INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA,

UNAM
CROMATOGRAFA
Curso de Mtodos
Romero Garca Aida Susana
Semestre 2/2002
Historia de la Cromatografa.
1848 Way y Thompson: Reconocieron el fenmeno de intercambio inico en slidos.
1850 Runge, Schoenbein, y Goeppelsroeder: Estudiaron el anlisis por capilaridad en papel.
1876 Lemberg: Ilustr la reversibilidad y estequiometra del intercambio inico en minerales
como el silicato de alumino.
1892 Reed: Separacin en columna en tubos de kaoln usados para la separacin de FeCI
3
y el
CuSO
4
.
1906 Tswett: Invent la cromatografa en columna con el uso de solventes puros para
desarrollar un cromatograma, us adsorventes suaves para resolver una mezcla de
pigmentos, (ver ms detalles abajo).
1930 Karrer, Kuhn, y Strain: Us adsorventes como hidrxido de calcio activado, aluminio y
magnesio
1935 Holmes y Adams: Sintetiz resinas orgnicas para intercambio inico.
1938 Reichstein: Introdujo la cromatografa lquida o fluida, as extendi las aplicaciones de la
cromatografa a sustancias sin color.
1938 Izmailov y Schraiber: Describieron el uso de la capa fina de alumina extendida sobre un
vidrio.
1939 Brown: Primero que us la cromatografa circular en papel.
1941 Martin y Synge: Introdujo la cromatografa por particin en columna.
1944 Consden, Gordon, y Martin: Primeros que describieron la cromatografa de particin en
papel.
1947 Boyd, Tompkins, Spedding, Rieman, y otros: Cromatografa de intercambio inico
aplicada a varios problemas analticos.
1948 M. Lederer y Linstead: Cromatografa en papel aplicada a compuestos inorgnicos.
1951 Kirchner: Introdujo la cromatografa de capa fina como es practicada ahora.
1952 James y Martin: Desarrollaron de la cromatografa de gas.
1956 Sober y Peterson: Prepararon las primeras celulosas para intercambio inico.
1956 Lathe y Ruthvan: Usaron almidn natural y modificado como tamiz para la estimacin
del peso molecular.
1959 Porath y Flodin: Introdujeron al dextrn entrecruzado como tamiz molecular
1964 J. C. Moore: Desarroll la cromatografa de permeacin en gel.
En 1906, el botnico ruso Mikhail Tswett (1872-1919) formaliz el uso de la cromatografa en
estudios cientficos, aplicndola a la separacin de los pigmentos naturales que se encuentran en
las plantas (conocidos como carotenoides y clorofilas). Adems le dio ese nombre a la tcnica.
Tswett empac una columna de vidrio vertical (de unos cuantos centmetros de dimetro) con
material adsorbente. Luego, por la columna vertical virti una solucin que contena la mezcla de
pigmentos provenientes de las hojas molidas de una planta. Pasados unos minutos, el material
empacado en la columna haba adquirido una coloracin diferente por segmentos. Es decir, haba
logrado la separacin de los pigmentos naturales de la planta. En cada segmento de color definido
haba un pigmento diferente.
CROMATOGRAFA
La caracterstica que distingue a la cromatografa de la mayora de los mtodos fsicos y qumicos
de separacin, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. La fase
estacionaria y la mvil. Una muestra que se introduce en la fase mvil es transportada a lo largo
de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra
experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase mvil y la fase estacionaria. Cuando
ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan
gradualmente en bandas en la fase mvil. Al final del proceso los componentes separados
emergen en orden creciente de interaccin con la fase estacionaria. El componente menos
retardado emerge primero, el retenido ms fuertemente eluye al ltimo. El reparto entre las fases
aprovecha las diferencias entre las propiedades fsicas y/o qumicas de los componentes de la
muestra. Los componentes adyacentes (picos) se separan cuando el pico que sale despus es
retardado lo suficiente para impedir la sobreposicin con el pico que emergi antes.
Una amplia gama de seleccin de materiales para las fases mvil y estacionaria, permite separar
molculas que difieren muy poco en sus propiedades fsicas y qumicas. En un sentido amplio, la
distribucin de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las molculas
del soluto y las molculas de cada fase. Refleja la atraccin o repulsin relativas que presentan
las molculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre s. Estas fuerzas pueden ser
de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden
deberse a fuerzas de dispersin del tipo London.
