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Revista Cubana de Plantas Medicinales.
2010; 15(1)

Revista Cubana de Plantas Medicinales 2010; 15(1)1-2

http://scielo.sld.cu
1
EDITORIAL

Ao 15 de la Revista Cubana de Plantas Medicinales

Year 15 of the Revista Cubana de Plantas Medicinales

Francisco J. Morn Rodrguez
Doctor en Ciencias Mdicas. Profesor Titular de Farmacologa. Director de la Revista
Cubana de Plantas Medicinales.

El presente nmero inicia el volumen 15 de nuestra revista que se ha editado
ininterrumpidamente desde 1996.
Nos parece que recin comenzamos esta publicacin, en medio de los difciles aos
del Perodo Especial en Cuba; sin embargo, la revista ha ido madurando y a sus
cambios han contribuido de manera importante nuestros autores, el comit editorial
y sus rbitros.
No menos importante ha sido la contribucin de la Editorial Ciencias Mdicas
(ECIMED) y su equipo de redaccin de revistas.
Tenemos la satisfaccin de haber sido la primera revista electrnica de ECIMED,
experiencia que fue generalizada rpidamente; as como, haber estado en el primer
grupo de revistas acreditadas por el Ministerio de Ciencia, Tecnologa y Medio
Ambiente como publicaciones cientficas cubanas seriadas.
Surgimos para crear un espacio hacia la divulgacin y el intercambio cientfico de
los resultados del Plan Nacional de Investigaciones de Plantas Medicinales del
Ministerio de Salud Pblica, que devino en el Programa Ramal de Medicina
Tradicional y Natural a partir de 1997. No obstante, poco a poco nos hemos ido
diversificando e internacionalizando; recibimos y publicamos un importante
porcentaje de artculos de colegas latinoamericanos en nuestros nmeros. Algunos
autores no cubanos han comenzado a tener 2 publicaciones o ms en la revista.
Nuestra revista cada vez tiene ms visibilidad y es indexada en importantes bases
regionales e internacionales.

2
Sea el presente ao 15 de la Revista Cubana de Plantas Medicinales, una nueva
etapa que nos permita de manera conjunta alcanzar mejores resultados.


3
ARTCULO ORIGINAL

Especificidad de la cromatografa lquida de alta
eficacia para evaluar estabilidad qumica basada en
partenina del follaje seco pulverizado de Parthenium
hysterophorus L. (escoba amarga)

Specificity of HPLC to assess the chemical stability based on
partenine from Parthenium hysterophorus L. powdered dry
foliage (escoba amarga)

Yanelis Saucedo Hernndez
I
; Bassam Mohamad Safa
II
; Mirtha Mayra
Gonzlez Bedia
III
; Hilda M. Gonzlez San Miguel
IV
; Luis Ramn Bravo
Snchez
V
; Elisa Jorge Rodrguez
VI
; Adalberto Quintana
VII
; Ricardo Quiones
Ramos
VIII
; Ana Hernndez Monzn
IX

I
Licenciada en Ciencias Farmacuticas. Mster en Qumica Farmacutica. Asistente.
Departamento de Farmacia. Facultad de Qumica Farmacia. Universidad Central de
Las Villas (UCLV). Villa Clara, Cuba.
II
Licenciado en Ciencias Farmacuticas. Departamento de Farmacia. UCLV. Villa
Clara, Cuba.
III
Licenciada en Ciencias Farmacuticas. Mster en Tecnologa y Control de
Medicamentos. Doctora en Ciencias. Profesora Titular. Departamento de Farmacia.
UCLV. Villa Clara, Cuba
IV
Doctora en Ciencias. Profesora Auxiliar. Departamento de Farmacia. Instituto de
Farmacia y Alimentos (IFAL). Universidad de la Habana (UH). Villa Clara, Cuba.
V
Licenciado en Qumica. Mster en Tecnologa y Control de Medicamentos. Doctor
en Ciencias Qumicas. Profesor Titular. Departamento de Farmacia. UCLV. Villa
Clara, Cuba.
VI
Licenciada en Ciencias Farmacuticas. Mster en Tecnologa y Control de
Medicamentos. Doctora en Ciencias Farmacuticas. Profesora Titular. Departamento
de Farmacia. UCLV. Villa Clara, Cuba.
VII
Tcnico en Qumica. Departamento de Farmacia. UCLV. Villa Clara, Cuba.
VIII
Licenciado en Ciencias Farmacuticas. Mster en Ciencias. Profesor Titular.
Departamento de Agronoma, Facultad de Agropecuaria. UCLV. Villa Clara, Cuba.
IX
Tcnica en Farmacia. Departamento de Farmacia. UCLV. Villa Clara, Cuba.


4

RESUMEN
INTRODUCCIN: se requiere una tcnica de anlisis especfica que permita dar
seguimiento al estudio de la estabilidad intrnseca del follaje seco pulverizado de
Parthenium hysterophorus L. (escoba amarga), para la obtencin de una forma
farmacutica de utilidad antiparasitaria con los requisitos de calidad, seguridad y
eficacia exigidos.
OBJETIVO: demostrar la especificidad de la tcnica analtica de cromatografa
lquida de alta eficacia para la cuantificacin de partenina en el polvo de P.
hysterophorus para su aplicacin en estudios de estabilidad.
MTODOS: se aplic cromatografa lquida de alta eficacia a muestras degradadas
de P. hysterophorus, bajo condiciones degradativas en medio cido, bsico y
oxidativo. Se evalu la especificidad de la tcnica de anlisis para detectar el
componente de inters sin interferencias de sus productos de degradacin y su
posible utilidad en estudios de estabilidad del polvo de la planta.
RESULTADOS: la cromatografa lquida de alta eficacia para cuantificar partenina
en el polvo de P. hysterophorus result especfica en las condiciones de trabajo
establecidas y puede emplearse en estudios de estabilidad del slido en el polvo de
la planta.
CONCLUSIONES: la tcnica de cromatografa lquida de alta eficacia propuesta es
especfica y se recomienda su utilizacin en los estudios de estabilidad del slido en
polvo de la planta.
Palabras clave: Parthenium hysterophorus, partenina, cromatografa lquida de
alta eficacia, especificidad, estabilidad.

ABSTRACT
INTRODUCTION: it is required a specific analysis technique allowing the follow-up
to stability study intrinsic of Parthenium hysterophorus L. (escoba amarga)
powdered dry foliage to achieve in a pharmaceutical way a antiparasitic usefulness
with the quality, safety and effectiveness demanded requirements.
OBJECTIVE: to demonstrate the specificity of analytical technique of high-
performance liquid chromatography for quantization of partenine in the powder of
P. hysterophorus for its application in stability studies.
METHODS: high performance liquid chromatography was applied to P.
hysterophorus degraded samples under degradation conditions in an oxidative,
basic and acid medium.The analysis technique specificity was assessed to detect
the interest component without interferences of its degradation products and its
possible usefulness in studies on solid stability in the plant powder.
RESULTS: high-performance liquid chromatography to quantify the presence of
partenine in the P. hysterophorus powder was specific in established work
conditions and may be used in solid stability studies of plant powder.
CONCLUSIONS: the high-performance proposed is specific and it is recommended
in solid stability studies of solids in plant powder.
Key words: Parthenium hysterophorus, partenine, high-performance liquid
chromatography.


5

INTRODUCCIN
La cromatografa lquida de alta eficacia (CLAE) constituye una herramienta
analtica de eleccin en la literatura internacional para la determinacin cuantitativa
de lactonas sesquiterpnicas, metabolitos mayoritarios en la planta.
1-3
No obstante
no ha sido descrita por los autores que abordan la temtica, la aplicacin de una
tcnica de anlisis cuantitativo en estudios de estabilidad de extractos de
Parthenium hysterophorus L. Se requiere como requisito indiscutible en la
realizacin de los estudios de estabilidad del slido en polvo de la planta, de una
tcnica analtica especfica que permita detectar y cuantificar el ingrediente activo
de inters (partenina) y dar seguimiento a los productos de degradacin como
interferencias potenciales en la matriz analizada. Demostrar la especificidad de esta
tcnica es el objetivo de este trabajo.
4-7

MTODOS
Las partes areas de la planta (follaje) se colectaron en el Reparto Universitario de
Santa Clara, donde predomina el suelo con caractersticas pardo con carbonato, y
se identific en el Jardn Botnico de la Universidad Central de Las Villas por el
doctor Cristbal Ros Albuerne con nmero de voucher 08133.

Especificidad de la tcnica analtica mediante cromatografa lquida de alta
eficacia para la estabilidad
8-10

Preparacin de la disolucin de referencia (150 mg/L)
Se prepar una disolucin de patrn de trabajo de partenina de concentracin 2,5
mg/mL. A partir de esta disolucin se tom una alcuota de 120 L, se transfiri a
un matraz aforado de 2 mL y se complet el volumen con acetonitrilo:agua (40:60)
(150 mg/L).

Preparacin de la disolucin de la muestra sin degradar
Se pesaron 0,5 g (con error de 0,1 mg) del slido en polvo de la planta y se
realiz una extraccin con 40 mL de metanol, se agit en bao ultrasnico durante
10 min. El extracto se filtr y se lav con 15 mL de metanol. Luego se repiti la
extraccin, se reunieron los filtrados, se concentraron a vaco en rotoevaporador y
se redisolvieron en 20 mL de metanol. Se tom una alcuota de 1 mL, se disolvi en
acetonitrilo: agua (40:60) y se enras en 10 mL. La disolucin se filtr por miliporo
de 0,45 m y se inyect en el instrumento 20 L de esta disolucin.

Preparacin de las disoluciones de las muestras degradadas

6
Medio oxidante, cido y bsico: Se realiz la extraccin del slido en polvo de la
planta, segn el procedimiento descrito con anterioridad para la preparacin de la
disolucin de la muestra sin degradar, hasta que se reunieron los filtrados. Se
adicion el agente degradante a cada filtrado: 10 gotas de perxido de hidrgeno
(H
2
O
2
) 3 % (medio oxidante), 10 mL de HCl 1 mol/L (medio cido) y 10 mL de
NaOH 1 mol/L (medio bsico) y se refluj en los ltimos 2 casos. La muestra
sometida a medio oxidante se protegi de la luz y se calent en bao de Mara a 50
C. Se determin el contenido de partenina mediante CLAE a los 10 min Para ello,
cada muestra se concentr a vaco, se redisolvi en 20 mL de metanol, se tom 1
mL, se ajust el pH entre 7 y 8 con disoluciones de HCl o NaOH a 0,5 mol/L, segn
el caso, y se enras a 10 mL con la fase mvil acetonitrilo:agua (40:60) en un
matraz aforado.
Luz natural y artificial: se colocaron en una placa petri, de forma extendida, 0,5 g
del slido en polvo de la planta y se mantuvieron bajo el efecto de la luz solar (no
directa) y de la luz artificial durante 72 h. En el caso de la luz artificial las muestras
se mantuvieron a una distancia de 20 cm de una lmpara de luz UV (254 nm). En
ambos casos se obtuvo la disolucin de la muestra degradada, para el anlisis,
segn la metodologa de preparacin de la muestra sin degradar descrita con
anterioridad.
Perfiles de CLAE: las condiciones cromatogrficas fueron las siguientes: FE:
LiChrospher-100 RP-18, FM: acetonitrilo (A): agua (B) (40:60), gradiente de
elucin: 40 % A (0-10 min), 40-100 % A (10-15 min) y 100-40 % A (15-20 min),
flujo: 1,0 mL/min, detector: longitud de onda () variable; = 210 nm. Se
inyectaron 10 L de cada muestra, previamente filtrada por filtro miliporo de 0,45
m, en el instrumento de CLAE. Adems, las muestras se inyectaron bajo las
mismas condiciones cromatogrficas en un instrumento de CLAE con los detectores
multiespectral y de espectrometra de masas (CLAE-EM), para demostrar la
homogeneidad del pico correspondiente a la partenina. La expresin de clculo para
determinar el porcentaje de partenina en base seca en el slido en polvo de la
planta (muestra sin degradar y muestras degradadas) mediante la tcnica por CLAE
es la siguiente:

Donde:
% p: porcentaje de partenina en base seca (%).
40: factor de correccin.
a: concentracin en mg/mL obtenida de la curva de calibracin.
% H: porcentaje de prdida de humedad (9,5 %).

Cromatografa en capa delgada cualitativa (CCD)
Fase estacionaria: gel de slice 60 GF 254, dimensiones (4 x 8 cm) y 0,2 mm de
espesor. Fase mvil: cloroformo: acetona (6:2). Se emplearon como reveladores la
luz UV a 254 nm y el asperjado con disolucin de vainillina (0,5 g de vainillina, 10
mL de etanol, 3 gotas de cido actico y 0,5 mL de cido sulfrico concentrado).

7
Se realiz un seguimiento cualitativo mediante la CCD a las muestras sometidas a
las diferentes condiciones degradativas (estrs), en comparacin con el
comportamiento cromatogrfico de la disolucin de referencia. Se aplicaron 20 mL
de cada variante analizada y del patrn de referencia; se emplearon las condiciones
cromatogrficas descritas anteriormente. Se calcul la razn de flujo (Rf) de las
manchas obtenidas en los cromatogramas en comparacin con la disolucin de
referencia.

Espectrofotometra ultravioleta
Muestra sin degradar: se pesaron con exactitud 250 mg del slido en polvo y se
realiz una extraccin con 10 mL de metanol, se agitaron en zaranda durante 10
min y se filtr. Se tom 20 L de la solucin anterior y se enras a un volumen de
2 mL con metanol en matraz aforado. Se efectu un barrido de exploracin en el
intervalo de 200 a 300 nm. Se realizaron las mediciones con metanol como blanco.
Muestras degradadas (medios cido, bsico, oxidante, luz UV y solar): las muestras
de ensayo concentradas a sequedad se redisolvieron en metanol, se enrasaron en
matraces aforados de 2 mL. Se obtuvo la absorbancia en el intervalo de 200 a 300
nm, con el empleo como blanco del metanol.

RESULTADOS
Especificidad de la tcnica analtica mediante cromatografa lquida de alta eficacia
para la estabilidad
Se evalo la especificidad de la tcnica analtica CLAE con vistas a su aplicacin en
estudios de estabilidad del polvo y se valor la posible interferencia de productos de
degradacin en relacin con la respuesta cromatogrfica del ingrediente activo
principal. Se valor el perfil cromatogrfico de cada condicin analizada, al ser
sometidas las muestras de ensayo a degradaciones en diferentes condiciones
extremas, que propicien una degradacin del ingrediente activo que no supere 20
%, segn se establece.
5,11,12
Para ello, se evaluaron las respuestas cromatogrficas
a cada condicin analizada, al ser sometidas las muestras de ensayo a
degradaciones en diferentes condiciones de estrs como: medio cido (HCl 1
mol/L), medio bsico (NaOH 1 mol/L), oxidacin (H
2
O
2
3 %), luz solar y
ultravioleta.
El cromatograma obtenido mediante CLAE de la sustancia de referencia (Fig. 1) y
de la muestra sin degradar (Fig. 2), evidencian un pico cromatogrfico bien definido
y resuelto a un tiempo de retencin de 5,3 min, correspondiente al metabolito de
inters.
Medio bsico: en esta condicin se obtuvo una reduccin significativa de la
concentracin de partenina (%) en relacin con la que se obtuvo en la muestra sin
degradar. Adems, se detectaron nuevos picos cromatogrficos que pueden
corresponder a posibles productos de degradacin, dentro de los cuales se destaca,
por su mayor rea, el que aparece a tiempo de retencin de 7,5 min, que sugiere la
presencia de un producto de menor polaridad en relacin con el metabolito activo
(partenina) (tablas 1 y 2) (Fig. 3).

8
Medio cido: se apreci un comportamiento similar al obtenido en medio bsico,
caracterizado por una reduccin significativa de la concentracin de partenina (%)
en relacin con la muestra sin degradar (tablas 1 y 2) (Fig. 4) y la aparicin de
nuevos picos cromatogrficos. De ellos el de mayor rea, que aparece a un tiempo
de retencin de 7,9 min, podra brindar un criterio de la presencia de un producto
de degradacin de menor polaridad en relacin con el metabolito activo (partenina).
Medio oxidante: se apreci un comportamiento similar al obtenido en medio cido y
bsico (tablas 1 y 2) (Fig. 5). Se destaca un nuevo pico cromatogrfico a un tiempo
de retencin de 7,3 min.
Luz solar y ultravioleta (UV): en esta condicin se obtuvo una reduccin menos
marcada de la concentracin de partenina (%) en relacin con la que se obtuvo en
la muestra sin degradar. En el caso de la luz UV se destaca un pico en el
cromatograma CLAE a un tiempo de retencin de 7,71 min, lo cual sugiere la
formacin de un posible producto de degradacin de una menor polaridad en
relacin con la partenina (tablas 1 y 2) (Figs. 6 y 7).
Como se observa en todas las condiciones, se obtuvo un pico estrecho
correspondiente al componente principal (partenina), bien resuelto, sin colas, ni
solapamientos (la ausencia de solapamientos est demostrada por la informacin
dada por los espectros de masa y UV en cada una de las regiones del pico de
partenina y con una adecuada separacin de los nuevos picos tras la degradacin).
Los resultados espectrales se muestran en la figura 8 y confirmaron la elucin del
pico a un tiempo de retencin de 5,3 min corresponde a una nica sustancia, por
causa de la aparicin de un pico de m/z 280,2 aducto [M+ NH
4
]
+
en
correspondencia con la masa molar (262,3 g/mol). Por tanto, se demostr que la
tcnica analtica de CLAE desarrollada, es especfica frente a los productos de
degradacin de la matriz analizada.

