin aer obia).

Cier t o nmer o de f er ment aciones est n basadas en la va
glucolt ica (Embden Meyer hof ). Est a va gener a ATP dos
veces: pr imer ament e a t r avs de la oxidacin del
glicer aldehido-3-f osf at o y de nuevo a t r avs de la
conver sin del f osf oenolpir uvat o.

143
1. Ferment acin lct ica

Es la f ement acin ms simple: Una r eaccin en un solo paso
cat alizado por la lact icodeshidr ogenasa ligada a ADN r educe
el pir uvat o a lact at o. No se f or ma gas. Dado que se consumen
dos molculas de ATP en la f or macin de hexosa dif osf at o a
par t ir de glucosa y que se pr oducen cuat r o molculas de
ATP, el r endimient o net o son dos ATP por hexosa.

La f er ment acin homolct ica que f or ma solament e lact at o.

$ St r ept ococcus lact is
$ S. f aecalis
$ S. salivar ius
$ S. pyogenes
$ S. cr emor is
$ S. t her mophilus
$ S. diacet ilact is
$ Lact obacillus lact is
$ L. acidophilus
$ L. bulgar icus
$ L. casei
$ L. plant ar um
$ L. inulinus

144
Fer ment acin het er olct ica convier t e solament e cada
molcula de glucosa en lact at o y pr oducen adems
cant idades consider ables de et anol, acet at o y CO
2
.

$ Leuconost oc mesent er oides
$ Leuconost oc cir ovor um
$ Lact obacillus br evis
$ Lact obacillus vir idescens

C
6
H
12
O
6
CH
3
-CHOH-COOH + CH
3
-CH
2
OH + CO
2

2. Ferment acin alcohlica

El pir uvat o se convier t e en CO
2
ms acet aldehdo que
despus se r educe a et anol en una r eaccin ligada a NAD.
Est a f er ment acin es r ar a en las bact er ias como va
pr incipal, es ms bien car act er st ica en las levadur as.

Black J.G. 1996
Figura 40. Produccin de queso
145
El et anol es uno de los pr oduct os ms ext endidos ent r e los
micr oor ganismos r esult ant es de la f er ment acin de los
azcar es. Los pr incipales pr oduct or es de et anol son las
levadur as (Sacchar omyces cer evisiae); el alcohol apar ece
t ambin como pr oduct o secundar io de la f er ment acin de las
hexosas y de las pent osas en diver sas bact er ias anaer obias y
aer obias f acult at ivas.

La t r ansf or macin del pir uvat o en et anol abar ca dos pasos.
En el pr imer o el pir uvat o es descar boxilado en una r eaccin
cat alizada por la pir uvat odescar boxilasa y en la que par t icipa
el t iaminpir of osf at o dando acet aldhdo, el cual es r educido
con NADH
2
por la alcoholdeshidr ogenasa convir t indose en
et anol.

2 C
6
H
12
O
6
+ H
2
O CH
3
-CH
2
OH + CH
3
-COOH
+
2CO
2
+ 2 C
3
H
8
O
3

Figura 41. Produccin de vino
146
3. Ferment acin propinica

Est a va ext r ae ener ga adicional del subst r at o. El pir uvat o
es car boxilado par a pr oducir oxalacet at o, que es r educido
par a pr opor cionar succinat o y despus es descar boxilado
par a pr opor cionar pr opionat o.

$ Gner o Pr opionibact er ium
$ Clost r idium pr opionicum
$ Selenomonas r uminant ium

La pr oduccin de cido pr opinico a par t ir de cido lct ico se
ef ect a de acuer do a la siguient e r eaccin:

3CH
3
-CHOH-COOH 2CH
3
-CH
2
-COOH + CH
3
-COOH
+
CO
2
+H
2
O

La r educcin del lact at o o del pir uvat o a pr opionat o se lleva
acabo con un complej o biot ina-CO
2
, el pir uvat o es
car boxilado en pr imer lugar hast a oxalacet at o y ent onces es
r educido hast a succinat o pasando por malat o y f umar at o. El
succinat o es t r ansf or mado en succinil-CoA de la f or ma
habit ual con la par t icipacin de ATP y de la CoA,
post er ior ment e es t r ansf or mado en met il-malonil-CoA en una
r eaccin cat lizada por la met il-malonil-CoA-isomer asa y en la
que int er viene t ambin la vit amina B
12
. El succinil-CoA es
descar boxilado y el pr opionil-CoA es hidr olizado dando
pr opionat o y CoA.
147
La liber acin de una molcula de CO
2
se lleva a cabo con
ayuda de una t r anscar boxilasa que cont iene biot ina que lo
t r ansf ier e nuevament e a pir uvat o.