Parmetros tericos que afectan la separacin cromatogrfica
Comportamiento cromatogrfico de los solutos.
El comportamiento cromatogrfico de un soluto puede describirse de diversas formas. Considero
ahora importante introducir las definiciones de algunos trminos importantes para la
cromatografa en columna (ver figura 1), como son:
Tiempo de retencin, t
r
. El tiempo que un soluto permanece en la columna, se mide desde el
momento de la inyeccin hasta la elusin del pico mximo. Es caracterstico del soluto para
condiciones de operacin constantes. Auxiliar en la identificacin de los solutos.
Tiempo muerto, t
o
. El tiempo requerido para eluir un soluto que no se retiene en la fase
estacionaria. Tiempo que un soluto permanece en fase mvil. Representa el espacio vaco de la
columna.
Tiempo de retencin ajustado, t
r
. Mide el tiempo que el componente permanece en fase
estacionaria.
t
r
= t
r
- t
o
Ancho a la base, W
b
. Es la porcin de la lnea base intersectada por las tangentes al pico. Para un
pico gaussiano es igual a 4. Tradicionalmente usado en el clculo de la eficiencia del sistema.
Ancho a la mitad de la altura, W_. Una medida mas reproducible, adecuada para evaluar
manualmente la eficiencia del sistema (platos tericos).
Nmero de platos tericos (N). Cada plato terico representa un equilibrio terico de distribucin
del soluto entre las fases. El nmero total de platos tericos de una columna representa el poder
de separacin de la columna. Una buena columna tiene un nmero alto de platos tericos. Se
calcula con cualquiera de las ecuaciones:
Comportamiento de retencin
El comportamiento de retencin refleja la distribucin del soluto entre la fase mvil y la
estacionaria. El volumen de fase mvil necesario para transportar la banda de soluto desde el
punto de inyeccin, a travs de la columna, hasta el detector (en el mximo del pico del soluto) se
define como el volumen de retencin, V
r
. Se puede obtener directamente del cromatograma
multiplicando el tiempo de retencin correspondiente, t
r
, por el gasto o flujo volumtrico, F
c
,
expresado como el volumen de fase mvil por unidad de tiempo.
V
r
= t
r
F
c
El gasto o flujo volumtrico, en trminos de los parmetros de la columna, depende la seccin
transversal de la columna vaca, la porosidad total del relleno (empaque) de la columna y la
velocidad lineal promedio de la fase mvil.
Coeficiente de reparticin
Cuando un soluto entra al sistema cromatogrfico inmediatamente se reparte o distribuye entre la
fase mvil y la estacionaria. Si la fase mvil se para en cualquier momento el soluto establece un
equilibrio de distribucin entre las dos fases. La concentracin en cada fase est dada por el
coeficiente termodinmico de particin (o reparto):
K = C
s
/ C
m
donde C
s
y C
m
son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y mvil, respectivamente.
Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos fases. El coeficiente de
reparto determina la velocidad promedio de cada zona de soluto, ms especficamente, del centro
de la zona de soluto conforme la fase mvil avanza a lo largo de la columna.
Resolucin
El grado de separacin o resolucin de dos bandas adyacentes se define como la distancia entre
los picos (o centros) dividida entre el ancho promedio de las bandas. Si la retencin y el ancho de
la banda se miden en unidades de tiempo (ver figura 2), la resolucin est dada por:
2(t
r,2
t
r,1
)
R
s
=
(W
b,2
+W
b,1
)
donde los tiempos de retencin y los anchos se expresan en las mismas unidades. La resolucin
mnima aceptable en mezclas sencillas es 1.0 (ver figura 3), una resolucin de 1.5 representa
separacin a la lnea base.
La resolucin alcanzada en un sistema es proporcional al producto de la selectividad, la eficiencia
y la capacidad del sistema, que son los tres ms importantes parmetros de control en una
columna cromatogrfica, siendo la expresin analtica para Rs la siguiente:
(a-1) k
Rs = _ ( N )
a (1+k)
selectividad capacidad
eficiencia
La resolucin de picos adyacentes puede mejorarse ya sea aumentando la separacin de los picos
o disminuyendo los anchos de los picos individuales. Esto involucra la selectividad de la columna
cuando se alejan ms los picos y la eficiencia cuando se intenta disminuir el ancho del pico.