Cromatografa en capa delgada cualitativa (CCD)
La determinacin de las razones de flujo (Rf) de cada una de las muestras
analizadas, sometidas a las diferentes condiciones degradativas, en comparacin
con la solucin de referencia, evidenci los resultados siguientes:
Medio bsico: se observ la aparicin de una mancha fluorescente a la luz
ultravioleta a un valor de Rf de 0,67. Se evidenci la presencia a la luz ultravioleta
de una segunda mancha fluorescente a un valor de Rf de 0,98, no siendo detectada
al revelado con vainillina.
Medio cido: se observ la aparicin de una mancha fluorescente a la luz
ultravioleta y de color carmelita al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,125.
Se evidenci la presencia de una segunda mancha fluorescente a la luz ultravioleta
y de color verde al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,93.
Medio oxidante: se observ la aparicin de una mancha fluorescente a la luz
ultravioleta y de color carmelita al revelado con vainillina, present un valor de Rf
de 0,26. Se evidenci la presencia de una segunda mancha fluorescente a la luz
ultravioleta, no siendo detectada al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,98.
Se evidencia atendiendo a los resultados anteriores, la presencia de posibles
productos de degradacin en cada medio analizado; se detectaron 2 nuevas

9
sustancias en cada condicin, en comparacin con la sustancia de referencia
(fluorescente a la luz ultravioleta y de coloracin azul violcea al asperjado con
vainillina, con un valor de Rf de 0,5).

Espectrofotometra ultravioleta directa
Muestra sin degradar
El espectro UV del polvo en metanol en el intervalo de 200 a 300 nm evidenci la
presencia de un mximo de absorcin a una longitud de onda de 215 nm,
correspondiente a una transicin (-
*
), caracterstico de las enonas (Fig. 9).

Medio cido y bsico. Caracterizacin espectrofotomtrica cualitativa
El espectro UV de la muestra objeto de anlisis sometida a la degradacin en medio
cido mostr la presencia un mximo de absorcin a una longitud de onda de 206
nm (Fig. 10).

10

El espectro UV de la muestra sometida a la degradacin en medio alcalino evidenci
la presencia de un mximo alrededor de 212 nm (Fig. 11).

Medio oxidante. Caracterizacin espectrofotomtrica cualitativa
El espectro UV de la muestra sometida a la degradacin oxidativa con perxido de
hidrgeno 3 %, evidenci la presencia de un mximo de absorcin a una longitud
de onda de 221 nm, correspondiente a una transicin (-
*
), lo cual corrobor el
pico caracterstico de las enonas entre 215 y 250 nm (Fig. 12).

11

DISCUSIN
Atendiendo a los resultados obtenidos, se evidencia la mayor incidencia de la
condicin degradativa en medio cido en la concentracin de partenina, seguida del
medio bsico y medio oxidante, con una degradacin inferior a 16 %; finalmente,
se muestra que la menor afectacin de la concentracin del ingrediente activo
principal se obtiene bajo el efecto de la luz artificial y luz solar. Los espectros UV
obtenidos como resultado de la evaluacin de las muestras sometidas en cada
medio de degradacin (cido, bsico, oxidativo) mostraron mximos de absorcin,
caractersticos de la banda de transicin (-
*
) de las enonas, lo cual infiere la
presencia de posibles productos de degradacin de estructura qumica similar a la
partenina, adems, confirma que este mtodo analtico no es recomendable en la
realizacin de estudios de estabilidad del slido en polvo.
El anlisis comparativo de los cromatogramas obtenidos para la sustancia de
referencia, muestra sin degradar y las muestras sometidas a las condiciones de
degradacin drsticas, demuestra la especificidad del mtodo analtico CLAE, al no
evidenciarse interferencias, ni solapamientos respecto al pico con una elucin a un
tiempo de retencin de 5,3 min, correspondiente al ingrediente activo principal.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Merfort I. Review of the analytical techniques for sesquiterpenes and
sesquiterpene lactones. J Chromatogr A. 2002;967(1):115-30.
2. Harborne JB. Preparative chromatography techniques. Application in natural
product isolation. 2nd ed. New York: Ed. Alan R. Liss; 1998. pp. 261-302.
3. Marchand B, Rodrguez E. Application of high-performance liquid chromatography
of analysis and isolation of sesquiterpene lactones. J Chromatography.
1983;265:97-104.

12
4. EURACHEM Guide. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory
Guide to Method Validation and Related Topics. Reino Unido: Guidelines 25; 1998.
p. 12-20.
5. ICH. Harmonised Tripartite Guideline. Guidance for industry. Stability testing of
new drug substances and products, Q1A. Geneva; 2005. p. 1-13.
6. Thompson M, Wood R. Harmonised guidelines for internal quality control in
analytical chemistry laboratories. Pure Appl Chem. 1995;67:49-56.
7. Thompson M, Ellison, SL, Fajgelj Ales, Willetts P, Wood R. Harmonized guidelines
for the use of recovery information in analytical measurement (Technical Report).
Pure Appl Chem. 1999;71(2):337-348.
8. Dehesa M. Contribucin al estudio qumico farmacutico de las hojas de la
especie Tamarindus indica L. [Tesis Doctoral]. Ciudad de La Habana: Universidad
de La Habana; 2005.
9. Jin P, Madieh S, Augsburger LL. The solution and solid state stability and
excipient compatibility of parthenolide in feverfew. AAPS PharmSciTech; 2008.
10. Jin P, Madieh S, Augsburger LL. Selected physical and chemical properties of
feverfew (Tanacetum parthenium) Extracts important for formulated product quality
and performance. AAPS PharmSciTech. 2008;9(1):22-30.
11. CECMED. Validacin de mtodos analticos. Regulacin No. 41. La Habana.
2007.
12. Klick S, Muijselaar G, Waterval J, Eichinger T, Christian K, Thijs K, et al. Toward
a generic approach for stress testing of drug substances and drug products. Pharm
Technol. 2005;2(1):48-66.

Recibido: 2 de abril de 2008.
Aprobado: 30 de enero de 2010.

MSc. Yanelis Saucedo Hernndez. Departamento de Farmacia. Facultad de Qumica
Farmacia. Universidad Central de Las Villas (UCLV). Villa Clara, Cuba. Correo
electrnico: ysaucedo@uclv.edu.cu

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18
ARTCULO ORIGINAL

Genotoxic assessment of aqueous extract of
Rhizophora mangle L. (mangle rojo) by spermatozoa
head assay

Evaluacin genotxica del extracto acuoso de Rhizophora
mangle L. (mangle rojo) mediante el ensayo de la cabeza del
espermatozoide

Deyanira Carnesoltas Lzaro
I
; Yanisey Izquierdo Lpez
II
; Ana Iris Fras
Vzquez
III
; Anibal Domnguez Odio
IV
; Jorge Ernesto Gonzlez
V
; Luz Mara
Snchez
VI
; Neivys Garca Delgado
VII

I
Licenciada en Ciencias Farmacuticas. Mster en Farmacologa. Investigadora
Auxiliar. Profesora Auxiliar. Departamento de Farmacologa, Instituto Nacional de
Oncologa y Radiobiologa. Ciudad de La Habana, Cuba.
II
Licenciada en Bioqumica. Aspirante a Investigadora. Laboratorio de Inmunologa,
Instituto Nacional de Oncologa y Radiobiologa. Ciudad de La Habana, Cuba.
III
Licenciada en Biologa. Mster en Farmacologa. Profesora Auxiliar. Departamento
de Biologa Animal y Humana, Facultad de Biologa, Universidad de La Habana.
Ciudad de La Habana, Cuba.
IV
Doctor en Medicina Veterinaria. Investigador Agregado. Asistente. Centro de
Toxicologa Mdica. Santiago de Cuba, Cuba.
V
Licenciado en Ciencias Farmacuticas. Mster en Toxicologa. Investigador
Agregado. Centro para la Proteccin e Higiene de las Radiaciones, Pedro P. La
Habana, Cuba.
VI
Doctor en Medicina Veterinaria. Investigador Auxiliar. Departamento de
Farmacologa, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria. San Jos, La Habana,
Cuba.
VII
Licenciada en Microbiologa. Reserva cientfica. Departamento de Biologa Animal
y Humana, Facultad de Biologa, Universidad de La Habana. Ciudad de La Habana,
Cuba.

ABSTRACT

19
INTRODUCTION: the aqueous extract bark of Rhizophora mangle L. (red
mangrove) has traditionally been used in Cuban folk medicine due to its wide array
of curative properties: astringent, haemostatic, febrifuge and antifungal. Previous
chemical characterization studies of the liophylized aqueous extract bark, revealed
that tannins are the main components, although the presence of other compounds
such as epicatechin, catechin, clorogenic, gallic and ellagic acids, as well as
galotannins have been also described.
OBJECTIVE: this work was designed to determine if any components of the
extracts has the ability to produce genotoxic effects in germ cells of Cenp:NMRI
mouse models using the abnormal shape of spermatozoa test.
METHODS: the lyophilized aqueous extract bark was given by oral gavages (500,
1000 and 2000 mg of total solids /kg bw) in three series of the classical protocol of
Wyrobeck and Bruce, in intervals of 24 hrs for 5 days.
RESULTS: in series I, the animals were sacrificed on day 4 after starting the
administration. In series II the animals were sacrificed on day 21 while in series III
the day of sacrificed was the 35
th
.
CONCLUSIONS: no cytotoxic effect was observed in the 3 series and in all doses
proved and only the highest dose of the extract in the series I provoked a slight
genotoxic effect when increase the percentage in the number of abnormal
spermatozoa.
Key words: Rhizophora mangle L., red mangrove, germinal cell test, plant extract,
genotoxicity.

RESUMEN
INTRODUCCIN: el extracto acuoso de Rhizophora mangle L. (mangle rojo), se
ha usado tradicionalmente en Cuba por su amplio espectro de propiedades
curativas: como astringente, hemosttico, febrfugo y antifngico. Los estudios
previos de caracterizacin qumica del extracto acuoso liofilizado de la corteza de la
planta revelaron que los taninos son los componentes principales, aunque tambin
se ha descrito la presencia de otros compuestos como las epicatequinas, el cido
clorognico, cido glico y cido elgico, as como galotaninos.
OBJETIVO: el presente estudio fue diseado para determinar si alguno de los
componentes del extracto tiene la capacidad para producir efectos genotxicos en
clulas germinales de ratones Cenp:NMRI utilizando el ensayo de anormalidades de
la cabeza del espermatozoide.
MTODOS: el extracto liofilizado fue administrado por va oral (500, 1 000 y 2 000
mg de material vegetal/kg) en 3 series del protocolo clsico de Wyrobeck y Bruce,
en intervalos de 24 h por 5 d consecutivos.
RESULTADOS: en la serie I los animales fueron sacrificados el dia 4 despus de
iniciada la administracin. En la serie II los animales fueron sacrificados el da 21,
mientras que en la serie III fueron sacrificados el da 35.
CONCLUSIONES: no se observ efecto citotxico en las 3 series y en todas las
dosis probadas, y solamente la dosis mayor del extracto en la serie I provoc un
ligero efecto genotxico al incrementar el porcentaje de espermatozoides
anormales.
Palabras clave: Rhizophora mangle L., mangle rojo, ensayo en clula germinal,
extracto de planta, genotoxicidad.


20
INTRODUCTION
The introduction in the clinical practice of newly discovered drugs from natural
sources should be submitted to pharmacological as well as toxicological studies
prior to clinical trials. Therefore, in order to estimate the risk associated to the use
of natural products, the study of genotoxicity, embriotoxicity and/or teratogenicity
should be conducted, together with conventional toxicological evaluation. Although
natural products have generally been regarded as a safe choice for the treatment of
different pathologies, some of them have been demonstrated to display mutagenic
effects. In this direction, it

has described the induction of mutagenic effects in
Salmonella typhimuriun strains, by the aqueous or methanolic extracts obtained
from Brosimum gaudichaudii.
1
Using the same assay, has similarly demonstrated
the occurrence of mutagenicity after exposure to a stem bark extract from Schinus
terebinthifoliusi.
2
Also, it have been showed that the hydroalcoholic extract of
Punica granatum (Punicaceae) whole fruits, used in Cuban traditional medicine as
an effective drug for the treatment of respiratory diseases, is genotoxic when
tested both in vitro and in vivo assays that detect DNA damage at different
expression levels.
3

In general, genotoxicity tests are carried out in order to identify if specific
compounds have the ability to interact with nucleic acids at low concentrations and
thus able to modify certain hereditary characteristics. These interactions may cause
a direct or indirect toxicity in the genetic materials of sexual cells, probably via liver
metabolism, which could in turn trigger a chain of events leading to carcinogenicity
or genetic alterations in successive generations.
4

Red mangrove, Rhizophora mangle L., is a widely distributed tree in some low,
muddy and swamp areas of the Caribbean region. This specie has traditionally been
used in Cuban folk medicine due to its wide array of curative properties: astringent,
haemostatic, febrifuge and antifungal.
5
Particularly, the aqueous extract obtained
from this plant has been demonstrated to exhibit antibacterial, wound healing,
antioxidant and gastric anti-ulcer activity and mouth mucosa healing properties.
6-10

Another study has shown a remarkable COX-2 and sPLA2 inhibitory in vitro activity
in the aqueous extract and polyphenols of this plant.
11
The chemical
characterization studies of the extract, tannins have revealed that are the main
components, although the presence of other compounds such as epicatechin,
catechin, clorogenic, gallic and elagic acids, as well as galotannins have been also
described. Moreover, this extract also appears to contain bound carbohydrates such
as xilose, ramnose, fucose, arabinose, mannose and galactose as well as saturated
and unsaturated long-chain fatty acids, essential oils and fitosterols.
12

Taking in account all the above considerations, the aim of current paper was to
carry out a genotoxicity evaluation of the aqueous extract obtained from R. mangle
in male mice germ cells assay, using morphological criteria as toxicity endpoint.

METHODS
Animals
Experiments were performed using 8-12 weeks, Cenp:NMRI out bred, male mice,
provided by Centro para la Produccin de Animales de Laboratorio (CENPALAB),
Havana, Cuba. Animals were kept at room temperature and room relative humidity
and exposed to the natural light-dark cycle. They were randomly distributed in

21
groups of 6 animals per dose in each treatment, and the standard rodent diet and
tap water were ad libitum. All the animal procedures reported here, were carried
out in accordance with the Cuban regulations on the protection of animals.
13
The
experimental protocol was also revised by ethical committee and conducted
humanely.
Plant extract preparation
R. mangle specimens were authenticated by Department of Botany, National Center
of Animal Health (CENSA), Cuba, and a voucher sample 6539, HAJB was deposited
at the Herbarium of this Institution. The extract was gently supply by Dr. Luz Mara
Sanchez from Pharmacology Department of National Center of Animal Health
(CENSA), and the quality of each batch was carefully monitored by Quality
Assurance Department of CENSA.
Experimental design
Three different experimental series (referred as I, II and III) were designed to
evaluate the possible genotoxic effect of the aqueous extract of R. mangle. In all
cases, the extract was dissolved in saline solution (NaCl 0.9%) and given by oral
administration using 3 different dose levels (500, 1000 and 2000 mg of total
solids/kg b.w.). An equal volume of saline solution was considered as a negative
control group in all experimental series. In series I, the extract was administered
during 3 days within 24 hours-time interval and the animals were humanely
sacrificed on day 4 after starting the administrations. In series II, the extract was
also given once per day, but the treatments lasted 5 days and the animals were
sacrificed on day 21. In series III, the administrations of the extract were
conducted as in series II, but the animals were sacrificed on day 35.
Sperm Morphology Test
The test was performed according to the method described by Wyrobek and Bruce
14

and Dobrzyriska and Gajewski.
15
The animals were sacrificed by cervical dislocation
on days 4, 21 and 35 after the first injection, according to the different series
detailed previously. Both caudal epididymus were removed and placed in a Petri
plaque containing 1 mL of saline solution. The sperms were released after
mechanical disruption and washing of the epididymus. The sperms concentrations
in each sample were determined by spermatic counts on Newbauer chamber (DDR,
Germany). In addition, an aliquot of the sperm suspension was stained by 0.1 %
eosin. Briefly, a drop was taken and smeared on a clean slide, and 1000
spermatozoa of each mouse were analyzed in a DMLS microscope (Leyca,
Germany) with 100x amplification. The following abnormalities were scored: lacking
hook, amorphous and banana-shaped head.
Statistical analysis
Results of sperm count and morphology are presented as the mean standard
deviation (SD). Data of normal distribution and variance homogeneity were studied
by Kolmogorov-Smirnov and Bartlet tests, respectively. Treatments were compared
using ANOVA and Dunneys post test. p < 0.05 was considered significant.