4. Ferment acin cido mixt a (f rmica)

Es car act er st ica de las Ent er obact er ias. Est os or ganismos
ut ilizan su sust r at o, par cialment e a t r avs de una
f er ment acin lct ica, per o de modo pr incipal a t r avs de una
f er ment acin car act er izada por el desdoblamient o del
pir uvat o a f or mat o y acet il CoA, a su vez st e lt imo gener a
un ATP.

Pr oduccin de gas: El f or mat o pr oducido en est e t ipo de
f er ment acin puede per manecer como t al siempr e que el pH
sea alcalino. Sin embar go en la mayor a de las
f er ment aciones, el pH se acidif ica: al alcanzar se un pH igual
o menor a 6.0 las bact er ias pr oduct or as de gas pr oducen una
enzima, llamada hidr ogenasa f r mica que convier t e el cido
f r mico en CO
2
y H
2
. Las ent er obact er ias que no f or man
est a enzima pr oducen cido per o no gas.

La f er ment acin se lleva acabo con la f or macin de gr an
nmer o de compuest os en los que pr edominan los cidos
or gnicos; los pr oduct os ms impor t ant es de la f er ment acin
son el cido act ico, f r mico, mlico, lct ico; et anol;
glicer ina; acet ona; 2,3- but anodiol, CO
2
e hidr geno
molecular .

148
5. Ferment acin de met ano: CO
2
como acept or de
hidrgeno

Las bact er ias met nicas (Met hanobact er ium) son t ambin
or ganismos anaer obios obligados. Tr ansf or man los alcoholes
y cidos or gnicos en met ano (CH
4
) y CO
2
, con lo que algunos
cidos or gnicos son par cialment e oxidados:

CO
2
+ 4 H
2
CH
4
+ 2 H
2
O

Se oxidan los cidos gr asos a hidr at os de car bono a
expensas del CO
2
a CH
4
.

6. Ferment acin but ilenglucolca (acet ona)

El acet aldehdo act ivo r esult ant e no es oxidado, si no que se
condensa con un pir uvat o. El pr oduct o de est a r eaccin es
t r ansf or mado en but ilenglicol (but anodiol) en las r eacciones
siguient es, en las que los cuat r o hidr genos absor bidos
equilibr an los hidr genos liber ados en la pr oduccin de las
dos molculas de pir uvat o.

Est a f er ment acin al igual que la alcohlica, da solo
pr oduct os neut r os, f or mndose dos ATP por unidad de
glucosa. Se denomina con f r ecuencia f er ment acin acet onica
debido a que con la exposicin al air e se oxida par t e del
but ilenglicol que se t r ansf or ma en acet ona, la cual se
r econoce con f acilidad con una pr ueba especf ica: Voges-
Pr oskauer .
149

El cido but ir ico, but anol, acet ona, isopr opanol, y ot r os
cidos or gnicos son pr oduct os t picos de la f er ment acin de
los hidr at os de car bono que llevan acabo los pr oduct or es
anaer obios de espor as (Clost r idium). Dur ant e la
f er ment acin se f or man cant idades var iables de cidos,
alcoholes, acet ona y gas. Como sust r at os se ut ilizan la
glucosa y algunos polisacr idos, cidos or gnicos y alcoholes.

El cido but r ico se f or ma por la condensacin de dos
molculas de Acet il CoA, r eaccin cat alizada por la enzima
t iolasa. El acet il CoA es r educido a cont inuacin con NADH
2

r eaccin cat alizada por la bet a-hidr oxibut ir il-CoA-
deshidr ogenasa, una f lavoenzima, dando but ir il-CoA.
Mediant e una desacilacin se liber a cido but r ico.

