PRODUCCIN Y CARACTERIZACIN DE POLIHIDROXIALCANOATOS,

SINTETIZADOS POR MICROORGANISMOS NATIVOS A PARTIR DE

RESIDUOS GRASOS

Javier Ricardo Gmez Cardozo
Tesis de Grado presentada para optar al Ttulo de
Magster en Ciencias-Biotecnologa


DIRECTOR
Amanda Lucia Mora Martnez
Qumica, M.Sc, D.Sc.


ASESORES
Mara del Socorro Yepes Prez
Qumica, M.Sc.

Guillermo Correa Londoo
Ingeniero Forestal, M.Sc, Ph.D

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MEDELLN
FACULTAD DE CIENCIAS
2013
A mis padres

A mis hermanos

Con gratitud y cario

AGRADECIMIENTOS

A mis padres sencillamente por todo, sin ellos esto no hubiera sido posible.

A la profesora Amanda Lucia Mora Martnez por acogerme en su grupo de investigacin y
guiarme en este proceso que enmarca mi inicio en el campo investigativo.

A la profesora Mara del Socorro Yepes Prez por aceptarme en el Laboratorio de Venenos
Naturales y, por todas las enseanzas, asesoras y consejos durante el desarrollo del
trabajo.

Al profesor Guillermo Correa Londoo por sus asesoras y su orientacin en este trabajo.

A la profesora Blanca Cecilia Salazar lzate por facilitarnos el espacio y los equipos del
laboratorio de Anlisis y Procesos Ambientales, para desarrollar este trabajo.

Al profesor Mauricio Alejando Marn por facilitarnos el espacio y los equipos del
Laboratorio de Biologa Celular y Molecular, para desarrollar parte de este trabajo.

A la profesora Blanca Fabiola Espejos Benavidez por facilitarnos los equipos de su
laboratorio, para desarrollar parte de este trabajo.

A mis compaeros de grupo: Alejo, Jersson, Xiomy, Cata, Cris, Pao, Oscar, Ana Caro y a
todos los integrantes del grupo PROBIOM que siempre estuvieron dispuestos a ayudar y a
dar la mano.

A mis compaeros de estudio: Rodrigo y Olga quienes siempre estuvieron dispuestos a
colaborarme y ayudarme durante el desarrollo de este trabajo.

A todas las personas que de una u otra manera hicieron parte colaborando con este trabajo.
CONTENIDO
INDICE DE TABLAS ............................................................................................................ 1
INDICE DE FIGURAS .......................................................................................................... 4
ABREVIATURAS ................................................................................................................. 6
RESUMEN ............................................................................................................................. 9
1. INTRODUCCIN ........................................................................................................ 10
2. MARCO TERICO ..................................................................................................... 13
2.1 LOS BIOPOLMEROS ........................................................................................ 13
2.1.1 Clasificacin de los biopolmeros .................................................................... 14
2.1.1.1 Biopolmeros producidos directamente por organismos vivos. ................... 14
2.1.1.2 Biopolmeros producidos mediante polimerizacin de monmeros. ........... 14
2.1.1.3 Biopolmeros producidos mediante combinacin de monmeros. .............. 15
2.1.1.4 Biopolmeros obtenidos de mezclas de materiales. ..................................... 15
2.1.2 Fuentes naturales de biopolmeros ................................................................... 15
2.1.3 Uso de los biopolmeros ................................................................................... 16
2.1.4 Ventajas y desventajas de los biopolmeros ..................................................... 17
2.2 PLSTICOS BIODEGRADABLES O BIOPLSTICOS .................................. 18
2.2.1 Plsticos sintetizados qumicamente. ............................................................... 18
2.2.2 Plsticos semi-biodegradables o plsticos a base de almidn. ......................... 19
2.2.3 Plsticos completamente biodegradables ......................................................... 19
2.3 POLIHIDROXIALCANOATOS ......................................................................... 19
2.3.1 Estructura y propiedades de los PHA ................................................................. 21
2.3.2 Clasificacin de PHA ......................................................................................... 23
2.3.3 Aplicaciones de los PHA ..................................................................................... 24
2.3.4 Principales productores de PHA a nivel mundial ............................................... 25
2.4 SNTESIS DE PHA .............................................................................................. 27
2.4.1 Sntesis qumica de PHA .................................................................................... 27
2.4.2 Sntesis biolgica de PHA .................................................................................. 28
2.4.2.1 Rutas metablicas ........................................................................................ 30
2.4.2.2 Sustratos empleados en la produccin bacteriana de PHA......................... 33
2.5 PRODUCCIN DE PHA ..................................................................................... 35
2.5.1 Produccin de PHA in vitro ............................................................................ 35
2.5.2 Produccin de PHA mediante fermentacin microbiana .................................. 35
2.3.3 Produccin de PHA en plantas transgnicas ................................................... 38
2.6 MTODOS DE EXTRACCIN DE PHA. ......................................................... 38
2.7 MTODOS DE DETECCIN, CUANTIFICACIN Y CARACTERIZACIN
DE PHA. ........................................................................................................................... 40
3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 42
3.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................. 42
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ..................................................................................... 42
4. METODOLOGA ......................................................................................................... 43
4.1 LUGAR DE EXPERIMENTACIN ....................................................................... 43
4.2 MATERIALES Y REACTIVOS ........................................................................... 43
4.2.1 Reactivos y equipos menores .............................................................................. 43
4.2.2 Sustratos .............................................................................................................. 44
4.3 CEPAS BACTERIANAS .......................................................................................... 47
4.4 MEDIOS DE CULTIVOS ........................................................................................ 48
4.4.1 Medio de cultivo con lactosuero como fuente de Carbono. ............................... 49
4.4.2 Medios de cultivo con aceites (ricino, Jatropha, frituras) como fuentes de
Carbono. ....................................................................................................................... 49
4.4.3 Medios de cultivo con glicerol comercial y glicerol residual como fuentes de
carbono. ........................................................................................................................ 50
4.5 CONDICIONES DE CRECIMIENTO MICROBIANO ........................................... 51
4.5.1 Fermentaciones con lactosuero como fuente de carbono ................................... 51
4.5.2 Fermentaciones con aceites (Jatropha, ricino, frituras) y glicerol (GGR), como
fuentes de Carbono. ...................................................................................................... 52
4.5.3 Fermentaciones con glicerol residual (GRSB) como fuente de Carbono ........... 53
4.6 MEJORES CONDICIONES OPERACIONALES PARA LA PRODUCCIN DE
PHA EN EL SISTEMA BACTERIA: SUSTRATO. ...................................................... 53
4.7 METODOLOGAS DE ANLISIS .......................................................................... 56
5. RESULTADOS Y DISCUSIN .................................................................................. 58
5.1 SELECCIN DEL SISTEMA BACTERIA: SUSTRATO ..................................... 58
5.1.1 EVALUACIN DE LAS FERMENTACIONES CON EL SISTEMA
BACTERIA: LACTOSUERO ...................................................................................... 58
5.1.1.1 Sistema Lactococcus lactis: Lactosuero ....................................................... 58
5.1.1.2 Sistema Bacillus sp: Lactosuero .................................................................. 59
5.1.2.3 Sistema B. megaterium : glicerol residual (GRSB) .................................... 68
5.2 MEJORES CONDICIONES OPERACIONALES PARA LA PRODUCCIN DE
PHA EN EL SISTEMA BACTERIA: GLICEROL RESIDUAL ................................... 70
5.2.1 Produccin de biomasa seca y de PHA ............................................................... 72
5.2.2 Superficies de respuesta produccin de biomasa ............................................. 75
5.2.3 Superficies de respuesta produccin de PHA ..................................................... 80
5.3.4 Superficies de respuesta rendimiento de sustrato en producto global Yp/s ....... 86
6. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 92
BIBLIOGRAFA .............................................................................................................. 94
ANEXOS ............................................................................................................................ 106
ANEXO A. ANLISIS ESTADSTICO ....................................................................... 106
ANEXO B. CALIBRACIN - CARACTERIZACIN DEL PHA POR GC/MS. Error!
Marcador no definido.
1

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Principales fuentes naturales de biopolmeros.. 15
Tabla 2. Algunos biopolmeros y sus aplicaciones.. 16
Tabla 3. Ventajas y desventajas del empleo industrial de los biopolmeros 17
Tabla 4. Algunas propiedades fsico-qumicas de los PHA y de otros plsticos sintticos. 23
Tabla 5. Aplicaciones de PHA en distintos campos.. 24
Tabla 6. Principales productores de PHA en el mundo26
Tabla 7. Precios de mercado de biopolmeros y polmeros derivados del petrleo en el ao
2009.. 27
Tabla 8. PHA sintetizados por diferentes bacterias.28
Tabla 9. Produccin bacteriana de PHA a partir de diferentes sustratos puros... 33
Tabla10. Produccin bacteriana de PHA a partir de diferentes desechos
agroindustriales. 34
Tabla 11. Valores de pH para diferentes cepas microbianas empleadas en la produccin de
PHA.. 37
Tabla 12. Mtodos de extraccin de PHA...39
Tabla 13. Equipos y reactivos utilizados en el desarrollo de la investigacin. 43
Tabla 14. Composicin Qumica de los aceites de Jatropha, Ricino y Palma. .45
Tabla 15. Composicin Qumica de lactosuero . 46
Tabla 16. Composicin caracterstica de Glicerol Grado reactivo (GRR)...46
Tabla 17. Composicin del glicerol en la fase obtenida por decantacin, en la produccin
de biodiesel a partir de aceite de palma47
Tabla 18. Diseo factorial para la seleccin del mejor sistema bacteria:sustrato ..52
Tabla 19. Niveles para cada factor evaluado en la produccin de PHA... 54
Tabla 20. Diseo experimental superficies de respuesta..55
Tabla 21. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin L. lactis-
Lactosuero. 58
Tabla 22. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin Bacillus sp-
Lactosuero. 60
2

Tabla 23. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin
B. megaterium-Lactosuero ... 61
Tabla 24. Concentracin del monmero metileter metilester del cido 3-hidroxibutrico en
los extractos de diferentes sistemas bacteria: Lactosuero... 62
Tabla 25. Valores de biomasa seca obtenida con B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis en
medios enriquecidos con diferentes fuentes de carbono. (aceite de fritura, aceite de
ricino, aceite de Jatropha y glicerol) 64
Tabla 26. Extractos polimricos obtenidos para B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis en
medios enriquecidos con diferentes fuentes de carbono (glicerol (GGR) , aceite de:
frituras, ricino, Jatropha)... 65
Tabla 27.Concentracin del monmero metileter metilester del cido 3-hidroxibutrico en
los extractos los sistemas B. megaterium: Glicerol; B. megaterium: aceite de frituras 67
Tabla 28. Valores de biomasa seca producida en los sistemas B. megaterium-glicerol RSB
y B. megaterium-glucosa.. 68
Tabla 29. Produccin de PHA diferentes cepas bacterianas, empleando glicerol como
sustrato. 71
Tabla 30. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenidos en el sistema B. megaterium-
GRSB, Temperatura: 25C....72
Tabla 31. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenido en el sistema B. megaterium-
GRSB, Temperatura: 30C. 73
Tabla 32. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenido en el sistema B. megaterium-
GRSB, Temperatura: 35C74
Tabla 33. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las
temperaturas evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten la mxima produccin de
biomasa en el sistema B. megaterium: glicerol residual... 80
Tabla 34. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las
temperaturas evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten la mxima produccin de
PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual.85
3

Tabla 35. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las
temperaturas evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten el mximo rendimiento
Yp/s en el sistema B. megaterium: glicerol residual. 91

















4

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Ciclo de vida de los PHA. ................................................................................... 21
Figura 2. Estructura qumica de PHA producidos en bacterias. .......................................... 22
Figura 3. Reaccin de biosntesis de PHB........................................................................... 29
Figura 4. Micrografa de trasmisin electrnica (TEM) de secciones delgadas de clulas de
C. nector PHB24 recombinadas que contienen grandes cantidades (90% peso seco de
las clulas) de PHB-co-5% mol de HHx.. ................................................................... 30
Figura 5. Biosntesis de PHA.. ............................................................................................ 31
Figura 6. Biosntesis para homopolmeros y copolmeros de PHA a partir de diferentes
fuentes de carbono (glucosa, glicerol y cidos grasos) ................................................ 32
Figura 7. Morfologa macro y microscpica de las colonias de cepas ............................... 48
Figura 8. Aceites empleados en las diferentes fermentaciones ........................................... 50
Figura 9. Crecimiento de L. lactis en Lactosuero ................................................................ 59
Figura 10. Crecimiento de Bacillus sp., en Lactosuero ...................................................... 60
Figura 11. Crecimiento de B. megaterium en Lactosuero .................................................. 61
Figura 12. Biomasa seca obtenida en los diferentes sistemas (microorganismo-sustrato). 64
Figura 13. Espectros de masas (GC/MS) de los metilester derivados de (a) cido 3-
hidroxibutrico (PHB) comercial;(b) extracto polimrico obtenido de la fermentacin
con el sistema B megaterium- glicerol y (c) extracto polimrico obtenido de la
fermentacin con el sistema B megaterium- A. de frituras ......................................... 67
Figura 14. Curvas de crecimiento de B. megaterium en glicerol residual y B. megaterium
en glucosa ..................................................................................................................... 69
Figura 15. Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 25 C... ...... 76
Figura 16. Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 30C.. ......... 77
Figura 17. Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 35C.. ........ 78
Figura 18. Efectos principales de cada una de las condiciones operacionales evaluadas
sobre la produccin de biomasa................................................................................... 79
Figura 19. Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 25 C... 82
Figura 20. Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 30 C... . 83
5

Figura 21. Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 35 C... 84
Figura 22. Efectos principales sobre concentracin de PHA , de cada una de las
condiciones operacionales evaluadas ........................................................................... 85
Figura 23. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B. megaterium:
glicerol a 25 C..............................................................................................................87
Figura 24. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B megaterium:
glicerol a 30 C..88
Figura 25. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B megaterium:
glicerol a 35 C.. .......................................................................................................... 89
Figura 26. Efectos principales sobre el rendimiento de producto por unidad de sustrato
Yp/s, de cada una de las condiciones operacionales evaluadas. ................................... 90












6

ABREVIATURAS

CMC: carboximetilcelulosa

FTIR: espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier ( por su abreviatura en
ingles, Fourier Transform Infrared Spectroscopy)

GC: cromatografa de gases (Por su abreviatura en ingles, Gas Chromatography)

GC-MSD: cromatografa de gases con detector selectivo de masa (Por su abreviatura en
ingles Gas Chromatography/Mass Selective Detector)

HA: cidos hidroxialcanocos (por su abreviatura en ingls, Hidroxialkanoic Acid)

HHx: hidroxihexanoato

mBar: milibares

MMS: medio mnimo de sales

PBTA: polibutileno tereftalato adipato

PBTS: polibutileno tereftalato succinato

PBTG: polibutileno tereftalato glutarato

PCL: policaprolactonas

PEA: polisteramidas

7

PEBDL: polietileno lineal de baja densidad a base de bioetanol

PDO: propanodiol (Por su abreviatura en ingles, Propane-1,3-diol)

PGA: cido poligliclico (por su abreviatura en ingls, Polyglycolic Acid)

PHA: polihidroxialcanoatos

PLA: cido polilctico (por su abreviatura en ingls, Polylactic Acid)

PHA
SCL
: polihidroxialcanoatos de longitud de cadena corta

PHA
MCL
: polihidroxialcanoatos de longitud de cadena media

PHA
LCL
: polihidroxialcanoatos de longitud de cadena larga

PHB: poli (3-hidroxibutirato)

PHV: polihidroxivalerato

PHBH: poli (3-hidroxibutiraro-4-hidroxibutiraro)

PVA: alcohol polivinlico (por su abreviatura en ingls, Polyvinyl Alcohol)

PP: polipropileno.

PS: Poliestireno.

PEBD: polietileno de baja densidad.

8

RMN-
13
C: resonancia magntica nuclear de Carbono-13.

RMN-
1
H: resonancia magntica nuclear de Hidrogeno-1.

SDS: dodecilsulfato sdico.

SET: solucin de elementos traza.

SAS: Statistical Analisys System.

TEM: micrografa de trasmisin electrnica (Por su abreviatura en ingles, Transmission
Electron Microscopy).

Y
P/S
: rendimiento de producto por unidad de sustrato.


9

RESUMEN

Los Polihidroxialcanoatos (PHA) son plsticos biocompatibles y biodegradables
sintetizados por una amplia variedad de microorganismo (hongos y bacterias) as como de
algunos organismos como las plantas, que comparten caractersticas con los plsticos de
origen petroqumico. Los estudios ms recientes se centran en la bsqueda de sustratos
econmicos y en estrategias de extraccin que permitan la reduccin de los costos del
producto y, de esta forma, puedan incursionar en un mercado ampliamente difundido cual
es el de los plsticos derivados del petrleo. En este trabajo, la produccin de
polihidroxialcanoatos (PHB) fue evaluada empleando las cepas nativas: Bacillus
megaterium, Bacillus sp. y Lactococcus lactis, y como sustratos: glicerol grado reactivo
(GGR), glicerol residual (GRSB) subproducto de la produccin de biodiesel a partir de
aceite de palma, aceite de Jatropha, aceite de ricino y aceites de fritura y lactosuero. Se
evaluaron a escala de laboratorio los diferentes sistemas bacteria-sustrato a diferentes
condiciones de temperatura, pH y concentracin de sustrato, en un proceso fermentativo
por lotes utilizando matraces de 250 mL, con un volumen de trabajo de 50 mL, todos los
sistemas se evaluaron por triplicado. El crecimiento bacteriano se dio en todos los sistemas
evaluados sin embargo, el sistema B. megaterium-GGR fue el que gener la mayor
acumulacin de PHA. Con base a esto, se propuso realizar el diseo estadstico de
optimizacin con el GRSB. Para este sistema se encontr un ptimo de produccin de
PHB (2.80 g/L) bajo las siguientes condiciones operacionales: GRSB, 15 g/L, pH 7.0 y
temperatura 25C. Sin embargo el ptimo de biomasa (5.42 g/L) se da a un pH 9.0 y una
concentracin de sustrato de 22 g/L, con una temperatura de 25C.
Palabras claves: biopolmero, polihidroxialcanoatos, glicerol, glicerol residual (GRSB),
aceites, lactosuero, Bacillus megaterium, fermentacin.


10

1. INTRODUCCIN

Los Biopolmeros, son sustancias producidas a partir de fuentes renovables, que dan lugar a
plsticos biodegradables y por tanto, pueden ser una alternativa a los problemas
ambientales y sociales que son generados por la industria de los plsticos de origen
petroqumico.
Los plsticos derivados del petrleo, son muy resistentes a la temperatura, la presin, los
solventes qumicos, la luz UV, entre otros factores, por lo que son muy utilizados en todos
los campos de la industria, as por ejemplo, mientras en 1950 se produjeron 1.5 millones de
toneladas (mTon) de plsticos, para el 2010 se reportaron 250 mTon y se prev que llegar
a 330 mTon para el 2015 (Castro, 2011). La produccin de plsticos a gran escala (con un
incremento anual alrededor del 6.5 % para los prximos 5 aos) resulta, finalmente, en una
acumulacin exponencial de desechos plsticos en el medio ambiente (Chanprateep, 2010)
y en la contaminacin de cuerpos de aguas y suelos, lo que tiene un impacto negativo en la
salud humana y la de los seres vivos, convirtindolos en un problema social de alto inters
(Cavalheiro et al., 2009).
Debido a esto, en las ltimas dcadas, investigadores de todo el mundo, se han enfocado en
la produccin de polmeros biodegradables, empleando diferentes mtodos y
procedimientos, principalmente en los de la familia de los polihidroxialcanoatos (PHA) y
sus derivados (polilcticos, polisteres alifticos, polisacridos) (Corre et al., 2012).
Los PHA son biopolisteres completamente biodegradables, sintetizados y catabolizados
por una amplia gama de microorganismos (bacterias y hongos) y por algunas plantas
(Suriyamongkol et al., 2007, Laycock et. al., 2012). Los PHA de origen bacteriano son
sintetizados intracelularmente como inclusiones citoplasmtica hidrofbicas, generalmente
en presencia de una fuente de carbono en exceso, cuando hay deficiencia de algn otro
nutriente esencial como O, N, P, S Mg (Wong et al., 2012), en periodos de tiempo cortos,
por lo que llama la atencin de empresarios. Sin embargo, los costos de produccin,
relativamente altos con respecto a la produccin petroqumica de sus anlogos, han
limitado la produccin industrial de PHA. En el 2010, por ejemplo, el costo de produccin
11

de PHB (uno de los tipos de PHA ms estudiado), fue estimado entre USD 2.13 6.25/kg,
de los cuales el 30-40% corresponde a la fuente de carbono; estos valores superaban los
precios de los polmeros similares obtenidos del petrolero, para los que se estim un costo
de USD 1.45/kg (Chanprateep, 2010, Posada et al., 2011).
Se ha evidenciado que la produccin rentable, a escala industrial, depende de varios
factores: habilidad del microorganismo para emplear una fuente de carbono econmica
(recientemente se han enfocado en desechos agrcolas y subproductos industriales), costo
del medio de cultivo, velocidad de crecimiento, velocidad de sntesis del polmero, calidad
y cantidad del PHA y, el costo de los procesos subsiguientes para la produccin del
plstico, temas en los que centran sus estudios los investigadores, a nivel mundial
(Chanprateep, 2010 ; Agnew y Pfleger, 2013 ). Adems, de la bsqueda de materias primas
renovables y econmicas (Alonso et al., 2010), la evaluacin de microorganismos
genticamente modificados (Hfer et al., 2011), el uso de consorcios microbianos (Liu et
al., 2011), mejoras en los proceso de extraccin y purificacin (Posada et al., 2011) y el
desarrollo de tecnologas en plantas transgnicas (Rebeille et al., 2006), . Adems de la
variacin en las estrategias del proceso fermentativo (en lotes, lotes alimentados y
continuo). (Naranjo et., la, 2010).
En Colombia existen empresas alimenticias y energticas, que generan subproductos que
pueden ser aprovechados como potenciales fuentes de carbono en la produccin de PHAs.
Esta investigacin, en particular, se centr en la evaluacin del potencial de cepas nativas
para la produccin de PHA a partir de sustratos econmicos, desechos o subproductos de
diferentes industrias (aceites de Jatropha, ricino, frituras, lactosuero, glicerol residual),
teniendo presente que existen microorganismos capaces de sintetizar PHA a partir de cidos
grasos y/o azcares (Tian et al., 2000; Ko-Sin et al., 2010; Nath et al., 2008).
En particular, el glicerol residual es una fuente de carbono econmica para el proceso de
produccin de PHA debido a que es un subproducto de la transesterificacin de aceites
empleados en el proceso de fabricacin de biodiesel (Shrivastav et al., 2010). En Colombia
existen 6 plantas de produccin de biodiesel las cuales tienen una capacidad de producir en
12

promedio 84 mil Ton/ao, aproximadamente el 10% de esa produccin se convierte en
glicerol de desecho (Fedebiocombustibles: Boletn N 62, 2012).
En nuestro pas, se han estudiado varios residuos agroindustriales como potenciales
materias primas para la produccin de PHA, entre los que figuran: glicerol (Naranjo, 2010),
jugo de fique (Snchez, 2007), melaza y pulpa de fruta (Salazar, 2011), y otros enfocados
en el aislamiento y caracterizacin molecular de cepas productoras de PHA (Revelo et al.,
2006, Snchez, 2007). No obstante, reportes en cuanto a la evaluacin de parmetros
operacionales que afectan la produccin de PHA, son mnimos: Salazar (2011) centrndose
en el uso de sustratos azucarados y valores ptimos de operacin, logr mejorar el
rendimientos hasta unas 4.3 veces.
En este trabajo se estableci un proceso fermentativo para la produccin de PHB a partir de
GRSB, utilizando el sistema B. megaterium: GRSB a 25 C, pH 7.0, velocidad de
agitacin 200 rpm. Con este sistema se logr un rendimiento en productos Yp/s de 204.1
mg de PHB /g .
El B. megaterium se ha reportado en muchas ocasiones empleando sustratos azucarados,
con resultados satisfactorios en cuanto a la acumulacin de biopolmeros (Gouda et al.,
2001; Reddy et al., 2003, Salazar, 2011); sin embargo, los reportes sobre produccin de
PHB empleando B. megaterium en presencia de glicerol son mnimos. Esta investigacin
constituye un aporte en ese sentido.

