Captulo 2 Una breve comparacin entre En Vivo ADN Replicacin y

In Vitro Amplificacin por PCR

En principio, PCR genera grandes cantidades de ADN de una pequea cantidad de a partir de material
utilizando una metodologa similar (pero mucho ms simple de cido nucleico que) que se observa en las
clulas vivas. Para las clula svivas, env ivoLasntesis de ADN es dependiente sobre un bien definido pero
complejo conjunto de enzimas y cofactores, que tienen evolucionado para actuar de manera concertada
durante la fase sinttica (fase S) de la ciclo celular. En comparacin, PCR facilita la sntesis de ADN in vitro en
una mucho ms simple moda, haciendo uso de un conjunto ms reducido de ingredientes definidos y las
condiciones de reaccin que implican temperaturas relativamente altas. La gama de factores que
contribuyen al xito Amplificacin por PCR se repasa por debajo.

2.1 cido nucleico objetivos 2.1.1 ADN En vivoDuplicacin del ADN, que es esencialmente una forma
de amplificacin de ADN limitada, se realiza bajo la direccin de un conjunto de protenas estructurales,
selecta y variada enzimas y cofactores adicionales (una descripcin detallada de la que est ms all de la
alcance de este libro y el lector interesado se refieren a la literatura internacional para una mirada ms
profunda sobre este tema en particular, por ejemplo Shcherbakova et al., 2003; Goren y cedro, 2003;
Kelman, 2000; Nasheuer et al., 2002; Nasmyth, 2002). En eucariotas, la molcula de ADN est ntimamente
asociada a cargado positivamente protenas, que son fuertemente electrostticamente vinculadas a los
grupos fosfato en la cadena de ADN. Estas protenas "histonas" asocian a los complejos octmerico, enlazar
a aproximadamente 400 pares de bases (PB) de ADN genmico, y constituyen despus - aproximadamente
mitad de la masa del cromosoma eucaritico. Hacen estas histonas no completamente disociar de la DNA
durante la replicacin. Un nivel adicional de complejidad tambin existe en el ADN eucariota, que inducen
procesos ms plegables secundario (300 nm) y terciario (700 nm) orden plegable en la plantilla de ADN,
generando firmemente en la espiral de ADN con una alta densidad molecular [Stewart, 1997] (fig. 2.1). Por
procariotas, la situacin con respecto a la en vivo estado de ADN


Figura 2.1En vivo, la molcula de ADN trenzada doble est organizada en una estructura altamente condensada con una
impresionante densidad molecular. La estructura de doble hlice principal est incrustada en los nucleosomas esfricos (11 nm
de dimetro) mediante una interaccin con las protenas chaperonas o las histonas. Estos nucleosomas son a su vez orden a
30 nm cromatina las fibras que se coloca en macroestructuras llamado cromatina. Esta cromatina puede condensarse an ms
en la heterocromatina, proporcionar el marco que genera la estructura cromosmica eucariota final. Qu es mostrado es un
modelo de granos-en-un-cuerdas de cromatina con una longitud de vinculador de 20 pares de nucletidos en tres dimensiones
(desde http://en.wikipedia.org/wiki/Chromatin)




2.1 cidonucleicoobjetivos11
se considera generalmente para ser algo ms sencillo, con microorganismos carecen de un ncleo visible y
que contiene una nica copia cromosmica (circular) por la clula. Sin embargo, se sabe que tambin est
asociada con una variedad de ADN procariota histona-como las protenas, que interactuarcon ntimamente
con el ADN celular, protegindola y confiriendo estructura compleja (aunque esta estructura es
generalmente menos ordenada o regular que asoci los cromosomas eucariotas). Por lo tanto, uno de los
requisitos principales para la replicacin del ADNen e nvivosistemas es el desenrollamiento sistemtica de
regiones especficas del ADN genmico para exponer cadenas simples de ADN listos para la replicacin. En
reinos tanto eucariotas y procariotas este proceso es lograrse mediante especficos Topoisomerasas de ADN,
helicasas y gyrases, que actan juntos ayudar a desenrollar la doble trenzado de ADN.