Factor de Capacidad
El factor de capacidad o retencin k es la cantidad ms importante de cromatografa en columna.
Relaciona el equilibrio de distribucin de la muestra dentro de la columna con las propiedades
termodinmicas de la columna y con la temperatura. Para un conjunto dado de parmetros de
operacin, k es una medida del tiempo transcurrido en la fase estacionaria en relacin el tiempo
transcurrido en fase mvil. Se define como el cociente de los moles de un soluto en la fase
estacionaria entre los moles en la fase mvil:
C
s
V
s
V
s
Factor de capacidad k = = K
C
m
V
m
V
m
La razn volumtrica de fases, V
m
/ V
s
, se denota usualmente por b. As, k = K / b. Dicho de
otra forma, la razn de reparto es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir,
en comparacin con un soluto no retenido (para el cual k = 0), dividido entre el tiempo de
elusin de una banda no retenida:
V
r1
- V
0
k =
V
0
Capacidad
La capacidad en un intercambiador inico es una medida cuantitativa de su habilidad de tomar
contra-iones intercambiables. La capacidad puede ser expresada como la capacidad inica total,
capacidad disponible o capacidad dinmica. La capacidad inica total es el nmero de
sustituyentes cargados por gramo drenado de intercambiador inico o por mL de gel hidratado.
La capacidad total puede medirse por titulacin con un cido o base fuerte.
Eficiencia
La eficiencia de la columna est relacionada con el ensanchamiento de la banda que se encuentra
en la columna y puede ser calculada:
V
r1

2
donde W
1/2
es el ancho del pico a una altura media
N = 5.54 del pico
W
1/2
y se expresa como un nmero de platos tericos (N) para la columna bajo condiciones
experimentales especficas. La eficiencia es conocida frecuentemente como el nmero de platos
tericos por metro de cama cromatogrfica, o expresada como H que es la longitud de la cama
(L) dividida por el nmero de platos tericos.
H = L / N
A partir de que el valor observado de N depende de factores experimentales tales como la
velocidad de flujo y la carga de la muestra, es importante que las comparaciones sean hechas bajo
condiciones idnticas. En el caso de la cromatografa de intercambio inico, la eficiencia se mide
bajo condiciones isocrticas, usando una sustancia que no interacciona con la matriz como por
ejemplo, la acetona. Mejorar la cintica del sistema aumenta la eficiencia de la separacin.
Una de las principales causas del ensanchamiento de zona en una cama cromatogrfica es la
difusin longitudinal de molculas de soluto. El efecto se minimiza si las distancias disponibles
para difusin, en ambos la fase mvil y la fase estacionaria, son mnimas. En la prctica esto se
logra usando tamaos de cuentas uniformes y pequeos. La mayor eficiencia se logra con
minicuentas de 3mm de dimetro, no porosas diseadas para aplicaciones analticas y
micropreparativas. Despus del tamao de cama, el segundo factor importante es una buena
tcnica experimental. Las camas cromatogrficas empaquetadas irregularmente y burbujas de aire
en ellas, producirn canales, ensanchamiento de la zona y prdida de la resolucin. Las buenas
separaciones requieren columnas bien empaquetadas.
Selectividad
La selectividad (a) se define la habilidad del sistema para separar los picos, por ejemplo la
distancia entre dos picos. El factor de selectividad puede ser calculado del cromatograma usando
la expresin: k
2
V
r2
- V
0
V
r2
a = = =
k
1
V
r1
- V
0
V
r1
Una buena selectividad es un factor muy importante, mejorar la selectividad implica alterar la
termodinmica del sistema cromatogrfico.
Rs est relacionada de forma lineal con la selectividad pero relacionada de forma cuadrtica con
la eficiencia. Esto significa que un incremento de cuatro veces en la eficiencia es necesario para
duplicar la resolucin en condiciones isocrticas.
La selectividad en la cromatografa de intercambio inico depende no solo de la naturaleza y
nmero de grupos inicos en la matriz, tambin depende del pH y fuerza inica.