13

2. MARCO TERICO

Sin duda alguna los polmeros sintticos ofrecen una amplia aplicacin en el mundo actual
a diferencia de los polmeros naturales, a tal punto que su uso se ha excedido y con ello,
han crecido los problemas ambientales, pues su acumulacin en ros y suelos afecta la
salud de las especies y las condiciones de vida humana.

Los polmeros que mayor impacto tienen en el ecosistema, son los derivados del petrleo
crudo. Los plsticos tienen el ms amplio campo de aplicacin; esto muestra lo dependiente
que es la industria de los plsticos del petrleo y las consecuencias que causa en el precio
de este recurso. Por lo que es conveniente pensar en la utilizacin de nuevas materias
primas para la fabricacin de estos compuestos (Siracusa et al., 2008).


Los polmeros biodegradables (biopolmeros), obtenidos de desechos agroindustriales, son
una de las posibles soluciones tanto al problema del consumo del recurso no renovable
(petrleo) como al problema ambiental que los plsticos sintticos, puesto que son
totalmente degradables por microorganismos.

2.1 LOS BIOPOLMEROS

El beneficio que los recursos naturales ofrece, en cuanto a conservacin y reciclaje se
convierte en una excelente opcin e innovacin en el desarrollo de nuevos productos
biodegradables. Los biopolmeros representan los componentes orgnicos ms abundantes
en la naturaleza. Ellos son importantes para la vida cotidiana y exhiben propiedades
fascinaste con variedad de aplicaciones. Su total biodegradacin en productos como CO
2
y
H
2
O y, posteriormente, en abonos orgnicos, constituye una gran ventaja frente a los
polmeros sintticos.

14

Los biopolmeros se encuentran en cualquier organismo y poseen un amplio rango de
funciones esenciales y/o benficas para los organismos, por ejemplo: conservacin y
expresin de la informacin gentica; catlisis de reacciones; reserva de Carbono,
Nitrgeno, Fsforo y otros nutrientes. Adems, actan como reserva de energa, proteccin
contra los ataques de otras clulas y de factores ambientales peligrosos o intrnsecos,
sensores de factores de bioticidad o abioticidad, comunicadores con el medio ambiente y
con otros organismos, y mediadores de adhesin a superficies u otros organismos.
Conjuntamente muchos de estos compuestos son componentes estructurales de clulas,
tejidos y microorganismos (Vandamme et al., 2005).

Hasta la presente, se han logrado reemplazar polmeros sintticos por otros de origen
natural, en aplicaciones especficas, relacionadas con propiedades de barrera, mecnicas y
trmicas, en empaques tipo pelculas, protectores, espumas, envolturas, platos, tasas,
cucharas, bolsas, etc (Villada et al., 2007).

2.1.1 Clasificacin de los biopolmeros
Los biopolmeros clasifican en cuatro grupos de acuerdo a su fuente, tal como se presenta a
continuacin:

2.1.1.1 Biopolmeros producidos directamente por organismos vivos.

Dentro de este grupo se encentran: la lana, la seda, el algodn, y otras fibras naturales como
la celulosa, el almidn, la goma xantan, la lignina, las protenas del aceite, la cutina, el
caucho natural, los polihidroxialcanoatos (PHA) y copolmeros como el 3-
mercaptopropionato (3MP), el 3-mercaptobutirato (3MB) o el 3-mercaptovalerato (3MV).
(Ltke-Eversloh et al., 2001)

2.1.1.2 Biopolmeros producidos mediante polimerizacin de monmeros.

En este grupo estn los polmeros constituidos por monmeros que existen en la naturaleza
o son derivados de materiales existentes en la naturaleza, por ejemplo: el cido polilctico
15

(PLA), el politrimetileno glicol, y los polioles a base de soya y sus derivados (Vandamme
et al., 2005).

2.1.1.3 Biopolmeros producidos mediante combinacin de monmeros.

Dentro de este grupo figuran los polmeros que mezclan monmeros de fuentes naturales
con monmeros de origen petroqumico, por ejemplo: el isosorbato-policarbonato y los
poliuretanos a base de soya (Villada et al., 2007)

2.1.1.4 Biopolmeros obtenidos de mezclas de materiales.

Este grupo incluye los polmeros producidos por mezclas de materiales de origen petrolero
con materiales de fuentes renovables tales como, mezclas de almidn con PVA
(Chanprateep, 2010).

2.1.2 Fuentes naturales de biopolmeros

Los biopolmeros naturales provienen fundamentalmente de cuatro grandes fuentes (Vase
Tabla 1).
Tabla 1. Principales fuentes naturales de biopolmeros
Origen Biopolmero

Animal

Colgeno, gelatina

Agrcola

Lpidos y grasas, e
hidrocoloides (protenas, polisacridos)

Marino

Quitina, Quitosan

Microbiano

PLA y PHA
Fuente: Villada et al., 2007.
16

2.1.3 Uso de los biopolmeros

Los polmeros sintticos estn siendo gradualmente reemplazados por materiales
biodegradables, especficamente por los obtenidos de fuentes naturales, en algunas
aplicaciones a nivel agrcola e industrial (Villada et al., 2007). El desarrollo de estos
materiales se enfoca a campos del mercado bien definidos (Vase Tabla 2), pero se pueden
ampliar a otros, en la medida en que las investigaciones permitan solucionar los problemas
asociados con su obtencin, elaboracin y fabricacin.

Tabla 2. Algunos biopolmeros y sus aplicaciones.
Biopolmero Aplicacin
Fibras naturales
En la industria automotriz, son usualmente empleados en partes
interiores formadas.
PLA
Fueron desarrollados para servicios mdicos tales como
tornillos reabsorbibles, suturas, y alfileres
Almidn, PHAs
Pueden ser empleados en la fabricacin de bolsas de basura,
cubiertos desechables y platos, envasado de alimentos, y
materiales de embalaje. El almidn tambin se usa en la
modificacin de las texturas de las comidas.

Polister, alcohol polivinlico,
pectina

Se disean para la extrusin,
moldeo por inyeccin y moldeo por soplado.
Tambin se fabrican bolsas de lavandera, elementos
desechables de servicio de alimentos, productos agrcolas, y
bolsas de catter.
Celulosa, (CMC)
Mejoran las propiedades de barrera en las pelculas elaboradas,
la CMC es una pelcula capaz de absorber el aceite de los
alimentos sometidos a procesos de frituras.
Ceras naturales
Ayudan a prevenir la disminucin de la humedad de frutas y
verduras, ellas tambin son usadas como agentes de
microencapsulacin, especficamente para sustancias con olores
y sabores a condimento.
17

Colgeno
Usado tradicionalmente en la preparacin de envolturas
comestibles.
Quitosn
Es un antifngico y antimicrobiano, las pelculas a partir de
quitosn prolongan la vida de los alimentos en las estanteras.
Fuente: Kolybaba et al., 2003

2.1.4 Ventajas y desventajas de los biopolmeros

El uso de los biopolmeros abre un gran potencial benfico para el medio ambiente en
todos los sectores de la agroindustria, dada la similitud de estos materiales naturales con
los sintticos por sus excelentes propiedades mecnicas, de barrera y transmisin de luz,
podran reemplazar materiales de origen petroqumico, evitndose contaminaciones por
acumulacin de materiales recalcitrantes (Vase Tabla 3) (Villada et al., 2007).

Tabla 3. Ventajas y desventajas del empleo industrial de los biopolmeros.
Biopolmeros
Desventajas Ventajas
El costo es un obstculo para los
materiales plsticos biodegradables de
origen natural cuando estn directamente
frente a sus convencionales homlogos.

Los plsticos sintticos se producen
a gran escala, mientras que la mayor parte
los biopolmeros a pequea escala.

No es posible esperar que la renovacin
completa de polmeros convencionales
por sus homlogos biodegradables sea a
Al ser productos obtenidos de fuentes renovables de
energa, su costo de produccin se puede reducir
significativamente, convirtindolos en una opcin
industrial apropiada frente a los polmeros
sintticos.
Son amigables al medio ambiente, ventaja
comparativa con respecto a los polmeros sintticos
derivados del petrleo, que se producen
masivamente.
La completa sustitucin de los plsticos a base de
petrleo por los basados en recursos renovables
como materia prima, llevara a un nivel de CO
2

equilibrado en la atmsfera.
18

corto plazo.
Aparentemente hay un nmero ilimitado de las
reas, donde los polmeros biodegradables pueden
encontrar aplicacin.
Fuente: Kolybaba et al., 2003

2.2 PLSTICOS BIODEGRADABLES O BIOPLSTICOS

Los plsticos biodegradables son compuestos de especial inters, ya que comparten algunas
propiedades mecnicas con los plsticos derivados del petrleo. Estos polmeros se dividen
en tres categoras:
2.2.1 Plsticos sintetizados qumicamente.

Estos materiales se constituyen por compuestos de origen biolgico y son susceptibles a
ataques enzimticos y microbianos. Puesto que no comparten todas las propiedades de los
plsticos, no son comercialmente viables como sustitutos de los mismos. Por ejemplo: el
cido poligliclico (PGA), las policaprolactonas (PCL), el alcohol polivinlico (PVA), el
poli (oxi-etileno), las polisteramidas (PEA), el 1,3 propanodiol (PDO), los cuales se
obtienen a partir de azcar de maz y el polietileno lineal de baja densidad, a base de
bioetanol (PEBDL). No se consideran totalmente biodegradables porque necesitan de
tratamientos con luz de alta frecuencia (ejemplo: luz ultravioleta) para su degradacin
parcial y durante el proceso se generan residuos txicos (Reddy et al., 2003).
19

2.2.2 Plsticos semi-biodegradables o plsticos a base de almidn.

En estos materiales el almidn es adicionado como relleno al agente reticulante
1
para
producir una mezcla de almidn y de plstico, por ejemplo: el polmero a base de almidn-
polietileno. Este tipo de bioplsticos son parcialmente biodegradables, dado que los
microorganismos presentes en el suelo, degradan el almidn pero no son capaces de romper
la matriz del polmero, persistiendo la problemtica ambiental con los fragmentos
recalcitrantes residuales. (Vilpoux y Averous, 2004).
2.2.3 Plsticos completamente biodegradables.

Son polmeros 100% biodegradables, pertenecientes a una familia de polisteres de cidos
hidroxialacanocos (HA). Entre estos se encuentran los PHA, polilctidos (PLA),
polisteres alifticos y polisacridos, y los copolmeros y/o mezclas de los anteriores
(Khanna y Srivastava, 2005). Dependiendo de sus caractersticas biodegradables se
subdividen en dos grupos: el primer grupo une biopolmeros que son plsticos de origen no
biolgico pero tienen propiedades biodegradables o compostables, entre estos figuran co-
poliesteres alifticos-aromticos sintticos biodegradables, tales como polibutileno
tereftalato adipato (PBTA), polibutileno tereftalato succinato (PBTS), y el polibutileno
tereftalato glutarato (PBTG).

El segundo grupo incluye polmeros de origen biolgico que son biodegradables o
compostables: materiales a base de almidn, materiales a base de celulosa, compuestos y
mezclas de PLA y los PHA entre otros (Chanprateep, 2010).
2.3 POLIHIDROXIALCANOATOS

Los PHA son polmeros de HA, que pueden ser sintetizados por una gran variedad de
microorganismos (bacterias, hongos y cepas recombinadas); como reserva de carbono y

1
Agente reticulante. Sustancia que promueve o regula enlaces covalentes intermoleculares entre las cadenas
de los polmeros, unindolos para crear una estructura ms rgida.

20

energa, usualmente bajo condiciones limitantes de nutrientes esenciales como N, P, O, S,
Mg, y en presencia de una fuente de carbono en exceso. Sin embargo, algunas bacterias
son capaces de producirlos incluso sin estar sujetas a cualquier tipo de contraste
nutricional; por ejemplo: Alcaligenes lactus (Reddy et al., 2003). Estos biopolmeros son
acumulados en forma de grnulos intracelularmente a niveles que alcanzan hasta el 90%
del peso seco de la clula (Khanna y Srivastava, 2005). Los PHA se les encuentran
haciendo parte de la membrana citoplasmtica y el citoplasma de bacterias, levaduras,
plantas y animales, cumpliendo funciones tales como, proteccin de macromolculas,
transporte de ADN entre otras. Poseen propiedades similares a varios termoplsticos
sintticos como el polipropileno y, en principio, pueden utilizarse en su lugar (Keshavarz y
Roy, 2010). Los PHA varan en sus caractersticas fsicas y qumicas debido a la variedad
de monmeros que contienen. Los factores que afectan el contenido de monmeros
incluyen: el tipo de microorganismos (Gram positivos o Gram negativos), los ingredientes
del medio de cultivo, las condiciones de fermentacin, los tipos de fermentacin (por lotes,
continuos, retroalimentados) y la recuperacin de los mismos (Lee et al., 1999; Castilho et
al., 2009). Hasta la fecha se reportaron ms de 150 tipos de PHA producidos
biolgicamente (Hofer et al., 2011; Rai et al., 2011).

En algunas plantas se ha inducido la produccin de PHA mediante modificaciones
genticas. El descubrimiento de la acumulacin de PHB en el citoplasma de las clulas de
Arabidopsis thaliana, fue el inicio de la aplicacin de esta tcnica, que se ha venido
aplicando desde el ao de 1992. Desde entonces, se sintetizaron varios tipos de PHA en
varias especies como Nicotiana tabacum y Brassica napus, mediante la creacin de rutas
metablicas en el citoplasma y en los plstidos o peroxisomas (Khanna y Srivastava, 2005).

Los PHA son completamente biodegradables hasta dixido de carbono (CO
2
) y agua (H
2
O)
bajo condiciones aerbicas, y hasta metano (CH
4
) bajo condiciones anaerbicas, por
microorganismos que se encuentran en el suelo, mar, lagos, aguas residuales, etc (Vase
Figura 1). Tambin pueden ser sujetos a degradacin trmica e hidrlisis enzimtica
21

(Khanna y Srivastava, 2005). En sistemas biolgicos pueden ser degradados usando
dipolimerasas microbianas as como por las hidrlisis enzimticas y no enzimticas en
tejidos anmales. (Rai et al., 2011).

Figura 1. Ciclo de vida de los PHA (Verlinden, et al., 2007).

2.3.1 Estructura y propiedades de los PHA

Los PHA usualmente estn compuestos de monmeros de ( R )--hidroxicidos, en los
cuales el grupo R vara desde metil (C
1
) hasta tridecil (C
13
) (Vase Figura 2). (Lee et al.,
1999; Reddy et al., 2003). La mayora de los PHA reportados presentan configuracin
ptica [R], esto debido a la estreoespecificidad de la enzima involucrada en la etapa de
polimerizacin (Wiley, 2011).


22


R grupo alquilo C
1
-C
13

X vara desde 100 hasta 35000 unidades.
n=1
R= hidrgeno; Poli (3-hidroxipropionato)
R= metil; Poli (3-hidroxibutirato) [P(3HB)]
R=etil; Poli (3-hidroxivalerato)
R=propil; Poli (3-hidroxihexanoato)
R=pentil; Poli (3-hidroxioctanoato)
R=nonil; Poli (3-hidroxidodecanoato)
n=2
R= hidrogeno; Poli (4-hidroxibutirato)
R=metil; Poli (4-hidroxivalerato) [P(4HV)]
n=3
R= hidrogeno; Poli (5-hidroxivalerato)
R=metil;Poli (5-hidroxihexanato) [P(5HHx)]
n=4
R= hexil; Poli (6-hidroxidodecanoato)
Figura 2. Estructura qumica de PHA producidos en bacterias.

Las propiedades fsico-qumicas de los PHA son muy similares a las de algunos polmeros
de origen petrolero (Polipropileno (PP), Poliestireno (PS), polietileno de baja densidad
(PEBD)) (Vase Tabla 4). Estas propiedades pueden ser mejoradas realizando mezclas
empleando monmeros como el HV y copolmeros como el P3HB-co-P3HV, los cuales
mejoran especficamente las propiedades mecnicas de estos materiales (Wiley, 2011).




23


Tabla 4. Algunas propiedades fsico-qumicas de los PHA y de otros plsticos sintticos
Propiedad PHA Polipropileno Poliestireno Polietileno de
Baja densidad
Cristalinidad (%) 20-80 70 --- 50
Punto de fusin (C) 30-180 176 240 110
Densidad (g/cm
3
) 1,05-1,25 0,91 0,010-0,025
Fuerza de tensin (MPa) 20-40 34,5 50 10
Temperatura de transicin
vtrea (C)
-150 a -4 -10 100 -110
Elongacin para quiebre (%) 6-1000 400 --- 600
Biodegradabilidad Buena No No No
Resistencia a solventes Pobre Buena --- ---
Fuente: Akaraonye et al., 2010

2.3.2 Clasificacin de PHA

Los PHA pueden dividirse en tres grupos, dependiendo del nmero de tomos de carbono
que sustituyen a la cadena lateral R. Generalmente varan entre C
1
-C
16
(Suriyamongkol
et al., 2007):
PHA de longitud de cadena corta o -PHA
SCL
; constan de monmeros como el 3-
hidroxibutirato (HB o C
4
)

y/o el 3-hidroxivalerato (HV o C
5
). Tienen propiedades
similares a los plsticos convencionales. Son considerados como termoplsticos
(Poirier et al., 2001).
PHA de longitud de cadena media o PHA
MCL
; constan de monmeros entre C
6
-C
16

3-HAs. Son considerados como elastmeros y cauchos (Suriyamongkol et al., 2007).
PHA de longitud de cadena larga o PHA
LCL
; constan de monmeros de >C
16
(Tian et
al., 2000).

24

2.3.3 Aplicaciones de los PHA

En la Tabla 5, se muestran los diferentes campos de industria y las diferentes aplicaciones
de los PHA.