En contraste, el desenrollamiento del ADN durante la amplificacin por PCR no es enzymati camente
controlada pero en realidad se logra utilizando un procedimiento mucho menos complicado, es decir, el
ADN amplificado qumicamente generalmente se extrae de su acompaante de host protenas y la
estructura secundaria o terciaria residual eliminado por calentamiento del ADN desnudo. Este paso de
calefaccin tambin proporciona el mecanismo por el cual el ADN de dos filamentos estn separados
(fundido) en solos filamentos listos para amplificacin por PCR. Como otro punto, mientras queen vivoLa
replicacin del ADN cromosmica implica la rplica-cin de muchos millones de nucletidos, los productos
de amplificacin PCR son generalmente diseado para ser ms corta que 1.000 bp en longitud (un
parmetro impuesta en gran medida a la Proceso de amplificacin PCR por el tipo de ADN dependiente de
DNA termoestable polimerasas utilizados). Sin embargo en casos extremos, la amplificacin por PCR de xito
las regiones de ADN sobre 35 kilobases de longitud se han divulgado mediante calor especial-combinaciones
estables DNA dependientes ADN polimerasas [Hu et al., 2002; Davies y Gray, 2002]. En principio, ADN de
todos los tipos de virus, clulas (planta, animal y bacterianas), o tejidos (pulmn, cerebro, etc.) pueden ser
amplificados mediante cido nucleico tcnicas de extraccin junto a la amplificacin por PCR
2.1.2 ARN Tal como se define en el "dogma central de la biologa molecular," el flujo de informacin
gentica-mation en vivoprocede de ADN al ARN (a travs de transcripcin) y luego finalmente a protena (a
travs de traduccin). Sin embargo, desde que se formul el dogma central, scien - descubrimientos
cientficas han demostrado que el flujo de informacin gentica puede ocurrir en el invertir la direccin, es
decir, del ARN a ADN (transcripcin reversa). Este proceso de transcripcin inversa se produce durante el
ciclo de replicacin de ciertas familias de virus (Retroviridae, Hepadnaviridaey Caulimoviridae) y las enzimas
correspondientes (reverso transcriptasas) han sido aislados y utilizados para generar el ADN del ARN
molculas en protocolos PCR especialmente adaptadas. Esta forma especial de PCR se conoce como la
transcriptasa inversa - o transcripcin reversa-PCR (acortado a menudo a la RT-PCR), y permite la deteccin
y cuantificacin de los distintos tipos de molculas de ARN, como ARN mensajero (ARNm) de las clulas
tanto procariotas y eucariotas, as como basado en RNA genomas, por ejemplo, los coronavirus y
picornavirus. Varios tambin se han desarrollado mtodos de amplificacin no basadas en PCR que no
utilizan enzimas transcriptasa inversa y por lo tanto no hacen uso de un ADN intermedio plantilla. Estas
tcnicas amplificar RNA (y no doble trenzado de ADN como es el caso con la PCR) utilizando una plantilla
inicial de RNA.


2.2 separacin de filamento de ADN blanco y cartilla recocido durante la replicacin del ADN en
vivo , celulares asociadas a protenas (incluyendo DNAa, DNAb DNAc, solo proteinas trenzado, helicasas y
gyrases, ligasa y una variedad de protenas de la subunidad de polimerasa), actan en concierto Desenrolle
la estructura del ADN-helicoidal estable, romper los enlaces de hidrgeno entre las bases purinas y
pirimidinas y exponer un origen de replicacin del ADN [Nasheuer et al.2002]. En contraste, necesario para
la amplificacin por PCR de DNA se separa de sus protenas chaperonas utilizando mtodos de extraccin
qumica o enzimtica, con el entonces estar separado en solos filamentos va disociacin trmica, es decir,
mediante incubacin a aproximadamente 94 C durante 30 segundos a 5 minutos, causante de la ruptura de
los enlaces de hidrgeno entre los pares de bases complementarios presentes en enfrente de filamentos de
ADN. Este mtodo no est disponible para las clulas vivas como las protenas son rpidamente
desnaturalizadas a 94 C e irremediablemente descompone la integridad celular. De hecho, la temperatura
de fusin (T) de un ADN m molcula se define como la temperatura a la cual la mitad de su base constitutiva
ya no estn emparejada a su pareja complementaria en el filamento opuesto. Para muchas especies de
natu-ral de ADN, las mentiras de temperatura fusin entre 70 C y 100 C, con el real T depender tanto la
longitud de la molcula de ADN m a ser derretida y sobre la base de la composicin de los filamentos.
