Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia

1









EFECTO DE ACETILCOLINA
SOBRE ILEON AISLADO DE RATA:
CONSTRUCCIN DE
CURVAS DOSIS RESPUESTA
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
2
EFECTO DE ACh SOBRE ILEON AISLADO DE RATA: CONSTRUCCIN DE CURVA
DOSIS-RESPUESTA.

En la bsqueda de receptores especficos que median la accin observada tras la
administracin de frmacos en el animal entero, as como su potencia relativa en comparacin
con otros agonistas o antagonistas, el farmaclogo comenz a utilizar la tcnica del rgano
aislado como pieza ineludible en el estudio del mecanismo de accin de los frmacos.
La utilizacin del rgano aislado como reactivo farmacolgico aporta varias ventajas respecto a
los preparados in vivo:
Posibilita la cuantificacin precisa de la respuesta o efecto
Conocimiento exacto de la concentracin del frmaco sin interferencias de procesos
de acceso y disposicin.
Eliminacin de respuestas de carcter reflejo (neuronal) o retroalimentacin humoral.
Sin embargo tambin posee sus limitaciones ya que la tcnica exige una gran minuciosidad y
un correcto montaje del preparado. A pesar de intentar mantener las condiciones fisiolgicas,
debemos tener en cuenta que el rgano va a estar en un medio artificial.








Figura 1.- Esquema de los elementos necesarios para la realizacin de un experimento con
rgano aislado.
transductor
sistema de
registro
amplificador
SSF
bao M
organo
aislado
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
3
1. Bao de rganos
Se denomina as al conjunto de materiales necesarios para realizar experiencias en rganos
animales. En realidad, son varios elementos que constituyen un sistema que intenta reproducir
las condiciones fisico-qumicas fisiolgicas necesarias para que el rgano responda.
a) Copa de Tejido: Es un vaso de cristal de volumen fijo (50 ml), en el que se dispone la
pieza de tejido mediante un sistema de sujecin (varilla). Esta copa se llena de solucin
nutricia y se sita inmersa en el bao propiamente dicho.
Recibe una entrada para aireacin y una conduccin regulable para el medio de
incubacin. Se debe comprobar que el llenado de la copa se efecta siempre al mismo
nivel.
Los frmacos se administran con una pipeta o una jeringa en el interior de la copa. El
volumen de solucin de frmaco aadido total no debe ser superior al 10% del volumen
total de la copa.
b) Aireacin: Se realiza a travs de conducciones adecuadas, regulables, a partir de
aireadores (aire) o botellas de gas (oxgeno o carbgeno, que contiene 95% O
2
y 5%
CO
2
). Habitualmente se utiliza carbgeno, salvo en caso de mayor requerimiento
metablico (msculo esqueltico) en el que se utiliza oxgeno. Cuando el medio
contiene NaHCO
3
como tampn, conviene utilizar carbgeno, ya que el oxgeno puro
hara perder CO
2
y el pH se elevara hasta valores mayores de 8, con el consiguiente
deterioro de la actividad del rgano.
c) Temperatura: El control de la temperatura se realiza mediante un bao mara con un
termostato, en el cual se encuentra introducida la copa de tejidos. La solucin nutricia
se hace circular a travs de un serpentn sumergido, antes de alcanzar la preparacin.
Se debe evitar administrar las disoluciones de frmaco an fras.
d) Solucin Salina Fisiolgica: Se entiende por solucin salina fisiolgica (SSF), aquella
diseada para mantener la viabilidad del rgano aislado. Diferentes preparados exigen
distintas SSF de acuerdo a las caractersticas de cada uno. El principio que determina
la composicin de la SSF es la aproximacin artificial a las condiciones fisiolgicas del
entorno en que se encuentra dicho rgano o tejido cuando forma parte del organismo.
Se deben, pues, tratar de respetar los siguientes parmetros:
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
4
Composicin electroltica
Osmolaridad
pH
Presin parcial de O
2
y CO
2

