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LABORATORIO DE ANLISIS DE ALIMENTOS

PRCTICA # 8
TCNICAS ANALTICAS PARA LA CUANTIFICACIN
DE COMPONENTES QUMICOS DE FRUTAS Y HORTALIZAS
DETERMINACIN DE AZCARES
INTRODUCCIN
En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los
componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azcares, almidones,
celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas.
Los azcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan
especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y
se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los
polisacridos ue conforman el material estructural y las gomas son productos de
desecho. !radicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia,
te"tura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos
de calidad los carbohidratos desempe#an un papel relevante, por ejemplo, el
sabor est dado bsicamente por un balance entre azcares y cidos orgnicos.
El sabor caracter$stico de y diferente de las frutas se debe a la gran variaci%n en
composici%n y concentraci%n de los azcares; el color atractivo se debe
principalmente a los gluc%sidos &antocianinas y anto"antinas' y la firmeza est
determinada por los polisacridos estructurales.
Es importante se#alar ue las proporciones de los diversos carbohidratos
e"istentes en las frutas pueden e"perimentar modificaciones como consecuencia
de la actividad metab%lica, ya ue durante la maduraci%n se producen cambios
intensos en donde los azcares son los sustratos preferidos para la bios$ntesis y
suministro de energ$a pues son o"idados &v$a gluc%lisis' hasta cido pirvico, el
cual a su vez, por descarbo"ilaci%n o"idativa se convierte en (cetil)*o( ue se
metaboliza, v$a ciclo de +rebs, dando lugar a la formaci%n de *,
-
, .
-
, y
E/E012( la cual ueda disponible para la bios$ntesis de otros componentes &otros
azcares, cidos orgnicos, cido asc%rbico, prote$nas, nucle%tidos azucarados,
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gluc%sidos, etc.'. 3urante todo este proceso, el contenido de azcares aumenta
casi invariablemente bsicamente por hidr%lisis ue e"perimentan los
polisacridos, aunue algunos azcares sean utilizados como sustratos para la
actividad respiratoria.
3ada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios
m4todos para su determinaci%n5 6ehling, 7enedict, Somogy, Lane)Enyon,
.agerdorn).ensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio5
!odos los azcares con un grupo aldeh$do libre o un grupo cet%nico se
clasifican como azcares reductores y se transforman fcilmente en enedioles
&reductonas' al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son
altamente reactivos y se o"idan fcilmente en presencia de o"$geno u otros
agentes o"idantes, por lo tanto, los azcares en soluci%n alcalina rpidamente
reducen iones o"idantes como (g
8
, .g
8
, *u
-8
y 6e&*/'
9
:)
y los azcares se o"idan
formando mezclas complejas de cidos. Esta acci%n reductora es la ue se utiliza
tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.
;na de las t4cnicas anal$ticas ms potentes consiste en determinar la
cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiaci%n absorbida
por la misma. Esta t4cnica se llama Espectrofotometr$a. Se puede utilizar el
espectrofot%metro para determinar la longitud de onda de la radiaci%n necesaria
para las determinaciones de la cantidad de azcar en las muestras bajo estudio,
comparndola despu4s con la radiaci%n absorbida por un blanco. La regla
espec$fica ue relaciona la cantidad de radiaci%n absorbida por una substancia
con la concentraci%n de esa misma substancia se llama Ley de 7eer y se puede
establecer como sigue5
Log <o = abc
<
En donde5
<o = 0adiaci>n incidente o radiaci>n transmitida por el blanco.
< = 0adiaci>n transmitida por la muestra.
Log <o = absorbancia de la muestra
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<
En donde5
a = coeficiente de absorbancia &absortividad' ? las unidades dependen de las
unidades utilizadas para la determinaci>n de la concentraci>n.
b = longitud de la celda usualmente en cent@metros.
c = concentraci>n de la muestra en las unidades apropiadas.
<
En esta prctica se emplear la t4cnica colorim4trica de /elson y !ing para
determinar glucosa, fructosa y sacarosa.
OBJETIVOS
El estudiante e"plicar por escrito el fundamento del m4todo empleado para
la determinaci%n de azcares en las muestras de frutas ue se le asignarn.
El estudiante relacionar los contenidos de azcares determinados en las
muestras de diversos frutos.
El estudiante se concientizarA del concepto y los instrumentos de medici>n
utilizados en la espectrofotometr@a, y de la aplicaci>n de curvas estAndar utilizando
el mBtodo de /elson y !ing.
MATERIAL
9 matraces volum4tricos de CDD ml con tap%n.
- matraces volum4tricos de EDD ml con tap%n.
- matraces volum4tricos de -ED ml con tap%n.
C embudo de vidrio.
- matraces Erlenmeyer de C-E ml.
9 pipetas de CD ml.
- pipetas de C ml.
- pipetas de E ml.
- vasos de precipitados de -ED ml.
C ba#o Far$a simple.
E celdas de espectrofot%metro.
C gradilla.
- c$rculos de CD cm de dimetro de papel filtro Ghatman H C.
Iapel sanitario blanco &proporcionado por el estudiante'.
(lgod%n o gasa .