Tabla 5. Aplicaciones de PHA en distintos campos
Aplicaciones Ejemplos
Industria de empaques
Tolos los materiales de empaque que son usados
por cortos periodos de tiempo, incluyendo
utensilios de comida, aplicaciones electrnicas,
entre otros.
Industria fotogrfica y de imprenta
Los PHA son polisteres que pueden ser
fcilmente teidos.
Otros productos qumicos
Adhesivos sensibles al calor, ltex, geles
inteligentes. Los PHA se pueden emplear en la
industria cosmtica como removedores de grasa
facial.
Bloque de copolimerizacin
Los PHA se pueden convertir en dioles de PHA
para formar copolimerizacin en bloque con
otros polmeros.
Procesamiento de plsticos
Los PHA puede ser usados como coadyuvantes
para el procesamiento de plsticos.
Industria textil
Como los nylons, los PHA pueden ser
convertidos en fibras.
Industria qumica fina
Los monmeros de PHA son todos quirales de
configuracin ( R ), pueden ser utilizados
como materiales de partida para la
la sntesis de antibiticos y otros productos
qumicos (fertilizantes, productos
farmacuticos).
25

Biomaterial para implantes mdicos
Los PHA son biodegradables, biocompatibles y
pueden procesarse para convertirlos en
materiales de implantes mdicos. Los PHA
tambin se emplean como recubrimientos en la
fabricacin de drogas de liberacin controlada.
Mdicas
Los monmeros de PHA especialmente el
R3HB, tiene efectos teraputicos en las
enfermedades de Alzheimer y Parkinson,
Osteoporosis, en incluso mejora la
memoria, entre otras.
Aditivos de alimentos saludables
Los oligmeros de PHA pueden ser empleados
como suplementos alimenticios para la
obtencin de cuerpos cetnicos.
Industria microbiolgica
El operon de sntesis de PHA puede ser usado
como regulador metablico o potenciador de
resistencia, para mejorar el rendimiento de
cepas microbianas industriales.
Biocombustibles o aditivos de combustibles
Los PHA pueden ser hidrolizados para formar
hidroxialacanoatos metil esteres que son
combustibles.
Purificacin de protenas
Las protenas de unin de grnulos de PHA
phasin o PhaP son usadas en la purificacin de
protenas recombinantes.
Administracin de frmacos especficos
La coexpresin de PhaP y los ligandos
especficos pueden ayudar a lograr una
orientacin especifica hacia los tejidos
enfermos.
Fuente: Chen, 2009.
2.3.4 Principales productores de PHA a nivel mundial

La produccin de PHA a nivel mundial cada da es ms competitiva en precio con los
productos derivados del petrleo. Esto se debe a las nuevas estrategias que se han venido
26

desarrollando con el fin de encontrar nuevas materias primas econmicas y realizando
procesos fermentativos ms eficientes. A continuacin (Vase Tabla 6) se presentan el
panorama mundial de la produccin de estos biopolmero entre los aos 2003 y 2010.

Tabla 6. Principales productores de PHA en el mundo.
Nombre del
producto: PHA
Compaa Sustrato
Precio
(US$/kg)
Produccin
(Ton/ao)
Biomer: P(3HB)
Biotechnoly Co.,
Alemania
Produccin a
pequea
escala

25 (2003)
17 (2004) 50 (2003)
3,75 -6,25 (2010)

Biocycle: P(3HB)
PHB industrial S/A
Company, Brazil
Caa de
azcar

12,5 -15 (2003)
1400 (2003)
3,12-3,75 (2010)

30-60000 (2010)
Biogreen:
P(3HB)
Mitsubishi GAS
Chemical, Japon
Metanol 2,75 (2010) 10000 (2010)
Mirel
TM
: P(3HB)

Metabolix, Telles,
US
Maz,
Azcar

14 -17 (2004)
2,13 (2010)

50000 (2010)
Enmat: PHBV,
PHBV+Ecoflex
blend
Tianan Biologic
Material Co., Ltda.
Ningbo, China
- 4,64 (2010) 10000 (2010)
Nodax
TM
:PHBH P&G, US - 3,56 (2010) 20000-50000 (2010)
Nodax
TM
: PHBH
Lianyi Biotech,
China
- 5,27 (2010) 2000 (2010)
Fuente: Chanprateep, 2010; Posada et al., 2011.

Los precios de los polmeros derivados del petrleo con mayor impacto en la industria
qumica se presentan (Vase Tabla 7).


27

Tabla 7. Precios de mercado de biopolmeros y polmeros derivados del petrleo en el ao 2009.
Nombre del Polmero Compaa
Precio del mercado
(US$/kg)
Polmeros modificados con almidn Novamont, Italia 3,54 - 4,25
cido polilctico (PLA) Cargill Dow, US 3,11 - 4,81
Polipropileno (PP) - 1,04
Polietileno de alta densidad (PEAD) - 1,10
Polietileno de baja densidad (PEBD) - 1,04
Cloruro de polivinlo (PVC) - 1,02
Poliestireno (PS) - 0,99
Tereftalato de polietileno (PET o PETE) - 1,15
Fuente: Castilho et al., 2009

2.4 SNTESIS DE PHA

Los PHA son obtenidos por mtodos qumicos y biolgicos. Sin embargo la sntesis
qumica es menos empleada debido a sus altos costos.

2.4.1 Sntesis qumica de PHA

La mayora de los PHA pueden ser sintetizados qumicamente a partir de lactonas
2

sustituidas apropiadamente. La apertura del anillo para la polimerizacin generalmente se
realiza con catalizadores a base de Zinc o Aluminio en soluciones acuosas (ej: PHVB, que
se obtiene de la polimerizacin de butirolactona y valerolactona promovida por un
aluminoxano
3
oligomrico como catalizador). Recientemente, se han descrito
procedimientos en los cuales se emplean catlisis enzimticas para realizar el rompimiento
del anillo de las lactonas para su polimerizacin, como una estrategia ms limpia empleada
en la sntesis qumica de PHA (Wiley, 2011).


2
Lactonas: compuesto orgnico del tipo Ester cclico
3
Aluminoxanos: compuestos que se obtienen de la hidrlisis parcial de compuestos de trialquilalumino
28

2.4.2 Sntesis biolgica de PHA

En 1923 el bacterilogo Francs Maurice Lemoigne encontr que la cepa bacteriana
B. megaterium produca cido 3-hidroxibutrico (P3HB) y tres aos ms tarde, describi el
procedimiento para obtener este material empleando clulas bacterianas (Seebach y Fritz,
1999). Inicialmente fue considerado como un material lipdico y solo hasta el ao 1950 se
pudo establecer la naturaleza de polister de este compuesto. Por mucho tiempo se pens
que las bacterias slo eran capaces de producir P3HB, sin embargo en 1974 Wallen y
Rohwedder, identificaron 3HV y 3HHx en extractos de cloroformo (Wiley, 2011). Luego
de varios estudios realizados en los siguientes aos se pudo establecer que haba una
variedad de HA que podan ser sintetizados por bacterias, tal como se presenta en la Tabla
8.

Tabla 8. PHA sintetizados por diferentes bacterias
Bacteria PHA producido Sustrato especfico
Cupriavidus nector
(antes Ralstonia eutropha)
PHB y PHVB,
P(3HB-co-4HB),
P(3HB-co-3HV-co-5HV),
P(3HB-co-4HV-co-3HV),
P(3HB-co-3HV-co-4HV)
---
Azohydromonas lata
(antes Alcaligenes lactus)
PHB y PHVB,
P(3HB-co-3HP),
P(3HB-co-4HB),
---
Rhodospirillum rubrum
P(3HB-co-3HV-co-3H4-pentanoato)

4-cido pentenoico o
cido pentanoico
Chromobacterium violaceum
Homopolmero P(3HV)

Valerato de sodio
Delftia acidovarans P(3HB-co-4HB) 1,4-Butanodiol
Methylobacterium P(3HB-co-4HB)
Metanol + 3-
Hidroxipropionato
Comomonas testoterone
P(3HB-co-4-Hidroxicaproato [HC])
P(3HB-co-3HC-co-3HO)
---
Sphaerotilus natans P(3HB-co-3HV)
Glucosa +
propionato de sodio
Fuente: Wiley, 2011
29

En 1980, los genes que codifican para enzimas que participan en la biosntesis de PHA
fueron clonados a partir de R. eutropha (en el presente conocida como C. necator), esto dio
lugar a la descripcin de una de las rutas metablicas ms conocida para la biosntesis
bacteriana de PHB (Vase Figura 3), esta ruta se describe bsicamente con tres reacciones
catalizadas por tres enzimas diferentes. (Reddy et al., 2003):
La primera reaccin consiste en la condensacin de dos molculas de acetil-
coenzima A (acetil-CoA) para formar acetoacetil-CoA. La reaccin es catalizada
por la enzima -cetoacil-SCoA tiolasa.
La segunda reaccin es la reduccin de acetoacetil-SCoA a ( R )-3-hidroxibutiril-
CoA por la enzima dependiente de NADPH, acetoacetil-CoA deshidrogenasa.

Finalmente, los monmeros de ( R ) -3-hidroxibutiril-CoA se polimerizan a PHB
por medio de la P(3HB) polimerasa.


Figura 3. Reaccin de biosntesis de PHB.

El homopolmero [P(3HB)] obtenido a partir de B. megaterium es el ms abundante y
estudiado de los miembros de la familia de los PHA (Castilho et al., 2009). Este
homopolmero es un polister termoplstico que se acumula cerca a la membrana de
muchas bacterias, representando hasta el 80% del peso seco de la clula. El PHB es una
reserva ideal de carbono, ya que existe en la clula en un estado altamente reducido (es
virtualmente insoluble) y ejerce una presin osmtica insignificante sobre los
microorganismos que lo sintetizan (Vase Figura 4). (Bright et al., 2003).
30


Figura 4. Micrografa de trasmisin electrnica (TEM) de secciones delgadas de clulas de C.
nector PHB24 recombinadas que contienen grandes cantidades (90% peso seco de las clulas) de
PHB-co-5% mol de HHx. (Rai. et al., 2011).

2.4.2.1 Rutas metablicas

Las rutas metablicas que emplean los diferentes microorganismos para la biosntesis de los
PHA son muy variadas y dependen de la maquinaria enzimtica con la que cuentan y del
sustrato empleado en el proceso fermentativo. Pueden resumirse como en el caso de la
produccin de PHB en solo tres etapas, as como tambin pueden llegar a ser un poco ms
complejas como en el caso de la produccin de PHA empleando cidos grasos como fuente
de carbono. A continuacin (Figura 5) se presentan algunas rutas conocidas para la
biosntesis de PHA realizada por bacterias
31


Figura 5. Biosntesis de PHAs. Abreviaciones: PhaA, 3-cetotiolasa; PhaB, ( R )-3-cetoacil-CoA
reductasa (para la biosntesis de PHB, la enzima es acetoacetil-CoA reductasa); PhaC, PHA sintasa
o polimerasa; PhaG, ( R )-3-hidroxiacil ACP:CoA transacilasa; PhaJ, ( R )- especifica enoil-CoA
hidratasa. PhaC, especfica para monmeros enantiomricos en la configuracin [R] (Aldor
Keasling, 2003).

En la Figura 6 se ilustran las diferentes rutas metablicas, comnmente descritas
dependiendo de la composicin final del biopolmero y del sustrato empleado como fuente
de carbono en el proceso fermentativo.


32


Figura 6 . Biosntesis para homopolmeros y copolmeros de PHA a partir de diferentes fuentes de
carbono (glucosa, glicerol y cidos grasos). Abreviaturas: PhaZ, PHA dipolimerasa (Gao et al.,
2011).


33

2.4.2.2 Sustratos empleados en la produccin bacteriana de PHA

La produccin microbiana de PHA abarca un gran nmero de microorganismos e incluso
plantas (Singh et al., 2009). A continuacin (Tabla 9), se resumen las principales
bacterias y sustratos puros utilizados en la produccin de PHA y el tipo de material que
sintetizan.
Tabla 9. Produccin bacteriana de PHA a partir de diferentes sustratos puros.
Sustrato Polihidroxialcanoatos (PHA)
Homopolmeros Copolmeros
Gram-Positiva Gram-Negativa Gram-Positiva Gram-Negativa
Glucosa Bacillus
Streptococcus
Streptomyces


Azotobacter
Comamonas
Escherichia
Pseudomonas
Ralstonia
Vibrio

Bacillus

Pseudomonas
Ralstonia

Fructosa Bacillus

Comamonas
Ralstonia
Bacillus
Microlunatus
Comamonas


Sacarosa Bacillus
Streptococcus
Alcaligenes
Comamonas
Vibrio
Bacillus Rhizobium
Sphingomonas

Lactosa Lactobacillus
Lactococcus
Streptococcus
Comamonas
Hydrogenophaga
Methylobacterium
Paracoccus
Pseudomonas
Sinorhizobium

cidos
Grasos
Bacillus Brachymonas
Comamonas
Pseudomonas
Spirulina
Vibrio
Bacillus
Microlunatus

Aeromonas

Comamonas
Escherichia
Pseudomonas


Maltosa Comamonas
Protomonas

Metanol Pseudomonas
Almidn Azotobacter
Haloferax

34

Glicerol Escherichia
Methylobacterium
Ralstonia
Vibrio

Xilosa Burkholderia
Methylobacterium

Fuente: Singh et al., 2009

Adems de fuentes de sustratos puros usados en la produccin de PHA, se emplean
sustratos de origen agroindustrial. En la Tabla 10 se presentan los principales residuos
agroindustriales estudiados como precursores de PHA.

Tabla 10. Produccin bacteriana de PHA a partir de diferentes desechos agroindustriales.
Sustrato Polihidroxialcanoatos (PHA)
Homopolmeros Copolmeros
Gram-Positiva Gram-Negativa Gram-Positiva Gram-Negativa
Desechos
Agrcolas
Bacillus
Staphylococcus
Alcaligenes
Azotobacter
Burkholderia
Escherichia
Haloferax
Klebsiella
Ralstonia
Bacillus

Haloferax
Klebsiella
Pseudomonas
Rhizobium
Sphingomonas

Productos de
Uso Diario
Escherichia
Hydrogenophaga
Methylobacterium
Pseudomonas
Sinorhizobium
Pseudomonas
Ralstonia


Desechos
Grasos

Ralstonia

Comamonas
Pseudomonas
Ralstonia


Desechos
Industriales

Actinobacillus
Bacillus
Rhodococcus
Azotobacter
Burkholderia
Pseudomonas
Azotobacter


Fuente: Singh et al., 2009

35

2.5 PRODUCCIN DE PHA

La produccin de PHA se realiza mediante procesos biotecnolgicos tales como:
produccin in vitro empleando enzimas aisladas, procesos fermentativos usando
microorganismos nativos y modificados genticamente, o a travs de plantas transgnicas
(Champrateep, 2010, Laycock et al., 2012).
2.5.1 Produccin de PHA in vitro

La biosntesis de PHA in vitro se realiza a partir de lactonas o cidos hidroxialacanocos
empleando lipasas, esterasas y proteasas aisladas. Este procedimiento al no depender de la
capacidad metablica del microorganismo ofrece una alternativa en la obtencin de PHA
con mayor pureza y propiedades fisicoqumicas especficas (Steinbchel y Fchtenbusch,
1998).
2.5.2 Produccin de PHA mediante fermentacin microbiana

La produccin de PHA mediante procesos fermentativos con microorganismos, se puede
efectuar con un microorganismo (cultivo puro) o un consorcio de microorganismos
(cultivos mixtos). Estos procesos se pueden realizar por lotes, por lotes alimentados o en
continuo (Dai et al., 2007).
La forma ms simple para la produccin de PHA usando cultivos puros se realiza en dos
etapas en un proceso de produccin por lotes. En una primera etapa se realiza el inoculo de
la cepa microbiana en un medio estril que contiene: solucin de elementos traza, con una
fuente de carbono y nutrientes disponibles (P, N O). En la segunda etapa se limita de
forma deliberada alguno de los nutrientes esenciales, tomando lugar la acumulacin de
PHA (Laycock et al., 2012). Este mismo principio es empleado en los procesos por lotes
alimentados y en continuo, solo que las escalas varan y la productividad se incrementa
hasta 1.7 veces ms que en los procesos por lotes (Naranjo et al., 2010). Adems del uso de
cepas puras en los procesos fermentativos, tambin se han desarrollado tcnicas
moleculares de recombinacin gentica en busca de incrementar la produccin de PHA, por
36

ejemplo con E. coli se han hecho estudios de recombinacin gentica con genes de
C. nector, logrndose resultados de acumulacin de PHA entre 80-90 % del peso seco
celular en procesos fermentativos por lotes (Akaraonye et al., 2010).
La produccin de PHA usando cultivos mixtos, ofrece una ventaja frente a los cultivos
puros, debido a que en este tipo de fermentaciones las condiciones de esterilidad no son
requeridas. Aunque no es la nica fuente y tampoco la nica forma de crear este tipo de
cultivos, estos consorcios microbianos pueden obtenerse de lodos activados provenientes de
plantas de tratamiento de aguas residuales (Villano et al., 2010).

En cualquier caso, se requiere establecer los valores ptimos para cada uno de los
parmetros operacionales involucrados en el proceso fermentativo. Los de mayor
incidencia son: la temperatura, pH y el tiempo de fermentacin (Kulprechaa et al:, 2009)

La temperatura

La temperatura es una variable de gran inters en la mayora de los procesos que involucran
metabolismo microbiano. Esta variable es reportada como determinante para, el tipo
biopolmero y las caractersticas que adquiera (Johnson et al., 2010). La gran mayora de
autores han desarrollado sus experimentos a 30 C, independiente del microorganismo
empleado en el proceso fermentativo Entre estos figuran Hfer et al. (2011); Obruca et al.
(2011); Naranjo (2010), Ko-Sin et al ( 2010) y Zakaria et al., (2010), quienes trabajaron
con Methylobacterium extorquens, Bacillus megaterium CCM 2037, Bacillus megaterium,
Cupriavidus. nector H16 y Comamonas sp EB162, respectivamente.

pH inicial del sistema

El pH es uno de los factores que ms influye en la dinmica de los procesos biolgicos, por
esta razn algunos autores han investigado tanto su efecto individual, como el efecto
combinado que tenga con otras variables como la temperatura y el tipo de sustrato, sobre el
37

proceso de produccin de PHA (Villano et al., 2010; Pandian et al., 2010), En la Tabla 11
se presentan algunos intervalos de pH evaluados para la produccin de PHA, utilizando
diferentes cepas.

Tabla 11. Valores de pH para diferentes cepas microbianas empleadas en la produccin de PHA
Cepa Valores de pH Ref.
Vibrio spp. MK4
2
Arun et al., 2009
3
4
5
6
7
8
9
Bacillus megaterium BA-019
6
Kulpreecha et al., 2009
7
8
Bacillus megaterium SRPK-3
7
Pandian et al., 2010
8
9
10
11
Comamonas sp. EB162
6.5
Zakaria et al., 2010
7
7.5
8
Fuente: Salazar, 2011
a) Valor reportado para la mxima produccin de biomasa seca


Tiempo de fermentacin

Los tiempos de fermentacin juegan un papel muy importante dentro de los bioprocesos,
con este parmetro se definen en algunas ocasiones costos de proceso y viabilidad de
produccin a grandes escalas. Es importante saber que en procesos biolgicos donde se
38

trabaja con bacterias, los tiempos de crecimiento y produccin se encuentran en un pequeo
rango dentro del proceso fermentativo. Los reportes muestran tiempos de fermentacin que
van desde las 36 h, hasta las 120 h de fermentacin, para diferentes microorganismos
(Kulpreecha et al. (2009), Pandian et al. (2010), Shen X. et al., (2009), Valappil et al
(2007)
2.3.3 Produccin de PHA en plantas transgnicas

En 1992, Pioret y colaboradores demostraron por primera vez la expresin en Arabidopsis
thaliana de Acetoacetil CoA- reductasa y PHB sintasa a partir de genes de Ralstonia
eutropha. Sin embargo las tecnologas en este campo a penas se estn desarrollando, por
ejemplo la Metabolix Inc., empresa productora de biopolmeros, ha estado desarrollando
estas tecnologas en plantas de Nicotiana tabacum pero aun se encuentran en la fase de
estudios preliminares (Laycock et al., 2012).

2.6 MTODOS DE EXTRACCIN DE PHA.

La etapa de extraccin de los biopolmeros (PHA) va seguida de la disolucin de ste en
un solvente adecuado, como cloroformo, diclorometano, 1,2-dicloroetano o piridina. Los
residuos de la pared celular (detritos) son removidos por filtracin y/o centrifugacin. En
un ltimo paso, la purificacin se puede llevar a cabo empleando mezclas de solventes ( ej:
agua/solventes orgnicos). A continuacin (Tabla 12), se resumen los mtodos de
extraccin empleados para la recuperacin de estos biopolmeros de origen bacteriano.