Fuente de energa (metablica)
Temperatura
Tensin mecnica
Como fuente de energa se utiliza la dextrosa y ms raramente otros sustratos como
sucrosa o aminocidos.
En nuestro experimento usaremos la solucin nutricia llamada Solucin de Krebs-
Henseleit, cuya composicin milimolar es la siguiente:
NaCl ......................118 mM
KCl........................4.75 mM
NaHCO
3
...................25 mM
MgSO
4
....................1.2 mM
CaCl
2
......................1.8 mM
KH
2
PO
4
...................1.2 mM
Glucosa...................11 mM
e) Sistema de registro: Est dotado de amplificador y registrador. Los cambios de
tensin, es decir la contraccin del msculo liso del preparado utilizado, deben ser
adecuadamente amplificados a fin de obtener un registro que se pueda medir. El
transductor isomtrico permite la traduccin de los cambios en la tensin mecnica
originados por la contraccin del msculo liso, en cambios de corriente elctrica, que
posteriormente sern aumentados por un amplificador al que va conectado. Este a su
vez enva su seal a un registrador. La seal llega a un ordenador, que gracias al
programa Biopac, registra en la pantalla la actividad mecnica del msculo (la seal
elctrica se transforma en un mensaje digital que comprende el ordenador). Tambin
podra utilizarse un registro poligrfico, es decir, la seal elctrica mueve unas agujas
con unos rotuladores que dibujan en un papel la contraccin del rgano.




Figura 2.- Esquema de la ruta seguida por la seal.
MSCULO TRANSDUCTOR AMPLIFICADOR REGISTRADOR
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
5
2. Montaje del preparado
En primer lugar se procede al sacrificio del animal, en nuestro caso, ratas de raza Wistar de
peso comprendido entre 300 y 350 g. Posteriormente procedemos a identificar y extraer el
rgano segn el mtodo general de Magnus.
Previo al montaje, el rgano debe ser colocado en una placa Petri conteniendo SSF oxigenada
a temperatura ambiente, procedindose a la eliminacin del tejido superfluo y limpieza
intraluminal en el caso del ileon. Una vez limpio, se procede a cortar el segmento a montar en
el bao. A continuacin se colocarn dos puntos opuestos de sujecin (hilo) donde uno de los
cuales se fija a la varilla y el otro hilo se acopla a un transductor isomtrico ajustado con la
correspondiente tensin inicial (0.7-1g).
La sujecin se realiza con la ayuda de una aguja; por el extremo que se unir al transductor
introducimos el hilo pinchando tan solo una vez en el rgano de manera que el medio nutritivo
pueda penetrar a la luz del ileon (pico de flauta). En el otro extremo, que se anclar a la varilla,
se pincha dos veces en el tejido, dejndose un asa de hilo antes de atarlo para no estrangular
el rgano.



Figura 3.- Esquema del montaje del ileon aislado de rata.

La preparacin se deja estabilizar durante 30 min. Una vez conseguida una linea basal estable,
podemos aadir al bao agonistas que provoquen contraccin de la musculatura lisa. Al
contraerse el ileon, ste tira de del transductor con una fuerza que se transforma en una seal
elctrica. Despus de ser ampliada por el amplificador, podremos observar en la pantalla del
ordenador una subida de la lnea basal.



Figura 4.- Contraccin del ileon aislado de rata

ileon
varilla
transductor
agonista
1.2 gr
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
6
3. Mecanismo de contraccin del msculo liso
En el intestino delgado podemos distinguir tres porciones: duodeno, yeyuno e ileon. Esta ltima
est constituida por distintas capas celulares: serosa, muscular, plexos nerviosos, submucosa y
mucosa. De todas ellas nos centraremos en la muscular, ya que son las clulas de musculatura
lisa del ileon las que van a contraerse en respuesta a diversos estimulos y por tanto las
responsables de la respuesta que nosotros vamos a registrar.
Entre los distintos neurotransmisores con capacidad de producir contraccin del ileon se
encuentran ACh, histamina, noradrenalina...ya que el ileon posee receptores para estos
mediadores. Concretamente ACh es un agonista de receptores muscarnicos y nicotnicos. El
nicotnico es un receptor preganglionar, y no se encuentra en el ileon, sino en el ganglio donde
sinaptan las neuronas que inervan el intestino. Esto quiere decir que mientras que el rgano
aislado (sin inervacin) no responde a la estimulacin del receptor nicotnico, en el animal
entero, esta estimulacin s provocara respuesta.