RESPI RACI N ANERBI CA CON ACEPTORES
I NORGNI COS DE HI DRGENO

FI JACI N DE NI TRGENO

El nit r geno at mosf r ico se ut iliza en pr imer a inst ancia par a
la snt esis de biomolculas. Sin embar go slo un nmer o
r elat ivament e pequeo de bact er ias son capaces de ut ilizar
el nit r geno en est a f or ma. Las bact er ias f ij ador as de
nit r geno r educen nit r geno molecular par a sint et izar
amoniaco.
150

En cier t a f or ma el sulf at o y el nit r at o act an como
t r anspor t ador es de oxgeno el hidr geno pr ocedent e del
sust r at o los r educe. La capacidad de t r ansf er ir elect r ones al
sulf at o o al nit r at o per mit e a las bact er ias oxidar el
sust r at o incluso en ausencia de oxgeno molecular y de est a
f or ma obt ener ms ener ga que por simple f er ment acin.

Reduccin de nit r at os

La r educcin de nit r at os t iene en las bact er ias dos dest inos
dif er ent es: asimilacin y desasimilacin.

En el pr imer caso ocur r en una ser ie de r educciones desde
nit r at os hast a nit r it os y amoniaco. Est e lt imo se ut iliza
par a la snt esis de aminocidos, pr ot enas y bases
nit r ogenadas, ent r e ot r os compuest os.

En el segundo caso los nit r at os se ut ilizan como acept or es de
elect r ones; lo cual ocur r e en la r espir acin anaer obia.

NH
2
OH NH
3

NO
3
NO
2
NO

N
2
O N
2

NITRATO NITRITO
XIDO DE
NITRGENO
XIDO
NITRSO
HIDROXILAMINA
AMONIACO
NITRGENO
151

REDUCCI N DE SULFATOS

Var ios Compuest os inor gnicos de azuf r e son acept or es de
elect r ones en la r espir acin anaer bica.

El sulf at o la f or ma ms oxidada del azuf r e, es uno de los
aniones pr incipales en el agua de mar y se ut iliza por las
bact er ias r educt or as de sulf at o.

El pr oduct o f inal de la r educcin del sulf at o es el sulf it o, un
impor t ant e pr oduct o nat ur al que par t icipa en muchos
pr ocesos bioqumicos.

La mayor a de las plant as y los micr oor ganismos ut ilizan el
sulf at o como f uent e de azuf r e y obt ienen el sulf ur o
necesar io par a la snt esis de los aminocidos sulf ur ados por
r educcin asimilat or ia de sulf at o. Como pr oduct o secundar io
de est a r educcin del sulf at o apar ece el sulf ur o de
hidr geno:

8 H
+
+ SO
4
H
2
S + 2 H
2
O + 2 OH

Est as bact er ias r educt or as de sulf at o, t ambin llamadas
desulf at izant es, son f r ent e a los r educt or es de nit r at os
or ganismos anaer obios obligados y r equier en condiciones
est r ict ament e anaer obias.

152
El met abolismo de los desulf at izant es es oxidat ivo. Obt ienen
la ener ga por f osf or ilacin oxidat iva.

La r educcin del sulf at o se inicia en la clula mediant e una
act ivacin del sulf at o; por una ATP-sulf ur ilasa se
int er cambia el r est o pir of osf at o del ATP con el sulf at o. El
pir of osf at o es hidr olizado por la pir of osf at asa. El adenosin-
5-f osf osulf at o (APS) es f inalment e r educido con f or macin
de sulf it o y liber acin de AMP.

Ej emplos de micr oor ganismos que r educen el
sulf at o:

$ Desulf ovibr io desulf ur icans
$ D. vulgar is
$ Desulf ot omaculum nigr if icans
$ D. or ient is
$ D. r uminis

153

ENTEROBACTERI AS

Las ent er obact er ias ms impor t ant es se incluyen en la
f amilia Ent er obact er iaceae, la cual est const it uida por
bacilos Gr am negat ivos. Hay especies mviles e inmviles.
Todas f er ment an glucosa con pr oduccin de cido y gas,
r educen los nit r at os a nit r it os y dan r esult ado negat ivo en la
pr ueba de indof enol oxidasa. Est a f amilia compr ende
bact er ias pat genas y no pat genas. Conviene r ecalcar que
las car act er st icas de pat ogenicidad r elat iva en las
ent er obact er ias en su hbit at nat ur al, que es el t r act o
gast r oint est inal, se modif ican r adicalment e cuando est as
bact er ias alcanzan una localizacin ext r a int est inal, en sit ios
como el t r act o genit our inar io, lquido cef alor r aqudeo,
t or r ent e sanguneo, mdula sea o la cavidad per it oneal.