RESULTS

22
The effect of the oral administration of the aqueous extract of R. mangle in terms of
germ cells viability is presented in table 1. The spermatic count was statistically
similar in control animals and animals treated with the different dose (500; 1 000;
2 000 mg/kg b.w.) of R. mangle aqueous extract.
Results of the sperm morphology test, conducted in the three different
experimental series are shown in table 2. In experimental series I, the exposure to
the highest dose of the plant extract (2 000 mg/kg b.w.) produced an increase of
anomalous sperms, with prevalence of hook and banana type cells. However, the
effect was not observed after exposure to the lower dose of the plant extract (500
and 1 000 mg/kg). On the other hand, in experimental series II and III, no
increment in the frequency of appearance of anomalous head was registered after
exposure to the plant extract.
On the other hand, in series II and III we appreciated that none of the doses of the
aqueous extract (500, 1 000 and 2 000 mg/kg b.w.) induced variations in the
percentage of appearance of anomalous sperms when it is compared with the
values in the control group of mice treated with saline solution (NaCl 0,9 %).

DISCUSSION
From ancient times, plants have been used for medicinal purposes. Nowadays,
primary health care in 80 % of the world population basically relies on plant and
plant-derived products,
16
mainly due to medicinal plants constitute the base of
health care systems in many societies and because the recovery of the knowledge
and practices associated with these plant resources are part of an important health
strategy in discovery of new medicines.
17
However, plants compounds can also
have toxic effects in the human body, as they markedly differ from endogenous
substances.
18

When evaluating the effect of the aqueous extract of R. mangle over the germinal
cells viability it was shown that it does not induce cytotoxicity on the sperm tides
that are in differentiation roads to sperms (spermatogenesis phase) or on the
sperms that are already formed at 4, 21 or 35 days, corresponding to experimental
series I, II and III respectively. Altogether, these results reveal that the plant
extract does not affect neither the viability of the primary and secondary
spermatocytes (meiosis phase) nor the viability of the spermatogonium (mitosis
phase).
The absence of toxicity observed in germinal cells after exposure to the aqueous
extract of the bark of R. mangle can be explained on the basis of its chemical
components. No toxic effects on in vivo models have been attributed to condensed
and hydrolysable tannins, phytosterols, semi volatile compounds and fatty acids,
which are constituents of R. mangle aqueous extract.
12
Similarly, it has reported no
toxic effects on germs cells viability after exposure to limit dose of the extracts of
caisimn of anis (Piper auritum H.B.K) and majagua (Hibiscus elatus Sw), which
also contain tannins in their chemical composition.
19
In addition, no toxic effects
have been found for high doses (1000 and 2000 mg/kg) of the aqueous extract of
Mangifera indica L, which contains an important amount of polyphenolic
compounds.
20

However, a significant increase in abnormal spermatozoa was observed in the
group administered with the higher dose of the plant extract within the
experimental series I, pointing out to a genotoxic effect on the germ cells,

23
particularly at the spermatogenesis phase. The finding could be related to certain
components of the extract such as hydrolysable tannins (e.g. gallic and ellagic
acids) or its metabolites able of exert toxicity particularly during the
spermatogenesis process.
Researchers have documented the in vitro cytotoxicity and genotoxicity induced by
ellagic and gallic acid (15-240 mM concentration range) as measured in culture of
B14 cell line.
21
The results of this study showed that tannins could decrease the
viability of cells and their cytotoxicity was highest at the concentration of 60 mM.
Also the data obtained from the Comet assay also supported the ability of both
compounds to contribute to formation of DNA single-strand breaks. Although, both
chemical entities could be at least partially responsible for the mutagenic effect of
the R. mangle extract at high doses, we thinks that in this case we must be
cautious and careful because these elements are common in our diets.
On the other hand, the mutagenic effect of the extract could be also related to the
lacking of effective cell repair mechanisms at this stage or to the nature of the
damage, as in some cases no endogenous mechanism exists for its reparation. In
any case, the values of anomalous sperms observed at the higher dose of 2000
mg/kg fall below the values reported in similar studies by,
19
even though they are
significant when compared to control group. Consequently, above results generates
questions that should be corroborated and discussed in further studies.
Current results show biggest susceptibility in the sperm tides cells, in disagreement
with previous approaches in which the late spermatogonial cells and/or early
primary spermatocytes appear to be the most susceptible.
14,22
But in support of our
finding, researchers have also found the late sperm tides undergoing differentiation
process and the sperms already formed as preferable targets of the genotoxicity,
exerted by the independent and combined treatment of acryl amide and X-rays on
the germinal and somatic cells.
15

The exposure to R. mangle aqueous extract lasting 21 and 35 days did not increase
the frequency of appearance of anomalous sperms, according to the data in
experimental series II and III. One line of thoughts, guided by results of Wyrobek
and Bruce,
22
could lead us to conclude that R. mangle aqueous extract does not
induce DNA damage in germ cells on mitosis and meiosis stages. But, a second
view should be also considered, as certain genotoxicity of the extract was observed
in experimental series I at high doses. Therefore, it can be speculated the
occurrence of genotoxicity after exposure to R. mangle extract, which could be
generally repaired, except during certain conditions, such as those observed in
experimental series I. Above considerations could be perfectly permissible as strong
genetic cellular control exists in the organism designed to allow the minimal
quantity of mutations to be transmitted to progeny cells.
R. mangle (red mangrove) represents an ethno botanically relevant plant in Cuba,
traditionally used for different biomedical applications.
5
It's variety of empirical uses
with different doses, frequencies of administration and duration of treatments,
make necessity to perform a complete set of toxicity studies. Current investigation
gives one step towards this general purpose and demonstrates the occurrence of
moderate genotoxic effects at doses 4 times higher than maximum therapeutic
dose.

ACKNOWLEDGEMENTS

24
The authors thank Dr. Adyari Fallarero for her helpful discussion and pertinent
advice.

REFERENCES
1. Varanda EA, Pozetti GL, Lourenco MV, Vilegas W, Raddi MS. Genotoxicity of
Brosimun gaudichaudii measured by the Salmonella/microsome assay and
chromosomal aberration in CHO cells. J Ethnopharmacol. 2002;81(2):257-64.
2. Carvalho MC, Barca FN, Agnez, LF, Medeiros SR. Evaluation of mutagenic activity
in an extract of pepper tree stem bark. Environ Mol Mutagen. 2003;42(3):185-91.
3. Snchez-Lamar A, Fonseca G, Fuentes JL, Cozzi R, Cundari E, Fiore M, et al.
Assessment of the genotoxic risk of Punica granatum L. (Punicaceae) whole fruit
extracts. J Ethnopharmacol. 2008;12;115(3):416-22.
4. Wallace, Hayes A. Principles and Methods of Toxicology. Chapter 6. 2nd ed. New
York: Raven Press, Ltd; 1989.
5. Roig JT. Plantas medicinales, aromticas y venenosas de Cuba. Ciudad de La
Habana: Editorial Cientfico-Tcnica; 1988.
6. Rojas N, Coto O. Propiedades antimicrobianas de extractos de Rhizophora
mangle L. Rev Cubana Med Trop. 1978;30(3):181-7.
7. Snchez L, Melchor G, lvarez S, Bulnes C. Caracterizacin qumica y
toxicolgica de una formulacin cicatrizante de Rhizophora mangle L. Rev. Salud
Anim. 1998;20:69-72.
8. Snchez L, Ruedas D, Gmez, BC. Gastric antiulcer effect of Rhizophora mangle
L. J Ethnopharmacol. 2001;77:1-3.
9. Berenguer B, Snchez LM, Qulez A, Lpez-Barreiro M, de Haro O, Glvez J, et al.
Protective and antioxidant effects of Rhizophora mangle L. against NSAID-induced
gastric ulcers. J Ethnopharmacol. 2006;103(2):194-200.
10. De Armas E, Sarracent Y, Marrero E, Fernndez O, Branford-White C. Efficacy of
Rhizophora mangle aqueous bark extract (RMABE) in the treatment of aphthous
ulcers: a pilot study. Curr Med Res Opin. 2005;21(11):1711-5.
11. Marrero E, Snchez J, de Armas E, Escobar A, Melchor G, Abad MJ, et al. COX-2
and sPLA2 inhibitory activity of aqueous extract and polyphenols of Rhizophora
mangle (red mangrove). Fitoterapia. 2006;77(4):313-5.
12. Fernandez O, Capdevila JZ, Dalla G, Melchor G. Efficacy of Rhizophora mangle
aqueous bark extract in the healing of open surgical wounds. Fitoter. 2002;73:564-
68.
13. CENPALAB. Cdigo Prctico para el Uso de los Animales de Laboratorio. La
Habana: CENPALAB; 1992.

25
14. Wyrobek A, Bruce W. Chemical induction of sperm abnormalities in mice. Proc
Natl Acad Sci (USA). 1975;72:4425-9.
15. Dobrzyriska M, Gajewski A. Induction of micronuclei in Bone Marrow and Sperm
Head Abnormalities after combined exposure of mice to low doses of X-rays and
acrylamide. Terat Carcinog Mutag. 2000;20:133-40.
16. Schuster BG. A new integrated program for natural product development and
the value of an ethnomedical approach. J Altern Complement Med. 2001;7(Suppl
1):S61-72.
17. Alviano DS, Alviano CS. Plant extracts: search for new alternatives to treat
microbial diseases. Curr Pharm Biotechnol. 2009;10(1):106-21.
18. Vidal A, Fallarero A, Vuorela P. Toxicological evaluation of plant extracts: is it
necessary? Recent progress in Medicinal Plants- Reviews series. Phytotherapeutics.
2005;10:1-13.
19. Remigio A. Evaluacin genotxica de seis extractos de plantas medicinales,
mediante ensayos in vivo en ratones [Tesis de Maestra]. Ciudad de La Habana:
Facultad de Farmacia y Alimentos, Universidad de La Habana; 2002.
20. Cancino L, Leiva A, Garrido G, Cossio A, Prieto E. Vimang: los efectos
antigenotxico y modulador de las enzimas glutatin peroxidasa y glutatin-S-
transferasa. Rev Cubana Invest Biomed. 2001;20(1):48-53.
21. Labieniec M, GabryelakT. Effects of tannins on Chinese hamster cell line B14.
Mutat Res. 2003;39(1-2):127-35.
22. Wyrobek AJ, Bruce WR. The induction of sperm shape abnormalities in mice and
humans. Chemical Mutagens: Principles and Methods for their detection. New York:
A Hollander and FH de Serres Plenum Press; 1978. p. 257-85.

Recibido: 30 de mayo de 2009.

MSc. Deyanira Carnesoltas. Departamento de Farmacologa, Instituto Nacional de
Oncologa y Radiobiologa. 29 y E, Vedado, CP 10400, Ciudad de La Habana, Cuba.
Correo electrnico: deya@infomed.sld.cu; neivys@fbio.uh.cu

26


27
ARTCULO ORIGINAL

Efecto protector del aceite esencial de Lippia alba
(Mill.) N.E. Brown sobre la toxicidad del mercurocromo
en races de Allium cepa L.

The protective effect of essential oil from Lippia alba (Mill)
N.E. Brown on the mercurochrome toxicity in roots of Allium
cepa L.

Antonia Paola Vera
I
; Jess T. Olivero V
II
; Beatriz E. Jaramillo
III
; Elena
Stashenko
IV

I
Ingeniera en Alimentos. Grupo de Qumica Ambiental y Computacional, Facultad de
Ciencias Farmacuticas, Universidad de Cartagena, Campus Zaragocilla. Cartagena,
Colombia.
II
Qumico Farmacetico. Doctor en Qumica. Docente. Grupo de Qumica Ambiental
y Computacional, Facultad de Ciencias Farmacuticas, Universidad de Cartagena,
Campus Zaragocilla. Cartagena, Colombia.
III
Doctora en Qumica. Docente. Grupo de Investigaciones Agroqumicas, Facultad
de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Cartagena, Campus Zaragocilla.
Cartagena, Colombia.
IV
Doctora en Qumica. Docente. Escuela de Qumica, Facultad de Ciencias, Centro
de Excelencia CENIVAM, Universidad Industrial de Santander. Bucaramanga,
Colombia.

RESUMEN
INTRODUCCIN: dentro de la gran variedad de recursos de origen natural y que
diversos estudios reportan propiedades medicinales, se encuentra la planta de
Lippia alba (Mill.) N.E. Brown; es un arbusto aromtico que pertenece a la familia
Verbenaceae, originaria de Amrica tropical. Conocida en Colombia como pronto
alivio. Presenta numerosas propiedades medicinales como antiespasmdica,
carminativa, digestiva, diurtica, expectorante, laxante, sedante, somnfera,
sudorfica, antimicrobiana, antioxidante, antiulcerosa y anticonvulsivante.
OBJETIVO: se evalu el efecto protector del aceite esencial obtenido de tallos y

28
hojas frescas de L. alba sobre la toxicidad del mercurocromo en races de A. cepa.
El mercurocromo a 10, 250 y 500 M mostr efecto txico sobre las clulas
meristemticas de A. cepa. El aceite a 100 M, produjo un efecto protector
demostrado por la disminucin de AC y aumento de la longitud y peso de las races
expuestas a mercurocromo 10 y 500 M.
MTODOS: los parmetros evaluados fueron alteracin del ndice mittico,
inhibicin del crecimiento radicular e induccin de aberraciones cromosmicas en
ausencia y presencia del aceite esencial.
RESULTADOS: el mercurocromo a 10, 250 y 500 M mostr efecto txico sobre
las clulas meristemticas de A. cepa. El aceite a 100 M, produjo un efecto
protector demostrado por la disminucin de aberraciones cromosmicas, as como
aumento de la longitud y peso de las races expuestas a mercurocromo 10 y 500
M.
CONCLUSIONES: los datos presentados en esta investigacin mostraron que
disminuy la aparicin de aberraciones cromsomicas y cambios morfolgicos
producidos por la exposicin de clulas meristemticas de A. cepa a mercurocromo,
lo cual indica un efecto protector o antigenotxico del aceite esencial de L. alba.
Palabras clave: aceite esencial, Allium cepa, clulas meristemticas, crecimiento
radicular, efecto protector, genotoxicidad, ndice mittico, Lippia alba Mill N.E.
Brown, mercurocromo.

ABSTRACT
INTRODUCTION: within the great variety of natural resources and that different
studies report its medicinal properties, is the Lippia alba (Mill) N.E. brown plant
which is a aromatic bush belonging to Verbenaceae family to come from tropical
America. Known in Colombia as soon relieve, it has many medicinal properties as
antispasmodic, carminative, digestive, diuretic, expectorant, laxative, sedative,
somniferous, sudoriferous, antimicrobial, antioxidant, antiulcerative and
anticonvulsant.
OBJECTIVE: authors assessed the protective effect of essential oil obtained from
stem and fresh leaves of L. alba on the mercurochrome toxicity on A. cepa roots.
Mercurochrome (10, 250 and 500M showed a toxic effect on the meristic cells of
A. cepa. Oil (100 M) had a protective effect demonstrated by AC decrease and an
increase of the length and weight of roots exposed to mercurochrome (10 and 500
M). METHODS: the parameters assessed include the mitotic rate alteration,
radicular growth inhibition and chromosome induction in the absence and in the
presence of essential oil.
RESULTS: mercurochrome (10, 250 and 500 M had a toxic effect on meristic cells
from A. cepa. Oil (100 M) had a protective effect demonstrated by decrease of
chromosomal aberrations, as well as an increase of length and weight of roots
exposed to mercurochrome (10 and 500 M.
CONCLUSIONS: data showed in present research suggest that there was a
decrease of chromosomal aberrations appearing due to exposition of A. cepa
meristic cells to mercurochrome indicating a protective or anti-genotoxic effect of
essential oil of L. alba.
Key words: essential oil, Allium cepa, meristic cells, radicular growth, protective
effect, genotoxicity, mitotic rate, Lippia alba Mill N.E. Brown, mercurochrome.


29

INTRODUCCIN
El desarrollo global en las ltimas dcadas ha estado caracterizado por un
incremento en la utilizacin de sustancias qumicas txicas asociadas con diferentes
tipos de actividades (industrial, urbana, hospitalaria, comercial y agrcola.
1
Los
bioensayos surgen como un instrumento alternativo y que complementa los
tradicionales anlisis qumicos para la determinacin de toxicidad de muestras
ambientales.
2
Estos pueden auxiliar en la evaluacin de los efectos a la salud
(toxicidad humana y animal) y de los efectos ecolgicos, de millares de sustancias
qumicas txicas que son introducidas por varias vas en el ambiente y permiten su
aplicacin en programas de monitoreo en la evaluacin de la toxicidad.
3
Entre ellos,
los realizados con plantas presentan especies representativas de los
agroecosistemas hortcolas, uno de los ms empleados es la prueba con Allium
cepa.
4,5
Hoy da existe una variedad de productos de uso humano que contienen
como principio activo componentes txicos, tal es el caso del mercurocromo,
nombre comercial de la merbromina y usualmente de tinturas hechas con
merbromina y alcohol o agua (merbromina 2 %), la cual es una sal disdica
rgano-mercrica fluorescente, empleada en medicina por sus propiedades
antispticas hace ms de 60 aos.
6
Pocos son los reportes que evidencian su
toxicidad,
6
existe la necesidad de conocer estos daos y buscar componentes
naturales, como alternativas que los contrarresten. Dentro de la gran variedad de
recursos de origen natural y que presenta diversos estudios reportados como
propiedades antioxidantes, est el aceite esencial obtenido de la planta L. alba
(Mill.) N.E. Brown; es un arbusto aromtico que pertenece a la familia
Verbenaceae, originaria de Amrica tropical. Conocida en Colombia como pronto
alivio, entre sus numerosas propiedades teraputicas pueden citarse su utilidad
antiespasmdica, carminativa, digestiva, diurtica, expectorante, laxante, sedante,
somnfera, sudorfica, antimicrobiana, antioxidante, antiulcerosa y
anticonvulsivante.
7-9

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto protector del aceite esencial de L.
alba sobre la toxicidad del mercurocromo, al aplicar la prueba de Allium cepa, por
causa de las numerosas propiedades reportadas de este aceite; adems, estudios
indican que este ensayo es un biomonitor adecuado tanto para el anlisis de
toxicidad como de genotoxicidad.
5

MTODOS
Se emplearon plantas superiores (A. cepa) como sistema biolgico, en las cuales la
observacin de aberraciones cromosmicas constituye el principal mtodo de
anlisis.