Figura 5.- Inervacin de la musculatura lisa del ileon

En esta prctica nosotros vamos a aadir al bao de rganos ACh. La ACh en el bao va a
interaccionar con receptores muscarnicos, concretamente M
3
. Tras su estimulacin se
desencadenan una serie de procesos que conducen a un incremento de [Ca
2+
] intracelular,
provocando la contraccin del musculo liso. Recordemos que el receptor M
3
est asociado a
HISTAMINA
SIST.
SIMPTICO
SIST. PARASIMPTICO
NICOTINICO
MUSCARNICO
POSTGANG
PREGANG


ILEON
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
7
una proteina G cuya activacin estimula la actividad de la fosfolipasa C (PLC). En el esquema
podemos ver los segundos mensajeros y mecanismos implicados en la contraccin.












Figura 6.- Mecanismo de accin de ACh, atropina, diltiazem y fisostigmina

El ileon presenta una contraccin bifsica, con un componente fsico (un pico de contraccin)
seguido de otro tnico (una meseta mantenida). El pico de contraccin se asocia con la
liberacin de Ca
2+
de los depsitos intracelulares y la contraccin tnica con la entrada de Ca
2+

a travs de canales.
Otro agonista que provoca contraccin del ileon en la especie humana es la histamina, sin
embargo, en el ileon de rata no se detecta contraccin provocada por histamina. Esto es
debido a que en la rata existen pocos receptores a histamina, por ello para estudiar frmacos
cuyo mecanismo este relacionado con estos receptores, tendremos que recurrir a otra especie,
normalmente la cobaya.
A continuacin comprobaremos que la ACh contrae el ileon de rata y observaremos el efecto
provocado pro otros agonistas.
M
3
ACh
G
q
PLC
IP
3
DAG
C
a
2+
[ C
a
2+
]
C
a
2+
PKC
+
+
contraccin
+
Colina + acetilo
ACE
diltiazem
M
3
ACh
G
q
PLC
IP
3
DAG
Ca
2+
[ Ca
2+
]
Ca
2+
PKC
+
+
contraccin
+
Colina + acetilo
ACE
fisostigmina
atropina
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
8
4. Respuesta del ileon a diferentes agonistas
Una vez tenemos listo el ileon en el bao de rganos y tras haber estabilizado durante un 30
min, vamos a comprobar el efecto de diferentes agonistas. El protocolo que vamos a seguir es
el siguiente:
- Contraccin a ACh 10
-5
M. Aadimos 0.25 ml de ACh 2x10
-3
M
- Renovamos la SSF y una vez que vuelva a su estado basal dejamos estabilizar el
rgano unos 15 min.
- Probamos diferentes agonistas en distintos baos:
o KCl 120 mM (0.2 ml de KCl 4M)
o 5-HT 10
-5
M (0.25 ml de 5-HT 2x10
-3
M)
o NA 10
-5
M (0.25 ml de NA 2x10
-3
M)
Anotamos los resultados obtenidos. Han contrado todos los agonistas? Qu efecto ha
tenido cada uno? Explica su mecanismo de accin.
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
9
5. Realizacin de curvas dosis-respuesta
Ya sabemos que la ACh produce contraccin del ileon, a continuacin vamos a comprobar
como este efecto depende de la concentracin de ACh en contacto con los receptores, es
decir, vamos a realizar una curva concentracin respuesta a ACh.





Para ello, aadiremos al bao ACh de
manera acumulativa, manteniendo las
dosis anteriores (sin renovar la SSF entre
las adiciones de frmaco). Comenzaremos
por ACh 10
-9
M y alcanzaremos 3x10
-4
M.