C cuchillo de cocina &proporcionado por el estudiante'.
C tabla para cortar la fruta &proporcionada por el estudiante'.
6ruta5 : ejemplares por especie por euipo. En el caso del mel%n con C
ejemplar basta &proporcionados por el estudiante'.
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EQUIPO:
C e"tractor de jugos.
C licuadora o mortero.
C potenci%metro.
C ba#o Far$a con control de temperatura y agitaci%n.
C espectrofot%metro Spectronic -DJK a ECE nm.
REACTIVOS
Soluci%n alcalina de 6erricianuro.
Soluci%n de (rsenomolibdato &-E g'.
.
-
S,
L
-/.
/a,. CD/, C/ y D.C/.
.*l C5C &MolNMol'.
/a
-
*,
:
anhidro. &C-.E g' %
/a
-
*,
:
monohidratado. &CL.: g'.
!artrato de potasio &C-.: g'.
/a.*,
:
&CD g'.
/a
-
S,
L
anhidro disuelto en :EO ml de agua destilada.
*uS,
L
P E.
-
, disuelto en ED ml. de .
-
,.
1lucosa &:DD QgNml'.
MTODO
I0EI(0(*<R/ 3E 0E(*!<M,S
R!"#$%& ' N()&* A.) 3isuelva C-.E g /a
-
*,
:
anhidro &% CL.: g /a
-
*,
:
P .
-
,', C-.: g de tartrato de potasio, CD g de /a.*,
:
y CDD g de /a
-
S,
L
anhidro
en :ED ml de .
-
, y afore a EDD ml.
R!"#$%& ' N()&* B.) 3isuelva S.E g de *uS,
L
P E.
-
, en ED ml. de .
-
,
y a#ada una gota de .
-
S,
L
.
R!"#$%& A("!($*& ' N()&*.) Fezcle -E ml del reactivo de /elson ( 8
C.D ml. del reactivo de /elson 7.
C+,%! ' (! -(+"&)!.) Elaborar una soluci%n stocT de glucosa en agua
ue contenga :DD QgNml. Ireparar una serie de diluciones desde :DD hasta :D
QgNml.
R!"#$%& ' A,)*&.&($/'!#&.) 3isuelva -E g de &/.
L
'
9
Fo
S
,
-L
P L.
-
,
&molibdato de amonio tetrahidratado' en LED ml. de agua destilada.
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I0,*E3<F<E/!, I(0( L( 3E!E0F</(*<R/ 3E (UV*(0ES 0E3;*!,0ES
!,!(LES
Irepare una serie de diluciones a partir de la soluci%n stocT de glucosa.
Las concentraciones debern ser de :DD, CED, SE y :D QgNml. ;tilice matraces
volum4tricos aforados con tap%n y mruelos con la concentraci%n
correspondiente.
1. Iipetee C ml. de cada soluci%n estndar de glucosa y agua destilada como
blanco en tubos de ensayo con capacidad de -E ml. aforados.
2. (#ada C ml. de reactivo alcalino de /elson.
3. Fezcle. *ol%ue los tubos en un ba#o de agua hirviendo durante -D minutos y
enfr$elos al chorro de agua fr$a.
4. (#ada C ml. de arsenomolibdato.
5. Fezcle bien por un per$odode E min. &para disolver el *u
-
, para reducir el
aresnomolibdato'.
6. (fore a -E ml. con agua destilada y mezcle.
7. Lea la absorbancia a E-D nm.
1raf$ue la absorbancia contra la concentraci%n &QgNg'. ;tilice esta curva
estndar para determinar la concentraci%n de glucosa en las muestras de
frutas.
I0EI(0(*<R/ 3E L(S F;ES!0(S I(0( L( 3E!E0F</(*<R/ 3E
(UV*(0ES 0E3;*,0ES !,!(LES
C.) E"traiga el jugo de la fruta asignada mediante un e"tractor de jugos.
-.) 3iluya el jugo de la muestra con agua destilada &C5LW'.
:.) *ol%ue E ml. del jugo diluido en un matraz volum4trico de -ED ml. y afore con
agua destilada.
3E!E0F</(*<R/ 3E (UV*(0ES 0E3;*!,0ES !,!(LES
C.) !ransfiera C ml. del jugo diluido a un matraz volum4trico aforado de CDDml. y
a#ada E ml. de reactivo de ferricianuro.
-.) *ol%ue los matraces en un ba#o de agua hirviendo por CD minutos.
:.) Enfr$e los matraces inmediatamente bajo el chorro de agua fr$a.
L.) /eutralice el contenido de los matraces con CD ml. de soluci%n de cido
sulfrico -/.
E.) Fezcle los contenidos de los matraces suavemente hasta ue no emanen ms
gases.
9.) (#ada L ml. de arsenomolibdato.
S.) Fezcle una vez ms el contenido de los matraces.
X.) (fore a CDD ml. con agua destilada.
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W.) !ome una celda del espectrofot%metro y transfiera ah$ el contenido de cada
matraz &uno por celda'.