Adems, existe una relacin lineal entre el porcentaje de guanosina y citosina bases presentes en los
filamentos de la DNA (denominados el "contenido GC") y la temperatura de fusin de la hlice de ADN
particular, con el ADN de GC-ricos de fusin a una temperatura superior a adenosina y timidina rica ADN
(AT-Rico). Debido al hecho de que las curvas de fusin de ADN son relativamente escarpadas, temperaturas
de-5 C por encima de T + 5 C y T o m m por debajo del valor calculado de T dar como resultado la doble
hlice estn completamente dena- m tured o completamente intacto, respectivamente. Varios otros factores
tambin pueden facilitar la desestabilizacin de hlice de ADN, todos ellos operan por desestabilizar la
interaccin entre los varios complementarios moieties base de ADN. Los valores de pH extremos,
desnaturalizantes como formamida o urea y la concentracin de sal en general son parmetros importantes
a este respecto (Rauch et al., 2000). Esencialmente, la adicin de estos reactivos desplaza la curva de fusin
de ADN a la izquierda, con el resultado que la absoluta T de doble trenzado de ADN m valor disminuye. Esta
disminucin en T puede ser decenas de grados centgrados dependientes m en el factor incluido en la mezcla
de reaccin. Por el contrario, varios compuestos actu-aliado estabilizar la doble hlice del ADN, incluyendo
los iones de magnesio y elevadas concentraciones de sal, que ayuda a neutralizar la carga de fosfato triple
negativo en las hebras de ADN en el duplex (limitando electrosttica repul-sion) de oposicin, as como
(parcialmente) neutralizar el efecto que tiene el dipolo de agua sobre la vinculacin del hidrgeno de ADN.
12 2 breve comparacin entre el ADN In Vivo y In Vitro PCR2.3 ADN polimerasa dependiente de ADN y oligonucletidos
cebadores 13 el procedimiento de calefaccin utilizado para fundir ADN durante el proceso de polimerizacin
en cadena es un simple mtodo fiable para garantizar esa separacin de filamento de ADN se produce y que
se exponen los sitios de unin de ADN para especficamente diseados cartillas de la polimerizacin en
cadena. Sin embargo, en ADN temperaturas de fusin, iniciadores PCR tambin siguen siendo desasociadas
del ADN Diana y efectiva Unin de los cebadores PCR para el ADN Diana slo puede tener lugar a una menor
temperatura cuando la energa trmica es lo suficientemente baja como para permitir la habitaci-tario base
que se aparea. En la mayora de las aplicaciones (amplificacin aleatoria de ADN polimrfico o RAPD
exceptuado), iniciadores PCR estn diseados se unen especficamente a secuencias conocidas de ADN
Diana y recuecen el objetivo derretida ADN a una temperatura de entre 45 y 65 C (la temperatura
"recocida"). Por supuesto, en este tem-temperatura objetivo ADN tambin re recuece a su filamento
complementario. Sin embargo, la excesiva concentracin de cartillas agregado a mezclas de PCR asegura que
atar de por lo menos algunos PCR cartillas se producen durante cada thermocycle (dependiente de la
presencia de secuencias cartilla-complementaria en el ADN Diana).
2.3 ADN polimerasa dependiente de ADN y las cartillas del oligonucletido ADN polimerasa
dependiente de ADN es un componente esencial de la replicacin del ADN en vivo y el proceso de
polimerizacin en cadena (Fig. 2.2), aunque las ADN dependiente DNA polimerasas encontradas en la
mayora de los organismos son calor sensible (termolbil), uno de los principales escollos obstaculizan el
xito inicial de polimerizacin en cadena. Sin embargo, el descubrimiento de microorganismos termfilos y
el posterior aislamiento de termoestable DNA polimerasas dependientes del ADN de estos organismos
anuncian un nuevo captulo en la tecnologa de amplificacin PCR [Saiki et al., 1988], tal que sucesivos ciclos
de calor-cin y enfriamiento (necesarios para la fusin de ADN blanco y cartilla recocido durante la PCR
termociclaje rpido) ya no dio lugar a la desnaturalizacin de la enzima de ADN polimerasa dependiente de
ADN termolbil concomitante. El descubrimiento de estas enzimas termoestables permiti todo el proceso
de polimerizacin en cadena para convertirse en mucho ms conveniente, consume menos tiempo y ms
fcil de usar para el personal de laboratorio. La primera enzima de ADN polimerasa dependiente de ADN
termoestable a ser ampliamente utilizado en PCR (polimerasa de Taq) se deriva de la aguas termales-
vivienda bacteria Thermus aquaticus, aunque muchas otras disponibles comercialmente no-Taq
termoestable ADN polimerasa dependiente de ADN enzimas estn ahora disponibles en el mercado, por