ACh
Figura 6.- Contraccin en respuesta a
la adcin acumulativa de ACh
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
10
Procedemos a preparar 5 soluciones de ACh de concentraciones crecientes, de las cuales se
administran al bao las siguientes cantidades:
solucin preparada orden volumen administrado concentracin en bao
1. 0.25 ml 10
-9
M
sol 2x10
-7
M 2. 0.50 ml 3x10
-9
M
3. 0.25 ml 10
-8
M
sol 2x10
-6
M 4. 0.50 ml 3x10
-8
M
5. 0.25 ml 10
-7
M
sol 2x10
-5
M 6. 0.50 ml 3x10
-7
M
7. 0.25 ml 10
-6
M
sol 2x10
-4
M 8. 0.50 ml 3x10
-6
M
9. 0.25 ml 10
-5
M
sol 2x10
-3
10. 0.50 ml 3x10
-5
M
11. 0.25 ml 10
-4
M
sol 2x10
-2
12. 0.50 ml 3x10
-4
M

En la pantalla del ordenador comprobaremos como aparece una contraccin parecida a la
recogida en la figura 6.
6. Construccin de la curva dosis-respuesta
Una vez obtenidas las grficas, se miden contraccin en gramos, se corrigen los resultados
restando el valor basal de contraccin y se expresan los resultados en porcentajes del efecto
mximo, al que se considera 100% de efecto. La representacin grfica del experimento se
suele realizar utilizando la escala logartmica, resultando una curva de forma sigmoidea. En el
eje de ordenadas se representa el porcentaje de efecto y en el de abscisas el log de la
concentracin molar de agonista (ACh).
Una vez representada la curva, se puede calcular la dosis eficaz 50 (DE
50
), que se define como
la concentracin de frmaco capaz de provocar el 50% de efecto. Al ser un numero exponecial
negativo, se suele representar como pD
2
.
pD
2
= -log DE
50

Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
11
Para realizar este clculo es muy til utilizar la parte de la cuva con valores de y=20 a y=80%.
En esa zona, el comportamiento es lineal y por tanto el clculo matemtico de una ecuacin
(y=mx + b) se simplifica.
En esta tabla podemos anotar los resultados obtenidos en nuestro experimento, para luego
poder construir la curva dosis-respuesta.
conc ACh log [ACh] Contraccin (g) Contrac-Basal % Efecto
basal - 0 (E/Emax) x 100
10
-9
M -9
3x10
-9
M -8.5
10
-8
M -8
3x10
-8
M -7.5
10
-7
M -7
3x10
-7
M -6.5
10
-6
M -6
3x10
-6
M -5.5
10
-5
M -5
3x10
-5
M -4.5
10
-4
M -4
3x10
-4
M -3.5

Una vez obtenidos los puntos, representamos nuestra curva aproximando al modelo sigmoideo.











-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
50
100
DE
50
= 3x10
-7
pD
2
= 6.5
log [ACh]
%

E
f
e
c
t
o
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
12
7.- Empleo del rgano aislado para identificar mecanismos de accin
Como ejemplo prctico de utilidad de los experimentos con rgano aislado para identificar
mecanismos de accin, vamos a estudiar los mecanismos de tres frmacos:
- Atropina: antagonista competitivo reversible del receptor muscarnico
- Diltiazem. antagonista de los canales de Ca
2+
. Al impedir la entrada de Ca
2+
inhibe la
contraccin provocada por ACh comportndose como agonista no competitivo.
- Fisostigmina: inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa, encargada de la destruccin de la
ACh. Potencia la accin de la ACh porque inhibe su degradacin.
Para comprobar estos mecanismos procedemos a realizar el siguiente experimento:
1. Construir la curva concentracin-respuesta a ACh en ileon aislado de rata
2. Lavar el tejido durante 30 min
3. Incubar con ATROPINA (10
-8
M) 15 min de incubacin y repetir la curva concentracin-
repuesta (por ejemplo en los baos 1 y 4)
4. Incubar con DILTIAZEM (10
-6
M) 15 min de incubacin y repetir la curva concentracin-
repuesta (por ejemplo en los baos 2 y 5)
5. Incubar con FISOSTIGMINA (10
-7
M). La Fisostigmina se aade al bao de rganos justo
antes de repetir la curva dosis-respuesta. (por ejemplo en los baos 3 y 6)
6. Volver a construir la curva concentracin-respuesta a ACh
Con los resultados obtenidos seremos capaces de identificar cada frmaco, ya que tienen
mecanismos de accin distintos y por tanto, las modificaciones que consigan de las curvas
dosis-respuesta a ACh sern diferentes.