CD.) Efecte la lectura en el espectrofot%metro a E-D nm. El blanco constar de
todos los reactivos antes mencionados, e"cepto la muestra de jugo de fruta bajo
estudio. /o olvide ajustar el espectrofot%metro con agua destilada al principio.
*YL*;L,S5
( partir de la curva estndar se calcula el valor T para la determinaci%n de
azcares reductores totales mediante la siguiente f%rmula5
T = cNa
En donde5
T = El factor por unidad de absorbancia o pendiente de la curva.
c = *oncentraci%n de azcares reductores en gramosNCDD ml.
a = (bsorbancia de la soluci%n a esa concentraci%n.
Los valores T a diferentes concentraciones de azcar se promedian y se
designan como +. El contenido total de azcares reductores, S, de la muestra se
calcula de la f%rmula5
S = +.(.3.
En donde5
S = *oncentraci%n total de azcares reductores de la muestra en
gramosNCDD ml de jugo.
+ = Iendiente promedio de la curva.
3 = 6actor de diluci%n.
3E!E0F</(*<R/ 3E 60;*!,S(
NOTA: E)#! '#,.$*!"$0* *& ) ,!($1!,2 * )#! ))$0* ' (!/&,!#&,$&34
(l calentar una mezcla de glucosa y fructosa a cierta temperatura ) eg.,
EEZ* ) con el reactivo alcalino de ferricianuro, la velocidad de o"idaci%n de la
glucosa es considerablemente menor ue la de fructosa. El resultado obtenido es
conocido como fructosa aparente. [sta es ligeramente ms alta ue el contenido
real de fructosa en la muestra, la cual puede ser calculada usando las f%rmulas
adecuadas. El procedimiento para la determinaci%n de esta fructosa aparente es
el mismo ue para el clculo de los azcares reductores totales, e"cepto ue se
cambia la temperatura y el per$odo de calentamiento a EEZ* por :D minutos.
Los valores de +
f
y +
g
de fructosa y glucosa respectivamente, o"idados a
EEZ* se obtienen a partir de las curvas estndar de estos dos azcares, de la
forma descrita para +. La proporci%n de +
g
a +
f
% \ se utiliza para el clculo real
de glucosa y fructosa de la muestra con las siguientes ecuaciones simultneas5
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1 8 6 = S
1N\ 8 6 = L
En donde5
1 = Iorcentaje de glucosa en la muestra.
6 = Iorcentaje de fructosa en la muestra.
S = Iorcentaje de azcares reductores totales &Suma de 1 y 6'.
L = Iorcentaje aparente de fructosa.
\ = Iroporci%n entre +
g
y +
f
&+
g
N+
f
'
En una mezcla de glucosa y fructosa se asume ue ambos azcares
presentes son fructosa. La fructosa aparente L se calcula a partir de la f%rmula S
= +.(.3., sustituyendo L por S y +
f
por +. Se obtiene la siguiente f%rmula para el
porcentaje de glucosa en la muestra5
1 = &S ) L' ] \
\)C
El cociente N&\)C', se utiliza como una constante en los clculos del valor
real de la glucosa. El valor real de la fructosa se obtiene por diferencia.
3E!E0F</(*<R/ 3E (UV*(0ES !,!(LES ^ S(*(0,S(
N&#!: E)#! '#,.$*!"$0* *& ) ((%!,2 ! "!/& * )#! ))$0* ' (!/&,!#&,$&3
La sacarosa de la muestra es invertida con el cido clorh$drico. El
procedimiento se describe a continuaci%n5
C.) Se colocan EDml. del jugo diluido en un vaso de precipitados de CED ml. y se
a#aden CD ml. de cido clorh$drico &C5C'.
-.) Se deja reposar esta mezcla durante CX horas a temperatura ambiental.
:.) Se a#aden E ml. de soluci%n de hidr%"ido de sodio CD/ y los contenidos se
ajustan a un p. de entre E y S con una soluci%n de hidr%"ido de sodio C/
mediante el uso de un potenci%metro.
L.) Los contenidos se transfieren a un matraz volum4trico aforado de CDDml y se
afora con agua destilada.
E.) Se toma una al$cuota de C ml de esta soluci%n y se pipetea en un matraz
volum4trico de CDD ml. y se sigue el procedimiento descrito para la determinaci%n
de azcares reductores totales.
9.) Se calcula la cantidad de sacarosa de la diferencia entre el contenido de
azcares reductores antes y despu4s de la inversi%n, multiplicada por el factor de
D.WE.
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Elabore un reporte comparando los diversos valores obtenidos para cada
especie de futas estudiadas en la sesi%n de laboratorio.
*;ES!<,/(0<,5
C.) _Ior u4 la sacarosa no se considera como un azcar reductor`
-.) _Iara u4 se utiliza el cobre en el reactivo de /elson`
BIBLIO-RAFIA:
(.,.(.*. ,fficial Fethods of (nalysis. CWXD. .oraitz G. &ed'. Ed. C:
th
.
Gashington, ;.S.(.
!ing, S.M. CWE9. 0apid *olorimetric Fethods for Simultaneous
3etermination of !otal 0educing Sugars and 6ructose in *itrus buices. (gric. 6ood
*hem. Mol. L&:' -9:)-99.