Tipos de cromatografa
La cromatografa puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio involucrado, mismo que es
gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada. As la cromatografa puede ser de (1)
adsorcin, (2) particin, (3) intercambio inico, (4) exclusin, y (5) afinidad (ver figura 4).
1. Cromatografa de adsorcin
La fase estacionaria es un slido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. La fase
mvil puede ser un lquido (cromatografa lquido-slido) o un gas (cromatografa gas-slido);
los componentes se distribuyen entre dos fases a travs de la combinacin de los procesos de
adsorcin y desorcin. La cromatografa de capa fina (TLC) es un ejemplo especial de
cromatografa por adsorcin en la cual la fase estacionaria es un plano, en la forma de un soporte
slido en un plato inerte.
2. Cromatografa de particin
La fase estacionaria de la cromatografa de particin es un lquido soportado en un slido inerte.
Otra vez, la fase mvil puede ser un lquido (cromatografa de particin lquido-lquido) o un gas
(cromatografa de particin gas-lquido, GLC). La cromatografa en papel es un tipo de
cromatografa de particin en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una
hoja de papel.
Estas son clasificaciones arbitrarias de la tcnicas cromatogrficas, y algunos tipos de
cromatografa se les considera juntas como una tcnica separada, como la cromatografa de gases
para la cromatografa gas-slido y gas-lquido. En cualquier caso, los equilibrios sucesivos son
los que determinan cuanto tiempo el analito permanecer unido o se mover con el eluyente
(fase mvil).
La cromatografa de gases es la tcnica a elegir para la separacin de compuestos orgnicos e
inorgnicos trmicamente estables y voltiles. La disponibilidad de detectores verstiles y
especficos, y la posibilidad de acoplar el cromatgrafo de gases a un espectro de masas o a un
espectrofotmetro de infrarrojo, amplan an ms la utilidad de la cromatografa de gases.
Un cromatgrafo de gases consiste en varios mdulos bsicos ensamblados para: 1) proporcionar
un gasto o flujo constante del gas transportador (fase mvil), 2) permitir la introduccin de
vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye, 3) contener la longitud apropiada de fase
estacionaria, 4) mantener la columna a la temperatura apropiada (o la secuencia del programa de
temperatura), 5) detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna, y 6)
proveer una seal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente.
Slo aprox. 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por cromatografa de
gases, ya sea por que son insuficientemente voltiles y no pasan a travs de la columna, o porque
son trmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de separacin.
La cromatografa de lquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid
chromatography) no est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra. La
HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales lbiles,
materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso
molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra disponible para la
selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa. La separacin cromatogrfica en HPLC es
el resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra con ambas fases,
mvil y estacionaria. Tales interacciones esencialmente no existen en la fase mvil para la
cromatografa de gases. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que
permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin.
El recobro de la muestra es fcil en la HPLC. Las fracciones separadas se recolectan en forma
sencilla, colocando un recipiente abierto al final de la columna. El recobro es usualmente
cuantivativo (exceptuando la adsorcin irreversible en la columna) y los componentes separados
son fcilmente asilados del disolvente de la fase mvil. Adicionalmente al tipo usual de
compuestos orgnicos, la cromatografa lquida en columna puede manejar separaciones de
compuestos inicos, productos lbiles de origen natural, materiales polimricos y compuestos
polifuncionales de alto peso molecular.
En el modo normal de operaciones de particin lquido-lquido, una fase estacionaria polar (p. ej.
agua, metanol) se usa con una fase estacionaria no polar (p. ej. hexano). Esto favorece la
retencin de compuestos polares y la elusin de compuestos no polares y se le conoce como
cromatografa fase normal. Si se utiliza una fase estacionaria no polar con una fase mvil polar,
entonces los solutos no polares sern retenidos y los solutos polares eluidos. Esto se conoce como
cromatografa por fase reversa.