En la figura se recogen unos resultados tpicos de la curva dosis-respuesta a ACh en presencia
de atropina. La representacin de las curvas dosis-respuesta se hace de manera similar a lo
ACh ACh
Atropina
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
13
recogido en la seccin anterior. Debemos tener en cuenta que nuestra intencin es comparar la
curva en presencia de los frmacos ensayados (la segunda) con la realizada en ausencia de
ellos (la primera, en la que solo tenamos ACh). Por este motivo, a la hora de calcular el efecto
mximo, deberemos tomar como valor de referencia el mximo conseguido en la primera curva.
Teniendo en cuenta los mecanismos de accin de diltiazem, atropina y fisostigmina resumidos
en el esquema de la figura 6, Cmo esperas que modifiquen estos frmacos las curvas dosis-
respuesta a ACh?. Se asemejan los resultados obtenidos a los esperados?. Discute los
resultados.

Bibliografia
- Florez J. Farmacologia Humana Ed Masson (4 edicin) 2003.
- Barastegui Almagro C. Esquemas y prcticas de Farmacologa. Ed Espaxs 1976.

Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
14
Preparacin de disoluciones
1.- Preparacin de la solucin slina fisiolgica de Krebs-Henseleit
Solucin Madre para 1L
peso PM
NaCl 82.6 g 58.44
MgSO
4
. 7H
2
O 3.5 g 246.48
PO
4
KH
2
1.94 g 136.09
KCl 4.22 g 74.56

Disolucin de CaCl
2
0.1 M para 500ml
CaCl
2
7.36 g 147

Preparacin Krebs Henseleit para 1L
84 ml de solucin madre
2 g de glucosa
2 g de NaHCO
3

20 ml CaCl
2
(0.1 M)

Preparacin de ACh 2x10
-2
M para 25 ml
0.0904 g / 25 ml
Preparacin de diluciones







4.5 ml H
2
O 9 ml H
2
O 9 ml H
2
O 9 ml H
2
O
9 ml H
2
O
ACh 2x10
-1
M
2x10
-2
M 2x10
-3
M
2x10
-4
M 2x10
-5
M 2x10
-6
M
0.5 ml
ml
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
2x10
-7
M
1 ml
9 ml
Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia
15
Preparacin de Antagonistas
1.- ATROPINA
solucin stock en el congelador 10
-3
M. Preparacin de diluciones:





Aadir al bao 0.5 ml de la disolucin 10
-6
M, la concentracin alcanzada en bao ser 10
-8
M
2.- DILTIAZEM
solucin stock en el congelador 10
-3
M. Preparacin de diluciones






Aadimos 0.5 ml de la disolucin 10
-4
M, en bao tendremos 10
-6
M
3.- FISOSTIGMINA
solucin stock en el congelador 10
-3
M. Preparacin de diluciones






Aadimos 0.5 ml de la disolucin 10
-5
M, en bao tendremos 10
-7
M

Atropina 10
-3
M
Atropina 10
-5
M Atropina 10
-4
M Atropina 10
-6
M
9 ml H
2
O 9 ml H
2
O
9 ml H
2
O
1 ml
1 ml
1 ml
Diltiazem 10
-3
M
Diltiazem 10
-4
M
9 ml H
2
O
1 ml
Fisostigm 10
-3
M
Fisostigm 10
-5
M Fisostigm 10
-4
M
9 ml H
2
O
9 ml H
2
O
1 ml
1 ml