39

Tabla 12. Mtodos de extraccin de PHA
Mtodo de extraccin Ventajas Desventajas Resultados (%wt)
Extraccin con
solventes
Eliminacin de
endotoxinas/alta
pureza. No hay
degradacin del
polmero
Quiebre de la
morfologa de los
grnulos de PHA. Alto
precio / baja
recuperacin
Puereza:99,5%
Recuperacin >90%
Digestin por
surfactantes
Tratamiento de altas
densidades celulares
Baja
pureza/tratamiento de
aguas residuales
necesario/degradacin
del polmero
Surfactante: digestin de
altas densidades celulares
por SDS. Pureza>95%.
Velocidad de liberacin
>90%
Digestin por NaClO Alta pureza
Degradacin del
polmero
Pureza:99%
Recupercin:94%
Digestin por NaClO y
Cloroformo
Baja degradacin del
polmero de alta
pureza
Rquiere altas
cantidades de solvente
Pureza:97%
Recupercin:91%
Digestin por NaClO y
surfactantes
Degradacin
limitada/bajos costos
de operacin
-
Sal disdica
Surfactante-EDTA.
Pureza: 98% .
Recuperacin:86,6%
Digestin por quelatos
y surfactantes
Alta
pureza/contaminacin
ambiental baja
Grandes volmenes de
aguas residuales
Puereza:98.7%
Recupercin:93,3%
Disolucin selectiva de
Masa celular
no-PHB mediante
protones (NPCM)
Alta recuperacin y
alta pureza/bajos
costos de operacin
-
Puereza:98.7%
Recupercin:95,4%
Digestin enzimtica Buena recuperacin
Altos costos de las
enzimas
Puereza:92,6%
Recupercin:90%
40

Fuente: Posada et al., 2011

2.7 MTODOS DE DETECCIN, CUANTIFICACIN Y
CARACTERIZACIN DE PHA.

La deteccin de inclusiones de PHA se realiza mediante una diferenciacin apropiada con
tintes lipoflicos, esto debido la naturaleza lipdica que exhiben estos materiales. Entre los
tintes ms usados se encuentran el Azul de Nilo A y el Negro de Sudan B. En la tincin
con Azul de Nilo-A, las clulas son fijadas por calor y al ser observadas bajo luz
fluorescente (= 362460 nm), emiten una fuerte coloracin anaranjada cuando la prueba
es positiva (Ostle y Holt, 1982). Con el Negro de Sudan B, la fijacin de las clulas se hace
Disrupcin con molino
de bolas
No requiere el uso
qumicos
Requieres de muchos
pases por el equipo
-
Homogenizacin de
alta presin
No requiere el uso
qumicos
Disrupcin
pobre/velocidad de
disrupcin baja
Rendimiento: 98%.
Pureza: 95%
CO
2
Supercrtico
Bajos costos, baja
toxicidad
Poca recuperacin Recuperacin: 89%
Utilizando la fragilidad
celular
Uso de dbiles
condiciones de
extraccin
-
Puereza:99%
Recupercin:96%
Clasificacin por
aireacin
Alta pureza Baja recuperacin
Rendimiento: 90%.
Pureza: 97%
Flotacin por aire
disuelto
No requiere el uso
qumicos
Requiere muchos
pasos consecutivos de
flotacin
Pureza: 86%
Liberacin espontanea
No es necesario
extraer las sustancias
qumicas
las clulas secreta
espontneamente los
grnulos de PHB
Rendimiento: 80%
41

al aire libre y la prueba es positiva si se presenta una coloracin azul-violeta bajo
iluminacin directa. S la coloracin es amarillo-caf la prueba es negativa (Byrom y
Byrom, 1991; Serafim et al., 2002).
Uno de los mtodos eficaces para la cuantificacin de PHA es la cromatografa de gases
(GC), empleando como patrn interno cido benzoico, en el cual se establecen tiempos de
retencin especficos para cada uno de los tipos de estructuras presentes en las muestras.
Una tcnica que brinda mayor informacin es la cromatografa de cases acoplada con un
detector selectivo de Masa (GC-MSD), que permite conocer las concentraciones de los
componentes de la muestras (Keum et al., 2008). Para poder realizar el anlisis mediante
estas tcnicas las molculas de PHA se deben extraer del interior de las clulas realizando
procesos de lisis o dispersin y por ltimo procesos derivativos que permita obtener
compuestos voltiles que faciliten la lectura en el equipo (Braunegg et al.,1978).
La cuantificacin de PHA tambin se realiza mediante anlisis espectroscpico de
resonancia magntica nuclear con Carbono 13 (RMN-
13
C). Esta tcnica permite determinar
los grupos terminales y las posibles ramificaciones de las molculas presentes en las
muestras (Khardenavis et al., 2009).
Adems de estas tcnicas tambin encontramos la espectroscopia infrarroja con
transformada de Fourier FTIR y RMN-
1
H, herramientas que se emplean en el presente,
para la caracterizacin de estos compuestos (Jan et al., 1996 ; Shrivastav et al., 2010).








42

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Encontrar un sistema bacteria-sustrato apropiado para la produccin de bioplsticos,
utilizando subproductos agroindustriales de naturaleza oleaginosa y cepas
microbianas nativas.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Evaluar la capacidad productora de PHA de tres cepas bacterianas nativas
potencialmente productoras de PHA, en aceites de Jatropha, ricino y frituras,
lactosuero, glicerol (grado reactivo y residual), como fuentes de carbono.
Seleccionar el sistema bacteria-sustrato ms promisorio, con base en la mayor
produccin de biomasa y la mayor acumulacin de PHA.
Establecer las mejores condiciones de operacin a escala de laboratorio, para la
produccin de PHA, utilizando el sistema bacteriasustrato ms promisorio.
Aplicar una metodologa de extraccin de PHA para valorar su produccin a partir
del sistema bacteriasustrato ms promisorio.






43

4. METODOLOGA

4.1 LUGAR DE EXPERIMENTACIN
El desarrollo experimental de esta investigacin, se llevo a cabo en los laboratorios de la
Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln
(UNALMED): Venenos Naturales (Micotoxinas), Anlisis y Procesos Ambientales,
Biologa Celular y Molecular y, Anlisis Instrumental.
4.2 MATERIALES Y REACTIVOS
4.2.1 Reactivos y Equipos Menores

Los equipos menores y algunos reactivos empleados en el desarrollo de la parte
experimental de la investigacin, se listan en la Tabla 13.

Tabla 13. Equipos y reactivos utilizados en el desarrollo de la investigacin
Equipos Reactivos
Cabina de Bioseguridad ESCO Sulfato de amonio ((NH
4
)
2
SO
4
)
Autoclave de mesa Tuttnauer 2540ML Extracto de levadura (OXOID)
Agitador orbital con control de temperatura
Innova
TM
4400
Fosfato monobsico de potasio(KH
2
PO
4
)
Ultracentrfuga Jouan MR22 Fosfato dibsico de sodio (Na
2
HPO
4
)
Balanza analtica de precisin
(0.0001g)
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO
4
.7H
2
O)
pH-metro Metrohm Agar nutritivo MERCK
Plancha de agitacin con calentamiento TRIS-HCl 0.1M
Espectrofotmetro UV-Visible
Shimadzu UV-160
cido dinitrosaliclico (DNS)
44

Transferpette (100-1000l, 100-5000 l)
BRAND
Hipoclorito de sodio 5% p/v (NaClO)
Incubadora BINDER cido poli-3-hidroxibutrico
Horno-Estufa Acido clorhdrico (HCl 5N)
Nevera (-20) Hidrxido de sodio (NaOH 5N)
Freezer (-70C) Metanol grado reactivo 95% v/v (CH
3
OH)
Liofilizador Labcono Cloroformo grado reactivo 99% v/v (CHCl
3
)
Vidriera general n-Hexano grado reactivo 95% v/v (C
6
H
6
)
Tubos Falcons (15 , 50ml) Acetona grado reactivo 99% v/v (CH
3
COCH
3
)
Tubos Eppendorf
Glicerol Grado Reactivo (GGR) 99.5% v/v (C
3
H
8
O
3
)
Marca JT Baker
Extractor de Gases CEX 120
Glicerol residuo de la produccin de biodiesel a partir
de aceite de palma
Solucin de elementos traza (SET)

4.2.2 Sustratos

Como fuente de carbono para el crecimiento de las cepas nativas, se utilizaron tres sustratos
de naturaleza oleaginosa (aceite de Jatropha, aceite de ricino, aceite de frituras), dos
muestras de glicerol, una comercial (GR) y una residual (subproducto del biodiesel)
(RSB)), y una de lactosuero, los cuales se conservaron bajo refrigeracin (- 4C) hasta su
utilizacin. Es de anotar que el glicerol y la lactosa, presente en el lactosuero, son de
naturaleza glicosdica (azcar alcohol y disacrido, respectivamente), pero en matrices
crudas, generalmente se encuentran acompaados de residuos grasos.
Los aceites de Jatropha y de ricino fueron donados por el Departamento Fisicoqumico de
Biolgicos y Contaminados, de la empresa Biocombustibles S.A, la cual los utiliza como
materia prima para la produccin de biodiesel.
El aceite de frituras fue recolectado en la Cafetera Central de la Universidad Nacional de
Colombia, Sede Medelln.
45

El lactosuero fue suministrado por la Planta de Leche de la Universidad Nacional de
Colombia, Sede Medelln, ubicada en el ncleo del Volador.
El GGR, fue suministrado por el Laboratorio de Venenos Naturales de la Universidad
Nacional de Colombia, Sede Medelln, mientras que GRSB (81,6%) provino de la empresa
Oleoflores Ltda., ubicada en el Municipio de Codazzi (Cesar), donde lo obtienen como
subproducto durante la produccin de biodiesel a partir de aceite de palma.
Estos sustratos fueron escogidos por su naturaleza qumica (oleaginosa, glicosdica
alcohlica), dado que las cepas productoras de PHA pueden seguir dos rutas, una a partir de
azcares y otra partiendo de cidos grasos (Vanse Figuras 5 y 6). As, se espera que los
microorganismos puedan crecer fcilmente sobre los aceites de Jatropha, ricino y frituras.
En la Tabla 14 se relacionan los cidos grasos presentes en diferentes aceites, incluyendo
el aceite de palma, del cual provena el aceite de frituras utilizado en esta investigacin.

Tabla 14. Composicin Qumica de los aceites de Jatropha, Ricino y Palma
% cidos Grasos
Aceite
Jatropha Ricino Palma
Saturado
Larico C12:0 < 0.01
--- ---
Mirstico C14:0 0.1
--- ---
Palmtico C16:0 17.1 ; 14.2
b
1.0 45.0
Esterico C18:0 4.3 ; 6.9
b
1.0 5.0
Dihidroxiesterico C18:0
---
0.7
---
Araqudico C20:0 < 0.01
--- ---
Eicosenoico
---
0.3
---
Insaturado
Palmitoleico C:16:1 1.2 --- ---
Ricinoleico C18:1 --- 89.5 ---
Oleico C18:1 42.0
a
; 43.1
b
3.0 40
Linoleico C18:2 34.8 ; 34.3
b
4.2 10
Linolenico C18:3 0.1 0.3 ---
Fuente: a) Ko-Sin et al., 2010
b) Gui et al., 2008

46

El lactosuero se escogi para la produccin de PHA, debido a que, adems de lactosa posee
cidos grasos provenientes de sus triacilgliceroles. En la Tabla 15, se presenta la
composicin de los lactosueros dulce (pH 6.45) y cido (pH 5).

Tabla 15. Composicin Qumica de lactosuero
Composicin de Lactosuero
Parmetro Dulce cido
pH 6.45 5
Agua 93 - 95% 93 - 95%
Extracto seco 5 - 7 % 5-7 %
Lactosa 4.53- 5.3 % 3.8-5.2 %
Protenas 0.6 - 1.1% 0.2-1.1%
Grasa 0.1 - 0.4% 0.1 -0.5%
Sales minerales 0.5 - 0.7% 0.5 - 1.2%
Fuente: Guerrero et al., 2010
Aunque el glicerol es un azcar-alcohol, hace parte de todos los aceites y grasas, vinculado
a los cidos grasos saturados como los cidos lurico, palmtico, esterico e insaturados
como el oleico y linoleco, entre otros, por lo que constituye un producto de la hidrlisis y
la transesterificacin de triacilgliceroles. En las Tablas 16 se presenta la composicin
caracterstica del GGR
Tabla 16. Composicin caracterstica de GGR
Composicin Glicerol J.T. Baker (GR)
Parmetro Valor
Pureza 99.5%
Esteres de cidos grasos (como cido Butrico ) 0.05% mx.
Residuos despus de ignicin 0.005% mx.
Trazas de impurezas (en ppm):
Hierro(Fe) 5.0 mx.
Plomo (Pb) 2.0 mx.
Mercurio (Hg) 10.0 mx.
Zinc (Zn) 2.0 mx.
Fuente: Biblioteca Tcnica de J.T.Baker, 2006
47

En Tablas 17 se presenta la composicin de glicerol obtenido durante la produccin de
biodiesel (crudo), a partir de aceite de palma.

Tabla 17. Composicin del glicerol en la fase obtenida por decantacin, en la produccin de
biodiesel a partir de aceite de palma.
Sustancia % p/p
Glicerol 84.6
Agua 4.82
Metanol 0.77
Metilesteres 0.03
Monoglceridos 0.22
Diglceridos 0.09
Triglceridos 0.77
Jabones 4.30
Catalizador 5.17
Otros (Sales y trazas de bases o cido) 0.77
As (ppm) 0.04 mx.
Fuente: Cardeo et al., 2011
4.3 CEPAS BACTERIANAS

En la investigacin se evaluaron tres cepas bacterianas nativas (Vase Figura 7) dela
coleccin del grupo de investigaciones PROBIOM, aisladas a partir de diferentes residuos
industriales, y seleccionadas, con base en pruebas bioqumicas, moleculares y analticas,
por su capacidad para producir PHA:

Bacillus megaterium y Bacillus sp., aisladas de suelos contaminados con jugo de fique, por
la estudiante Silvia Alexandra Snchez Moreno (Snchez, 2007) en el marco de su tesis de
maestra Produccin de polihidroxialcanoatos a partir de residuos orgnicos
agroindustriales.

Lactococcus lactis, aislada de muestras de lactosuero, por la estudiante Ana Carolina
Cardona, en el marco de su trabajo de grado de pregrado en Ingeniera Biologica
48



Figura 7. Morfologa macro y microscpica de las colonias de cepas: A) B. megaterium B)
Bacillus sp. 1 y 2. Caractersticas macroscpicas de las colonias, 3. Microscopa de Fluorescencia a
450 nm con azul de Nilo y 4. Coloracin de Gram. (Sanchez et al., 2007)

El potencial de las cepas para producir PHA a partir de residuos azucarados, fue evaluado
por Alejandro Salazar Villegas en su trabajo de maestra Parmetros operacionales
ptimos para la produccin de bioplsticos a partir de fuentes renovables azucaradas
(Salazar, 2011). En esta investigacin se evalu el potencial para producir PHA a partir de
sustratos oleaginosos, glicerol y lactosuero.

4.4 MEDIOS DE CULTIVOS

Para la evaluacin de los microorganismos (B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis), se
prepararon medios de cultivos suplementados con fuentes de carbono de distinta naturaleza
y origen (aceites de Jatropha, ricino, frituras, lactosuero, glicerol, y glicerol residual)
(Vase Seccin 4.2). Cada cepa bacteriana se hizo crecer en los diferentes medios de
cultivo, tal como se describe en las secciones siguientes.


49

4.4.1 Medio de cultivo con lactosuero como fuente de Carbono.

Para la evaluacin de este sustrato como fuente de carbono, se prepar un medio mnimo
de sales (MMS) en agua, el cual contena por L de solucin: 1.2 g de KH
2
PO
4
, 11 g de
Na
2
HPO
4
.12H
2
O, 16 g de NH
4
Cl, 1.4 g de MgSO
4
.7H
2
O, 1 mL de Solucin acuosa de
Elementos Traza (SET); que contena por L: 10 g de FeSO
4
.7H
2
O, 2.25 g de ZnSO
4
.7H
2
O,
1 g de CuSO
4
.5H
2
O, 0.5 g de MgSO
4
.5H
2
O, 2 g de CaCl
2
.2H
2
O, 0.23 g de
Na
2
B
4
O
7
.10H
2
O, 0.1g de (NH
4
)
6
Mo
7
O
24
, 10 mL de HCl al 35%, y lactosuero 20 g/L . El
medio se suplement con de extracto de levadura (1 g/L) y se ajust a pH 7.0 con una
solucin de NaOH 5N. Finalmente, se autoclav (15 psig, 121C, durante 15 min), para la
subsiguiente inoculacin de los microorganismos.

Previo a su adicin, el lactosuero se someti a un tratamiento de limpieza para eliminar
interferentes como las protenas: inicialmente se acidific con HCl 5N hasta un pH < 4.0,
seguidamente se autoclav (15 psig y 121C por 15 min), se dej enfriar a temperatura
ambiente y se centrifug a 10000 rpm durante 15 min. El sobrenadante se filtr, para
eliminar las partculas flotantes, con papel de filtracin rpida marca Whatman, Banda
Roja, grado 589/3 (125 mm dimetro). Del filtrado se tom el volumen necesario para
ajustar una concentracin de (20 g/L) en el medio de cultivo (Pantazaki et al., 2009).

4.4.2 Medios de cultivo con aceites (ricino, Jatropha, Frituras) como fuentes de
Carbono.

Para el crecimiento de las cepas bacterianas se utiliz un medio mnimo de sales (MMS)
que contena, por L de agua: 1.2 g de KH
2
PO
4
, 11 g de Na
2
HPO
4
.12H
2
O, 16 g de NH
4
Cl,
1.4 g de MgSO
4
.7H
2
O, 1 mL de Solucin de Elementos Traza (SET), preparada tal como
se describe en la Seccin 4.4.1. Antes de la adicin del aceite, el medio se llev a pH 7.0
con NaOH 5N. Posteriormente, se le adicion la fuente de carbono (aceite de ricino,
50

Jatropha o frituras, segn el caso) a 20 g/L, y se suplement con extracto de levadura
(1g/L). Finalmente, se autoclav (15 psig, 121C, durante 15 min).

En la Figura 8 se pueden observar las muestras de los aceites evaluados en esta fase de la
investigacin.


Figura 8. Aceites empleados en las diferentes fermentaciones: A) Ricino B) Jatropha C) Frituras

4.4.3 Medios de cultivo con glicerol comercial y glicerol residual como fuentes de
carbono.

Se evaluaron dos muestras como fuentes de carbono: glicerol GR (99.5 % v/v) y glicerol
producido colateralmente en la industria de biodiesel (81.6 % v/v). Para la preparacin de
1 L de los medios de cultivo en agua, se utilizaron: 10 g de Glicerol GR (o residual
(GRSB)), 1 g de (NH
4
)
2
SO
4
, 1.5 g de KH
2
PO
4
, 9 g de Na
2
HPO
4
.12H
2
O, 0.2 g de
MgSO
4
.7H
2
O, 1 mL de SET (Vase Seccin 4.4.1). El medio se suplement con 1 g/L de
extracto de levadura y se llev a pH 7.0 con NaOH 5N. Seguidamente se autoclav (15
psig, 121C, durante 15 min). Siguiendo las sugerencias de Cavalheiro y colaboradores
(2009), la fuente de carbono se autoclav separadamente antes de adicionarse al medio.

51

4.5 CONDICIONES DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Para evaluar el crecimiento bacteriano en los diferentes sustratos propuestos como fuente
de carbono (Vase Seccin 4.4), se llevaron a cabo experimentos a escala de laboratorio,
bajo agitacin orbital y temperatura controlada. En todos los casos se utilizaron
erlenmeyers de 250 mL, con un volumen de trabajo de 50 mL, en el que se consider un
10% v/v para el inoculo. A continuacin se describen las condiciones operacionales
especficas de cada sistema bacteria: sustrato evaluado.

4.5.1 Fermentaciones con lactosuero como fuente de carbono

Las fermentaciones de los tres sistemas bacteria:sustrato resultantes de combinar el
lactosuero con: B megaterium, Bacillus sp., y L. lactis. se realizaron a 30C y 150 rpm
(Salazar et al., 2011).
Las variables que se analizaron para realizar la seleccin del sistema bacteria-sustrato ms
promisorio fueron: la biomasa seca y la presencia de PHA, producidos bajo las mismas
condiciones operacionales (T 30C, pH 7.0, 150 rpm), El seguimiento del crecimiento
bacteriano se monitore durante 72 h, tomando muestras a diferentes tiempos, cada punto
de la curva de crecimiento se evalu por triplicado.

Para la identificacin qumica (GC/MSD) del PHA, se realizaron extracciones de muestras
compuestas de biomasa, obtenidas para cada cepa, con la biomasa producida en los
triplicados de cada punto muestreado a lo largo de los procesos fermentativos. As se
obtuvieron tres extractos, correspondientes a los sistemas B. megaterium: lactosuero,
Bacillus sp., y L. lactis.


52

4.5.2 Fermentaciones con aceites (Jatropha ricino, frituras) y glicerol (GGR), como
fuentes de Carbono.

Para escoger el mejor sistema bacteria-sustrato, se desarroll un diseo experimental
factorial 4x3; con cuatro factores (cuatro fuentes de carbono: (S
1
) aceites de ricino, (S
2
)
Jatropha, (S
3
) fritura y (S
4
) GGR) y 3 niveles (3 microorganismos: (Mo
1
)

B. megaterium,
(Mo
2
) Bacillus sp., (Mo
3
) L. lactis); con serie de tres repeticiones, manteniendo constantes
el tiempo de reaccin (48 h), la temperatura ( 30 C), el pH 7.0, la velocidad de agitacin
(200 rpm), la concentracin de sustrato (20 g/L) y el volumen de medio de cultivo (50 mL)
(Vase Tabla 18). Las variables respuestas fueron: la cantidad de biomasa (g/L) y la
acumulacin de PHA (g/L).

Tabla 18. Diseo factorial para la seleccin del mejor sistema bacteria:sustrato (T: 30C; pH 7.0 y
velocidad de agitacin de 200 rpm; t de fermentacin 48 h)
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3
S
1
Mo
1
S
1
Mo
1
S
1
Mo
1

S
1
Mo
2
S
1
Mo
2
S
1
Mo
2

S
1
Mo
3
S
1
Mo
3
S
1
Mo
3

S
2
Mo
1
S
2
Mo
1
S
2
Mo
1

S
2
Mo
2
S
2
Mo
2
S
2
Mo
2

S
2
Mo
3
S
2
Mo
3
S
2
Mo
3

S
3
Mo
1
S
3
Mo
1
S
3
Mo
1

S
3
Mo
2
S
3
Mo
2
S
3
Mo
2

S
3
Mo
3
S
3
Mo
3
S
3
Mo
3

S
4
Mo
1
S
4
Mo
1
S
4
Mo
1

S
4
Mo
2
S
4
Mo
2
S
4
Mo
2

S
4
Mo
3
S
4
Mo
3
S
4
Mo
3

S: Sustrato (1: A. Ricino; 2: A. Frituras; 3: A. Jatropha; 4: GGR)
Mo: Microorganismo (1: B. megaterium; 2: Bacillus sp.; 3: L. lactis).