En vist a de lo ant er ior , es posible aislar y cult ivar miembr os
de la f amilia Ent er obact er iaceae t ant o a par t ir de muest r as
f ecales y pr oduct os que pudier on haber suf r ido una
cont aminacin f ecal como el agua, aliment os, ut ensilios, et c.

154
Es muy impor t ant e r ecor dar que las muest r as de cualquier
t ipo que se envan al labor at or io par a invest igar la pr esencia
de est as bact er ias, deben ser colect adas en condiciones
aspt icas t r anspor t adas y pr ocesadas con la mayor r apidez,
a f in de evit ar alt er aciones de muest r as y pr dida de
viabilidad de las bact er ias que se buscan, o cr ecimient o
excesivo de gr menes banales que pudier an ent or pecer el
est udio.

+ + + + - + + + - - -- Arizona
+ + - - - + - + - - - Salmonella
- + - - - + - + - + - Edwardsiella
+ - - - - - - + - + - Shigella
- - - - - - - + - + - E. Coli
ARGINI
NA
DESC.
LI SINA
DESC.
GELATI
NA
MOVI LID
AD
UREA SH2 CI TRATO RM VP I NDOL OXIDASA BACTERIA
- - - - - - + + - + - Pr ovidencia
- - + + + + + + - + - Pr ot eus
vulgar is
- + + + - - + + + - - Serrat ia
- + + + - - + - + - - Ent er obact er
- + - - + - + - + + - Klebsiella
- - - - - + + + - - - Citr obact er

Tabla 8. Caractersticas bioqumicas de bacilos Gram negativos
155
COPROCULTI VO
En cualquier caso, es impor t ant e cont ar con pr ocedimient os
de labor at or io bien cont r olados que per mit an det ect ar la
pr esencia de agent es pat genos o bien dar alguna
inf or macin sobr e alt er aciones en el equilibr io de la f or ma
nor mal.
El esquema que se pr opone en st e at las par a aislamient o e
ident if icacin de ent er obact er ias pat genas f igur a ent r e
numer osas var iant es de t r abaj o ut ilizadas por dif er ent es
aut or es. Se consider a que est e esquema es uno de los ms
usuales y que puede dar r esult ados consist ent es y
sat isf act or ios.
COPROCULTI VO COPROCULTI VO
MEDI OS
PARA AI SLAMI ENTO PARA ENRI QUECI MI ENTO PARA I DENTI FI CACI N
Agar ent rico Hekt oen Base de caldo t et rat ionat o Agar de hierro y t riple azcar
Agar de eosina y azul de met ileno Caldo de selenit o y cist ina Caldo rojo de f enol y carbohidrat os
Agar ENDO Medio urea
Agar XLD Medio SI M
Agar Salmonella Shi gella Agar hierro y lisina
Agar verde brillant e Medio MI O
Agar cit rat o de Simons
AISLAMIENTO
PLACA: Agar EMB
ENDO, XLD, Mac
Conkey
IDENTIFICACIN
BIOQUMICA
TSI, MIO, LI A, SIM,
fenilalanina,
RMVP,Citrato de
Simmons, urea
ENRI QUECIMIENTO
TUBOS: Caldo
tetrationato y/ o
caldo selenit o
INCUBACIN
24 h 37C
PLACAS: Agar
ver de brillante,sulfito
de
bismuto, XLD,EMB,
ENDO, Mac
Conkey.
PLACAS: Agar S-S,
ver de brillante, sulfito de
bismuto.
Agar sangre