ejemplo Pfu de Pyrococcus furiosus, ventilacin de Thermococcus litoralis, etc.. Las ventajas y desventajas de
algunos de estos diferentes polimerasas termoestables con respecto a la PCR termociclaje rpido se
describen ms plenamente en el captulo 7. ADN dependiente ADN polimerasas propiamente son realmente
incapaz de llevar a cabo la sntesis de ADN de un pedazo de ADN puramente trenzado y requieren un
oligonucletido "cebado" ms corto adicionales para iniciar la replicacin del ADN. En la replicacin del ADN
en vivo , un oligonucletido de RNA (generado por una dependiente ARN polimerasa llamada primasa) acta
como la cartilla para la replicacin del ADN. Esta enzima primasa sintetiza una molcula de ARN corta (de
aproximadamente diez nucletidos),
Figura 2.2 Esquema esquema de la estructura de la DNA polimerasa dependiente de ADN holoenzyme de Escherichia coli. El
dominio amino terminal tiene actividad exonucleasa, que es capaz de eliminar cebadores ARN y timidina dmeros y para inducir
el desplazamiento del filamento. La supresin de este dominio genera una enzima que es deficiente en actividad de
exonucleasa 5 3 - al (fragmento Klenow). En con-trast, el dominio central exhibe actividad de exonucleasa 3 5 - al y
dominio carboxi terminal est involucrado en la Unin de ADN y cofactores como los iones de magnesio y dNTPs. Taq
polimerasa tiene esencialmente la misma organizacin estructural
que es complementaria a la regin de ADN para replicarse y una vez hibridada acta como una "cartilla"
para la replicacin del ADN por celular ADN polimerasa dependiente de ADN. La enzima primasa s mismo no
requiere una cartilla para generar este oligonucletido corto de RNA. En contraste, un tpico utiliza PCR dos
especficamente diseado y sintetizado sintticamente 15 25 pares largo oligonucletidos que actan
como iniciadores de la enzima ADN polimerasa dependiente de ADN (ver Fig. 1.1, captulo 1). Cebadores de
PCR estn diseados de modo que una cartilla es complementaria a la hebra molde de sentido (codificacin)
y una cartilla complementaria a la hebra antisentido de plantilla (no codificantes) y como tal son los
componentes principales, para determinar la especificidad de la PCR. Adems, los dos iniciadores PCR
determinan la longitud de la regin de ADN amplificado y facilitar la exponencial (doble o duplicacin) de
amplificacin ciclo de productos durante cada PCR.
2,4 desoxirribonucletidos y factores adicionales En vivo Adn replicacin y PCR no slo requieren
iniciadores especficos (RNA para replicacin in vivo , ADN de amplificacin por PCR) y un polmero de ADN
(termoestable)-ase, pero tambin muchos otros factores. Lo ms esencial de estos factores son el edificio
bloques o molculas de trifosfato de Deoxinucletidos gratis que se incorporan a la creciente cadena de
ADN por la ADN polimerasa dependiente de ADN. Estos compuestos pueden ser adquiridos en vivo como
nutrientes, pero generalmente se sintetizan mediante vas complejas que implican la reduccin de difosfatos
ribonucletido y adicin de un grupo fosfato adicional por una enzima quinasa. Los cuatro principales
Deoxynucletidos necesarias para la sntesis de ADN (adenosina, guanosina, timidina - y citosina-trifosfato)
contienen una molcula rica en energa Trifosfato, que es utilizado por la polimerasa de la DNA para
catalizar un enlace fosfodister entre la 3 - hidroxi termi -nus de la cartilla (o previamente agregado
Deoxinucletidos trifosfato) y el trifosfato de Deoxinucletidos recin adquiridas en la creciente cadena de
ADN. Vinculacin entre los nucletidos complementarios en filamentos adyacentes luego del hidrgeno
completa la doble estructura primaria trenzada de la molcula de ADN. La Meca-insensible por cual
Desoxirribonucletido trifosfatos (dNTPs) se agregan a la cadena de ADN crece-ing es idntico para la
replicacin en vivo y los procesos de amplificacin PCR, aunque la concentracin de dNTPs en reacciones de
amplificacin en vitro puede ser fcilmente manipulada a niveles artificialmente altos. As como
deoxyribonucle-otides, exitosa en vivo la sntesis de ADN y amplificacin requiere una gran cantidad de
componentes qumicos tales como (1) el magnesio iones metlicos bivalentes (cofactor de la enzima ADN
polimerasa) y manganeso y productos qumicos (2) simples tales como cloruro de sodio, etc. que ayudan a
mantener el pH correcto de la reaccin o permitir la sntesis de ADN con una compleja estructura secundaria
(vase los captulos 4-7 y Wilson et al.[2002] para una discusin ms detallada).