53

En estos experimentos, el tiempo de fermentacin se redujo de 72, aplicadas a los sistemas
con lactosuero, a 48 horas, con base en la revisin bibliogrfica: En la literatura referente a
la produccin de PHA, en matrices oleaginosas y en glicerol, reportan tiempos menores o
iguales a las 48 h. As, por ejemplo, Tian et al., (2000), utilizando Pseudomona mendocina
0806 sobre sustratos tales como los cidos mirstico y oleico, caractersticos los aceites
evaluados en esta investigacin, encontraron mayor acumulacin de biomasa y produccin
de PHA a las 48 h; Ko-Sin et al., (2010) reportaron el mismo tiempo para dos variables, al
trabajar con C. nector H16 y aceite de Jatropha. Por su parte, Lopez-Cuellar et al., (2010)
reportaron mayor produccin de PHB y de biomasa, despus de las de 40 h para una cepa
de W. eutropha en aceite de canola; y Naranjo (2010) reporto mayor produccin de PHB, a
las 45 h, empleando una cepa de B. megaterium y glicerol.

Para la identificacin qumica (GC/MSD) del PHA se realizaron extracciones de muestras
compuestas de biomasa, obtenidas para cada cepa, con la biomasa producida en los
triplicados de cada punto muestreado a lo largo de los procesos fermentativos. No obstante,
solo se sometieron a anlisis mediante GC/MSD, los de mayor peso.

4.5.3 Fermentaciones con glicerol residual (GRSB) como fuente de Carbono

Los ensayos con GRSB se realizaron siguiendo el protocolo descrito para el GGR (Vase
Seccin 4.5.2) pero con un tiempo de fermentacin de 72 horas, tomando muestras (por
triplicado) para determinacin de biomasa a las 0, 8, 12, 24, 36 y 72 h.

4.6 MEJORES CONDICIONES OPERACIONALES PARA LA PRODUCCIN DE
PHA EN EL SISTEMA BACTERIA: sustrato.

Para establecer, a escala de laboratorio, las mejores condiciones de operacin del sistema
bacteria:sustrato, se realiz un diseo experimental factorial mediante anlisis de
superficies de respuesta con serie de tres repeticiones. Las variables respuesta del sistema
54

fueron: produccin de biomasa seca por unidad de volumen, concentracin de PHA por
unidad de volumen y rendimiento Yp/s. Las constantes fueron: el tiempo de reaccin (48
h), la velocidad de agitacin (200 rpm) y el volumen del medio de cultivo (50mL). La zona
de trabajo se delimit con la ayuda del software STATGRAPHICS, mediante la opcin
crear diseo y tomando en cuenta valores de referencia mnimos y mximos (Vase
Tabla 31).

En la Tabla 19 se resumen los valores de T, pH y concentracin de sustrato que se estimo
el diseo experimental.

Tabla 19. Niveles para cada factor evaluado en la produccin de PHA
Niveles
Factores
T(C) pH Concentracin del sustrato (g/L)
1 25 5 8
2 30 6 10
3 35 7 15
4 --- 8 20
5 --- 9 22

En la Tabla 20, se presenta el diseo experimental propuesto para la evaluacin de las
diferentes condiciones, en las que se combinan cinco concentraciones (C
1
: 8 g/L, C
2
: 10
g/L, C
3
: 15 g/L C
4
: 20 g/L, C
5
: 22 g/L), cinco valores de pH ( pH
1
: 5,

pH
2
: 6 pH
3
: 7, pH
4

:8 pH
5
: 9)

y tres valores de T ( T
1
: 25 C; T
2
: 30C; T
3
: 35 C).








55

Tabla 20. Diseo experimental superficies de respuesta.
T
1
T
2
T
3

C
1
pH
3
(1) C
1
pH
3
(1) C
1
pH
3
(1)
C
1
pH
3
(2) C
1
pH
3
(2) C
1
pH
3
(2)
C
2
pH
2
(1) C
2
pH
2
(1) C
2
pH
2
(1)
C
2
pH
2
(2) C
2
pH
2
(2) C
2
pH
2
(2)
C
2
pH
4
(1) C
2
pH
4
(1) C
2
pH
4
(1)
C
2
pH
4
(2) C
2
pH
4
(2) C
2
pH
4
(2)
C
3
pH
1
(1) C
3
pH
1
(1) C
3
pH
1
(1)
C
3
pH
1
(2) C
3
pH
1
(2) C
3
pH
1
(2)
C
3
pH
3
(1) C
3
pH
3
(1) C
3
pH
3
(1)
C
3
pH
3
(2) C
3
pH
3
(2) C
3
pH
3
(2)
C
3
pH
3
(3) C
3
pH
3
(3) C
3
pH
3
(3)
C
3
pH
3
(4) C
3
pH
3
(4) C
3
pH
3
(4)
C
3
pH
5
(1) C
3
pH
5
(1) C
3
pH
5
(1)
C
3
pH
5
(2) C
3
pH
5
(2) C
3
pH
5
(2)
C
4
pH
2
(1) C
4
pH
2
(1) C
4
pH
2
(1)
C
4
pH
2
(2) C
4
pH
2
(2) C
4
pH
2
(2)
C
4
pH
4
(1) C
4
pH
4
(1) C
4
pH
4
(1)
C
4
pH
4
(2) C
4
pH
4
(2) C
4
pH
4
(2)
C
5
pH
3
(1) C
5
pH
3
(1) C
5
pH
3
(1)
C
5
pH
3
(2) C
5
pH
3
(2) C
5
pH
3
(2)
C: concentracin de sustrato; T: temperatura; pH; (X): N de repeticiones para cada experimento

El anlisis de los datos obtenidos mediante el diseo experimental, se realiz utilizando los
software: SAS (Statistical Analisys System) y STATGRAPHICS. Estos permitieron hacer
los anlisis de varianza (ANOVA) y graficar las superficies de respuesta y las interacciones
presentadas entre las diferentes variables.

El anlisis de los resultados se hizo mediante la herramienta del software SAS, que
realiz procedimientos de RSREG, y mediante la metodologa de superficies de respuesta
y, con la herramienta anlisis de diseo del programa estadstico STATGRAPHICS, se
analizaron los efectos lineales, cuadrticos y de interaccin, para temperatura, pH y
56

concentracin de sustrato, sobre los trminos de produccin de biomasa, PHA y Yp/s.
Adems, se hizo el anlisis del efecto global de cada uno de los parmetros, considerando
de manera conjunta todos sus componentes (lineal, cuadrtico e interacciones) (Vase
Anexo A).

4.7 METODOLOGAS DE ANLISIS

Para la seleccin del mejor sistema bacteria:sustrato, se hizo seguimiento microbiano
(biomasa seca) y qumico (concentracin de PHA) a los experimentos descritos en la
Seccin 4.5, siguiendo las metodologas presentadas a continuacin:

Determinacin de biomasa seca

Los medios de cultivo fueron centrifugados a 8000 rpm a 20 C, durante un periodo de 5
min, en una centrifuga refrigerada Marca JOUAN Modelo MR22. Los centrifugados se
resuspendieron en buffer TRIS-HCl pH 7.0 y se congelaron a -70C, para su posterior
liofilizacin (-50C y 0.05 mBar). Los liofilizados se pesaron para determinacin de
biomasa. Para los medios con aceite, se requiri una centrifugacin previa con n-hexano
(8000 rpm, 20 C, 5 min) para separar la biomasa del medio oleaginoso.

Extraccin y caracterizacin qumica mediante GC/MSD de los PHA

Los PHA fueron extrados de la biomasa bacteriana usando dispersiones de cloroformo
(99% v/v) e hipoclorito de sodio (5% p/v) (Jacquel et al., 2008). Se adicion 1mL de cada
reactivo por cada 20 mg de biomasa seca. Las muestras se agitaron a 30 C y 200 rpm
durante 1h y se centrifugaron (5 min, 8000 rpm) para separar la fase orgnica, enriquecida
con el PHA. A la fase orgnica, se le adicion metanol (95% v/v), gota a gota, hasta ver
precipitacin. Seguidamente se dej en reposo a 4C, transcurridas 12 h se descart el
57

sobrenadante y el precipitado se lav varias veces con metanol. Finalmente el polmero se
someti a secado (60C) y se pes.

La caracterizacin del biopolmero se realiz en el Laboratorio de Cromatografa de la UIS,
mediante cromatografa de gases con detector selectivo de masas, operado en el modo de
Monitoreo de Ion Selectivo (GC-MS/SIM). Para la cuantificacin se aplic la norma ISO
5509 (2000), la cual requiere la derivatizacion del biopolmero hasta los metilsteres
correspondientes. La columna empleada en el anlisis fue DB-WAX [60 m x 0.25 mm x
0.25 m]. La inyeccin se realiz en modo splitless (V
iny
= 1 L). Se utiliz PHB (19.6 g)
como material de referencia y cido benzoico como estndar interno. En el Anexo B se
detallan los datos de calibracin suministrados por el Laboratorio.



















58

5. RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1 SELECCIN DEL SISTEMA BACTERIA: SUSTRATO

La seleccin del mejor sistema bacteria sustrato, se hizo con base en la biomasa seca y la
cantidad de PHA producidos en cada una de las fermentaciones descritas en las Seccin
4.5.
5.1.1 EVALUACIN DE LAS FERMENTACIONES CON EL SISTEMA
BACTERIA: LACTOSUERO

Al evaluar las diferentes cepas nativas en medio con lactosuero, se evidenci la mxima
produccin de biomasa a las 24 h, 48h y 36 h, para L. lactis., Bacillus sp., y B. megaterium
respectivamente, como se muestra en las Secciones 5.1.1.1 a .51.1.3

5.1.1.1 Sistema Lactococcus lactis: Lactosuero

La mayor produccin de biomasa con la cepa L. lactis en medio enriquecido con lactosuero
(20 g/L) se present a las 24 h, con valores de 0.88 0.04 g/L (Vase Tabla 21 y Figura 9).

Tabla 21. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin L. lactis-Lactosuero
(T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin 150 rpm sustrato 2% v/v, inoculo 10% v/v.
Tiempo (h) Biomasa seca (g/L)
0 0.57 0.03
24 0.88 0.04
36 0.16 0.02
48 0.28 0.01
72 0.15 0.01

Como se aprecia en la Figura 9 el microorganismo present un comportamiento
exponencial entre las 0 y 24 h, seguido de una caida hasta las 40 h. Despues se present un
59

nuevo pero pequeo incremento en la biomasa hasta las 48 h, tiempo en el que de nuevo,
empez a caer, hasta alcanzar valores de 0.15 0,01 g/L a las 72 h. Esto puede asociarse a
la presencia en el medio de cultivo , de otros compuestos que empiezan a ser degradados
por los microorganismos cuando la fuente principal de carbono se agota.


Figura 9.Crecimiento de L. lactis en Lactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin 150 rpm
sustrato (20 g/L), inoculo 10% v/v

5.1.1.2 Sistema Bacillus sp: Lactosuero

En la Tabla 22 se registran los valores de biomasa seca obtenidos en el tiempo para la cepa
Bacillus sp., en medio enriquecido con lactosuero (20 g/L). En este caso el valor ms alto
(0.22 0.02 g/L) se present a las 48 h y solo represent la cuarta parte de la biomasa
obtenida con la cepa L. lactis, en tan solo 24 h.



60

Tabla 22. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin Bacillus sp-
Lactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin 150 rpm sustrato 20 g/L, inoculo 10% v/v
Tiempo (h) Biomasa seca (g/L)
0 0.09 0.01
24 0.10 0.02
36 0.05 0.01
48 0.22 0.02
72 0,11 0.01

La baja cantidad de biomasa generada por este sistema, se relaciona con su la baja
capacidad de Bacillus sp. para asimilar el lactosuero (Figura 10). En este sistema, la etapa
de adaptacin del microorganismo al medio fue ms lenta que la del L. lactis, en el mismo
sustrato y bajo las mismas condiciones, y su fase exponencial empez despus de las 30 h.
Seguida una cada alrededor de alrededor de las 48 h, hasta alcanzar 0,11 0,01 g/L a las
72 h.

Figura 10. Crecimiento de Bacillus sp., en Lactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin
150 rpm sustrato (20g/L), inoculo 10% v/v


61

5.1.1.3 Sistema B. megaterium : Lactosuero
Los valores de biomasa obtenidos para la cepa B. megaterium en lactosuero como fuente de
carbono (20 g/L) se registran e ilustran en la Tabla 23 y Figura 11, respectivamente. En
este caso se observ una fase exponencial entre las 0 y 36 h, con un valor mximo de
biomasa (0,59 0,06 g /L) a las 36 h de fermentacin, . seguida de una fase de disminucin
desde las 36 h, la cual se prolonga posiblemente hasta despus de las 72 h, tiempo en el que
se obtuvieron 0,40 0,05 g de biomasa/L

Tabla 23. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin B. megaterium-
Lactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin 150 rpm sustrato 20g/L, inoculo 10% v/v
Tiempo (h) Biomasa seca (g/L)
0 0.46 0.05
24 0.58 0.07
36 0.59 0.06
48 0.45 0.03
72 0.40 0.05



Figura 11. Crecimiento de B. megaterium en Lactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin
150 rpm sustrato (20g/L), inoculo 10% v/v
62

En la Tabla 24 se registran los valores de PHB detectados en los extractos polimricos para
cada uno de los sistemas bacteria:lactosuero. Como se puede ver, la mayor concentracin
de biopolmero (0,4 mg/g) se detect para el sistema B megaterium: Lactosuero. Pese a que
la mayor concentracin de biomasa (0.88 0.04 g/L) se dio con sistemas L. lactis:
Lactosuero, en ste el biopolmero se detect en concentraciones traza. Posiblemente el L.
lactis, logr su crecimiento con base en el metabolismo de la degradacin de lactosa,
sustrato difcil de asimilar por los microorganismos que carecen de lactasa, enzima
responsable de su degradacin.

Tabla 24. Concentracin del monmero metileter metilester del cido 3-hidroxibutrico en los
extractos de diferentes sistemas bacteria: Lactosuero
Compuesto NMC*, mg/g Concentracin en las muestras, mg/g
Metileter metilester del cido
3-hidroxibutrico
0,2
B. megaterium Bacillus sp. L. lactis
0,4 0,2 0,2
*NMC: nmero mnimo de cuantificacin.

Los resultados permiten establecer la combinacin B. megaterium: lactosuero como el
mejor sistema bacteria: lactosuero. No obstante, los valores de biomasa [0.88 0.04 g/L
(24h), 0.22 0.02 g/L (48 h) y 0.59 0.06 g/L (36 h), con L. lactis, Bacillus sp., y B.
megaterium], obtenidos en los tres sistemas evaluados se encuentran muy lejos de los
valores de biomasa (3.1 g/L, 36 h) que se obtienen con B. megaterium en un medio
enriquecido con glucosa y operado bajo las mismas condiciones (T: 30 C, pH 7.0,
concentracin de sustrato 20 g/L y velocidad de agitacin de 150 rpm) (Salazar , 2011) y
los obtenidos (2.82 g/L, 30 h) por Obruca et al, (2011) en un sistema B. megaterium: suero
de queso, (con la fuente de carbono optimizada) que a su vez, son ms bajos que los
obtenidos con glucosa como sustrato.


63

El lactosuero, sustrato reportado como posible fuente de carbono en la produccin de
biopolmeros, a partir de la cepa B. megaterium (Pantazki et al., 2009; Obruca et al., 2011),
en este caso no present un buen rendimiento, posiblemente porque estaba contaminado
con otros productos colaterales del proceso de quesos que se desarrolla en la planta de
lcteos de la cual se muestreo, tales como protenas no precipitadas, las cuales pueden
actuar como inhibidores que afectaron el proceso fermentativo. Sin embargo, Obruca et al,
report valores es un sistema optimizado para el sustrato de 2.82 g/L biomasa y 1.05 g/L
de PHB, incluso estos valores se encuentra por debajo de los reportados por Salazar ,2011.

Por tanto, y como el objetivo es buscar sustratos econmicos, que permitan superar los
rendimiento de PHA obtenidos con sustratos como glucosa, utilizada a nivel industrial, no
se recomienda el sistema B. megaterium: lactosuero, como sustrato alterno para producir
PHA.

5.1.2 EVALUACIN DE LOS SISTEMAS BACTERIA: sustrato oleaginoso y
BACTERIA : glicerol

El arreglo factorial establecido y desarrollado segn la descripcin de la Seccin 4.5.2, para
evaluar el comportamiento de las cepas nativas en los medios suplementados con aceites
(Jatropha, ricino, frituras) y el glicerol comercial, permiti determinar de manera rpida
cul de los sustratos y cepas, combinados, resultaban mejores para la produccin de
biomasa y de PHA. En la Tabla 25, se registran los valores de biomasa seca obtenidos para
las cepas B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis en los diferentes sustratos y en la Figura 12
se ilustran de manera comparativa los mismos; como se puede apreciar la mejor respuesta
se present con el sistema B. megaterium- glicerol, seguido de los sistemas B. megaterium
A. de ricino, Bacillus sp.- A. de fritura y Bacillus sp.- Ricino


64

Tabla 25. Valores de biomasa seca obtenida con B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis en medios
enriquecidos con diferentes fuentes de carbono (aceite de fritura, aceite de ricino, aceite de Jatropha
y glicerol) T 30C, pH 7.0, Velocidad de agitacin 150 rpm, Inoculo 10 % v/v, t 48 h.
Biomasa (g/L)
Microorganismo
Aceite
Glicerol
Fritura Ricino Jatropha
B. megaterium 0.35 0,02 0.58 0,02 0.44 0,08 1.23 0,05
Bacillus sp 0.45 0,16 0.45 0,07 0.41 0,18 0.24 0,06
L. lactis 0.21 0,11 0.27 0,03 0.19 0,08 0.17 0,11



Figura 12. Biomasa seca obtenida en los diferentes sistemas (microorganismo-sustrato). (Fuente de
carbono (20 g/L, tiempo de fermentacin 48 h, temperatura 30C, pH 7.0)

Todos los sistemas bacteria: sustrato fueron sometidos a extraccin; no obstante, la
produccin de PHA solo se analiz en los sistemas B. megaterium: glicerol, el cual arrojo la
mayor cantidad de biomasa (1.23 0,05 g/L) y B. megaterium: Aceite de frituras, en el que
pese a que el crecimiento bacteriano fue ms bajo (0.35 0,02 g/L), el microorganismo se
65

expone a una fuente de sustrato mucho ms econmica que el glicerol. Aunque en los
sistemas B. megaterium: A. ricino y Bacillus sp : A ricino, hubo crecimiento bacteriano y
de su biomasa seca se obtuvieron pequeas cantidades extractos polimricos (< 10 mg), no
se sometieron a anlisis GC/MSD, dado que el crecimiento microbiano es bajo y el A. de
ricino se utiliza fuertemente en las industrias energtica (produccin de biodiesel) y
qumica (produccin de pinturas), en consecuencia el proceso para producir PHA debera
ser excelente para poder competir con los otros proceso industriales. En los sistemas con
aceite de Jatropha, por su parte no hubo precipitado polimrico visible.
En la Tabla 26, se registran los pesos de los extractos obtenidos para cada sistema
bacteria:sustrato

Tabla 26. Extractos polimricos obtenidos para B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis en medios
enriquecidos con diferentes fuentes de carbono (glicerol (GGR) , aceite de: frituras, ricino,
Jatropha).
Peso biopolmero (mg)
Microorganismo
Aceite
Glicerol (GGR)
Fritura Ricino Jatropha
B. megaterium 25 9.7 N.P 11,9
Bacillus sp N.P 5.4 N.P N.P
L. lactis N.P N.P N.P N.P
N.P: No hubo precipitado visible en los viales.

En la Figura 13 se presenta el espectro (GC/MSD) de los metilester derivados del (a)
cido 3-hidroxibutirico PHB) comercial y de los biopolmeros extractados de los sistemas
(b) B. megaterium- glicerol y (c) B. megaterium- A. de frituras. La seal a 23.358 min
corresponde al metileter metilester del cido 3-hidroxibutrico (compuesto de referencia
para la cuantificacin), y la que aparece a 40.841 min, al ster del cido benzico
66

(estndar interno) y en la Tabla 27, se registran los valores PHB detectados en los extractos
polimricos evaluados.





67


Figura 13. Espectro de masas (GC/MS) de los metilester derivados de (a) cido 3-hidroxibutrico
(PHB) comercial;(b) extracto polimrico obtenido de la fermentacin con el sistema B
megaterium- glicerol y (c) extracto polimrico obtenido de la fermentacin con el sistema B
megaterium- A. de frituras

Tabla 27.Concentracin del monmero metileter metilester del cido 3-hidroxibutrico en los
extractos los sistemas B. megaterium: Glicerol; B. megaterium: aceite de frituras
Compuesto NMC*, mg/g Concentracin en las muestras, mg/g
Metileter metilester del cido
3-hidroxibutrico
0,2
B. megaterium
F G
7,6 11,8
*NMC: nmero mnimo de cuantificacin. F: aceite de frituras, G: glicerol

Como se puede apreciar, y como era de esperar, el mejor resultado (11.8 mg/g de PHB) fue
obtenido en el sistema B megaterium: glicerol, con el que a las 48 h de fermentacin se
obtuvo mayor concentracin de biomasa ( 1.23 0,05g/L). Por lo que fue seleccionado
como el mejor sistema bacteria:sustrato para la produccin de PHB. No obstante, el
68

sistema B megaterium: aceite de fritura, en cuyos extractos se detectaron 7.6 mg/g de PHB,
resulta promisorio, por lo que debera evaluarse con detalle en otros estudios.
En consecuencia y con el nimo de disminuir costos en el proceso de produccin de PHB,
se procedi a realizar los ensayos con el glicerol residual, empleando las mismas
condiciones de operacin (concentracin de sustrato, temperatura, pH y velocidad de
agitacin), utilizadas en este ensayo para el glicerol grado reactivo. De obtener resultados
similares, para la produccin de biomasa seca, se procedera a optimizar los parmetros
operacionales con glicerol residual.
5.1.2.3 Sistema B. megaterium : glicerol residual (GRSB)

Los valores de biomasa seca producida por la cepa B. megaterium en medio con GRSB (20
g/L) y con glucosa (20 g/L), se registran en la Tabla 28. La glucosa es el sustrato por
excelencia, empleado en la produccin de PHA a nivel industrial (Chanprateep 2010), por
lo que fue tomado como referente en esta etapa el proceso. Los datos fueron obtenidos en
el grupo PROBIOM, bajo las mismas condiciones operacionales.