Determinacin de la concentracin txica y el efecto genotxico del mercurocromo
en meristemos de Allium cepa. Cultivo celular
Cebollas blancas (A. cepa) de 2,5 cm de dimetro, secas y sin formacin de hojas
y(o) raz, fueron adquiridas y trasladadas al laboratorio para ser sometidas a los
procesos de limpieza y adecuacin correspondientes. Los bulbos fueron colocados
en vasos plsticos transparentes con agua potable, iluminacin directa y

30
temperatura entre 24 y 25 C; se realiz cambio total del agua cada 24 h hasta
culminar el perodo de estimulacin de 72 h, se alcanz as, meristemos radculares
con longitudes entre 1,5 y 2,5 mm.
Prueba toxicolgica
Obtenidas las longitudes de las races deseadas, se constituyeron los grupos de
trabajo: control negativo (agua potable), control positivo (cadmio 22,5 M) y
mercurocromo 0,01, 0,1, 1, 10, 50, 100, 250 y 500 M. El txico empleado
(mercury dibromofluorescein disodium salt), se obtuvo de Sigma Aldrich, cada
ensayo se hizo por triplicado, perodo de experimentacin de 72 h y renovacin
total durante este perodo de las soluciones a evaluar.
Prueba citolgica: fijacin-coloracin-montaje-medicin
pices radiculares de cebolla blanca cortados 2 mm antes de la cofia, se tomaron
en cada intervalo de tiempo correspondiente (24 a 72 h); estos fueron sometidos a
cido clorhdrico 1 N, durante 10 min. Los pices fueron retirados del cido y
colocados en lminas portaobjetos donde les fue agregado a cada uno fucsina
bsica (10 min), se adicion un cubreobjeto para realizar el aplastamiento
mecnico llamado tambin squash y quedaron as listas las preparaciones
citolgicas para ser observadas. Aproximadamente 3 000 clulas se analizaron por
grupo de tratamiento, se determinaron a su vez las fases mitticas y las
aberraciones (fragmentos puentes y cromosomas aislados).
Evaluacin del efecto protector del aceite de Lippia alba
El aceite esencial de L. alba utilizado en este estudio fue suministrado por el Centro
de Excelencia CENIVAM (Universidad Industrial de Santander).
Prueba toxicolgica
Los grupos de trabajo fueron: control negativo (dimetil sulfxido: DMSO), control
positivo (Cadmio: Cd 22,5 M), soluciones de mercurocromo (10 y 500 M) y las
mezclas de mercurocromo (10 y 500 M) ms el aceite de L. alba (100 M).
Anlisis estadstico
Los datos obtenidos de los bioensayos son presentados como las medias error
estndar de la media (SEM), para un mnimo de 3 experimentos realizados por
triplicado. Las medias para los marcadores evaluados en las diferentes
concentraciones utilizadas se compararon mediante ANOVA, previa revisin de la
normalidad y de varianza, con el empleo de Kolmogorov-Smirnov y Barlett. Para
todos los casos el nivel de significacin a utilizar fue p< 0,05.

RESULTADOS
Al evaluar mercurocromo a 10 y 500 M en relacin con el ndice mittico de las
races (Fig. 1), se encontr que tanto a las 24 como a las 72 h de exposicin la
concentracin de 10 M no present diferencia significativa con el control negativo
(DMSO); por el contrario, s se pudo observar un efecto txico del mercurocromo a
500 M.

31
En la figura 2, la solucin de mercurocromo a 500 M no mostr aberraciones, a
diferencia de la concentracin 10 M, la cual present diferencia significativa con el
control negativo. La adicin del aceite (100 M) a mercurocromo de 10 M,
present diferencia significativa comparada con los valores obtenidos para esta
misma concentracin de mercurocromo sin el aceite, tanto a las 24 como a las 72 h
de exposicin.
El efecto protector del aceite esencial de L. alba sobre la toxicidad producida por el
mercurocromo sobre el crecimiento de la raz (Fig. 3), mostr que a las 24 h la
concentracin de 10 M de mercurocromo no present diferencia significativa
cuando se compar con el DMSO, lo cual indic ausencia del efecto txico del
mercurocromo a esta concentracin sobre el crecimiento en longitud de la raz. Sin
embargo, a las 72 h, se present una moderada actividad txica (p< 0,01). Como
se puede observar en la figura 3, al adicionar el aceite se presenta una diferencia
significativa al comparar los resultados obtenidos para el mercurocromo 10 M, con
aquellos obtenidos para la mezcla de mercurocromo 10 M ms el aceite 100 M, lo
cual significa un efecto protector del aceite. Para la concentracin de 500 M de
mercurocromo, una diferencia significativa se observ (p< 0,001) cuando se
compar con el DMSO 0,5 %; se corrobor el efecto inhibidor del crecimiento
producido por el mercurocromo como se indic previamente en este estudio. La
adicin del aceite esencial de L. alba 100 M no produjo diferencia significativa a las
24 h, cuando se compararon los resultados obtenidos por la concentracin de 500
M de mercurocromo solo con los de la mezcla de mercurocromo 500 M ms el
aceite esencial; esto indica ausencia de efecto protector. Sin embargo, a las 72 h s
se present una diferencia significativa que permite sugerir un efecto protector
importante contra la toxicidad del mercurocromo, ejercida por el aceite esencial de
L. alba.
Como se puede observar, los resultados obtenidos a las 24 y 72 h de exposicin de
las races al mercurocromo, antes y despus de adicionar el aceite de L. alba, son
muy similares (Fig. 4). Lo anterior significa que el aceite no incrementa su actividad
protectora a travs del tiempo, en relacin con el peso de la races, a diferencia de
lo que se observ en este estudio para el caso del crecimiento en longitud de estas.

DISCUSIN
De acuerdo con los resultados obtenidos, las alteraciones fsicas como ganchos,
ndulos, formacin de races laterales, adelgazamiento y ablandamiento estas,
encontradas en las races tratadas con mercurocromo a las concentraciones de 10,
50, 100, 250 y 500 M, coinciden con estudios realizados en los cuales fue
empleado cadmio como agente genotxico;
10
lo anterior puede explicarse porque el
cadmio puede ser acumulado por las plantas, principalmente en las races y hojas,
lo cual produce desrdenes en su fisiologa e inhibe el crecimiento y afecta su
morfologa, por competir bioqumicamente con metales esenciales como el Fe
2+
,
Mn
2+
, Zn
2+
y Ca
2+
en la raz, as como disminuye la concentracin de clorofila hasta
60 % en las hojas.
11
Los daos presentados en el peso y la longitud de las races de
A. cepa expuestas a diferentes concentraciones de mercurocromo a lo largo de este
estudio fueron visibles a concentraciones de 10 y 500 M, a diferencia de las races
expuestas al control negativo (DMSO), las cuales mostraron un crecimiento y peso
normal con el pasar del tiempo, de esta manera se corrobor el efecto txico del
mercurocromo sobre su crecimiento; estos resultados permiten establecer
similitudes con reportes de otros autores, quienes establecieron alteraciones con
otras sustancias txicas

en otros cultivos celulares, reflejado por un bloqueo en el
crecimiento de las races de diferentes plantas como el gnero Helianthus,
12


32
Hordeum vulgares,
13
Z. mays.
14
De igual forma, Fusconi report resultados
similares utilizando Cd como agente genotxico, l mostr que este metal caus
una inhibicin en el crecimiento de las races de Pisum sativum, cuando observ su
crecimiento en soluciones de cadmio a 250 M, despus de 24 h de tratamiento.
15

La inhibicin en longitud de las races observadas en este estudio puede explicarse
quizs por mecanismos relacionados con el funcionamiento de la membrana
plasmtica, y que involucran diferentes especies qumicas, todas ellas de
importancia en la fisiologa vegetal, como el cinc (Zn
2+
), magnesio (Mg
2+
) y al
calcio (Ca
2+
). Las bajas concentraciones de iones cinc favorecen un aumento de la
autooxidacin de la membrana plasmtica, rgano en el cual estn ubicados los
principales sitios de selectividad en la adquisicin de cationes y aniones, que
provoca graves perturbaciones del ambiente celular; en consecuencia, dan un
trnsito desordenado de elementos metlicos o metaloides, que conducen
finalmente a la inactivacin de enzimas especficas en la sntesis de protenas y de
ARN,
16
responsables directos del desarrollo de las races.
El anlisis microscpico para las alteraciones cromosmicas realizado a las races de
A. cepa, durante su exposicin a las diferentes concentraciones de mercurocromo,
fueron dadas durante las etapas del ciclo celular correspondientes a la metafase y
anafase, lo cual indica puentes cromosmicos, cromosomas aislados y
fragmentados como los daos genticos ms frecuentes; resultados que se apoyan
en estudios realizados por Lazutka y otros.
17
Posiblemente, los daos genotxicos
identificados en el presente estudio son resultado de la generacin de especies
reactivas de oxgeno, durante las reacciones de reduccin y oxidacin que sufren
los metales pesados en el interior de las clulas y por la interferencia en los
procesos de reparacin y replicacin del ADN.
18
Una vez incorporados estos metales
a los tejidos, se bioacumulan y son capaces de reaccionar con molculas orgnicas,
que presenten en su estructuras grupos sulfhidrlos y, en menor medida, radicales
amino, fosfato, carboxilo, imidazol e hidroxilo, los cuales estn presentes en
enzimas, protenas esenciales y cidos nucleicos.
19
Los resultados expuestos
sugieren que el aceite esencial de Lippia alba ejerce un efecto protector sobre la
disminucin en la presencia de aberraciones cromosmicas, peso y longitud de las
races de Allium cepa expuestas a mercurocromo 10 y 500 M y a Cd

a 22,5 M.
El aceite de L. alba a la concentracin de 100 M, no produjo alteraciones sobre las
clulas meristemticas de A. cepa, a pesar de que para la carvona, componente
principal del aceite, se ha reportado efecto mutagnico dbil en la prueba de Ames.
Por el contrario, disminuy la aparicin de aberraciones cromsomicas (puentes
cromosmicos, cromosomas fragmentados y aislados) y cambios morfolgicos
(adelgazamiento de las races) producidos por la exposicin de clulas
meristemticas de A. cepa a mercurocromo 10 M, lo que indica un efecto protector
o antigenotxico del aceite de L. alba.

AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de Cartagena, CENIVAM-Universidad Industrial de Santander,
COLCIENCIAS.


33
1. Ronco A, Gagnon P, Daz M, Arkhipchuk V. Overview of results from the watertox
intercalibration and environmental testing phase II program: P.1; Statistical
analysis of blind simple testing. J Environm Toxicol. 2002;17:232-40.
2. Arkhipchuk V, Garanko N. A novel nucleolar biomarker in plant and animal cells
for assessment of substance cytotoxicity. J Environ Toxicol. 2002;17:187-94.
3. CETESB. Bioensaios Microbianos Aplicados no Controle de Contaminantes Txicos
Ambientais. Serie Didctica, PROCOP; 1991. p. 1-75.
4. Turkoglu S. Evaluation of genotoxic effects of sodium propionate, calcium
propionate and potassium propionate on the root meristem cells of Allium cepa.
Food Chem Toxicol. 2008;46:2035-41.
5. Yi H, Wu L, Jiang L. Genotoxicity of arsenic evaluated by Allium-root
micronucleus assay. Science Total Environ. 2007;383:232-6.
6. Ayala J, Nieto C, Santana C, Urbn A, Gracias R. Accidental oral mercurochrome
poisoning. Anales de Pediatra. 2000;52:479-81.
7. Stashenko E, Jaramillo B, Martnez J. Comparison of different extraction methods
for the analysis of volatile secondary metabolites of Lippia alba (Mill.) N.E. Brown,
grown in Colombia, and evaluation of its in vitro antioxidant activity. J Chromatogr
A. 2004;1025:93-103.
8. Stashenko E, Jaramillo B, Martnez J. Comparacin de la composicin qumica y
de la actividad antioxidante in vitro de los metabolitos secundarios voltiles de
plantas de la familia Verbenaceae. Rev Acad Colomb Cienc. 2003;27(105):579-97.
9. Pascal M, Slowing K, Carretero E, Snchez D, Villar A. Lippia: traditional uses,
chemistry and pharmacology: a review. J Ethnoparmacol. 2001;76:201-14.
10. Wojcik M, Tukendorf A. Cd-tolerance of maize, rye and wheat seedlings. Acta
Physiol Plant. 1999;21:99-107.
11. Zoghlami L, Djebali W, Chaib W, Ghorbel M. Modification physiologiques et
struc-turales induites par l'interaction cadmium-calcium chez la tomate
(Lycopersicon esculentum). C R Biologies. 2006;329:702-71.
12. Chakravarty B, Srivastava S. Toxicity of some heavy metals in vivo and in vitro
in amsira. Mutation Res. 1992;283:287-94.
13. Zhang Y, Yang X. The toxic effects of cadmium on celldivision and chromosomal
morphology of Hordeum vulgare. Mutation Res. 1994;312:121-6.
14. Andrade L, Campos J, Davide L. Cytogenetic alterations induced by SPL (spent
potliners) in meristematic cells of plant bioassays. Ecotoxicol Environ Saf.
2008;71:706-10.
15. Fusconi A, Repetto O, Bona E, Massa N, Gallo C, Dumas-Gaudot E, et al. Effects
of cadmium on meristem activity and nucleus ploidy in roots of Pisum sativum L. cv
Frisson seedlings. Environ Exp Botany. 2006;58:253-60.
16. WHO. "Methylmercury". Environmental Health Criteria 101. Geneva,
Switzerland: Word Health Organization; 1990.

34
17. Lazutka J, Stapulionyte A, Bjerketvedt D, Odland A. Seasonal variation in the
frequency of abnormal anaphases and mitotic index values in wild populations of
herb-Paris (Paris quadrifolia L., Trilliaceae): implications for genetic monitoring. Mut
Research. 2003;534:113-22.
18. Hartwig A. Current aspects in metal Genotoxicity. Biometals. 1995;8:3-11.
19. Carrascal M, Cano M, Ramos V, Arenas C. Contenidos en As, Cd, Pb, Cu y Zn en
msculo e hgado de liebres (Lepus europaea) capturadas en el corredor verde del
guardiamar. Rev Toxicicol. 2005;22(1):19-25.

Recibido: 27 de octubre de 2009.

Ing. Antonia Paola Vera Ospina. Grupo de Qumica Ambiental y Computacional,
Facultad de Ciencias Farmacuticas, Universidad de Cartagena, Campus
Zaragocilla. Cartagena, Colombia. Correo electrnico: beatrizjaramilloc@yahoo.com

35


36


37


38
ARTCULO ORIGINAL

Estudios preliminares para el establecimiento del
cultivo de Tagetes lucida Cav.

Preliminary studies for Tagetes lucida Cav. culture
establishment

Lrida Acosta de la Luz
I
; Isabel Hechevarra Sosa
II
; Carlos Rodrguez
Ferrad
II

I
Doctora en Ciencias Agrcolas. Investigadora Titular. Centro de Investigacin y
Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Estacin Experimental de Plantas Medicinales
"Dr. Juan Toms Roig". Ciudad de La Habana, Cuba.
II
Tcnico Medio Agrcola. CIDEM. Estacin Experimental de Plantas Medicinales "Dr.
Juan Toms Roig". Ciudad de La Habana, Cuba.