El mecanismo de separacin en cromatografa de fase reversa depende de interacciones
hidrofbicas entre las molculas de soluto en la fase mvil y el ligando hidrofbico inmovilizado
en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las interacciones de unin hidrofbica asume que
la interaccin de unin es el resultado de un efecto entrpico favorable. Las condiciones iniciales
de unin de la fase mvil usadas en la cromatografa de fase reversa son acuosas lo cual indica un
grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las molculas de soluto y el ligando
inmovilizado. A medida que el soluto que une al ligando hidrofbico inmovilizado disminuye el
rea hidrofbica expuesta hacia el disolvente. As, el grado de organizacin de la estructura de
agua disminuye con un favorable aumento de entropa en el sistema.
3. Cromatografa de intercambio inico
La separacin en la cromatografa de intercambio inico depende la adsorcin reversible de
molculas de soluto cargadas, a una resina con grupos inicos de carga opuesta. El mecanismo de
separacin se basa en un equilibrio de intercambio inico. Muchos de los experimento de
intercambio inico se llevan a cabo en cinco etapas.
La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador inico se encuentra en las
condiciones apropiadas de pH y fuerza inica, lo que permitir la unin de las molculas de
soluto. En este estado inicial, los grupos que se intercambiarn estn asociados con sus
respectivos contra-iones (usualmente aniones o cationes simples, como cloruro o sodio).
En una segunda etapa se encuentra la aplicacin de la muestra y su adsorcin, en la cual las
molculas del soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se
unen reversiblemente al gel. Las substancias que no se unen son eludas de la cama del
intercambiador usando el buffer inicial.
En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorcin de la muestra cambiando las condiciones de
elusin, al desfavorecer la formacin del enlace inico de las molculas de la muestra y la cama
del intercambiador. Esto normalmente se logra aumentando la fuerza inica del buffer de elusin
o cambiando su pH.
En las cuarta y quinta etapas corresponden a la remocin de sustancia no eludas bajo las
condiciones experimentales previas y regresar al equilibrio de las condiciones iniciales para la
siguiente purificacin.
La separacin de diferentes sustancias se lleva a cabo porque stas tienen diferentes grados
interaccin con el intercambiador inico debido a diferencias en sus cargas, densidades de carga
y distribuciones de carga en su superficie. Estas interacciones pueden ser controladas variando
condiciones como la fuerza inica y el pH. Las diferencias en propiedades de carga de
compuestos biolgicos son a menudo considerables, y tomando en cuenta que la cromatografa de
intercambio inico es capaz de separar especies con propiedades poco diferentes.
Se pueden llevar a cabo separaciones por intercambio inico en una columna, mediante un
procedimiento en lote o por adsorcin en cama extendida.
La matriz. Un intercambiador inico consiste de una matriz slida insoluble a la cual se unen de
forma covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a contra-iones mviles. Estos
contra-iones pueden intercambiarse reversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la
matriz.
La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contra-iones tambin. Los intercambiadores
cargados positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones) disponibles para
ser intercambiados por lo que son llamados intercambiadores aninicos. Intercambiadores
cargados negativamente tienen contra-iones cargados positivamente (cationes) y se les conoce
como intercambiadores catinicos.
La matriz puede estar hecha de compuestos inorgnicos, resinas sintticas o polisacridos. Las
caractersticas de la matriz determinan sus propiedades cromatogrficas tales como su eficiencia,
capacidad y recuperacin, as como su estabilidad qumica, fuerza mecnica y fluidez. La
naturaleza de la matriz afectar su comportamiento hacia sustancias biolgicas y el
mantenimiento de la actividad biolgica
Grupos cargados. La presencia de grupos cargados es una propiedad fundamental de un
intercambiador inico, y el tipo de grupo determina el tipo y fuerza del intercambiador inico; su
nmero total y disponibilidad determina la capacidad. Hay una variedad de grupos que pueden
escogerse para usarse en intercambiadores inicos; algunos de estos se muestran a continuacin.