Esquema 4. Coprocultivo
156

Aislamiento de bacterias patgenas en Aislamiento de bacterias patgenas en
heces heces
Salmonella, Shigella, E. coli, Y. ent erocolit ica
Mat eria fecal
Mac Conkey EMB o XLD Sulfit o de bismuto Caldo de selenito
Seleccionar colonias lactosa (-)= Salmonella Colonia negra = Sal monella Sulfito de XLD, VB
Lactantes: colonias lactosa (+)= E. coli y
Shigella
Certifique Y. enterocoliti ca Colonia negra Colonia lactosa
Salmonella (-) =
Salmonella
t yphi
Esquema 5. Aislamiento de bacterias patgenas de heces
157

FAMI LI A MI CROCOCACEAE

CARACTER STI CA MI CROCOCCUS STOMATOCOCCUS PLANOCOCCUS STAPHYLOCOCCUS
Racimos
irregulares
+ + + +
Tt radas + - - -
Cpsula - + - -
Movilidad - - + -
Crecimient o G-
f urazolidona
+ - - -
Ferment acin
de glucosa
- + - +
Oxidasa + - No
desar r olla
-
Resist encia de
lisost af ina
R R R S
Glicina de
ppt ido- glicana
- - - +
cidos
t eicoicos en
pared celular
- - - +

Tabla 9. Caractersticas bioqumicas de la Familia Micrococaeeae
158
ESTAFI LOCOCOS

El est af ilococo es un micr oor ganismo poco exigent e y de
f cil desar r ollo. En los medios no select ivos sus colonias son
gr andes, opacas, lisas, cir cular es y ent er as. A veces pueden
pr esent ar bor des liger ament e ondulados, color acin amar illa
o blanca.
En agar sangr e las colonias t ienen los car act er es
ant er ior ment e mencionados y pueden adems pr esent ar
hemlisis. La mayor par t e de las cepas vir ulent as son
hemolt icas, f er ment an manit ol, r esist en alt as
concent r aciones de clor ur o de sodio y gener alment e
pr oducen pigment o dor ado, aunque ot r as cepas vir ulent as son
blancas car ecen de pigment o.
La mej or pr ueba de vir ulencia es la f acult ad que t iene de
coagular el plasma (est af ilococos coagulasa posit ivos).

MEDI OS
PARA AI SLAMI ENTO PARA I DENTI FI CACI N
Agar S-110 Medio CTA
Agar sal y manitol Caldo rojo de fenol
Agar de Vogel Johnson Caldo SF

1.Examen directo
2. Siembra
Ti ncin de Gram
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar de Vogel Johnson
3. Froti s
4. Pruebas bioqumicas
Coagulasa
Catalasa
Fermentacin de
manitol
Susceptibilidad a
novobicina
Esquema 6. Aislamiento de Staphylococcus
159

PRUEBA

S. aur eus S. epider midis S. sapr ophyt icus
Pigment o colonial + - 10-90% cepas +
Coagulasa + - -
Fact or de agr egacin + - -
Nucleasa t er moest able + - -
Fosf at asa alcalina + + -
Or nit ina descar boxilasa - 10-90% cepas + -
Ur easa 10-90% cepas + + +
Bet a-galact osidasa - - +
Pr oduccin de acet ona + + +
Resist encia a novobiocina - - +
Resist encia a polimixina + + -
Tr ehalosa + - +
Manit ol + - 10-90% cepas +
Manosa + + -
Xilosa - - -
Celulosa - - -
Malt osa + + +
Sacar osa + + +
Tabla 10. Caractersticas bioqumicas de Staphylococcus
160

ESTREPTOCOCOS

El est r ept ococo puede est ar pr esent e en gr andes nmer os
como component es de la f lor a nor mal, per o baj o cier t as
cir cunst ancias puede est ar asociado con inf ecciones o ser el
r esponsable pr incipal de las mismas.

Los est r ept ococos ms impor t ant es gener alment e pueden
demost r ar se por la pr oduccin de hemlisis en los medios
que cont ienen sangr e.

Los St r ept ococcus del gr upo A son bet a hemolt icos y se
aslan gener alment e de exudados f ar ngeos. Sin embar go,
ent r e la f lor a exist en diver sos t ipos de est r ept ococos, los
cuales pueden ser alf a o bet a hemolt icos es necesar io
ef ect uar ot r as pr uebas par a ident if icar los, t ales como la
composicin ant ignica y la pr ueba de sensibilidad de
bacit r acina.