RESUMEN
INTRODUCCCIN: Tagetes lucida Cav. se ha cultivado en Cuba en jardines por la
belleza de su follaje, pero para su explotacin con fines medicinales se requiere
establecer su cultivo.
OBJETIVO: determinar preliminarmente los parmetros agrcolas fundamentales
que brinden la informacin necesaria para orientar los experimentos que
proporcionen la introduccin al cultivo de T. lucida.
MTODOS: propagacin de la especie mediante multiplicacin sexual y asexual por
estacas, establecimiento de los estaquilleros y porcentaje de estacas enraizadas,
as como los relativos al cultivo: determinacin del mtodo de plantacin en
canteros de un 1 m de ancho, colocar 2 y 3 hileras de plantas y distanciamiento
entre ellas de 30 y 40 cm; la evaluacin de las mejores variantes se realiz
mediante los resultados obtenidos en 2 cosechas de follaje. Se llev paralelamente
otro experimento preliminar relacionado con la distancia entre plantas, donde las
estacas enraizadas se colocaron en 2 hileras y el distanciamiento fue de 30 y 50 cm
entre plantas y se evaluaron 6 recolecciones de follaje.
RESULTADOS: las semillas no germinaron, bajo nuestras condiciones, la
multiplicacin de T. lucida se debe efectuar mediante estacas de yemas terminales
obtenidas de ramas jvenes de plantas madres seleccionadas que han sido podadas

39
con anterioridad, con lo que se logran altos porcentajes de estacas enraizadas y
que puedan llevarse a cultivo a pleno sol, en un perodo de 25 a 30 d. Su cultivo
mediante la plantacin de 3 hileras de plantas por canteros con distanciamiento
entre ellas de 30 cm, result la ms adecuada, se determin que en la segunda
cosecha se duplican los rendimientos y que continan incrementndose hasta la
sexta recoleccin, donde los valores comienzan a disminuir y las plantas aparecen
con alta proporcin de tallos lignificados, lo que sugiere se haga una poda baja
buscando obtener nuevos brotes o eliminar la plantacin, aspecto que ser
estudiado ulteriormente.
CONCLUSIONES: estos resultados sirven de base para los experimentos
posteriores con vista a determinar la agrotecnologa de esta especie de inters por
sus propiedades medicinales.
Palabras clave: Tagetes lucida, introduccin a cultivo, agrotecnologa,
multiplicacin sexual, multiplicacin asexual, mtodo de plantacin, distanciamiento
entre plantas.

ABSTRACT
INTRODUCTION: Tagetes lucida Cav. has been cultured in Cuba in gardens due to
the beauty of its foliage, but to exploitation for medicinal aims it is necessary to
establish its culture.
OBJECTIVE: to determine before the fundamental agricultural parameters together
with the necessary information to direct the experiment supplying the introduction
to T. lucida culture.
METHODS: authors used the species spreading by sexual multiplication and
asexual by stakes, the establishing of the stretch with pegs and the percentage of
rooted stakes, as well as the processes relative to culture: determination of 1 m
wide planting in plots, to place 2 and 3 plant rows and a 30 and 40 cm distance
among them; the assessment of the better variants was carrying out by results
obtained in two foliage harvests. In parallel we made another preliminary
experiment related to the distance among plants, where the rooted stakes were
placed in two rows and the distance was of 30 and 50 cm among plants assessing 6
foliage harvests.
RESULTS: under our conditions, seeds no germinate; multiplication of T. lucida
must be carried out by terminal buds stakes obtained from young branches from
the prior pruned selected mother plants achieving high percentages of rooted
stakes that my be cultured in broad daylight during 25 to 30 days. Its culture by
means of three row plantation by plots separated 30 cm was the better method and
authors determined that in the second harvest yields are duplicate and remain
increasing until the sixth harvest, where values decrease and the plants have a high
ratio of lignified sprouts, suggesting the need of a low pruning looking for new buds
or to eliminate the plantation, a feature that will be subsequently studied.
CONCLUSIONS: these results are the basis for latter experiments to determine the
agro-technology of this species due to its medicinal properties.
Key words: Tagetes lucida, introduction to culture, agro-technology, sexual
multiplication, plantation method, distance among plants.


40

INTRODUCCIN
Tagetes lucida Cav., sin. T. florida Swartz, T. schediana Less., de la familia
Asteraceae, es conocida comnmente en Guatemala, Honduras, Mxico, Costa Rica,
entre otros pases, como anisillo, pericn, hierbans, hierba de San Juan. Sus
orgenes se refieren a varias regiones de Mesoamrica, forma parte de la
vegetacin natural en campos abiertos y orillas de bosques de pino y encino; se le
encuentra distribuida desde el noroccidente de Mxico hasta Honduras.
1-3

En las prcticas tradicionales y locales se usan las flores y hojas en infusin, en
diversos problemas gastrointestinales (diarreas, disentera, clicos, flatulencias,
parasitismo intestinal), para aliviar el parto y dolores menstruales, hepatitis,
tratamiento de la anemia e incluso para combatir el paludismo; se adiciona que es
til en afecciones nerviosas.
2,4

Existen reportes sobre estudios etnofarmacolgicos realizados en Mxico, donde se
le menciona como una planta que cura la gente loca y asustada y que fue descrita
por Sahn como una planta que adormece y es usada para el sacrificio de
prisioneros. En las principales fuentes precolombinas de Mxico y Guatemala es
conocida como hierba adivinatoria, medicinal, mstica, religiosa y ms
recientemente como una planta que produce todo tipo de sensaciones, desde
euforia, hasta visiones.
5,6

Estos reportes ms el uso tradicional que se le da en algunos municipios de La
Habana como planta utilizada fundamentalmente con fines sedantes, hizo a los
autores del presente trabajo considerar la posibilidad de su cultivo en el pas para
este empleo.
Aunque la planta se ha cosechado tradicionalmente de forma silvestre en sus
lugares de origen y en Cuba, por la hermosura de su follaje, se ha cultivado a
escala de jardn, se requiere establecer su cultivo para su explotacin con fines
medicinales.
En tal sentido, se propuso realizar algunos experimentos con el cultivo de esta
planta en suelo ferraltico rojo hidratado (Ferralsols), en la Estacin Experimental
de Plantas Medicinales Dr. Juan Toms Roig, y cuyos resultados puedan orientar
hacia donde dirigir los experimentos agrcolas que proporcionen establecer la
agrotecnologa.

MTODOS
Se determinaron aspectos relacionados con la propagacin de la especie:
multiplicacin sexual y asexual por estacas; para el estudio se hizo un semillero en
el local de propagacin de la citada Estacin en marzo de 2007, se utilizaron
semillas provenientes de una planta ya establecida en este local, posteriormente,
en noviembre de 2008 se efectuaron pruebas de germinacin al nivel de
laboratorio, se utilizaron semillas que se sumergieron en agua para emplear las que
fueran al fondo del recipiente
De la misma planta de la que se haban obtenido las semillas se cortaron ramas, se
hicieron estacas de las yemas terminales y de las partes intermedias y se plantaron

41
en estaquilleros, en reas preparadas con zeolita y con tierra solamente; se
mantuvo en un adecuado estado de humedad, riegos frecuentes y ligeros durante
todo el perodo.
Establecimiento de plantas madres
Estacas enraizadas en las naves de propagacin fueron llevadas a campo abierto, a
los canteros del vivero coleccional de la Estacin; a los 6 meses de edad se prob
su utilizacin como plantas madres. Se hicieron estacas de yemas terminales de
plantas madres florecidas y de plantas madres que se cortaron a 10 cm del suelo;
alrededor de los 40 d se tomaron los renuevos para preparar las estacas de yemas
terminales.
Establecimiento de los estaquilleros
Se utilizaron estacas de yemas terminales, las que se plantaron en los meses
siguientes: septiembre y noviembre de 2007; abril, mayo, junio y agosto de 2008;
se evalo el porcentaje de las que enraizaron en cada una de las fechas.
Aspectos relacionados con el cultivo. Determinacin del mtodo de plantacin
En julio de 2007 se plantaron estacas enraizadas, en canteros de 1 m de ancho, a
pleno sol, donde se colocaron 2 y 3 hileras de plantas y distanciamiento entre ellas
de 30 y 40 cm. Para la evaluacin de las mejores variantes se tomaron en
consideracin los rendimientos de 2 cosechas de follaje, la primera efectuada a los
4 meses y medio del trasplante (noviembre de 2007) y la segunda 4 meses
despus (marzo de 2008).
Paralelamente, fue llevado a cabo otro experimento preliminar relacionado con la
distancia entre plantas; el trasplante se realiz el 15 de octubre de 2007 en
canteros de 1 m de ancho dividido en parcelas de 4 m, las estacas enraizadas se
colocaron en 2 hileras y el distanciamiento entre plantas fue de 30 y 50 cm. Se
evaluaron 6 recolecciones de follaje, antes del corte se midieron las plantas para
determinar la altura alcanzada en el perodo.
Una muestra se encuentra depositada en el Herbario de la Estacin Experimental de
Plantas Medicinales ROIG 4781.

RESULTADOS
Aun cuando el suelo del semillero permaneci con suficiente humedad, ninguna de
las semillas germin, solo en las pruebas de laboratorio se alcanz que una semilla
lo lograra, la que haba ido al fondo del recipiente por ser los aquenios ms pesados
y, consecuentemente, tener mayor posibilidad de germinar; las restantes que
quedaron flotando en la superficie resultaron vanas
En relacin con la multiplicacin por estacas, se obtuvo un alto porcentaje de
enraizamiento en cualquiera de los lechos utilizados, pero siempre menor en las
estacas preparadas de las partes intermedias de las ramas.
De igual modo, se observ adems que cuando las estacas se prepararon de
plantas madres florecidas, ms de 83 % no enraizaron, en tanto que cuando se

42
tomaron los renuevos de las plantas madres para preparar las estacas de yemas
terminales, el porcentaje de adaptacin fue de 100 %.
Respecto a los porcentajes de estacas enraizadas en las diferentes fechas en que se
establecieron estaquilleros, se observ que en las de septiembre, casi 100 %
enraizaron; en las de noviembre, alrededor de 85 % de las estacas murieron, las
plantas madres estaban en estado de floracin; en las de abril, tambin alrededor
de 100 % enraizaron, las plantas madres tenan unos 30 d de podadas; en las de
mayo, enraizaron 81 %, las plantas madres tenan aproximadamente 60 das de
podadas; en las de junio, enraiz 96,7 %, se utilizaron renuevos obtenidos de
plantas que llevaban 35 d de podadas, en tanto que en las de agosto, enraiz 64,6
%, las plantas madres presentaban ramas muy lignificadas.
No se llevaron a cabo estaquilleros en el perodo diciembre-marzo (perodo
invernal) porque las plantas madres tenan poco desarrollo y permanecan en
floracin.
En cuanto a los estudios relacionados con el distanciamiento, buscando que esta
planta, la cual es muy ramificada, mantenga su crecimiento erecto, se observ en
el primero de ellos, que las plantas en el momento de las cosechas presentaron
estado de floracin y que alcanzaron una altura promedio entre 46 y 52 cm, y el
rendimiento de follaje fresco como aparece en la tabla 1.

Se determin que los rendimientos se duplican en la segunda cosecha, que hay
mayores rendimientos cuando se utilizan 3 hileras de plantas por canteros y que los
valores de rendimientos muestran pocas diferencias entre los distanciamientos
entre plantas (tabla 1).
En el otro estudio realizado se obtuvieron los resultados que aparecen en la tabla 2.
De forma general se pudo observar que en la segunda cosecha se duplicaron los
rendimientos y continuaron incrementndose hasta la sexta recoleccin, en que
comienzan a disminuir y las plantas aparecen con alta proporcin de tallos
lignificados.

DISCUSIN
En la bibliografa se recoge que la multiplicacin de esta planta es por semillas y
como ellas presentan alto porcentaje de semillas vanas, aproximadamente 85 % y

43
muy bajo porcentaje de germinacin, recomiendan como mtodo para la
reproduccin por semillas hacer su inmersin en agua, para lograr que de 15 % de
las semillas viables seleccionadas se obtenga un porcentaje de germinacin entre
30 y 40 %.
1,4,7

En nuestros estudios se comprob que la especie presenta altos porcentajes de
semillas vanas y que la adecuada propagacin de esta especie se debe realizar de
forma vegetativa, con la utilizacin de estacas de yemas terminales, con lo que se
garantizan altos porcentajes de enraizamiento, hasta de 100 %, en un perodo de
25 a 35 d, si se utilizan renuevos obtenidos de plantas madres que se hayan
podado con anterioridad.
En estudios realizados en Guatemala se hace referencia a su propagacin mediante
estacas tanto de yemas terminales como de partes intermedias, siempre que se
mantengan con adecuada humedad y se obtengan de plantas madres vigorosas,
que hayan sido podadas y luego de 45 a 50 d se hagan las estacas, con lo que han
logrado buen porcentaje de estacas enraizadas en un perodo de 25 a 35 d.
8

Respecto al distanciamiento entre plantas los estudios demostraron que los mejores
resultados se obtuvieron con la plantacin de 3 hileras de plantas por canteros a
distancias de 30 cm; se hace alusin a que en los climas clidos la especie es
propensa al acame cuando para su cultivo se planta con amplias distancias.
8

Desde el punto de vista de la cosecha del follaje, existen reportes donde se
menciona que el primer corte se realice entre los 4 meses y medio y los 5 meses y
medio de establecido el estaquillero; los restantes, alrededor de los 3 meses
despus, en plantas que presenten estado de floracin, porque en esta fase del
desarrollo es cuando muestran mayor acumulacin de los aceites esenciales; se
adiciona que a partir del segundo ao se lleve a cabo una poda de la plantacin,
cortar a unos 5 cm del suelo, para devolverle el vigor a la planta y evitar que se
formen tocones de tallos viejos que demeritan la calidad del material que se
coseche.
1,8
En el estudio donde se analiz el comportamiento del cultivo en 6
recolecciones de follaje se demostr que en la sexta recoleccin comienzan a
disminuir los rendimientos y las plantas aparecen con alta proporcin de tallos
lignificados y, por consiguiente, requieren que se les haga una poda baja para
buscar obtener nuevos brotes o eliminar la plantacin, aspecto que ser estudiado
con posterioridad.
De este estudio preliminar se puede inferir que bajo nuestras condiciones la
multiplicacin de T. lucida no se puede realizar por semillas, sino mediante estacas
de yemas terminales obtenidas de ramas jvenes de plantas madres seleccionadas
que han sido podadas con anterioridad, con lo que se logran altos porcentajes de
estacas enraizadas en un perodo de 25 a 30 d.
Para el establecimiento del cultivo se aconseja que se planten las estacas en 3
hileras por canteros de 1 m de ancho, a pleno sol, con distanciamiento entre
plantas de 30 cm, porque mayores espaciamientos pueden proporcionar un
desarrollo exuberante que acarrea problemas de acame y plantas con mayor
proporcin de tallos y aunque se seala que es un cultivo perenne, bajo
explotacin, es mejor podar la plantacin despus de un determinado nmero de
cortes para obtener un material vegetal de buena calidad, es decir, con poco tallo
lignificado.
Estas recomendaciones sirvieron de base para los experimentos que con
posterioridad se han llevado a cabo con vistas a determinar su agrotecnologa.

44

1. Martnez JV, Cceres A. Agrotecnologa para el cultivo del pericn o hierba de
San Juan. En: Martnez JV, Yesid Bernal H, Cceres A, editores. Fundamentos de
Agrotecnologa de Cultivo de Plantas Medicinales Iberoamericanas. Santaf de
Bogot, Colombia: Convenio Andrs Bello y Programa Iberoamericano de Ciencia y
Tecnologa para el Desarrollo; 2002. p. 451-62.
2. Cceres A. Plantas de uso medicinal en Guatemala. Guatemala: Editora
Universitaria.; 1996. p. 305-7.
3. Germosn-Robineaue L. Farmacopea Vegetal Caribea. Martinico: Ediciones
Emile Dsormeaux; 1997. p. 317-9.
4. Gupta MP. 270 Plantas Medicinales Iberoamericanas. Santaf de Bogot,
Colombia: Editora Presencia Ltda.; 1995. p. 157-60.
5. Linares E, Bye R. A study of four medicinal plant complexes of Mxico and
adyacent US. J Ethnopharmacol. 1987;19:153-83.
6. Linares E, Flores B, Bye R. Seleccin de Plantas Medicinales de Mxico. Mxico:
Ed. Limusa; 1990. p. 68-9.
7. Orellana A. Proyecto Desarrollo Agrotecnolgico de Plantas Medicinales con
potencial en el mercado interno y de exportacin en regiones de la zona Paz.
Informe de Resultados, Fase I. Convenio ICTA-AGEXPRONT-IPP-AID; 2001.
8. Martnez JV, Orellana A. Desarrollo agrotecnolgico de 5 especies de plantas
medicinales silvestres con potencial industrial. El pericn (Tagetes lucida) y orozus
(Lippia dulcis). Informe de presentacin de resultados del ao 1992.
Chimaltenango, Guatemala: ICTA; 1993. p. 8.

Recibido: 3 de diciembre de 2009.

Dra. Lrida Acosta de la Luz.

Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos
(CIDEM). Estacin Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Toms Roig".
Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrnico: lerida@infomed.sld.cu

45


46
ARTCULO ORIGINAL

Determinacin de la fecha de siembra y del mtodo de
plantacin de Artemisia annua L. introducida en Cuba

Determination of sowing date and the plantation method of
Artemisa annua L. introduced in Cuba

Lrida Acosta de la Luz
I
; Carlos Rodrguez Ferrad
II
; Isabel Hechevarra
Sosa
II

I
Doctora en Ciencias Agrcolas. Investigadora Titular. Centro de Investigacin y
Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Estacin Experimental de Plantas Medicinales
"Dr. Juan Toms Roig". Ciudad de La Habana, Cuba.
II
Tcnico Medio Agrcola. CIDEM. Estacin Experimental de Plantas Medicinales "Dr.
Juan Toms Roig". Ciudad de La Habana, Cuba.