Intercambiadores aninicos Grupo funcional
Dietilaminoetil (DEAE) -O-CH
2
-CH
2
-N
+
H(CH
2
CH
3
)
2
Aminoetil cuaternario (AEC) -O-CH
2
-CH
2
-N
+
H(CH
2
CH
5
)
2
-CH
2
-CHOH-CH
3
Amonio cuaternario (C) -O-CH
2
-CHOH-CH
2
-O-CH
2
-CHOH-CH
2
-N
+
H(CH
3
)
3
Intercambiadores catinicos Grupo funcional
Carboximetil (CM) -O-CH
2
-COO
-
Sulfopropil (SP) -O-CH
2
-CHOH-CH
2
-O-CH
2
-CH
2
-CH
2
SO
3
-
Metil sulfonato (S) -O-CH
2
-CHOH-CH
2
-O-CH
2
-CHOH-CH
2
SO
3
-
Se usan los grupos sulfnico y amino cuaternario para formar intercambiadores inicos fuertes,
los otros grupos formar intercambiadores inicos dbiles. Los trminos fuerte y dbiles se
refieren a la extensin de variacin de ionizacin con pH y no a la fuerza del enlace.
Los intercambiadores inicos fuertes estn completamente ionizados en un amplio rango de pH
mientras que con los intercambiadores inicos dbiles, el grado de disociacin y la capacidad de
intercambio varia ms marcadamente con el pH.
4. Cromatografa de exclusin por tamao
En la cromatografa de exclusin puede separarse molculas solvatadas de acuerdo a su tamao y
habilidad a penetrar en una estructura tamiz (la fase estacionaria).
La separacin en cromatografa de particin y en cromatografa de intercambio inico se logra de
diferentes interacciones de solutos con la fase mvil y la fase estacionaria. En contraste, las
separacin en cromatografa de exclusin por tamao se lleva a cabo por diferencias en tamao
molecular y la habilidad de diferentes molculas para penetrar los poros de la fase estacionaria a
diferentes tamaos o magnitudes.
La cromatografa de exclusin por tamao se usa extensivamente para las separaciones
preparativas de macromolculas de origen biolgico, as como para la purificacin de polmeros
orgnicos sintticos.
5. Cromatografa de afinidad
Este tipo de cromatografa utiliza interacciones altamente especficas entre un tipo de molculas
de soluto y una segunda molcula unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria. Por
ejemplo, la molcula inmovilizada podra ser un anticuerpo especfico para un protena particular.
Cuando una mezcla cruda que contiene miles de protenas se pasa a travs de una columna, slo
una protena reacciona con el anticuerpo que est unido a la columna. Despus de lavar todos los
otros solutos de la columna, la protena deseada es desplazada del anticuerpo cambiando el pH ,
la fuerza inica o la polaridad.
Las interacciones entre las molculas del ligando y blanco pueden ser el resultado de
interacciones hidrofbicas o interacciones electrostticas, fuerzas de van der Waals y/o puentes
de hidrgeno.
La purificacin por afinidad requiere un ligando bioespecfico que puede ser unido
covalentemente a una matriz cromatogrfica. El ligando acoplado debe retener su afinidad
especfica de enlace hacia las molculas blanco, y despus de lavar el material no unido, la unin
entre la molcula blanco y el ligando debe ser reversible y permitir que las molculas blanco sean
removidas en forma activa. Cualquier componente puede ser usado como un ligando para
purificar a su compaero respectivo. Algunas interacciones biolgicas tpicas usadas
frecuentemente en cromatografa de afinidad son:
Enzima sustrato anlogo, inhibidor, cofactor.
Anticuerpo antgeno, virus, clula.
Lecitina polisacrido, glicoprotena, receptor de superficie celular, clula.
c. nucleico secuencia base complementaria, histonas, polimerasa de
cidos nucleicos, protena de unin al DNA.
Hormona, vitamina receptor, protena acarreadora.
Glutatin glutatin-S-transferasa o protenas de fusin GST
Iones metlicos protenas de fusin poli (his), protenas nativas con histidina,
residuos de cistena y/o triptofano en sus superficies.
La matriz. Es un soporte inerte al cual un ligando puede ser directa o indirectamente acoplado.
Algunas caractersticas importantes para sta son:
adsorcin no especfica extremadamente baja es esencial ya que el xito de la
cromatografa de afinidad depende de interacciones especficas,
los grupos hidroxilo en los residuos de azcar pueden servir para unirse a un ligando,
proporcionando una plataforma ideal del desarrollo del medio de afinidad,
la estructura de poro abierta asegura una capacidad de unin alta, an para biomolculas
grandes porque el interior de la matriz estara disponible para el ataque de ligandos,
propiedades de fluido buenas para la rpida separacin,
estabilidad bajo un rango de condiciones experimentales tales como pH alto y bajo,
detergentes y agentes disociadores.