En agar sangr e las colonias de est a bact er ia son pequeas,
elevadas, de color blanco a gr is, dur as y secas con un halo
clar o bien def inido de hemlisis complet a (hemlisis bet a).

161

Especie Suscept ibilidad
bacit racina
Suscept ibilidad
opt oquina
Hidrlisis
hiprat o
Hidrlisis
esculina
Crecimient o
en bilis
Crecimient o
en NaCl
6. 5%
CAMP Fenmeno
sat elit ismo
Est rept ococos
bet a-
hemolt icos
Grupo A
Grupo B

S
R

R
R

+
-

-
+

-
-

-
+

-
+

-
-
Ent erococos
No
ent erococos
R

R
R

R
+

-
-

-
+

+
+

-
-

-
-

-
S. viridans R R - - - - - +
S.
pneumoniae
R R - - - - -

Tabla 11. Caractersticas bioqumicas de Streptococcus
162
UROCULTI VO
El ur ocult ivo debe hacer se cuando hay signos o snt omas de
inf eccin ur inar ia, insuf iciencia r enal o hiper t ensin.
Llevndolo a cabo siempr e en per sonas en que se sospecha
inf eccin sist mica o que pr esent en f iebr e de or igen
desconocido.

Las inf ecciones agudas o cr nicas pueden af ect ar en f or ma
ascendent e desde la ur et r a hast a los r iones,
especialment e cuando se t r at a de una invasin por la f lor a
nor mal del t r act o genit our inar io que al act uar sobr e el
mismo pr ovoca una accin pat ognica impor t ant e.

MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar sangre
Agar EMB
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar Biggy

PARA IDENTIFICACIN
TSI, Caldo rojo de fenol
Urea, SIM, MIO, LIA, Citrato
de simmons

PARA SENSIBILIDAD A
ANTIBITICOS
Agar de Mueller Hinton
Agra soya tripticasena
Agar sangre,
identificacin de:
Estafilococos
Estreptococos
Neumococos
Observacin de
hemlisis
Agar EMB
Identificacin de:
Enterobacterias
Pseudomonas
Salmonella y
Shigella
Tincin de Gram
Agar S-110 sal
y manitol
Identificacin de
Staphylococcus y
otros Micrococos
AISLAMIENTO E
IDENTIFICACIN
Orina

Esquema 7. Urocultivo
163
HEMOCULTI VO

En el pacient e con f iebr e, con o sin signos o snt omas de
localizacin el hemocult ivo es la pr ueba ms t il y ms usada
par a demost r ar la f r ecuencia de inf eccin sist mica. La
demost r acin de bact er emia es t ambin esencial en las
per sonas en que se sospecha endocar dit is bact er iana.

Es impor t ant e conocer las inf ecciones en las que se pueden
aislar micr oor ganismos de la sangr e. Ent r e est os se
encuent r an la f iebr e t if oidea, neumonas, meningit is,
endocar dit is bact er iana, ost eomielit is, per it onit is, et c.

La posibilidad de obt ener cult ivos posit ivos depende de la
et apa de la enf er medad en que se t ome la muest r a y el
gr ado de evolucin de la misma. En la mayor a de los casos,
por lo gener al es convenient e t omar var ias muest r as a
int er valos apr opiados ya que un solo cult ivo puede ser
insuf icient e.

164

EXUDADO FARI NGEO

MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar sangre Agar S-110
Agar eosina y azul de metileno Medio de transporte Stuart
Agar sal y manitol Agar BIGGY
Tincin de Gram
Agar sangre
Agra eosina y
azul de metileno
Agra S-110, sal
y manitol
Agar BIGGY
Streptococcus
Neumococos

Enterobacterias

Staphylococcus
aureus y otros
Micrococos

Candida albicans
Hemoltico grupo A
Disco de bacitracina

Disco de optoquina
Solubilidad de bilis

TSI, LIA, MIO, citrato y urea

Catalasa y coagulasa

Tubos germinales y
clamidiosporas
Esquema 8. Exudado faringeo
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