RESUMEN
INTRODUCCIN: Artemisia annua L. es una especie originaria de China y Vietnam
de inters medicinal para la produccin de drogas antipaldicas, por lo que resulta
necesario establecer las condiciones de cultivo en Cuba.
OBJETIVO: establecer algunos parmetros agrcolas fundamentales para el cultivo
de A. annua.
MTODOS: se emple el mtodo de siembra y la fecha de plantacin, para lo que
se establecieron semilleros en los meses desde diciembre de 2006 a mayo de 2007;
posteriormente, a los 2 meses de la siembra, las posturas se trasplantaron a
canteros de 1 m de ancho, a pleno sol, y se emplearon 2 variantes: 2 y 3 hileras de
plantas y 60 cm de distanciamiento entre plantas, equivalentes a 6 y 9 plantas/m
2
,
respectivamente. Para evaluar las mejores variantes las plantas se cosecharon 4
meses despus del trasplante, o sea, a la edad de 6 meses; los parmetros
analizados fueron la altura alcanzada en el momento de la cosecha y el rendimiento
de follaje fresco.
RESULTADOS: solamente se lograron los semilleros que se hicieron en los meses
desde diciembre a febrero, con buena germinacin, en un perodo de 10 d. En
cuanto al crecimiento y rendimiento se determin que los mayores valores se
observaron en las plantas cultivadas en diciembre y enero y donde se colocaron 3

47
hileras de plantas/canteros.
CONCLUSIONES: esta lnea de A. annua introducida en Cuba, adaptada al
ambiente tropical vietnamita, bajo las condiciones donde se realizaron los estudios,
proporcion gran adaptabilidad de los semilleros cuando se establecen entre
diciembre y enero, as como un crecimiento vigoroso y rendimiento de biomasa
adecuada cuando se trasplantan a canteros al sol, con densidad de poblacin de
aproximadamente 9 plantas/m
2
, lo que permite hacer su cosecha durante la etapa
vegetativa, a los 6 meses de edad, con altos rendimientos de follaje.
Palabras clave: Artemisia annua, drogas antipaldicas, parmetros agrcolas,
introduccin a cultivo, semilleros, canteros.

ABSTRACT
INTRODUCTION: Artemisa annua L. is a Vietnam and China-original species of
medicinal interest for the anti-paludism drugs begin necessary to establish the
culture conditions in Cuba.
OBJECTIVE: to establish some fundamental agricultural parameters for A. annua
culture.
METHODS: we used the sowing method and the plantation date establishing
seedbeds from December, 2006 to May, 2007; subsequently at 2 months of sowing,
saplings were transplanted to plots of 1 m wide and 60 cm of distance among the
plants, equivalent to 6 and 9 plants/m
2
respectively. To assess the better variants
the plants were harvested 4 months after transplantation, that is, at 6 months old;
analyzed parameters included the height achieved at the moment of harvest and
the fresh foliage yield.
RESULTS: we obtained only those seedbeds processed from December to February
with a good germination during a period of 10 days. Regards the growth and the
yield, we determined that the great values were observed en plants cultured in
December and January and where three rows of plants/plots were placed.
CONCLUSIONS: this species of A. annua introduced in Cuba and adapted to
Vietnamese tropical environment, under conditions where studies were conducted,
supplied a big seedbeds adaptation when they are established between December
and January, as well as a strong growth and yield of the biomass suitable when
seedbeds are transplanted to plots under sunlight, with a population density of
approximately 9 plants/m
2
allowing its harvest during the vegetative stage at 6
months age with high foliage yields.
Key words: Artemisa annua, anti-paludism drugs, agricultural parameters,
introduction to culture, seedbeds, plots.

INTRODUCCIN
Artemisia annua L., Asteraceae, especie medicinal cuyos orgenes se refieren a las
regiones templadas de China, forma parte de su vegetacin natural y crece en
amplias latitudes: templadas, subtropicales y tropicales. La especie tiene gran
empleo en la medicina herbolaria tradicional china, su principal principio activo, una

48
lactona sesquiterpnica, la artemisinina (denominada qinghaousu en los pases
asiticos), es conocida como la responsable de la actividad antipaldica que se le
adjudica al follaje de esta especie.
1

Aunque la planta se ha cosechado tradicionalmente de manera silvestre, se
requiere establecer su cultivo, pues la disponibilidad limitada de artemisinina y la
mayor demanda de drogas antipaldicas potentes ante el incremento de la
enfermedad, han necesitado de su desarrollo. En tal sentido se han realizado
algunas pruebas con el cultivo de esta planta, a partir de la dcada de los ochenta
del siglo xx en la India, EE. UU., Madagascar, Suiza y Brasil; se ha establecido en
gran escala en China y Vietnam. Los estudios han demostrado que la adecuada
seleccin de las lneas que se quieren cultivar y el conocimiento de los mtodos de
cultivo, tomando en consideracin fundamentalmente su ciclo de crecimiento
vegetativo y la cosecha final, son los que ayudan a encontrar resultados
provechosos.
2

MTODOS
En la Estacin Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Toms Roig", ubicada
en San Antonio de los Baos, provincia La Habana, con suelo ferraltico rojo
hidratado (Ferralsols), se realizaron experimentos preliminares que proporcionen su
introduccin a cultivo bajo las condiciones cubanas. En tal sentido, la determinacin
de la fecha de siembra y del mtodo de plantacin de esta planta fueron los
principales parmetros agrcolas estudiados. El nmero de Herbario es ROIG 4782
Las pruebas realizadas sobre la fecha de siembra se hicieron basadas en la
ejecucin de varios semilleros en el local de propagacin de la citada Estacin, en
los meses de diciembre a mayo, donde se utilizaron semillas provenientes de
Vietnam, que tenan altos porcentajes de germinacin, las que se mezclaron con
tierra cernida para su distribucin uniforme; el suelo del semillero permaneci con
suficiente humedad durante la fase de semillero, se mantuvieron riegos frecuentes
y ligeros durante el perodo de germinacin y la fase preliminar de crecimiento; 2
meses despus cuando las plantas estuvieron lo suficientemente robustas las
posturas se trasplantaron al lugar definitivo, a campo abierto.
Para el establecimiento de las plantaciones se hicieron canteros de 1 m de ancho,
los que fueron divididos en pequeas parcelas, se estudiaron 2 variantes de
plantacin: 2 y 3 hileras en cada cantero e igual distancia entre plantas, 60 cm,
equivalentes a 6 y 9 plantas/m
2
,

respectivamente, en cada una de las fechas de
siembra.
La evaluacin de la mejor variante de plantacin se llev a cabo mediante la
cosecha de las plantas a los 4 meses de ser trasplantadas, o sea, a la edad de 6
meses, cuando presentaban estado vegetativo; con anterioridad al corte se
midieron la altura alcanzada por las plantas en cada una de las variantes probadas
y fueron cortadas a unos 30 cm por encima del nivel del terreno.

RESULTADOS
Solo se lograron los semilleros establecidos en los meses de diciembre a febrero,
porque en los restantes, aun cuando por lo general las plantas germinaron, no

49
crecieron y al no alcanzar un desarrollo adecuado no pudieron ser trasplantadas.
Las buenas condiciones de humedad durante este perodo facilitaron que la
germinacin ocurriera alrededor de los 10 d despus de la siembra.
Las posturas llevadas a campo, en canteros a pleno sol, tuvieron un alto porcentaje
de adaptacin, 90 %, en cualquiera de las fechas probadas. La evaluacin de las 3
fechas de siembra: diciembre, enero, febrero, arroj que la altura alcanzada en el
momento de la cosecha fue de alrededor de 1,7 m, en las plantas que provenan de
los semilleros realizados en diciembre y enero, en tanto que en la de febrero fue
algo menor, 1,6 m, lo que repercuti en el rendimiento de masa vegetal que
tambin fue notablemente inferior, 15,9 y 15,4 t/ha en diciembre y enero y solo
9,13 t /ha en febrero (Fig. 1).
En relacin con el estudio sobre el mtodo de plantacin, los resultados
demostraron que donde se plant a 3 hileras por canteros fue donde se alcanz el
mayor crecimiento, con el logro de una altura promedio de 1,71 m, y un
rendimiento de follaje de 15,9 t/ha; en tanto que donde se colocaron 2 hileras de
plantas por canteros, la altura fue de 1,60 m y el rendimiento de follaje de 12,2
t/ha (Fig. 2).

DISCUSIN
Como se observa, la fecha de siembra es una decisin importante, donde se debe
tener en cuenta que la elegida le permita a la planta germinar, crecer y alcanzar un
desarrollo vegetativo vigoroso antes del comienzo de la floracin, etapa en que se
realizaron las cosechas en los experimentos del presente trabajo y de la cual
algunos autores plantean que para la seleccin vietnamita fue donde se obtuvo el
rendimiento mximo.
3-5

En nuestro caso se observ que, al parecer, a partir de febrero no existen las
condiciones climticas apropiadas para efectuar los semilleros.
En relacin con la etapa en la que se realizaron las cosechas, cuando las plantas
tenan edades de 6 meses, o sea, 4 meses del trasplante y presentaban estado
vegetativo antes del comienzo de la floracin, se hace referencia a que este es el
perodo ptimo de recoleccin, porque en esta etapa de desarrollo, el rendimiento
de hojas y el contenido de artemisinina se incrementan gradualmente y despus de
esta etapa disminuye; de igual forma se menciona que con semillas nativas de
Vietnam, en siembras directas efectuadas en enero, a los 6 meses se hizo la
cosecha con plantas en estado vegetativo con los mayores rendimientos.
3-7

En cuanto al mtodo de plantacin, la densidad de poblacin tiene importancia
considerable y determinante en el rendimiento de esta especie, que necesita de
cierta iluminacin para proporcionarle caractersticas agronmicas adecuadas:
plantas vigorosas, de hojas grandes que den lugar a altos rendimientos de material
vegetal, resistencia a las enfermedades y estado de desarrollo deseable para la
regin donde se cultive; se refiere que su plantacin en hileras, utilizando lneas
seleccionadas, ha proporcionado su cultivo con xito y que una densidad de
poblacin equivalente a alrededor de 10 plantas/m
2
es apropiada para esta planta,
lo que se vio reflejado en el presente estudio donde la densidad de plantacin de
aproximadamente 9 plantas/m
2
result la mejor.
2-5


50
De igual modo, el mtodo de plantacin es de inters en cuanto al aspecto prctico
para el control de las malezas, en este caso hubo un mayor control en las parcelas
con 3 hileras de plantas por canteros, porque solamente se realiz un deshierbe al
mes del trasplante y otro cuando las plantas haban emitido las ramas principales,
despus el campo cierra y no requiere de ms limpiezas.
De este trabajo se puede concluir que bajo las condiciones de estudio, en esta lnea
de A. annua adaptada al ambiente tropical vietnamita, se determin:
1. Establecer los semilleros entre diciembre y enero, que posibilita su trasplante en
febrero y marzo, respectivamente, con gran adaptabilidad.
2. Realizar su cultivo en canteros al sol, colocar 3 hileras de plantas y
distanciamientos de 60 cm entre ellas, que equivalen a unos 9 plantas/m
2.
3. Realizar la cosecha de follaje a los 4 meses despus del trasplante, es decir, a
los 6 meses de edad.

1. The Pharmacopoeia Commission of PRC. The Peoples Republic of China.
Pharmacopoeia. Vol 1. Beijing: Chemical Industry Press; 2000.
2. WHO. Monography on good agricultural and collection practices of Artemisia
annua L. Geneva: World Health Organization Publication; 2005.
3. Lauglin JC. Effect of agronomi practices on plant yield and antimalarial
constituents of Artemisia annua L. Acta Hort. 1993;331,53-61.
4. Laughlin JC, Heazlewood GN, Beattie BM. Cultivation of Artemisia annua L. In:
Wright CW, editor. Artemisia Medicinal and Aromatic Plants. London: Industrial
Profiles; 2002.
5. Magalhaes PM. A experimentacao agricola com plantas medicinais e aromticas.
Atualidades Cientificas. 1994;3:31-56.
6. Ferreira JF, Simon JE, Janick J. Artemisia annua: Botany, Horticulture,
Pharmacology. Horticultural Reviews. 1997;19,319-71.
7. Ferreira JF, Simon JE, Janick J. Developmental studies of Artemisia annua:
flowering and artemisinin production under greenhouse and field conditions. Planta
Med. 1995;61:167-70.



51
Dra. Lrida Acosta de la Luz.

Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos
(CIDEM). Estacin Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Toms Roig".
Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrnico: lerida@infomed.sld.cu


52
ARTCULO ORIGINAL

Composicin qumica voltil de Saturej a brownei (Sw.)
Briq. colombiana y determinacin de su actividad
antioxidante

Volatile chemical composition of the Colombian Saturej a
brownei (Sw.) Briq. and determination of its antioxidant
activity

Beatriz E. Jaramillo
I
; Elena Stashenko
II
; Jairo Ren Martnez
III

I
Doctora en Qumica. Campus de Zaragocilla. Programa de Qumica, Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Cartagena. Cartagena, Colombia.
II
Doctora en Qumica. CENIVAM. Escuela de Qumica, Universidad Industrial de
Santander. Bucaramanga, Colombia.
III
Doctor en Qumica. CENIVAM. Escuela de Qumica, Universidad Industrial de
Santander. Bucaramanga, Colombia.

RESUMEN
INTRODUCCIN: las plantas aromticas son una fuente valiosa de aromatizantes
y (o) principios activos en preparados farmacolgicos, cosmticos, aditivos en
alimentos, entre otros. Satureja brownei (Sw.) Briq., (Lamiaceae) se ha usado en la
medicina popular como antigripal, digestiva y carminativa. Especies de Satureja de
varios pases han mostrado composicin variable de su aceite esencial,
particularmente, en sus hojas. As, por la bsqueda de nuevos sabores y efectivos
agentes antioxidantes se determin la composicin qumica voltil de S. brownei
colombiana y su actividad antioxidante.
OBJETIVO: establecer la composicin qumica voltil del aceite esencial, extractos
y fracciones voltiles de hojas y tallos frescos S. brownei (Sw.) Briq., mediante
diferentes tcnicas de extraccin y evaluar la actividad antioxidante de su aceite
esencial.
MTODOS: se emplearon tcnicas destilativas, extractivas y headspace, para aislar
metabolitos secundarios voltiles de hojas y tallos frescos de S. brownei. La
actividad antioxidante in vitro del aceite esencial obtenido fue evaluada al

53
determinar hexanal, el principal compuesto carbonlico, liberado por el cido
linoleico sujeto a peroxidacin y por cuantificacin de este cido como su
metilster; con el uso de cromatografa de gases acoplada a detector de ionizacin
en llama y de captura de electrones.
RESULTADOS: el principal compuesto encontrado en todos los extractos de S.
brownei, fue la pulegona (54-71 %). El aceite esencial present actividad
antioxidante, pero no ms eficiente que la vitamina E y el butilhidroxianisol, ambos
ampliamente utilizados como aditivos.
CONCLUSIONES: la caracterizacin completa de los metabolitos secundarios
voltiles de una planta requiere el uso de varias tcnicas de extraccin. La actividad
antioxidante in vitro de S. brownei, hace de esta planta aromtica una fuente
interesante de antioxidantes naturales y justifica una mayor investigacin en el
aislamiento de las fracciones y(o) los compuestos responsables de ella.
Palabras clave: Satureja brownei (Sw.) Briq., compuestos voltiles, cromatografa
de gases, mtodos de extraccin, actividad antioxidante.

ABSTRACT
INTRODUCTION: the aromatic plants are a valuable source of flavoring and/or
active principles in pharmacological preparations, cosmetic, food additives, etc.
Satureja brownie (Sw.) Brig (Lamiaceae) has been used in the folk medicine as flu
remedie, digestive and carminative. Species of Satureja from several countries
have shown a variable composition of its essential oil, particularly, in their leaves.
Thus, in search of new flavours and antioxidant and effective agents we determined
the volatile chemical composition of Colombian S. brownie and its antioxidant
activity.
OBJECTIVE: to establish the volatile chemical composition of essential oil,
extracts, and volatile fractions of fresh leaves and stems of S. brownie (Sw.) Brig,
by different extraction techniques and to assess the antioxidant activity of its
essential oil.
METHODS: we used distillation, extraction and headspace techniques to isolate the
volatile secondary metabolites from leaves and stems of S. brownie. The in vitro
antioxidant activity of essential oil obtained was assessed by determination of
hexanal, the main carbonyl compound, released by linoleic acid subject to
peroxidation and by quantified method of this acid as its methyl ester using gas
chromatography coupled to in flame ionization detector and of electron capture.
RESULTS: the main compound found in all extracts off S. brownie was the
pulegona (54-71 %). The essential oil had antioxidant activity but not more
efficient than the vitamin E and the butyl-hydroxianisol, both widely used as
additives.
CONCLUSIONS: total characterization of volatile secondary metabolites of a plant
requires the use of some extraction techniques. The in vitro antioxidant activity of
S. brownie becomes interesting source of natural antioxidants and justifies a further
research on fractions isolation and(or) compounds accounting for it.
Key words: Satureja brownie (Sw.) Brig, volatile compounds, gas
chromatography, extraction methods, antioxidant activity.