Tabla 28. Valores de biomasa seca producida en los sistemas B. megaterium-glicerol RSB y B.
megaterium-glucosa. (T: 30 C, concentracin de Sustrato (20 g/L), pH 7.0, inoculo: 10% v/v)
Tiempo (h)
Biomasa (glicerol residual)
(g/L)
Biomasa (glucosa
a
)
(g/L)
0 0.18 0.05 0.164 0.008
8 1.51 0.14 ---
24 2.66 0.06 1.91 0.124
36 3.07 0.11 3.096 0.124
48 2.80 0.03 ---
72 2.21 0,05 2.138 0.176
144 --- 0.552 0.028
a) Datos reportados por Salazar (2011), obtenidos simultneamente con los de las fermentaciones en
glicerol, bajo condiciones operacionales iguales. y que fueron compartidos con esta investigacin
69

.
Figura 14. Curvas de crecimiento de B. megaterium en glicerol residual y B. megaterium en
glucosa. Condiciones operacionales: (T 30 C, concentracin de fuente de carbono 20 g/L, pH 7.0,
inoculo:10% v/v)

Como se puede apreciar B. megaterium muestra una tendencia de crecimiento microbiano
muy similar en los dos sistemas, alcanzando valores mximos de biomasa de 3.07 0.11
g/L, en el medio con GRS , y de 3.096 0.124 g/L, en medio con glucosa ,a las 36 h y bajo
las mismas condiciones de fermentacin. Esto puede atribuirse al conjunto enzimtico que
posee, las cuales les permite asimilar los dos sustratos rpidamente, puesto que el glicerol
es un azcar-alcohol que puede ser incorporado en la ruta metablica de los carbohidratos
para la sntesis de PHA, adems por lo observado en los resultados al encontrarse
crecimiento en aceites de la cepa, es de suponer que poseen enzimas capaces de degradar
los cidos grasos y usarlos como fuentes de carbono , es por ellos que en medios con
GRSB, a parte de glicerol, obtendran una fuente de carbono adicional que sigue la ruta
metablica para la sntesis de PHA a partir de cidos grasos. (Vanse Figuras 5 y 6)
Ahora, comparando la biomasa obtenida (1.23 0.05 g/L) a las 48 horas con GGR y la
obtenida (2.80 0.11 g/L) a las mismas condiciones operacionales con GRSB se observa
70

mejor comportamiento de la cepa en GRSB ; el microorganismo aprovecha las diferentes
fuentes de carbono presentes en el sustrato como se explico anteriormente, pues como se
presenta en la Tabla 17 este sustrato no es completamente puro. Este comportamiento
coincide con el de Cupriavidus nector en glicerol puro (rendimientos Yp/x = 0.37 y Yp/s
=0.36) y en glicerol residual,(subproducto del proceso biodiesel a partir de aceites
refinados, (rendimientos Yp/x = 0.45 y Yp/s =0.34), (Cavalheiro et al, 2009).

Los resultados encontrados en esta evaluacin y la capacidad de B. megaterium para
acumular PHA en GGR (Vase Tabla 27), muestran el potencial de la cepa para producir
PHA a partir de GRSB, con mejores rendimientos de produccin de biomasa, este ltimo es
lo que lo vuelve muy atractivo para la produccin de biopolmeros. Ante esto, se procedi a
realizar la evaluacin de las condiciones ptimas, para la produccin de PHB a partir de
GRSB un subproducto de la industria del biodiesel, siguiendo el diseo experimental
descrito en la seccin 4.6

5.2 MEJORES CONDICIONES OPERACIONALES PARA LA PRODUCCIN DE
PHA EN EL SISTEMA BACTERIA: GLICEROL RESIDUAL

Los reportes sobre investigaciones en la que se analizan parmetros operacionales en
sistemas con glicerol como fuente de carbono, son pocos (Vase Tabla 29).
Particularmente con B. megaterium y glicerol, se encuentran los de naranjo, quien utiliz
una cepa de B. megaterium aislada de un sedimento marino del estuario de Baha Blanca,
Argentina, sobre glicerol como fuente de carbono.(Naranjo, 2010)






71

Tabla 29. Produccin de PHA diferentes cepas bacterianas, empleando glicerol como sustrato
Condiciones operacionales para la produccin de PHA evaluadas en trabajos previos
Cepa Fuente de C pH T (C)
Concentracin
(g/L)
% PHB en
Biomasa seca
Ref.
C. necator
H16
Glicerol (86-
88%)
a
/
Glicerol Residual
(1174.5 g/L)
b

6.8 30 20
62
a


38
b

Cavalherio et al.,
2009
C. necator
JMP 134 y
Paracoccus
denitrificans
DSMZ 413
Glicerol crudo 7.0 35 20 70
Mothes et al.,
2007
Zobellella
denitrificans
MW1
Glicerol 7.3 41 15 66.9
Mohammad et
al., 2009
Escherichia
coli CT1061
Glicerol N.R 37 22 42,31
Pablo et al.,
2008
C. necator
NCIMB
11842
Glicerol 6.8 30
20
50
45.32
55.99
Naranjo et al.,
2010
B. megaterium Glicerol 7.0 30
20
50
23.74
30.2
Naranjo et al.,
2010
N.R : No Reporta.

Con base los niveles de los diferentes factores reportados en la Tabla 29, se determinaron
los rangos de Temperatura, pH y concentracin de sustrato, para realizar el diseo
estadstico para evaluar las mejores condiciones de operacin del sistema B. megaterium -
GRSB que fue presentado en la Seccin 4.6. As, los valores mximos y mnimos fueron
establecidos teniendo en cuenta que
La mayora reportan temperatura de 30C para la produccin de PHA y no se han
considerado proceso a 25C. Por lo que el diseo experimental aplicado incluy
temperaturas de 25C, 30C y 35C.
En la Tabla 11 se observan estudios con variaciones en pH desde 2 hasta 11 para
distintos microorganismo encontrndose acumulacin de PHA en pH bsicos y
neutros. Ante esto, se propuso una zona de bsqueda, para determinar la influencia
72

de este parmetro sobre el sistema B. megaterium-glicerol RSB, evaluando valores
de pH por encima y por debajo de 7.0.
Los mayores valores de acumulacin de PHB se reportan a concentraciones de
sustrato de15 g/L y 20 g/L. No obstante, el diseo experimental aplicado sugiri
concentraciones de 8 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L y 22 g/L.

A continuacin se presentan los resultados obtenidos para cada una de las variables
respuesta que fueron objeto de estudio, bajo el diseo experimental propuesto.

5.2.1 Produccin de biomasa seca y de PHA

En las Tablas 30 a 32, se muestran los valores de biomasa seca y de PHA, as como los
rendimientos (Y
P/S
), obtenidos para el sistema B. megaterium: GRSB, en cada una de las
condiciones evaluadas. La mayor produccin de biomasa (4.62 g/L), se obtuvo a T
1
(25C)
bajo las condiciones C
4
pH
4
(C
4,
20 g/L y pH
4
, 8), mmientras que la mayor produccin de
PHA (3.06 g/L) se dio a 25C con las condiciones C
3
pH
3
(C
3,
15 g/L y pH
3
, 7), con un
porcentaje de PHA en biomasa seca de 86,69 % y un rendimiento Y
P/S
de 204.1 mg/g
(Vase Tabla 30).

Tabla 30. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenidos en el sistema B. megaterium-GRSB,
Temperatura: 25C.
Muestra Biomasa seca (g/L)
Produccin de PHA
(g/L)
Y
P/S
(mg/g)
C
1
pH
3
1.57 0.33 41.5
C
1
pH
3
1.11 0.36 45.0
C
2
pH
2
2.11 2.02 202.4
C
2
pH
2
2.84 2.52 252.4
C
2
pH
4
1.47 0.45 45.2
C
2
pH
4
1.15 0.38 38.0
C
3
pH
1
3.86 1.39 92.7
C
3
pH
1
3.22 1.40 93.3
C
3
pH
3
2.70 2.42 161.1
73

C
3
pH
3
3.52 2.71 180.8
C
3
pH
3
3.18 3.02 201.3
C
3
pH
3
3.53 3.06 204.1
C
3
pH
5
3.73 0.88 58.8
C
3
pH
5
3.67 0.89 59.6
C
4
pH
2
1.69 0.91 45.5
C
4
pH
4
4.62 0.97 48.4
C
4
pH
4
3.73 1.05 52.3
C
5
pH
3
3.12 0.99 45.0
C
5
pH
3
3.43 1.04 47.4

Al variar la temperatura de operacin a T
2
(30 C), se observ una mayor produccin de
biomasa (3.69 g/L) bajo las condiciones C
3
pH
5
(C
3,
15 g/L y pH
5
, 9), mientras que la
mayor produccin de PHA (0.81 g/L ) se dio bajo las condiciones C
3
pH
1
(C
3,
15 g/L y pH
1
,
5), con un porcentaje de PHA en biomasa seca de 96,89 % y un rendimiento Y
P/S
de 54.0
mg/g (Vase Tabla 31). Este incremento en la temperatura afect de forma negativa el
crecimiento bacteriano y la acumulacin de PHA.

Tabla 31. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenido en el sistema B. megaterium-GRSB,
Temperatura: 30C.
Muestra Biomasa seca (g/L)
Produccin de
PHA(g/L)
Y
P/S
(mg/g)
C
1
pH
3
1.41 0.41 51.1
C
1
pH
3
2.20 0.49 61.2
C
2
pH
2
1.51 0.41 41.2
C
2
pH
2
1.40 0.49 49.2
C
2
pH
4
2.80 0.56 56.0
C
2
pH
4
2.75 0.41 40.6
C
3
pH
1
0.94 0.75 50.0
C
3
pH
1
0.84 0.81 54.0
C
3
pH
3
2.68 0.48 32.1
C
3
pH
3
3.21 0.54 35.7
C
3
pH
3
2.06 0.62 41.3
C
3
pH
5
3.64 0.39 26.1
C
3
pH
5
3.69 0.32 21.5
C
4
pH
2
1.72 0.27 13.4
74

C
4
pH
2
2.26 0.14 6.9
C
4
pH
4
2.29 0.55 27.6
C
4
pH
4
2.86 0.48 24.1
C
5
pH
3
2.39 0.55 25.2
C
5
pH
3
2.12 0.53 51.2

Al pasar a una temperatura de operacin del sistema de T
3
(35C), la mayor produccin de
biomasa (4.46 g/L) se dio bajo las condiciones C
3
pH
1
(C
3
15 g/L y pH
1
5.0). Mientras que
la mayor produccin de PHA (0.74 g/L) se dio con las condiciones C
4
pH
2
(C
4
20 g/L y pH
6.0), con un porcentaje de biomasa seca de 45.04 % y un rendimiento Y
P/S
de 36,8 mg/g
(Vase Tabla 32)
Tabla 32. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenido en el sistema B. megaterium-GRSB,
Temperatura: 35C.
Muestra Biomasa seca (g/L)
Produccin de PHA
(g/L)
Y
P/S
(mg/g)
C
1
pH
3
1.58 0.17 20.8
C
1
pH
3
1.55 0.16 19.5
C
2
pH
2
2.02 0.21 21.0
C
2
pH
2
3.10 0.24 23.8
C
2
pH
4
3.27 0.25 24.6
C
2
pH
4
2.33 0.29 29.0
C
3
pH
1
4.46 0.19 12.9
C
3
pH
1
2.46 0.15 10.1
C
3
pH
3
2.24 0.45 29.7
C
3
pH
3
3.27 0.40 26.9
C
3
pH
3
2.30 0.42 27.7
C
3
pH
3
1.97 0.27 18.1
C
3
pH
5
2.68 0.45 30.0
C
3
pH
5
2.60 0.44 29.2
C
4
pH
2
1.63 0.74 36.8
C
4
pH
2
1.43 0.66 32.9
C
4
pH
4
2.88 0.16 8.0
C
4
pH
4
2.43 0.13 6.3
C
5
pH
3
2.04 0.27 12.2
Estos resultados indican que un incremento en la temperatura del sistema incide
negativamente en la produccin de PHA.
75

5.2.2 Superficies de respuesta produccin de biomasa

En las superficies construidas (Figuras 15a17a), se ilustra el comportamiento del sistema
(B. megaterium-GRSB) con respecto a la biomasa producida, bajo las condiciones
evaluadas en funcin de la concentracin de sustrato (glicerol residual ) y el pH. Por otra
parte, los modelos estadsticos ajustados al sistema (ver Anexo B), estimaron los valores
que maximizan la produccin de biomasa (ptimos) de cada uno de los factores estudiados,
para cada una de las temperatura evaluadas (25C, 30C y 35 C) (Vase Tabla 32).
En la Figura 15a, superficie construida para la biomasa a T
1
(25C) , se observa una
curvatura con un posible mximo de concentracin de biomasa, para C
5
pH
5
(22 g/L, pH
9.0). Por otra parte, para condiciones cercanas a C
1
pH
3
(8 g/L, pH 7.0), se observa la regin
de menor concentracin para la biomasa. En la regin intermedia se observa un mximo
aparente de biomasa, para valores de pH alrededor de C
3
pH
3
(15 g/L, pH 7.0). El
diagrama de contornos (Figura 15b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos
mximos de biomasa.
En la superficie construida para la biomasa a T
2
(30 C) (Figura 16a), se presenta una
curvatura hacia un posible mximo de concentracin de biomasa, C
1
pH
5
(8 g/L, pH 9.0).
Para valores de C
1
pH
1
(8 g/L, pH 5.0) se observa el punto en la superficie de menor
concentracin para la biomasa. El diagrama de contornos (Figura 16b) muestra la
tendencia del sistema hacia los puntos mximos de concentracin biomasa.
En la Figura 17a, se ilustra la superficie construida para la biomasa a T
3
(35 C), en la que
se aprecia la tendencia del sistema para su valor mximo en la regin seleccionada para
condiciones del sistema alrededor de C
3
pH
5
(15 g/L, pH 9.0). El diagrama de contornos
(Figura 17b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos mximos de concentracin
biomasa.
76


Figura 15. Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 25 C. a) Superficie de
respuesta para la biomasa. b) Diagrama de contornos para la superficie estimad en funcin del pH y
la concentracin de biomasa. La flecha indica las condiciones hacia donde se maximiza la
produccin de biomasa para el sistema.
a)
b)
77


Figura 16 Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 30C. a) Superficie de
respuesta para la biomasa. b) Diagrama de contornos para la superficie estimada, en funcin del pH
y la concentracin de biomasa. La flecha indica las condiciones hacia donde se maximiza la
produccin de biomasa para el sistema.
a)
b)
78


Figura 17. Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 35C. a) Superficie de
respuesta obtenida para la biomasa. b) Diagrama de contornos para la superficie estimada, en
funcin del pH y la concentracin de biomasa. La flecha indica las condiciones hacia donde se
maximiza la produccin de biomasa para el sistema.
a)
b)
79

En la Figura 18, se visualizan los efectos principales de cada una de las condiciones
operacionales que se evaluaron. Como se observa, un incremento en la temperatura entre T
1

y T
3,
presenta un efecto negativo en la produccin de biomasa. Contrariamente, se observa
que el incremento en el pH tiene un efecto positivo sobre la variable respuesta. Por ltimo,
se ve como la concentracin del GRSB, presenta un efecto positivo en los valores
intermedios evaluados (10 g/L y 15 g/L), mientras que en los extremos el efecto sobre la
concentracin de biomasa es negativo.

Figura 18. Efectos principales de cada una de las condiciones operacionales evaluadas sobre la
produccin de biomasa

Segn el modelo estadstico, la combinacin de los condiciones operacionales donde se
maximiza la biomasa, para la regin de estudio seleccionada, sugiere C
5
pH
5
T
1
(22 g/L, pH
9.0, 25 C) y estima una biomasa de 5.42 g/L. (Vanse 33).





80

Tabla 33. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las temperaturas
evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten la mxima produccin de biomasa en el sistema B.
megaterium: glicerol residual
Factor
Valores ptimos
25C 30C 35C
Concentracin de glicerol residual (g/L) 22.0 12.5 16.7
pH 9.0 9.0 9.0
Biomasa Estimada (g/L) 5.42 3.58 3.28

5.2.3 Superficies de respuesta produccin de PHA

Las superficies obtenidas (Figura 19a 21a), muestran las regiones evaluadas y el
comportamiento del sistema B. megaterium-glicerol residual con respecto a la produccin
de PHA, bajo las condiciones de operacin propuestas. En las Figuras 19-21b y en la
Tabla 35 se presentan los valores operacionales que maximizan la produccin de PHA
(ptimos) a las diferentes temperaturas evaluadas (25C, 30C y 35C).

En la Figura 19a, se muestra la superficie construida para la concentracin de PHA a T
1
(25
C) , se observa un mximo de concentracin de PHA en la regin de estudio seleccionada
de biomasa, para valores alrededor de C
3
pH
3
(15g/L pH 7.0). Por otra parte para valores de
C
1
pH
5
(8 g/L, pH 9.0), se observa la menor concentracin para PHA. El diagrama de
contornos (Figura 19b) muestra la regin donde se encuentra el punto mximo para la
concentracin de PHA, a las condiciones de pH y concentracin de sustrato que se
seleccionaron en el diseo experimental.

En la superficie construida para la concentracin de PHA a T
2
(30 C) (Figura 20a), se
presenta una regin para el posible mximo de concentracin de PHA en el sistema, a
C
3
pH
1
(15 g/L, pH 5.0); A valores de C
1
pH
5
(8 g/L, pH 9.0), se observa el punto en la
superficie de menor concentracin para acumulacin de PHA. El diagrama de contornos
(Figura 20b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos mximos de concentracin
PHA.
81


En la Figura 21a, se ilustra la superficie construida para la concentracin de PHA a T
3

(35C). En este caso se presenta un punto de silla para valores entre C
2
(10 g/L) y C
3

(15g/L) y valores de (pH
3
7.0) y (pH
4
8.0), con un posible mximo para valores alrededor
de C
5
pH
5
(22 g/L, pH9.0). El diagrama contornos (Figura 21b) muestra la tendencia del
sistema hacia los puntos mximos de concentracin de PHA.


















82


Figura 19. Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 25 C. a)
Superficie de respuesta obtenida para la acumulacin de PHA. b) Diagrama de contornos para la
superficie estimada en funcin de la concentracin de biomasa y del pH. La flecha indica la zona
donde se encuentra el punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.
a)
b)
83


Figura 20. Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 30 C. a) Superficie
de respuesta obtenida para la acumulacin de PHA. b) Diagrama de contornos para la superficie
estimada en funcin de la concentracin de biomasa y del pH. La flecha indica la zona donde se
encuentra el punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.



a)
b)
84


Figura 21 Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 35 C. a) Superficie
de respuesta obtenida para la acumulacin de PHA. b) Diagrama de contornos para la superficie
estimada en funcin de la concentracin de biomasa y del pH. La flecha indica la zona donde se
encuentra el punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.

En la Figura 22, se presentan los efectos principales de cada una de las condiciones
operacionales que se evaluaron. Como se puede observar un incremento entre T
1
y T
3
,
presenta un efecto negativo en la produccin de PHA. Mientras que un incremento en el
pH, hasta valores cercanos a pH 7.0, tiene un efecto positivo sobre la variable respuesta;
a)
b)
85

por encima de 7.0, el pH tiene efecto negativo sobre la concentracin de PHA. Por ltimo,
se ve como la concentracin del glicerol residual, presenta un efecto positivo en los valores
intermedios evaluados (10 g/L y 15 g/L), mientras que en los extremos el efecto sobre la
concentracin de PHA es negativo.

Figura 22. Efectos principales sobre concentracin de PHA , de cada una de las condiciones
operacionales evaluadas

Segn el modelo estadstico, la combinacin de los condiciones operacionales donde se
maximiza la produccin de PHA, para la regin de estudio seleccionada, sugiere una
concentracin de glicerol residual de 14.8 g/L, un pH 6.7 y una temperatura de proceso de
25 C. Con estas condiciones el modelo estima una concentracin de PHA de 2,81 g/L
(Vase Tabla 34).
Tabla 34. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las temperaturas
evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten la mxima produccin de PHA en el sistema B.
megaterium: glicerol residual
Factor
Valores ptimos
25C 30C 35C
Concentracin de glicerol residual (g/L) 14.8 13.0 22.0
pH 6.7 5.8 5.0
PHA Estimado (g/L) 2.81 0.67 0.69
86

5.3.4 Superficies de respuesta rendimiento de sustrato en producto global Yp/s

Las superficies encontradas (Figuras 23a 25a) para el rendimiento de PHA por unidad de
sustrato (Yp/s), muestran las regiones de inters para el sistema evaluado. Mientras que en
las Figuras 23b-25b y en la Tabla 35 se presentan los valores operacionales que
maximizan Yp/s (ptimos) a las diferentes temperaturas evaluadas (25C, 30C y 35C).

En la Figura 23a, se muestra la superficie construida para el rendimiento Yp/s a T
1
(25
C), se observa una curvatura hacia un posible mximo de concentracin de Yp/s,
alrededor de C
3
pH
3
(15g/L, pH 7.0). Las condiciones extremas C
5
pH
1
(22g/L, pH 5.0) y
C
1
pH
5
(8 g/L, pH
5
9.0) presentaron los valores minimos del sistema para Yp/s. El
diagrama de contornos (Figura 23b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos
mximos de rendimiento Yp/s.