El ligando. Es la molcula que se une reversiblemente a molculas especficas o grupo de
molculas, capacita la purificacin por cromatografa de afinidad.
La seleccin del ligando para cromatografa de afinidad est influenciado por dos factores:
El ligando debe presentar una afinidad de unin especfica y reversible para la sustancia blanco y
debe tener grupos qumicamente modificables que permitan ser unidos a la matriz sin destruir su
capacidad de unin.
Brazo espaciador. El sitio de unin de una protena blanco a menudo se localizan dentro de la
molcula y un medio de afinidad preparado con pequeos ligandos acoplados directamente a la
columna puede exhibir una capacidad de unin baja debido a interferencias estricas, por
ejemplo, el ligando no podra accesar al sitio de unin de la molcula blanco. En estas
circunstancias un brazo espaciador se pone entre la matriz y el ligando para facilitar la unin
especfica. El brazo espaciador puede ser diseado para mximar la unin especfica.
APLICACIONES
La cromatografa de adsorcin es particularmente adecuada para el anlisis de molculas no
ionizantes, insolubles en agua y relativamente simples, que frecuentemente son ismeros o
compuestos muy relacionados. El intervalo de compuestos que pueden separarse se extiende
desde los hidrocarburos muy polares hasta compuestos polifuncionales fuertemente polares. Esta
cromatografa se ve poco influida por las diferencias en peso molecular y ms por los grupos
funcionales especficos. En consecuencia, la separacin por adsorcin de compuestos que difieren
solamente en el grado o tipo de sustitucin alguilo, como en los miembros de las series
homlogas, es pobre. Esta cromatografa se utiliza en la separacin de la vitamina D
3
y sus
metabolitos las vitaminas A, D y E (y compuestos muy relacionados a estas vitaminas), muchas
drogas de abuso (LSD, por ejemplo), antidepresivos tricclicos, bloqueadores beta y los PTH-
amino cidos. Los aceites naturales y los extractos de esencias se analizan fcilmente y los
pigmentos menos polares de las plantas, tales como los carotenoides y las porfirinas, se han
separado con xito durante muchas dcadas. Los steres tambin son factibles de ser separados,
siendo los glicridos y los ftalatos tpicos de esta clase de compuestos. Tambin han sido
separadas en clumnas de slice las aflatoxinas y otras micotoxinas.
En qumica clnica cada vez se realiza con ms frecuencia el anlisis cuantitativo de las drogas de
abuso por medio de la cromatografa de fase reversa. Los productos farmacuticos que se
analizan en forma rutinaria incluyen a los barbitricos, drogas antiepilpticas, analgsicos y
sedantes. Aplicaciones adicionales de los mtodos de fase reversa son los conservadores
alimentarios, herbicidas y azcares. En el campo farmacutico ha venido en aumento el uso de
esta tcnica a costa de la cromatografa de adsorcin. Un amplio espectro de biomolculas,
lipoflicas o inicas, pequeas o grandes, pueden ser separadas debido a que el contenido de agua
en la fase mvil puede variar desde el 100% hasta porcentajes muy bajos o ninguno en absoluto.
Los compuestos lipoflicos, tal como los triglicridos, que tienen una solubilidad muy pobre en
los disolventes acuosos de la fase inversa, con frecuencia pueden separarse con una fase inversa
no acuosa utilizando una columna empacada de octadecilo y disolventes orgnicos polares como
el acetonitrilo o el tetrahidrofurano.
En la actualidad, la cromatografa ha alcanzado tal nivel de fineza y especializacin que cada uno
de sus tipos constituyen herramientas imprescindibles en las reas de la ciencia y la tecnologa,
en la industria qumica, farmacutica, cosmtica, en estudios ambientales, en la clnica, en
alimentos, etc.
Bibliografa
Willard, HH., Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth, Inc., U.S.A., 1988.
Handbooks of Amersham Pharmacia Biotech: Ion Exchange Chromatography, Affinity
Chromatography, Hydrophobic Interaction Chromatography, Reversed Phase Chromatography,
Sweden, 2002.
http://gc.discussing.info/gs/b_theory/index.html
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