54

INTRODUCCIN
Satureja brownei Briq., denominada tambin Thymus brownei Sw., Clinopodium
brownei (Sw.) Kuntze, Micromeria brownei (Sw.) Benth, es una planta autctona
que pertenece a la familia Lamiaceae. Se distribuye desde el sur de los EE. UU.
hasta Brasil y Paraguay. Se conoce popularmente como "poleo" y "ajedrea".
1,2

Todas las especies de esta familia contienen aceite esencial, en particular, en sus
hojas. Se usa como condimento, sobre todo de carnes; en la medicina popular se
utiliza como antigripal, carminativo, efecto aperitivo, digestivo, colagogo,
espasmoltico, expectorante, diurtico, antisptico, cicatrizante y repelente de
insectos. Es una hierba semirrastrera, todas las especies de esta familia, en
particular, sus hojas, contienen aceite esencial.
1,2

Por ser de origen natural, la composicin qumica de las esencias vara mucho y
depende de diferentes factores como el mtodo y la duracin de la extraccin, la
temperatura de este proceso, el estado y la procedencia de la planta, y las
condiciones geobotnicas y agrcolas de su cultivo, entre otros.
3-5
El valor
econmico y la aplicacin industrial de las esencias estn directamente relacionados
con su composicin qumica; la que, a su vez, determina todas las propiedades
macroscpicas e.g. fsico-qumicas (olor, color, etc.) y la actividad biolgica.
6,7
Es
por ello, que en esta investigacin se emplearon y compararon varias tcnicas
destilativas y extractivas, como la hidrodestilacin (HD), hidrodestilacin asistida
por la radiacin de microondas (MWHD), destilacin con vapor-extraccin
simultnea con solvente (SDE) y extraccin con fluido supercrtico (SFE); adems,
para analizar la composicin per se de la fragancia de las plantas se emplearon
tcnicas de headspace, dinmico (P&T), esttico (S-HS) y la microextraccin en
fase slida (SPME) en modo headspace.
Muchos aceites esenciales se utilizan en medicina tradicional, aromaterapia,
industrias farmacutica y cosmtica no solo por sus fragancias, tambin por la
actividad biolgica (bactericida, fungicida, antiparasitaria, etc.) que pueden
presentar, entre las cuales se destaca la actividad antioxidante.
7-9
La ltima fue el
objeto del presente estudio, se us un sistema lipdico modelo, para medir el grado
de proteccin, que proporcionan los componentes del aceite esencial de S. brownei
contra la oxidacin del cido linoleico, acelerada por Fe
2+
en presencia de O
2
.

MTODOS
Material vegetal: el material vegetal de S. brownei (Sw.) Briq., fue recolectado en
el rea rural de la ciudad de Bucaramanga, departamento de Santander
(Colombia). Se usaron solamente hojas y tallos frescos en las extracciones.
La identificacin taxonmica se llev a cabo en el Instituto de Ciencias Naturales,
Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia (Bogot). Los pliegos
testigos de cada planta quedaron depositados como muestra permanente en el
Herbario Nacional Colombiano (COL 48751) y fue clasificada por el doctor J. L.
Fernndez.

Extracciones

55
Hidrodestilacin (HD): se realiz con un equipo de destilacin tipo Clevenger, segn
los procedimientos descritos.
10,11
Hidrodestilacin asistida por radiacin de
microondas (MWHD): se realiz las misma tcnica descrita para HD, pero, en vez
de la manta de calentamiento, se us un horno microondas.
12-14

Destilacin con vapor- extraccin simultnea con solvente (SDE): se emple un
equipo a microescala para solventes de alta densidad.
15
Se usaron 10 g del material
vegetal, finamente picado; la duracin de la extraccin fue de 2 h, as como lo
describen Stashenko y otros.
12-18

Extraccin con fluido supercrtico (SFE): se emple un extractor Soxhlet de alta
presin (J&W Scientific, Folsom, CA, EE. UU.) y se aplic la metodologa descrita
por Stashenko y otros.
18,19

Para cada una de las extracciones se inyect 1 L de extracto al cromatgrafo
gaseoso (GC).

Obtencin de fracciones voltiles
Purga de espacio de cabeza con N
2
y trampa en solvente simultnea (P&T): se
realiz en un equipo de extraccin headspace dinmico similar al diseado por
Umano y Shibamoto.
18

El procedimiento de extraccin fue realizado de acuerdo con la metodologa descrita
por Stashenko y otros.
20
1 L del extracto final se inyect al GC.
Headspace esttico (S-HS): se utilizun equipo headspace sampler HP 7694
(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, EE. UU.). Se emplearon los parmetros
operacionales siguientes: temperatura del termostato 40 C, tiempo de equilibrio
de 15 min, temperaturas del loop y de la lnea de transferencia se mantuvieron a
100 y 110 C, respectivamente.
Se usaron 5 g de planta picada, colocada en un frasco de 20 mL; 1 mL de la fase
vapor se inyect a la columna cromatogrfica.
10-12

Microextraccin en fase slida de la fase vapor (headspace) (HS-SPME): se realiz
mediante una fibra de polidimetilsiloxano (PDMS, 100 mm de espesor). Se llev a
cabo la extraccin de voltiles a 22 1 C de la fase vapor de la planta picada (10
g), colocada en un frasco de 50 mL. El tiempo de exposicin de la fibra fue de 60
min (la seleccin de este parmetro se bas en experimentos preliminares). Las
sustancias extradas fueron trmicamente desorbidas a 250 C, durante 5 min, en
un puerto de inyeccin del GC, mediante un liner especial para SPME, de volumen
reducido.
10-12

Determinacin de la actividad antioxidante in vitro
Descripcin general del sistema modelo lipdico: la oxidacin de la emulsin del
cido linoleico fue inducida por iones Fe
2+
en presencia de oxgeno, segn la
metodologa descrita por Tamura y otros.
21
El hexanal, producto final principal de la
degradacin oxidativa del cido linoleico y marcador del avance del proceso de
peroxidacin,
21,22
fue medido por 2 mtodos independientes:

56
1. En solucin, despus de su derivacin con PFPH (pentafluorfenilhidracina) y
extraccin lquido-lquido de la hidrazona, C
6
-PFPH, con hexano, segn la
metodologa descrita por Stashenko y otros.
13,14
2. En fase vapor, mediante la fibra SPME (PDMS/DVB, 65 m), saturada
previamente con PFPH a temperatura ambiente durante 40 min; y la extraccin-
derivacin directa del hexanal sobre la fibra,
23
as como se describe en los trabajos
de Stashenko y otros.
24,25
Todas las mediciones se hicieron por triplicado; se
determinaron parmetros estadsticos, como el promedio (X) y la desviacin
estndar (DE) de los valores obtenidos.
Anlisis cromatogrfico: el anlisis cromatogrfico de las muestras se realiz en un
GC Hewlett-Packard (HP) 5890A Series II, equipado con un puerto de inyeccin
split/splitless (250 C, relacin de split 1:30) y un detector de ionizacin en llama
(FID) (250 C). Los espectros de masas fueron obtenidos por impacto de electrones
con energa de 70 eV, en un cromatgrafo de gases Agilent Technologies 6890 Plus
acoplado a un detector selectivo de masas Agilent Technologies MSD 5973,
equipado con un puerto de inyeccin split/splitless (250 C, relacin split de 1:30),
Las condiciones cromatogrficas usadas se realizaron de acuerdo con la
metodologa descrita por Stashenko y otros.
13,14
Para la identificacin de los
compuestos se usaron algunos terpenos estndar, analizados bajo las mismas
condiciones instrumentales que las muestras, espectros de masas e ndices de
retencin de Kovats de componentes, que se compararon con los reportados en la
literatura.
26-28

La determinacin del hexanal, en forma de su derivado hidraznico, C
6
-PFPH, se
llev a cabo en un cromatogrfo de gases HP 5890 A Series II, equipado con un
detector de captura de electrones (ECD), operado a 280 C, con una mezcla
metano:argn (10 %) como gas auxiliar, a la velocidad lineal de 60 mL min
-1
; con
una columna capilar HP-5 de 30 m x 0,25 mm, DI x 0,25 m, d
f
, con fase
estacionaria de 5 %-fenil-poli(metilsiloxano) y un puerto de inyeccin split/splitless
(250 C, relacin split 1:10). Se us helio (99,995 %, Aga-Fano S.A.), con una
presin de entrada en la cabeza de la columna de 200 kPa y una velocidad lineal de
26 cm.s
-1
.

RESULTADOS
En la figura se muestra un perfil cromatogrfico de metabolitos secundarios
voltiles y semivoltiles del aceite esencial de S. brownei, obtenido por HD.
Como se puede apreciar en la tabla 1, se encontraron 23, 26, 25 y 33 metabolitos
secundarios en los aceites esenciales y extractos de S. brownei en concentraciones
superiores a 0,1 % aislados por las tcnicas HD, MWHD, SDE y SFE,
respectivamente.

Tabla 1. Composicin qumica de los metabolitos secundarios voltiles de Satureja
brownei (Sw.) Briq., obtenidos por diferentes tcnicas de extraccin
I
k
b
Cantidad r Pico
No.
a

Compuesto Tipo
HP-5 Innowax HD MWHD
1 -tuyeno M 928 1 032 0,10 0,04 0,10 0,02

57
2 -pineno* M 937 1 040 0,57 0,04 0,21 0,01
3 Sabineno* M 976 1 128 0,3 0,1 tr
4 trans-p-mentano M 978 1 038 tr tr
5 -pineno* M 982 1 123 0,90 0,01 0,66 0,02
6 3-octanona HO 985 1 310 0,60 0,01 0,50 0,01
7 -mirceno* M 990 1 154 0,50 0,04 0,20 0,01
8 3-octanol HO 995 1 515 0,10 0,01 0,74 0,03
9 p-menta-1(7),
8-dieno
M 1 007 1 186 tr 0,10 0,01
10 Limoneno* M 1 032 1 210 0,8 0,1 0,50 0,02
11 -felandreno M 1 035 1 218 0,11 0,02 tr
12 1,8-cineol* MO 1 037 1 230 0,10 0,05 tr
13 Linalool* MO 1 099 1 504 0,10 0,01 0,20 0,02
14 Mentona MO 1 164 1 470 16,2 0,3 17,7 0,5
15 Isomentona MO 1 171 1 465 2,5 0,3 5,1 0,2
16 Isomentol MO 1 181 1 662 1,6 0,5 2,1 0,2
17 -terpineol* MO 1 186 1 657 0,99 0,02 1,3 0,2
18 Piperitol MO 1 201 1 660 0,1 0,1 0,10 0,06
19 Pulegona* MO 1 235 1 663 71 2 65,5 0,9
20 Piperitona MO 1 261 1 740 0,12 0,01 0,30 0,01
21 Timol MO 1 289 2 105 0,11 0,01 0,35 0,1
22 p-menten-9-ol* MO 1 292 1 736 tr tr
23 Acetato de mentilo MO 1 294 1 543 tr 0,22 0,02
24 Carvacrol MO 1 298 2 161 0,09 0,03 tr
25 Acetato de terpinilo MO 1 346 1 689 tr tr
26 trans--cariofileno* S 1 402 1 612 2,10 0,05 2,20 0,04
27 Geranil acetona MO 1 447 1 655 0,52 0,01 0,58 0,01
28 -humuleno S 1 450 1 669 tr 0,10 0,03
29 allo-aromadendreno S 1 469 1 680 tr 0,10 0,01
30 -selineno S 1 481 1 729 0,26 0,05 0,72 0,03
31 -cadineno S 1 512 1 770 tr 0,12 0,01
32 xido de cariofileno SO 1 598 2 004 tr 0,3 0,1
33 NI

- - tr tr
34 NI

- - tr 0,1 0,1

HO: hidrocarburos oxigenados

0,70 0,02 1,2 0,1

M: monoterpenos

3,3 0,5 2,6 0,1

MT: monoterpenonas

90 2 89 1

MO: monoterpenos oxigenados

3,60 0,02 4,3 0,9

58

S: sesquiterpenos

2,3 0,05 3,20 0,04

SO: sesquiterpenos oxigenados

- 0,4 0,2
HD: hidrodestilacin; MWHD: hidrodestilacin asistida por la radiacin de microondas; SDE:
destilacin con vapor-extraccin simultnea con solvente; SFE: extraccin con fluido
supercrtico; P&T: tcnicas de headspace dinmico; S-HS: tcnicas de headspace esttico;
SPME: microextraccin en fase slida; a: nmero del pico en la figura 1; b: ndice de Kovats
determinados experimentalmente en las columnas HP-5 e Innowax; c: porcentajes
calculados sobre la base de las reas de los picos, promedio de 3 extracciones; *:
identificado por espectrometra de masas usando compuesto estndar; NI: no identificado;
tr: trazas.

Los aceites esenciales obtenidos por HD y MWHD, contenan 23 y 26 compuestos;
con un rendimiento de 0,35 y 0,27 %, respectivamente; la gran ventaja que
present la extraccin por MWHD result en un menor tiempo de destilacin (30
min), en comparacin con el requerido por HD (2 h), para obtener la misma
cantidad de esencia.
El principal compuesto encontrado en todos los extractos de S. brownei fue la
pulegona (54-71 %), identificada por comparacin de su espectro de masas con el
del compuesto patrn. Otros compuestos encontrados en alta proporcin fueron
mentona (16 -32 %), isomentona (3-5 %), isomentol (ca. 2 %) y trans--
cariofileno (2-3 %).
Los extractos de HD, MWHD, SDE y SFE fueron constituidos por hidrocarburos
oxigenados (0,7-1,3 %), monoterpenos, C
10
H
16,
(2-4 %); monoterpenos
oxigenados (91-95 %), sesquiterpenos, C
15
H
24
(2-4 %) y sesquiterpenos
oxigenados (< 0,5 %).
En la tabla 1 se muestra tambin la composicin qumica de las fracciones voltiles
aisladas de las hojas y tallos frescos de S. brownei (Sw.) Briq., mediante las
tcnicas de headspace (P&T, S-HS, HS-SPME). En ellas, 11, 13 y 15 metabolitos
secundarios voltiles fueron detectados en concentraciones superiores a 0,1 %. Los
compuestos fueron -pineno (0,9-9 %), sabineno (<1 %), -pineno (1-8 %),
limoneno (1-2 %), mentona (26-54 %) isomentona (3-25 %), pulegona (7-42 %) y
trans--cariofileno (0,9-3 %).
En la tabla 1 se aprecia que las monoterpenonas resultaron los compuestos
predominantes en todos los extractos.

En la tabla 2 se reportan las mediciones del hexanal en la fase vapor y en la
emulsin del cido linoleico (disminucin relativa de este respecto al blanco), junto
con el porcentaje del cido sin oxidar, el efecto protector del aceite esencial de S.
brownei se incrementa con el aumento de su concentracin en el sistema a las
concentraciones de 2,5-10 g/L hasta un mximo de 53 %, pero no es ms eficiente
que la de vitamina E y butilhidroxianisol, ambos ampliamente utilizados como
aditivos.


59
DISCUSIN
Varias investigaciones han mostrado la variabilidad composicional del aceite
esencial de esta especie. Rojas y otros
29
analizaron el aceite esencial de S. brownei
de Venezuela, reportaron un rendimiento de 0,12 % del aceite esencial y como
compuestos mayoritarios la pulegona (64,3 %), mentona (20,2 %), isomentona
(3,4 %) e isopulegona (2,4 %). Pino y otros
30
estudiaron el aceite esencial de S.
brownei cubana, en este, la pulegona (54,6 %) y la mentona (32,9 %) fueron los
compuestos mayoritarios obtenidos. El principal compuesto encontrado en el aceite
esencial de S. parvifolia, procedente de Argentina
31
fue el xido de piperitona (69,8
%), los de S. boliviana, tambin de Argentina
31
, fueron -terpineno (15,4 %),
trans--cariofileno (10,2 %), germacreno D (8,9 %) y biciclogermacreno (8,3 %).
Mientras que para otras especies peruanas como la S. boliviana y S. brevicalix, los
compuestos mayoritarios fueron la mentona (24 y 36 %) e isomentona (30 y 25
%), respectivamente.
32

Existen diferentes mecanismos por los que se da la actividad antioxidante:
atrapamiento de radicales (scavenging), la interrupcin de la reaccin en cadena de
la peroxidacin, la formacin de quelatos de iones metlicos, aceleradores de la
reaccin, entre otros.
12,33-37

La accin protectora del S. brownei se puede explicar sobre la base en la naturaleza
qumica de los componentes presentes en l. Como ya se mencion, generalmente,
la proteccin de un sustrato contra el deterioro oxidativo, se atribuye a la presencia
de compuestos fenlicos. Sin embargo, teniendo en cuenta que en este caso,
fenoles como el eugenol y el timol se encuentran en cantidades muy bajas, y que
los compuestos mayoritarios son hidrocarburos monoterpnicos y sesquiterpnicos;
se puede suponer que estos tambin pueden actuar como "antioxidantes", aunque
por mecanismos distintos a los que operan los compuestos fenlicos.
En resumen, la actividad antioxidante del aceite esencial de S. brownei, se debe a
que los terpenos presentes en ellos, se oxidan ms rpidamente que el cido
linoleico, es decir, "se sacrifican" primero, de esta manera "protegiendo" el sustrato
lipdico.

AGRADECIMIENTOS
Al Grupo de Investigaciones Agroqumicas de la Universidad de Cartagena y
CENIVAM de la Universidad Industrial de Santander.