En la superficie construida para el rendimiento Yp/s a T
2
(30 C) (Vase Figura 24a), se
observa claramente que el mximo rendimiento no se encuentra en la zona de estudio
propuesta para la optimizacin; Sin embargo, se puede ver que para valores de pH cidos y
concentraciones bajas de sustrato, el rendimiento incrementa. El diagrama de contornos
(Figura 24b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos mximos de rendimiento
Yp/s.

En la Figura 25a, se ilustra la superficie construida para el rendimiento Yp/s a T
3
(35C).
Se aprecia la tendencia del sistema hacia su valor mximo, para valores cercanos a C
2
pH
4

(10g/L, pH8.0). El diagrama de contornos (Figura 25b) muestra la tendencia del sistema
hacia los puntos mximos rendimiento Yp/s.

87


Figura 23. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B. megaterium: glicerol a 25
C. a) Superficie de respuesta obtenida para Y
P/S
. b) Diagrama de contornos para la superficie
obtenida, en funcin de la concentracin y el pH. La flecha indica la zona donde se encuentra el
punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.
88


Figura 24. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B megaterium: glicerol a 30
C. a) Superficie de respuesta obtenida para Y
P/S
. b) Diagrama de contornos para la superficie
obtenida, en funcin de la concentracin y el pH. La flecha indica la zona donde se encuentra el
punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.
89


Figura 25. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B megaterium: glicerol a
35 C. a) Superficie de respuesta obtenida para Y
P/S
. b) Diagrama de contornos para la superficie
obtenida, en funcin de la concentracin y el pH. La flecha indica la zona donde se encuentra el
punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.
90

En la Figura 26, se presentan los efectos principales de cada una de las condiciones
operacionales que se evaluaron. Como se puede observar un incremento en la temperatura
entre 25 C y 35 C presenta un efecto negativo en el rendimiento Yp/s, mientras que el
incremento en el pH tiene un efecto positivo sobre la variable respuesta en valores cercanos
a pH 7.0, por encima de este valor el efecto sobre la variable respuesta es negativo. Por
ltimo, se ve que la concentracin del glicerol residual, presenta un efecto positivo en los
valores intermedios evaluados (10 g/L y 15 g/L), mientras que en los extremos el efecto es
negativo.

Figura 26. Efectos principales sobre el rendimiento de producto por unidad de sustrato Yp/s, de
cada una de las condiciones operacionales evaluadas.

De acuerdo al modelo estadstico, la combinacin de los condiciones operacionales donde
se maximiza el rendimiento Yp/s, para la regin de estudio seleccionada, sugiere una
concentracin de glicerol residual de 13.2 g/L, un pH de 6.3 y una temperatura de proceso
de 25 C y, estima un rendimiento Yp/s =199.6 mg/g (Vase Tabla 35).



91

Tabla 35. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las temperaturas
evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten el mximo rendimiento Yp/s en el sistema B.
megaterium: glicerol residual
Factor
Valores ptimos
25C 30C 35C
Concentracin glicerol residual (g/L) 13.2 8.0 8.0
pH 6.3 5.0 9.0
Y
P/S
Estimado (mg/g) 199.6 60.8 41.0


















92

6. CONCLUSIONES

Al cultivar la cepa nativa B. megaterium en medio liquido suplementado con GGR como
fuente de carbono, se forma un sistema combinado bacteria: sustrato muy promisorio para
la produccin de PHB, que permite utilizar GRSB al 81.6% v/v y obtener 2.80 g/L de
PHB, un rendimiento de Yp/s 186.8 en un proceso operado a 25C, pH 7 y concentracin
de sustrato de 15 g/L.

Los valores ptimos para el sistema se dan bajo condiciones de operacin (concentracin
de GRSB 14.8 g/L, pH 6.7; T 25C) con una produccin de PHB de 2.81 g/L y un
rendimiento Y p/s 199.6 mg/g.

La zona de trabajo para optimizar el sistema B. megaterium-GRSB y obtener mayores
cantidades de biopolmero (estimadas en g/L), se encuentra a temperaturas cercanas a los
25C, concentraciones de glicerol residual cercanas a los 15 g/L y pHs prximos a la
neutralidad.

La utilizacin del sistema B. megaterium-glicerol residual para la produccin de PHB,
constituye un proceso doblemente verde, en tanto que se solucionara el problema de la
industria del Biodiesel asociado a la generacin de glicerol residual y a la vez, se generara
un producto de valor agregado, que contribuira a disminuir la contaminacin por plsticos
derivados del petrleo.

La cepa B. megaterium tiene la propiedad de crecer en sustratos azucarados, en sustratos
oleaginosos y en glicerol, en este ltimo caso tiene la ventaja de producir PHB en
cantidades similares a las que se producen a partir de residuos azucarados, bajo las
condiciones de operacin utilizadas en esta experimentacin.

93

El lactosuero no resulto buen sustrato para la produccin de PHA con las cepas nativas B.
megaterium, Bacillus sp. y L. lactis, bajo las condiciones de operacin (T: 30C ; pH 7.0 y
concentracin de sustrato (20 g/L) aplicadas en esta investigacin. En los sistemas
bacteria:sustrato, solo se alcanzaron cantidades de PHB por debajo de los 0.4 mg de PHB/g
de extracto microbiano.

La cepa nativas B. megaterium, mostr capacidad para producir PHA (concentracin de
sustrato 20 g/L, pH 7.0, T: 30C) en sistemas combinados con aceite de Jatropha, aceite de
ricino y aceite de frituras, con una produccin de biomasa de 0,44 g/L; 0,58g/L y 0,35 g/L
respectivamente. valores que resultan bajos si se comparan con los obtenidos para sistema
B. megaterium-GGR (1,23 g/L).
.
Todos los sustratos evaluados (aceite de ricino, aceite de frituras, aceite de Jatropha, GGR,
GRSB y lactosuero) resultaron aptos para el crecimiento de las cepas B. megaterium,
Bacillus sp. y L. lactis; no obstante, las bajas concentraciones de biomasa obtenidas, son
una limitante para la produccin de PHA.

El sistema B megaterium-aceite de fritura, resulta prometedor para la produccin de PHB,
con este se alcanzaron concentraciones de PHB de 7.6 mg /g de extracto microbiano, valor
que podra desinteresar si se compara con el obtenido (11,8 mg/g extracto microbiano) por
el sistema B megaterium-GRSB, pero llama la atencin si se tiene en cuenta que ese valor
es obtenido a partir de un desecho muy barato.




94

BIBLIOGRAFA


1. AGNEW, D.E., PFLEGER, B.F., Synthetic biology strategies for synthesizing
polyhydroxyalkanoates from unrelated carbon sources. Chemical Engineering
Science (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.ces.2012.12.023i

2. ALDOR I AND KEASLING JD. Process design for microbial plastic factories:
metabolicengineering of polyhydroxyalkanoates. Current Opinion in
Biotechnology. 2003; 14:475483

3. ALONSO DM, BOND JQ, DUMESIC JA. Catalytic conversion of biomass to
Green Chemistry Biofuels and Biorefinery. 2010;12:14931513.

4. AKARAONYE E, KESHAVARZ T, y ROY I. Production of
polyhydroxyalkanoates: the future green materials of choice. Journal Chemical and
Technology Biotechnology. 2010; 85: 732743.

5. ASLIM B, CALSIKAN F, BEYATLI Y, GUNDUZ U. Poly--
hydroxybutyrate production by lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Letters.
1998; (159): 293-297

6. BIBLIOTECA TCNICA DE J.T.BAKER, Solv-It Center, Documentacin de
productos. [consultado en lnea]: 15Jjulio 2010. Disponible en: URL:
http://www.duerolab.com/jtbaker/catalogo_jtb_2006.pdf

7. BIOPOLYMERS: New Materials for Sustainable Films and Coatings. 1ra Ed.
Wiley: WILEY J. y SONS; 2011. p. 63-82. Capitulo 4: Production, Chemistry and
95

Properties of Polyhydroxyalkanoates Eric Pollet y Luc Avrous. LPIHT-ECPM,
Universit de Strasbourg, Strasbourg, France.

8. BRAUNEGG G, SONNLEITNER B, LAFFERTY RM, A rapid gas
chromatographic method for determination of Poly--hydroxybutyric Acid in
microbial biomass. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology.
1978; 6: 29-37.

9. BRIGHT S, WILLIAM J, BYROM D, AND FENTEM PA. Produccin de
polihidroxialcanoatos en plantas. Metabolix, Inc. [Patente ES 2 182 819 T3].
Madrid; 2003.

10. BYROM J, BYROM D. Biopol- Natures plastic Plastic from Bacteria. NCBE
Newsletter Summer 1991: 911.

11. CARDEO F, GALLEGO LJ Y RIOS LA. Refining of Glycerin Phase from Palm
Oil Biodiesel using Mineral Acids. Informacin tecnolgica. 2011, 22 (6):15-24

12. CASTILHO LR, MITCHELL DA, FREIRE DMG. Production of
polyhydroxyalkanoates (PHAs) from waste materials and by-products by
submerged and solid-state fermentation. Bioresource Technology. 2009; 100: 5996
6009.

13. CASTRO L. Los plsticos en el mbito mundial.
[En lnea desde: Junio 2 de 2011 ] Disponible en URL:
http://airdplastico.wordpress.com/2011/06/02/los-plasticos-en-el-ambito-mundial/
96

14. CAVALHEIRO JMBT, DE ALMEIDA MCMD, GRANDFILS C, DA FONSECA
MMR. Poly(3-hydroxybutyrate) production by Cupriavidus necator using waste
glycerol. Process Biochemistry. 2009; 44:509-515.

15. CORRE YM, BRUZAUD S, AUDIC JL, GROHENS Y. Morphology and
functional properties of commercial polyhydroxyalkanoates: A comprehensive and
comparative study. Polymer Testing. 2012; 31 : 226235

16. CHANPRATEEP S. Current trends in biodegradable polyhydroxyalkanoates.
Journal of Bioscience and Bioengineering. 2010; 110(6): 621-632.

17. CHEN G-Q. A microbial polyhydroxyalkanoates (PHA) based bio- and materials
industry. Chemical Society Reviews. 2009; 38:24342446.

18. CHOI J, LEE SY. Process analysis and economic evaluation for poly (3-
hydroxybutirate) production by fermentation. Bioprocess and Biosystems
Engineering. 1997; 17(6):335-342.

19. DAI Y, YUAN ZG, JACK K, KELLER J. Production of targeted poly(3-
hydroxyalkanoates) copolymers by glycogen accumulating organisms using acetate
as sole carbon source. Journal of Biotechnology 2007; (129) : 489497.

20. FEDERACIN NACIONAL DE BIOCOMBUSTIBLES DE COLOMBIA:
Bolentin N 62, 2012. [Citado: 15 Feb 2012]. Disponible en: URL:
http://www.fedebiocombustibles.com/files/Boletin62(1).pdf

97

21. GAO X, CHEN JC, WU Q y CHEN GQ. Polyhydroxyalkanoates as a source of
chemicals, polymers, and biofuels. Current Opinion in Biotechnology,
2011;22:768774.

22. GUERRERO WJ, GOMEZ CA, CATRO R, GONZLEZ CA, SANTOS EM.
Caracterizacin fisicoqumica del suelo lactosuero en el valle de Tulancingo [ XII
Congreso Nacional de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos] Guanajuato:
Divisin ciencias de la vida campus Irapuato-salamanca, Universidad de
Guanajuato, 2010

23. GOUDA MK, SWELLAM AE, OMAR SH. Production of PHB by a Bacillus
megaterium strain using sugarcane molasses and corn steep liquor as sole carbon
and nitrogen sources. Microbiological Research. 2001; 156: 201207.

24. GUI MM, LEE KT, BHATIA S. Feasibility of edible oil vs. non-edible oil vs.
waste edible oil as biodiesel feedstock. Energy 2008; (33):1646 1653

25. HFER P, VERMETTEB P, GROLEAUA D. Production and characterization of
polyhydroxyalkanoates by recombinant Methylobacterium extorquens: Combining
desirable thermal properties with functionality. Biochemical Engineering Journal.
2011; 54(1): 26-33 .

26. IBRAHIM M H A AND STEINBCHEL A. Poly(3-Hydroxybutyrate) Production
from Glycerol by Zobellella denitrificans MW1 via High-Cell-Density Fed Bach
Fermentatin and Simplified Solvent Extraction. Applied and Environmental
Microbiology. 2009; 75(19): 6222623.


98

27. JACQUEL N, LO CW, WEI YH, WU HS, WANG SS. Isolation and purification of
bacterial poly(3-hydroxyalkanoates). Biochemical Engineering Journal. 2008;
39:1527.

28. JAN S, ROBLOT C, COURTOIS J, COURTOIS B, BARBOTIN JN, SGUIN JP.
1H NMR spectroscopic determination of poly 3-hydroxybutyrate extracted from
microbial biomass. Enzyme and Microbial Technology. 1996; 18( 3): 195201.


29. JOHNSON K, VAN-GEEST J, KLEEREBEZEM R, VAN-LOOSDRECHT M.
Short- and long-term temperature effects on aerobic polyhydroxybutyrate producing
mixed cultures. Water Research. 2010;44(6):1689-1700.

30. KALIA VC, RAIZADA N, SONAKYA V. Bioplastics. Journal of Scientific &
Industrial Research. 2000(a); 59:433445.

31. KEUM YS, SEO JS, LI QX, KIM JH. Comparative metabolomic analysis of
Sinorhizobium sp. C4 during the degradation of phenanthrene. Applied
Microbiology and Biotechnology. 2008; 80(5):863-72

32. KESHAVARZ T, ROY I. Polyhydroxyalkanoates: bioplastics with a green agenda.
Current Opinion in Microbiology. 2010; 13:321326.

33. KOLLER M, BONA R, CHIELLINI E, GRILLO E, HORVAT P, KUTSCHERA
C, HESSE P, BRAUNEGG G. Polyhydroxyalkanoate production from whey by
Pseudomonas hydrogenovora. Bioresource Technology. 2008; 99:48544863.

34. KOLYBABA M, TABIL LG, PANIGRAHI S, CRERAR WJ, POWELL T, WANG
B. Biodegradable Polymers: Past, Present, and Future. ASAE. 2003; 1 -15.
99

35. KO-SIN, OOI W, GOH L, SHENBAGARATHAI R, SUDESH K. Evaluation of
Jatropha oil to produce poly(3-hydroxybutyrate) by Cupriavidus necator H16.
Polymer Degradation and Stability. 2010; 95(8):1365-1369.

36. KHANNA S, SRIVASTAVA AK. Recent advances in microbial
polyhydroxyalkanoates. Process Biochemistry. 2005; 40:607619.

37. KHARDENAVIS AA, VAIDYA AN, KUMAR MS, CHAKRABARTI T.
Utilization of molasses spentwash for production of bioplastics by waste activated
sludge. Waste Management 29 (2009) 25582565.


38. KULPREECHA S, BOONRUANGTHAVORN A, MEKSIRIPORN B,
THONGCHUL N. Inexpensive fed-batch cultivation for high poly(3-
hydroxybutyrate) production by a new isolate of Bacillus megaterium. Journal of
Bioscience and Bioengineering. 2009;107(3):240-245.

39. LAYCOCK B, HALLEY P, PRATT S, WERKER A, LANTA P. The
chemomechanical properties of microbial polyhydroxyalkanoates. Progress in
Polymer Science (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.progpolymsci.2012.06.003

40. LEE SY AND CHOI J. Production of microbial polyester by fermentation of
recombinant microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/
Biotechnology. 2001; 71: 183207

41. LEE SY, CHOI J, WONG HH. Recent advances in polyhydroxyalkanoate
production by bacterial fermentation: mini-review. International Journal of
Biological Macromolecules. 1999; 25: 3136.
100

42. LIU Z, WANG Y, HE N, HUANG J, ZHU K, SHAO W, WANG H, YUAN W, LI
Q. Optimization of polyhydroxybutyrate (PHB) production by excess activated
sludge and microbial community analysis. Journal of Hazardous Materials
.2011;185: 816

43. LOO C AND SUDESH K. Polyhydroxyalkanoates: Bio-based microbial plastics
and their properties. MPJ. 2007; 2(2):31-57.

44. LOO C, LEE W, TSUGE T, DOI Y, SUDESH K. Biosynthesis and characterization
of ploy(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) from palm oil in a Wautersia
eutropha mutant. Biotechnology Letters. 2005; 27: 14051410.

45. LPEZ-CUELLAR M.R, ALBA-FLORES J, GRACIDA RODRGUEZ J.N,
PREZ-GUEVARA F. Production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) with canola
oil as carbon source. International Journal of Biological Macromolecules. 2011;
48(1):74-80.

46. LTKE-EVERSLOH T, BERGANDER K, LUFTMANN H, STEINBCHEL A.
Biosynthesis of Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-mercaptobutyrate) as a Sulfur
Analogue to Poly(3-hydroxybutyrate) (PHB). Biomacromolecules.
2001; 2(3):10611065.


47. MARCHS ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: Reactions, Mechanisms, and
Structure. 5th ed. Smith MB, Wiley JM Interscience , 2001 p. 386.


101

48. . MOTHES G, SCHNORPFEIL C , ACKERMANN JU. Production of PHB From
Crude Glycerol. Engineering in Life Sciences. 2007;7(5): 475479

49. NARANJO JM. Produccin de polihidroxibutirato a partir de residuos
agroindustriales. [Tesis de maestra]. Manizales: Grupo de investigacin de
procesos qumicos, catalticos y biotecnolgicos, Universidad Nacional de
Colombia; 2010.

50. NATH A, DIXIT M, BANDIYA A, CHAVDA S, DESAI AJ. Enhanced PHB
production and scale up studies using cheese whey in fed batch culture of
Methylobacterium sp. ZP24. Bioresource Technology. 2008; 99:57495755.

51. NIKEL P, PETTINARI J, GALVAGNO MA, MENDES BS Poly (3-
hydroxybutyrate) synthesis from glycerol by recombinant Escherichia coli arcA
mutant in fed-batch microaerobics cultures. Applied Microbiology
and Biotechnology. 2008 ; 77: 1337:1343

52. OBRUCA S, MAROVA I, MELUSOVA S, MRAVCOVA L. Production of
polyhydroxyalkanoates from cheese whey employing Bacillus megaterium CCM
2037. Ann microbiol. 2011; 61: 947-953.

53. OSTLE A.G., HOLT J.G. Nile Blue A as a Fluorescent Stain for Poly--
Hydroxybutyrate. Applied and Environmental Microbiology. 1982; 44(1): 238-241.

54. PRITSA CP, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES AG, KYRIAKIDIS MDA.
Production of polyhydroxyalkanoates from whey by Thermus thermophilus HB8.
Process Biochemistry. 2009; 44: 847853.

102

55. PANTAZAKI A, PAPANEOPHYTOU C, PRITSA A, LIAKOPOULOU-
KYRIAKIDES M, KYRIAKIDIS D. Production of polyhydroxyalkanoates from
whey by Thermus thermophilus HB8. Process Biochemistry. 2009; 44: 847853.

56. POIRIER Y.; ERARD N., PETTOT JMC. 2001 Synthesis of
polyhydroxyalkanoates in the peroxisome of Saccaharomyces cereveiseae by using
intermediates of fatty acid -oxidation. . Applied and Environmental Microbiology,
67; 11: 5254-5260.

57. POSADA JA., NARANJO JM., LPEZ JA., HIGUITA JC. CARDONA CA.
Design and analysis of poly-3-hydroxybutyrate production processes from crude
glycerol. Process Biochemistry. 2011; 46:310317.

58. RAI R, KESHAVARZ T, ROETHER JA, BOCCACCINI AR, ROY I. Medium
chain length polyhydroxyalkanoates, promising new biomedical materials for the
future. Materials Science and Engineering. R. 2011; 72: 2947.

59. REBEILLE F, JABRIN S, BLIGNY R, LOIZEA UK, GAMBONNET B
,VANWILDER V, DOUCE R, RAVANEL S. Methionine catabolismin Arabidopsis
cells is initiated by a gamma-cleavage process and leads to S-methylcysteine and
isoleucine syntheses. Proceedings of the National Academy of Science USA 2006;
103:1568715692.


60. REDDY CSK, GHAI R, RASHMI, KALIA VC. Polyhydroxyalkanoates: an
overview. Bioresource Technology. 2003; 87:137146.


103

61. REVELO DM, GROSSO MV, MORENO NC, MONTOYA D. A most effective
method for selecting a broad range of short and medium-chain-length
polyhidroxyalcanoate producing microorganisms. Electronic Journal of
Biotechnology. 2006;10(3):348-357.

62. SALAZAR A. Parmetros operacionales ptimos para la produccin de bioplsticos
a partir de fuentes renovables azucaradas. [Tesis de maestra]. Medelln: Facultad de
Ciencias, Universidad Nacional de Colombia; 2011.

63. SNCHEZ S. Produccin de polihidroxialcanoatos a partir de residuos orgnicos
agroindustriales [Tesis de maestra]. Medelln: Facultad de Ciencias, Universidad
Nacional de Colombia; 2007.

64. SEEBACH D, FRITZ MG,. Detection, synthesis, structure, and function of oligo (3-
hydroxyalkanoates): contributions by synthetic organic chemists. International
Journal of Biological Macromolecules. 1999; 25:217236.

65. SERAFIM LS, LEMOS PC, LEVANTESI C, TANDOI V, SANTOS H, REIS
MAM. Methods for detection and visualization of intracellular polymers stored by
polyphosphate-accumulating microorganisms. Journal of Microbiological Methods.
2002; 5:11 18.

66. SINGH M, PATEL SK, KALIA VC. Bacillus subtilis as potential producer for
polyhydroxyalkanoates. Microbial Cell Factory. 2009; 8-38.