1. Garca H. Flora medicinal de Colombia: Botnica mdica. Tomo III. 2da ed.
Bogot (Colombia): Tercer Mundo Editores; 1992. p. 37.
2. Correa JE, Bernal HY. Especies vegetales promisorias de los pases del Convenio
Andrs Bello. Tomo X (Labiatae)., Bogot (Colombia): Editorial Guadalupe; 1989. p.
179-83.
60
3. Oke F, Aslim B, Ozturk S, Altundag S. Essential oil composition, antimicrobial and
antioxidant activities of Satureja cuneifolia Ten. Food Chem. 2009;112 (4):874-9.
4. avar S, Maksimovi M, oli M, Jerkovi-Mujki A, Beta R. Chemical
composition and antioxidant and antimicrobial activity of two Satureja essential oils.
Food Chem. 2008;111(3):648-53.
5. Razzaghi-Abyaneh M, Shams-Ghahfarokhi M, Yoshinari T, Bagher Rezaee M,
Jaimand K, Nagasawa H, et al. Inhibitory effects of Satureja hortensis L. essential
oil on growth and aflatoxin production by Aspergillus parasiticus. Intern. J Food
Microbiol. 2008;123 (3):228-33.
6. Bandoni A. Los recursos vegetales aromticos en Latinoamrica. CYTED. La Plata
(Argentina): Editorial de la Universidad de La Plata; 2000. p. 410.
7. Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D, Idaomar M. Biological effects of essential oils.
A review. Food Chem Toxicol. 2008;46 (2):446-75.
8. Aburjarai T, Natsheh FM. Plants used in cosmetics. Phytotheraphy Res.
2003;17(9):987-1000.
9. Tiziana Barata M, Damien HJ, Deans SG, Fiquereido AC, Barroso JG, Ruberto G.
Antimicrobial and antioxidant properties of some comercial essential oils. Flavour
Fragr J. 1998;13:235-44.
10. Stashenko EE, Martnez JR, Macku C, Shibamoto T. HRGC and GC-MS analysis
of essential oil from Colombian ylang-ylang (Cananga odorata Hook Fil. Et
Thomson, forma genuine). J High Resol Chromatogr. 1993;16:441-4.
11. Combariza MY, Blanco C, Stashenko EE, Shibamoto T. Limonene concentration
in lemon (Citrus volcameriana) peel oil as a function of ripeness. J High Resol
Chromatogr. 1994;17:643-6.
12. Stashenko EE, Jaramillo BE, Martnez JR. Comparacin de la composicin
qumica y de la actividad antioxidante in vitro de los metabolitos secundarios
voltiles de plantas de la familia Verbenaceae. Rev Acad Colomb Cienc.
2003;27(105):579-97.
13. Stashenko EE, Jaramillo BE, Martnez JR. Comparison of different extraction
methods for the analysis of volatile secondary metabolites of Lippia alba (Mill.) N.E.
Brown, grown in Colombia, and evaluation of its in vitro antioxidant activity. J
Chromatogr A. 2004;1025:93-103.
14. Stashenko EE, Jaramillo BE, Martnez JR. Analysis of volatile secondary
metabolites from Colombian Xylopia aromatica (Lamarck) by different extractive
and headspace methods and gas chromatography. J Chromatogr A.
2004;1025:105-13.
15. Godefroot M, Sandra P, Versale M. New method for quantitative essential oil
analysis. J Chromatogr A. 1981;203:325-35.
16. Stashenko EE, Quiroz N, Martnez JR. HRGC/FID/NPD and HRGC/MSD study of
Colombian ylang-ylang (Cananga odorata) oils obtained by different extraction
techniques. J High Resol Chromatogr. 1996;19:359-62.
61
17. Stashenko EE, Cervantes M, Combarza Y, Fuentes H, Martnez JR. HRGC/FID
and HRGC/MSD Analysis of the secondary metabolites obtained by different
extraction methods from Lepechinia schiedeana, and in vitro evaluation of its
antioxidant activity. J High Resol Chromatogr. 1999;22:343-9.
18. Stashenko EE, Acosta R, Martinez JR. High resolution gas chromatographic
analysis of the secondary metabolites obtained by subcritical fluid extraction from
Colombian rue (Ruta graveolens L.). J Biochem Biophys Methods. 2000;43:379-90.
19. Stashenko EE, Puertas MA, Combariza MY. Volatile secondary metabolites from
Spilanthes americana obtained by simultaneous steam distillation-solvent extraction
and supercritical fluid extraction. J Chromatogr A. 1996;752:223-32.
20. Stashenko EE, Macku C, Shibamoto T. Monitoring volatile chemicals formed
from must during yeast fermentation. J Agric Food Chem. 1992;40:2257-9.
21. Tamura H, Yamagami A. Antioxidant activity of monoacylated anthocyanins
isolated from Muscat Bailey a grape. J Agric Food Chem. 1994;42:1612-5.
22. Garca-Llatas G, Lagarda MJ, Romero F, Abelln P, Farr R. A headspace solid-
phase microextraction method of use in monitoring hexanal and pentane during
storage: Application to liquid infant foods and powdered infant formulas. Food
Chem. 2007;101(3):1078-86.
23. Gioti Eleni M, Fiamegos Yiannis C, Skalkos Dimitris C, Stalikas Constantine D.
Improved method for the in vitro assessment of antioxidant activity of plant
extracts by headspace solid-phase microextraction and gas chromatographyelectron
capture detection. J Chromatogr A. 2007;1152(1-2):150-5.
24. Stashenko EE, Puertas MA, Salgar W, Delgado W, Martnez JR. Solid-phase
microextraction with on fibre derivatisation applied to the analysis of volatile
carbonyl compounds. J Chromatogr A. 2000;886:175-81.
25. Stashenko EE, Puertas MA, Martnez JR. SPME determination of volatile
aldehydes for evaluation of in vitro antioxidant activity. Anal Bioanal Chem.
2002;373:70-4.
26. Davies NW. Gas chromatography retention indices of monoterpenos and
sesquiterpenes on methyl silicone and carbowax 20M phases. J Chromatogr A.
1990;503:1-24.
27. Adams RP. Identification of essential oil components by gas
chromatography/mass spectrometry. Carol Stream (Illinois): Allured Publishing
Corporation; 1995. p. 469.
28. Joulain D, Knig W. The atlas of spectral data of sesquiterpene hydrocarbons.
Hamburg: E.B.-Verlag; 1998. p. 658
29. Rojas LB, Usubillaga A. Composition of the Essential Oil of Satureja brownei
(Sw.) Briq. from Venezuela. Flavour Fragr J. 2000;15:21-2.
30. Pino J, Estarron M, Fuentes V. Essential Oil of Satureja brownei grown in Cuba.
J Essent.Oil Res. 1997;9:595-6.
62
31. Viturro CI, Molina A, Guy I, Charles B, Guinaudeau H, Fournet A. Essential oils
of Satureja boliviana and S. parvifolia growing in the region of Jujuy, Argentina.
Flavour Fragr J. 2000;15:377-82.
32. Senatore F, Urrunaga S, Urrunaga R, Della Port G, De Feo V. Essential oils from
two Peruvian Satureja species. Flavour Fragr J. 1998;13:1-4.
33. Foti MC, Ingold KU. Mechanism of inhibition of lipid peroxidation by g-terpinene,
an unusual and potentially useful hydrocarbon antioxidant. J Agric Food Chem.
2003;51:2758-65.
34. Damien-Dorman HJ, Surai P, Deans SG. In vitro antioxidant activity of a
number of plant essential oils and phytoconstituents. J Essent Oil Res.
2000;12:241-8.
35. Ruberto G, Baratta MT. Antioxidant activity of selected essential oil components
in two lipid model systems. Food Chem. 2000;69:167-74.
36. Rontani JF, Nassiry M, Mouzdahir A. Free radical oxidation (autoxidation) of -
tocopherol (vitamin E): A potential source of 4, 8, 12, 16-tetramethylheptadecan-4-
olide in the environment. Organic Geochem. 2007;38(1):37-47.
37. Roginsky V, Lissi EA. Review of methods to determine chain-breaking
antioxidant activity in food. Food Chem. 2005;92(2):235-54.


Dra. Beatriz E. Jaramillo. Campus de Zaragocilla, Programa de Qumica, Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Cartagena. Cartagena, Colombia.
Telefax: 57-5-6698180. Correo electrnico: beatrizjaramilloc@yahoo.com
63

64
SECCCIN INFORMATIVA

WHO Congress Passes Beijing Declaration on
Traditional Medicine

Lindsay Stafford
HerbalEGram Managing Editor; HerbalGram Writer/Assistant Editor. American
Botanical Council. Austin TX.

In November 2008, attendees at the first-ever World Health Organization (WHO)
Congress on Traditional Medicine adopted the Beijing Declaration. Heralded as the
most significant outcome of the Congress, the Declaration promotes the safe and
effective use of traditional medicine (TM), while guiding and supporting its
integration into national healthcare systems around the world.
1

"The Declaration may be World Health Organization's most significant initiative on
traditional medicine to date", said Ryan Abbott, a researcher at the University of
California at Los Angeles (UCLA) Center for EastWest Medicine, who attended the
Congress as a member of the WHO Secretariat and is a former member of WHO's
TM team (oral communication, May 8, 2009). "More than ever now, many countries
are promoting progressive policies towards alternative medicine. I don't think you
would have seen something like the Declaration 10 years ago".
The Declaration suggests for the governments of WHO Member States to do the
following:
1

respect, preserve, promote, and communicate TM;
create national policies, regulations, and standards within the national health
system to ensure safe and effective use of TM;
integrate TM into national health systems;
further develop TM based on the "Global Strategy and Plan of Action on Public
Health, Innovation, and Intellectual Property", adopted at the 61
st
World Health
Assembly in 2008;
2
establish systems for the qualification, accreditation, or licensing of TM
practitioners;
strengthen communication between conventional and TM providers and establish
training programs for health professionals, medical students, and researchers.
Six months after the Beijing Declaration was adopted, a resolution on TM was
passed by the 62
nd
World Health Assembly (WHA), the supreme decision-making
65
body for WHO.
3
The resolution is heavily based on the Beijing Declaration,
acknowledged the Declaration in its text, and calls for Member States to consider
adopting and implementing the Declaration in accordance with their own national
capacities, priorities, relevant legislation, and circumstances, said Xiaorui Zhang,
MD, the coordinator of WHO's TM Program (oral communication, June 8, 2009).
"Since the resolution was adopted by all Member States during the WHO Health
Assembly in May 2009, it is more powerful than the Declaration, which was agreed
upon by the representatives of 74 countries", Dr. Zhang added.
WHO has a 3-decade history with TM, including the historic 1978 Alma-Ata
Declaration, which was the organization's first recognition of TM's importance and
how it affects primary healthcare.
4
WHO further validated the importance of TM by
recognizing in 1993 that as much as 80% of the world's population relies primarily
on TM,
5
and the organization has published various guidelines and monographs
concerning quality, safety, and efficacy of medicinal plants and herbal preparations
over the years.
6,7

Still, the Beijing Declaration stands out among other components of WHO's TM
history, said Gerry Bodeker, a senior clinical lecturer in public health at Oxford
University, chair of the Oxford-based Global Initiative For Traditional Systems
(GIFTS) of Health, and co-editor of the 2005 WHO Global Atlas of Traditional,
Complementary and Alternative Medicine (e-mail, June 2, 2009). The 2008 Beijing
Declaration advances the most comprehensive set of policy recommendations that
go beyond the clinical emphasis of previous positions, he said.
In order for the Declaration's policies and practices to become entrenched and
endure, further actions are needed, such as the regulation of TM practices and
practitioners, adequate financing, and TM economic research, said Bodeker. Though
WHO has great influence, it does not have authoritative powers, requiring any
outcomes of the Declaration to result from a range of actions from governments,
non-governmental organizations, TM practitioners and associations, and
international networks, he said.
"Ultimately, the ball is back in the court of national governments to make the big
decisions to mainstream and fast trackor nottraditional medicine and integrative
healthcare", said Bodeker. "What is certain is that the Declaration urges those
governments that are lagging in their development of this field to move ahead to
catch up with the rest of the world".
Some nations are taking the initiative to proceed. The State Council of China
announced on April 21, 2009, the "Guidance to Support and Promote the
Development of Traditional Chinese Medicine (TCM)", which requests that TCM
services be included in all levels of health services and covered by all kinds of
health insurance.
8
The State Council also requested that the country's TCM
pharmaceutical industry be improved and that all levels of local government
increase investment in TCM public hospitals and support research and training of
TCM doctors, said Zhu Haidong, who works in the Department of International
Cooperation of State Administration of TCM (e-mail, June 11, 2009).
Other entities have not necessarily changed their actions as a direct response to the
Declaration but are continuing with TM-related programs already in place or being
planned. The Japan-based Nippon Foundation, for example, is an important partner
of WHO's TM department and has several TM-related projects underway, such as its
collaboration with governments of countries like Myanmar and Thailand to distribute
TM kits.
9
Nippon's future projects include a 5-year collaboration with the
66
Association of Southeast Asian Nations (ASEAN) Secretariat for the promotion of TM
throughout the region, as well as the creation of curriculum and funding for
Cambodia's first TM school.
"The Declaration itself does not affect our projects", said Tatsuki Nakajima, who
oversees Nippon's TM program (e-mail, May 11, 2009). "Instead, the Declaration
could prove to be the meaning of our projects".
Additionally, for the African Region of WHO, which is mid-way through the African
Decade for the Development of Traditional Medicine, the Beijing Declaration further
reinforces their commitment to make TM a priority within the context of rational
use, safety, and professional development, said Bodeker.
The National Center for Complementary and Alternative Medicine (NCCAM), a
division of the National Institutes of Health in the United States and a WHO
collaborating center for TM, also feels that its projects are in accordance with the
Declaration. Jack Killen, Jr., MD, deputy director of NCCAM, noted that the
Declaration calls for research to develop an evidence base for complementary,
alternative, and traditional medicine (e-mail, May 22, 2009).
"In this regard, the Declaration is entirely consistent with the existing mission,
programs, and operations of NCCAM", said Dr. Killen, adding that NCCAM's research
informs policy and healthcare coverage decisions made by governmental and
corporate entities.
Though the Declaration is an advocacy document and cannot require countries to
act, it will influence future TM negotiations at WHO, said UCLA's Abbott. Abbott
added that he expects it might take years before WHO would require member
countries to commit themselves to certain activities.
"This may be the first step to something like a legally-binding agreement".
A compulsory agreement would call for great motivation and initiative from Member
States, and as far as he knows, there is no push for such a commitment, said
Abbott. Part of this is due to complicated issues, such as TM regulation, groups'
rights to protect their natural resources, and intellectual property rights, on which
developed and underdeveloped countries tend to disagree, he continued.
10

Future promotion of TM by WHO, however, will have to come about under new
leadership. Dr. Zhang, who has been the leader of WHO's TM program for nearly 20
years, will soon retire. Dr. Zhang maintains her strong belief in TM and the
importance of an integrative relationship between TM and Western medicine.
"I was a `barefoot doctor' in a rural area for 5 years. I used herbs and acupuncture
on the patients and I've seen it work", Dr. Zhang said. "I have big hopes for
traditional medicine because the people need it and it works. We need to do more
research on its safety, efficacy, and quality to ensure that the patient benefits".

References
1. Beijing Declaration. World Health Organization Web site. [cited 29 Apr 2009]
Available at: http://www.wpro.who.int/china/sites/hsd/beijing_declaration.htm
67
2. World Health Organization. Sixty-first World Health Assembly. Global strategy
and plan of action on public health, innovation and intellectual property. WHA
61.21. Agenda Item 11.6 [cited 24 May 2008][accessed 20 Dec 2009]. Available at:
http://www.who.int/phi/implementation/phi_globstat_action/en/index.html
3. World Health Organization. Sixty-second World Health Assembly. Traditional
Medicine. WHA 62.13. Agenda Item 12.4 [cited 22 May 2009][accessed 20 Dec
2009]. Available at: http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/A62/A62_R13-en.pdf.
Spanish version available at:
http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/A62/A62_R13-sp.pdf
4. Background of WHO Congress on Traditional Medicine. World Health Organization
Web site [Accessed 29 Apr 2009]. Available at:
http://www.who.int/medicines/areas/traditional/congress/congress_background_inf
o/en/index.html
5. WHO/IUCN/WWF. Guidelines on Conservation of Medicinal Plants. Switzerland:
International Union for the Conservation of Nature, Geneva: WHO; 1993.
6. Akerele O. Summary of WHO guidelines for the assessment of herbal medicines.
HerbalGram. 1994;28:13.
7. Herbal monographs. HerbalGram. 1997;40:30.
8. China introduces traditional medicine into basic healthcare program. Xinhua
News Agency [cited 7 May 2009][accessed 11 May 2009]. Available at:
http://news.xinhuanet.com/english/2009-05/07/content_11332281.htm
9. Sasakawa Y. World Congress speech. Lecture presented at: World Health
Organization Congress on Traditional Medicine; November 79, 2008; Beijing, China.
10. Abbott R. The Beijing Declaration: A landmark for traditional medicine..
International Centre for Trade and Sustainable Development. Bridges Monthly.
2009;13(1). Available at: http://ictsd.org/news/bridges/

Recibido: 5 de enero de 2010.

Dr. Lindsay Stafford. HerbalEGram Managing Editor; HerbalGram Writer/Assistant
Editor. American Botanical Council. Austin TX. (512) 926.4900 ext. 122. E-mail:
lindsay@herbalgram.org

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