67. SIRACUSA V, ROCCULI P, ROMANI S, ROSA MD. Biodegradable polymers for
food packing: review. Trends Food Science & Technology. 2008; 19:634-643.
104

68. SHAH AA, HASAN F, HAMEED A, AHMED A. Biological degradation of
plastics: A comprehensive review. Biotechnology Advances. 2008; 26:246265.

69. SHRIVASTAV A , MISHRA SK , SHETHIA B , PANCHA I, JAIN D, MISHRA
S. Isolation of promising bacterial strains from soil and marine environment for
polyhydroxyalkanoates (PHAs) production utilizing Jatropha biodiesel byproduct,
International Journal of Biological Macromolecules. 2010; 47:283287.

70. STEINBCHEL A, FCHTENBUSCH B. Bacterial and other biological systems
for polyester production. Tibtech. 1998; 16:419-427.

71. SURIYAMONGKOL P, WESELAKE R, NARINE S, MOLONEY M, SHAH S.
Biotechnological approaches for the production of polyhydroxyalkanoates in
microorganisms and plants- review. Biotechnology Advances. 2007; 25:148175.

72. TIAN W, HONG K, CHEN G, WU Q, ZHANG R, HUANG W. Production of
polyesters consisting of medium chain length 3-hydroxyalkanoic acids by
Pseudomonas mendocina 0806 from various carbon sources. Antonie van
Leeuwenhoek. 2000; 77: 3136.

73. VALAPPIL SP, PEIRIS D, LANGLEY GJ, HERNIMAN JM, BACCACCINI AR,
et al. Polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis from structurally unrelated carbon
sources by a newly characterized Bacillus spp. Journal of Biotechnology.
2007;127:475487.

74. VANDAMME EJ, DE BAETS S, STEINBCHEL A. Biopolymers. Carbohydrate
Polymers. 2005; 59: 265266.

105

75. VERLINDEN RAJ, HILL DJ, KENWARD MA, WILLIAMS CD, REDECKA I.
Bacterial synthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoates. Journal of Applied
Microbiology. 2007; 102:1437-1449.

76. VILLADA HS, ACOSTA HA, VELASCO RJ. Biopolmeros naturales usados en
empaques biodegradables. Temas Agrarios. 2007; 12(2):5 -13.

77. VILLANO M, BECCARI M, DIONISI D, LAMPIS S, MICCHELI A, VALLINI G,
MAJONE M. Effect of pH on the production of bacterial polyhydroxyalkanoates by
mixed cultures enriched under periodic feeding. Process Biochemistry. 2010; (45):
714723.

78. VILPOUX O, AVEROUS L. Starch-based plastics: technology, use and
potentialities of latin american starch tubers. En: cereda M.P, vilpoux O, editors.
Latin American Starchy Tubers. Brazil: NGO RAIZES and Cargill Foundation-Sao
Paolo; 2004. p. 521-533.

79. WONG YM, BRIGHAM C J. , RHA C, SINSKEY AJ, SUDESH K. Biosynthesis
and characterization of polyhydroxyalkanoate containing high 3-hydroxyhexanoate
monomer fraction from crude palm kernel oil by recombinant Cupriavidus necator..
Bioresource Technology. 2012; 121: 320327

80. WANG F , LEE SY. Poly(3-hydroxybutyrate) production with high productivity
and high polymer-content by a fed-bacth culture of Alcaligenes lactus under
nitrogen limitation. Applied and Environmental Microbiology. 1997; 63(9):3703-
3706.

106

ANEXOS
ANEXO A. ANLISIS ESTADSTICO

BIOMASA

En la Tabla 1, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato
y el pH inicial del medio sobre la obtencin de biomasa, para un proceso de fermentacin
con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 25C, acompaados de los
datos de error estndar y V.I.F (factor de inflacin de varianza) para cada uno de los efectos
individuales y combinados.

Tabla 1. Efectos estimados para la produccin Biomasa; sistema B. megaterium: GRSB;
T= 25 C
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
Promedio 13,4662 7,57121
A:pH -6,19964 3,20724 174,991
B: Concentracin glicerol res -0,179289 0,776293 169,157
AA 0,192022 0,209962 148,341
AB 0,2381 0,0839873 125,02
BB -0,0393716 0,0167806 72,4866

En la Figura 1, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre
la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema
(positivos y/o negativos), por ejemplo en este caso podemos observar que el efecto
combinado de la concentracin y el pH tiene un efecto positivo sobre el sistema mientras
que el factor cuadrtico de la concentracin afecta negativamente la produccin de biomasa
en el sistema.
107


Figura 1. Diagrama de pareto para la produccin de biomasa para el sistema B.
megaterium: GRSB; T: 25 C

En la Tabla 2, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato
y el pH inicial del medio sobre la produccin de biomasa, para un proceso de fermentacin
con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 30C, acompaados de los datos
de error estndar y V.I.F (factor de inflacin de varianza) para cada uno de los efectos
individuales y combinados.

Tabla 2. Efectos estimados para la produccin Biomasa; sistema B. megaterium: GRSB;
T= 30 C
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
promedio 2,50309 0,176251
A:pH 2,485 0,297704 1,0

En la Figura 2, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre
la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema
(sean positivos o negativos), para este caso podemos observar que solo el efecto individual
del pH es significativamente positivo en la produccin de biomasa.

108

Diagrama de Pareto Estandarizada para Biomasa
0 2 4 6 8 10
Efecto estandarizado
AA
B:Concentracin
AB
BB
A:pH
+
-

Figura 2. Diagrama de pareto para la produccin de biomasa para el sistema B. megaterium
:GRSB; T: 30 C

En la Tabla 3, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato
y el pH inicial del medio sobre la produccin de biomasa, para un proceso de fermentacin
con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 35C, acompaados de los datos
de error estndar y V.I.F (factor de inflacin de varianza) para cada uno de los efectos
individuales y combinados.

Tabla 3. Efectos estimados para la produccin Biomasa; sistema B. megaterium: GRSB;
T= 35 C
Efecto Estimado Error Estndar. V.I.F.
promedio 2,51357 0,338159
A:pH -0,0916667 0,571181 1,0
B: Concentracin glicerol res -0,440152 0,492152 1,0
AA 1,21584 0,989285 1,34992
AB 1,239 1,38504 1,0
BB -1,65535 0,968553 1,34992

En la Figura 3, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre
la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema
109

(positivos y/o negativos), para este caso podemos observar que para una temperatura de
35C, no hay efectos individuales significativos sobre la produccin de biomasa.

Diagrama de Pareto Estandarizada para Biomasa
0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4
Efecto estandarizado
A:pH
B:Concentracin
AB
AA
BB
+
-

Figura 3. Diagrama de pareto para la produccin de biomasa para el sistema B.
megaterium: GRSB; T: 35 C

En la Tabla 4, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de
sustrato, el pH inicial del medio y la temperatura sobre la produccin de biomasa, para el
proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : glicerol residual , acompaados de
los datos de error estndar y V.I.F (factor de inflacin de varianza).

Tabla 4 Efectos estimados para la produccin Biomasa; sistema B. megaterium: GRSB
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
Promedio 5,39238 5,6673
A:pH -2,73308 1,477 81,4611
B:Concentracin glicerol res. 0,614231 0,482487 152,02
C:Temperatura -0,114306 0,325088 56,615
AB 0,0842667 0,055064 123,495
AC 0,0722031 0,040868 104,435
BC -0,0368838 0,00958541 66,0747

En la Figura 4, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre
la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura. La lnea azul indica los efectos
110

significativos para el sistema (sean positivos o negativos). En este caso se observar que el
efecto combinado entre la concentracin de sustrato y la temperatura afecta negativamente
al sistema.

Figura 4. Diagrama de pareto para la produccin de biomasa para el sistema B.
megaterium: GRSB

En la Tabla 5, se presenta el anlisis de varianza para la produccin de biomasa en el
sistema B. megaterium-glicerol residual, para las diferentes condiciones operacionales
(temperatura, pH y concentracin de GRSB)

Tabla 5. Anlisis de variancia para la produccin de biomasa para el sistema B. megaterium-
glicerol residual
Fuente Suma de
Cuadrados
Grados de
Libertad
Cuadrado de la
Media
Razn-F Valor-P
A:pH 1,55729 1 1,55729 3,42 0,0699
B:Concentracin 0,737088 1 0,737088 1,62 0,2087
C:Temperatura 0,0562289 1 0,0562289 0,12 0,7265
AB 1,06513 1 1,06513 2,34 0,1320
AC 1,41962 1 1,41962 3,12 0,0831
BC 6,73407 1 6,73407 14,81 0,0003
Error Total 23,6499 52 0,454806
111

Total (corr.) 48.9808 58

En la Tabla 6. Se muestra los valores ptimos estimados por el modelo estadstico para la
produccin de biomasa en el sistema B. megaterium glicerol residual. En este punto no se
fijo la temperatura como una constate sino como otra variable.

Tabla 6. Puntos ptimos para la biomasa en el sistema B. megaterium GRSB.

El modelo ajustado estim, que el mximo de biomasa se podra obtener bajo las
condiciones presentadas en la Tabla 6, con una concentracin de biomasa (4,74 g/L)

BIOPOLIMERO (PHA)
En la Tabla 7, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato
y el pH inicial del medio sobre la produccin de PHA, para un proceso de fermentacin con
el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 25C, acompaados de los datos de
error estndar y V.I.F para cada uno de los efectos individuales y combinados.

Tabla 7. Efectos estimados para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: GRSB ; T:
25C
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
Promedio -16,3906 4,52006
A:Concentracion 1,38528 0,463452 169,157
B:pH 8,43215 1,91474 174,991
AA -0,0881242 0,0100181 72,4866
AB 0,182 0,0501409 125,02
BB -0,831939 0,125349 148,341

Factor Optimo
pH 9,0
Concentracin glicerol residual (g/L) 22,0
Temperatura (C) 25,0
Biomasa (g/L) 4,74
112

En la Figura 7, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre
la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema
(positivos y/o negativos), para este caso podemos observar que la acumulacin de PHA se
ve favorecida por los efectos individuales y combinados de estas dos condiciones de
operacin.
Diagrama de Pareto Estandarizada para PHA
0 2 4 6 8 10
Efecto estandarizado
A:Concentracion
AB
B:pH
BB
AA
+
-

Figura 7. Diagrama de pareto para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium:
GRSB; T: 25 C

En la Tabla 8, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato
y el pH inicial del medio sobre la produccin de PHA, para un proceso de fermentacin con
el sistema B. megaterium : GRSB residual a una temperatura de 30C, acompaados de los
datos de error estndar y V.I.F para cada uno de los efectos individuales y combinados.

Tabla 8. Efectos estimados para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: GRSB; T:
30C
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
promedio -0,078572 2,60778
A:Concentracin 0,0868864 0,267382 169,157
B:pH 0,320045 1,10468 174,991
AA -0,00946271 0,00577979 72,4866
113

AB 0,0275 0,0289281 125,02
BB -0,0583365 0,072318 148,341

En la Figura 8, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre
la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema
(positivos y/o negativos), para este caso podemos observar que no hay efectos
significativos sobre el sistema B. megaterium: GRSB.

Diagrama de Pareto Estandarizada para PHA
0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4
Efecto estandarizado
B:pH
A:Concentracion
BB
AB
AA
+
-

Figura 8. Diagrama de pareto para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium:
GRSB; T: 30 C

En la Tabla 9, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato
y el pH inicial del medio sobre la produccin de PHA, para un proceso de fermentacin con
el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 35C, acompaados de los datos de
error estndar y V.I.F para cada uno de los efectos individuales y combinados.





114

Tabla 9. Efectos estimados para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: GRSB; T:
35C
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
promedio -4,56253 1,69921
A:Concentracion 0,618439 0,174224 169,157
B:pH 1,44523 0,719801 174,991
AA -0,005719 0,00376606 72,4866
AB -0,06 0,0188493 125,02
BB -0,0384692 0,0471218 148,341


En la Figura 8, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre
la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema
(positivos y/o negativos), para este caso podemos observar que el efecto individual de la
concentracin del sustrato favorece la acumulacin de PHA en el sistema B. megaterium:
GRSB, mientras que el efecto combinado lo desfavorece.

Diagrama de Pareto Estandarizada para PHA
0 1 2 3 4
Efecto estandarizado
BB
AA
B:pH
AB
A:Concentracion
+
-

Figura 9. Diagrama de pareto para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium:
GRSB; T: 35 C
En la Tabla 10, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de
sustrato, el pH inicial del medio y la temperatura sobre la produccin de biomasa, para el
115

proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium GRSB, acompaados de los datos
de error estndar y V.I.F (factor de inflacin de varianza).

Tabla 10. Efectos estimados para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium:
glicerol residual;
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
Promedio 1,79887 0,222565
A:Temperatura 0,486645 0,914121 5,38886
B:pH -0,904436 0,652741 7,02097
C:Concentracin 0,00930976 0,561587 7,0
AA -2,65563 0,751113 4,16585
AB 0,855655 0,937317 7,45314
AC 0,118788 0,779893 7,0
BB -1,29965 0,438003 1,42259
BC 0,697667 0,597353 1,0
CC -1,68261 0,417796 1,35037


En la Figura 10, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados
entre la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura. La lnea azul indica los efectos
significativos para el sistema (sean positivos o negativos). En este caso no se observan
efectos significativos sobre el sistema.
Diagrama de Pareto Estandarizada para PHA
0 1 2 3 4 5
Efecto estandarizado
C:Concentracin
AC
A:Temperatura
AB
BC
B:pH
BB
AA
CC
+
-

Figura 4. Diagrama de pareto para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium:
GRSB
116

En la Tabla 11, se presenta el anlisis de varianza para la produccin de biomasa en el
sistema B. megaterium-glicerol residual, para las diferentes condiciones operacionales
(temperatura, pH y concentracin de glicerol residual)

Tabla 11. Anlisis de variancia para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium- GRSB
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado Medio Razn-F Valor-P
A:Temperatura 0,0773954 1 0,0773954 0,28 0,5968
B:pH 0,524289 1 0,524289 1,92 0,1720
C:Concentracin 0,0000750481 1 0,0000750481 0,00 0,9868
AA 3,41368 1 3,41368 12,50 0,0009
AB 0,227573 1 0,227573 0,83 0,3657
AC 0,00633535 1 0,00633535 0,02 0,8796
BB 2,40435 1 2,40435 8,80 0,0046
BC 0,372504 1 0,372504 1,36 0,2484
CC 4,42929 1 4,42929 16,22 0,0002
Error total 13,6542 50 0,273085
Total (corr.) 29,9324 59

En la Tabla 12. Se muestra los valores ptimos estimados por el modelo estadstico para la
produccin de PHA en el sistema B. megaterium glicerol residual. En este punto no se fijo
la temperatura como una constate sino como otra variable.

Tabla 12. Puntos ptimos para PHA en el sistema B. megaterium glicerol residual

El modelo ajustado estim, que el mximo de PHA se podra obtener bajo las condiciones
presentadas en la Tabla 12, con una concentracin de PHA (2,00 g/L).


Factor Optimo
pH 6,30
Concentracin glicerol residual (g/L) 14,6
Temperatura (C) 25,0
PHA (g/L) 2,00
117

RENDIMIENTO Yp/s

En la Tabla 13, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de
sustrato y el pH inicial del medio sobre el rendimiento Yp/s, para un proceso de
fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 25C,
acompaados de los datos de error estndar y V.I.F, para cada uno de los efectos
individuales y combinados.

Tabla 13. Efectos estimados para el rendimiento Yp/s; sistema B. megaterium: GRSB ;
T= 25 C
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
promedio 188,526 17,2674
A:pH -85,0833 29,1661 1,0
B:Concentracin -57,3859 25,1307 1,0
AA -221,305 50,5157 1,34992
AB 257,53 70,7241 1,0
BB -280,364 49,4571 1,34992

En la Figura 13, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados
entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el
sistema (positivos y/o negativos), por ejemplo en este caso podemos observar que los
efectos individuales desfavorencen el sistema B. megaterium: GRSB, mientras que el efecto
combinado lo favorece.
118

Diagrama de Pareto Estandarizada para Yp/s
0 1 2 3 4 5 6
Efecto estandarizado
B:Concentracin
A:pH
AB
AA
BB
+
-
Figura 13. Diagrama de pareto para la produccin el rendimiento Yp/s, para el sistema B.
megaterium: GRSB; T: 25 C

En la Tabla 14, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de
sustrato y el pH inicial del medio sobre el rendimiento Yp/s, para un proceso de
fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 30C,
acompaados de los datos de error estndar y V.I.F, para cada uno de los efectos
individuales y combinados.

Tabla 14. Efectos estimados para el rendimiento Yp/s; sistema B. megaterium: GRSB;
T= 30 C
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
Promedio 43,1243 6,32713
A:pH -12,5333 10,6871 1,0
B:Concentracin -35,9439 9,20843 1,0
AA -15,3501 18,51 1,34992
AB 17,64 25,9148 1,0
BB -15,4016 18,1221 1,34992

En la Figura 14, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados
entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el
sistema (positivos y/o negativos), en este caso podemos observar la concentracin del
119

sustrato presenta un efecto negativo en el rendimiento Yp/s del sistema B. megaterium:
GRSB
Diagrama de Pareto Estandarizada para Yp/s
0 1 2 3 4
Efecto estandarizado
AB
AA
BB
A:pH
B:Concentracin
+
-

Figura 14. Diagrama de pareto para la produccin el rendimiento Yp/s, para el sistema B.
megaterium: glicerol residual; T: 30 C


En la Tabla 15, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de
sustrato y el pH inicial del medio sobre el rendimiento Yp/s, para un proceso de
fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 35C,
acompaados de los datos de error estndar y V.I.F, para cada uno de los efectos
individuales y combinados.

Tabla 15. Efectos estimados para el rendimiento Yp/s; sistema B. megaterium: GRSB; T=
35 C
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
Promedio 26,4077 3,47266
A:pH 4,3 5,86564 1,0
B:Concentracin -5,88636 5,05407 1,0
AA -10,0313 10,1593 1,34992
AB -44,94 14,2234 1,0
BB -15,8284 9,94637 1,34992

120

En la Figura 15, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados
entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el
sistema (positivos y/o negativos), se observa que el efecto combinado entre pH y
concentracin del sustrato presenta un efecto negativo en el rendimiento Yp/s del sistema
B. megaterium: GRSB.
Diagrama de Pareto Estandarizada para Yp/s
0 1 2 3 4
Efecto estandarizado
A:pH
AA
B:Concentracin
BB
AB
+
-

Figura 15. Diagrama de pareto para la produccin el rendimiento Yp/s, para el sistema B.
megaterium: GRSB; T: 35 C

En la Tabla 16, se presenta el anlisis de varianza para rendimiento Yp/s, en el sistema B.
megaterium-GRSB, para las diferentes condiciones operacionales (temperatura, pH y
concentracin de glicerol residual)

Tabla 16. Efectos estimados para el rendimiento Yp/s; sistema B. megaterium: GRSB
Efecto Estimado Error Estndar V.I.F.
Promedio 71,0292 11,691
A:Temperaruta -76,98 11,0854 1,0
B:Concentracin -33,0721 14,2388 1,0
C:pH -31,1056 16,5252 1,0
AA 44,97 19,2005 1,0
AB 25,7497 17,4389 1,0
AC 44,6917 20,2391 1,0
121

BB -103,865 28,0218 1,34992
BC 76,7433 40,0714 1,0
CC -82,2289 28,6216 1,34992

En la Figura 16, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados
entre la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura. La lnea azul indica los efectos
significativos para el sistema (sean positivos o negativos). En este caso no se observa que el
efecto combinado del la temperatura y el pH favorecen Yp/s en el sistema B. megaterium
GRSB; mientras que el efecto individual de la temperatura lo desfavorece.
Diagrama de Pareto Estandarizada para Yp/s
0 2 4 6 8
Efecto estandarizado
AB
C:pH
BC
AC
B:Concentracin
AA
CC
BB
A:Temperaruta
+
-

Figura 16. Diagrama de pareto para la produccin el rendimiento Yp/s, para el sistema B.
megaterium: GRSB

En la Tabla 17, se presenta el anlisis de varianza para el rendimiento Yp/s, en el sistema
B. megaterium- GRSB, para las diferentes condiciones operacionales (temperatura, pH y
concentracin de glicerol residual)





122

Tabla 17. Anlisis de variancia para el rendimiento Yp/s, para el sistema B. megaterium- GRSB
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razn-F Valor-P
A:Temperaruta 59259,2 1 59259,2 48,22 0,0000
B:Concentracin 6629,53 1 6629,53 5,39 0,0243
C:pH 4354,0 1 4354,0 3,54 0,0656
AA 6741,0 1 6741,0 5,49 0,0232
AB 2679,26 1 2679,26 2,18 0,1461
AC 5992,04 1 5992,04 4,88 0,0318
BB 16883,0 1 16883,0 13,74 0,0005
BC 4507,3 1 4507,3 3,67 0,0612
CC 10143,0 1 10143,0 8,25 0,0060
Error total 61443,4 50 1228,87
Total (corr.) 170101, 59

En la Tabla 18. Se muestra los valores ptimos estimados por el modelo estadstico para el
rendimiento Yp/s en el sistema B. megaterium GRSB. En este punto no se fijo la
temperatura como una constate sino como otra variable.

Tabla 18. Puntos ptimos para el rendimiento Yp/s en el sistema B. megaterium GRSB

El modelo ajustado estim, que el mximo de rendimiento Yp/s, se podra obtener bajo las
condiciones presentadas en la Tabla 12, con un rendimiento Yp/s (153,64 mg/g).



Factor Optimo
pH 5,57
Concentracin (g/L) 11,2
Temperatura (C) 25,0
Yp/s (mg/g) 153,64