MANUAL DE PRCTICAS

BIOLOGA CELULAR Y
MOLECULAR II






DR. MIGUEL MARTINEZ TRUJILLO

M.C. HUGO ALEJANDRO FARIAS CHAGOYA

DRA. LOURDES BALLESTEROS A.

MC. JOSE LUIS ABREGO ARANDA



AGOSTO 2011
2
INTRODUCCIN


La Biologa Celular y Molecular en la actualidad ha tenido un avance
muy notable, ya que se ha dado la aplicacin de nuevos mtodos para el
anlisis de la clula en todos sus niveles. Para tener un mayor
conocimiento acerca de la organizacin molecular de la clula es necesario
que sea a partir del estudio de las diferentes molculas que la conforman.
Esto nos permite enfocar cada uno de los fenmenos celulares que
se llevan a cabo en aquella.

Este curso pretende analizar al ncleo y los distintos mecanismos
moleculares que se llevan a cabo durante el ciclo celular, tales como la
formacin y asociacin de los cidos nucleicos que constituyen el material
gentico de los organismos.


Objetivos:


1.- Comprender la duplicacin del material gentico por medio de la
observacin y anlisis de las diferentes etapas celulares.


2.- Aprender diferentes tcnicas de estudio en Biologa Celular.


Lineamientos en el laboratorio:

Se recomienda que se lea cada prctica antes de presentarse a la
sesin de laboratorio, ya que este curso est dirigido hacia la aplicacin de
tcnicas de estudio de la Biologa Celular. Para lo cual se pide el diseo y
control sobre los experimentos que se estn realizando.

El alumno deber contar como mnimo en cada sesin de prcticas
con el siguiente material:

1.- Manual de prcticas de Biologa Celular y Molecular II.

El alumno deber observar buena conducta dentro del laboratorio y
cumplir con los Lineamientos que marca el Reglamento interno de los
Laboratorios de Docencia:

3
1.- El uso de la bata en el laboratorio es obligatorio, NO permitiendo el
acceso al mismo a ningn alumno si no se trae en ese momento.

2.- El alumno deber tener limpio su lugar de trabajo, por tal motivo
deber depositar la basura en los cestos y no en el suelo y no se permite la
ingesta de bebidas ni alimentos dentro del laboratorio.

3.- Al trmino de la prctica todo el material de cristalera utilizado
debe estar perfectamente bien lavado y sus mesas de trabajo limpias.

4.- Trabaje en orden, evitando distraer a sus compaeros cuando estn
realizando sus experimentos. El alumno desordenado ser suspendido de la
sesin en curso.

5.- Esta prohibido el huso de celulares dentro del laboratorio como medio
de comunicacin. Solo podrn ser utilizados para la toma de fotografas de
las preparaciones cuando as lo requieran, para una mayor calidad en el
reporte.

EVALUACION DEL CURSO

Se pasar lista de asistencia dentro de los primeros 15 minutos, despus de
este tiempo se contar como falta y no se le permitir la entrada al
laboratorio.

La evaluacin final de la parte prctica tendr un puntaje mximo de 3.0
(30 % de la calificacin final) la cual ser sumado a la calificacin
terica correspondiente.

Ambas calificaciones (terica y practica), debern ser aprobatorias de lo
contrario automticamente tendrn que presentar el examen extraordinario.

El curso tendr un examen de evaluacin final.

Sistema de Evaluacin

1.- Se requiere el 80 % de asistencia a las sesiones de laboratorio lo cual
representar el 5% del curso prctico y el derecho a examen final.

2.- Los reportes de laboratorio que representan el 10%

3.- El examen final que tendr un valor del 15%

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REPORTE

1).- Referencias: Citar cuando menos una fuente bibliogrfica, la cual
Deber incluir: Autor, Ttulo, Editorial, Pas y Ao. No se
aceptarn pginas de internet

2) El informe ser evaluado POR EQUIPO y al trmino del semestre,
todos entregaran sus manuales debidamente contestados.

3) Solo se reportarn los resultados y el cuestionario en el mismo manual,
en caso de requerir ms hojas se anexaran. No se aceptarn hojas sueltas.
































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CONTENIDO






PRCTICA No. 1 MITOSIS EN CELULAS VEGETALES



PRCTICA No. 2 CARIOTIPOS EN RAICES DE HABA ( Vicia faba )



PRCTICA No. 3 MEIOSIS EN CELULAS DE Listoncillo
(Chlorophytum comosum).



PRCTICA No. 4 PURIFICACIN DE ADN EN PLANTAS



PRCTICA No. 5 AISLAMIENTO DE ADN PLASMDICO EN
BACTERIAS


PRCTICA No. 6 ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE
AGAROSA


PRCTICA No. 7 CODIGO GENETICO Y TRADUCCIN


PRCTICA No. 8 EJERCICIOS DE BIOLOGA MOLECULAR










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PRCTICA NMERO 1

MITOSIS EN CELULAS VEGETALES

Introduccin:

La mitosis es el proceso celular por el cual las clulas somticas se
dividen para originar nuevas clulas hijas, son las encargadas de provocar
el crecimiento y desarrollo de un organismo, esto es, las clulas aumentan
en nmero por divisin, como resultado de la mitosis. Los ncleos
resultantes mantienen el mismo nmero e identidad de los cromosomas de
la clula de la cual derivan.

La mitosis es un proceso bajo control gentico, el cual ha sido
dividido en cuatro fases: PROFASE, METAFASE, ANAFASE y
TELOFASE. Teniendo cada una de estas sus etapas intermedias
correspondiente. Adems de la etapa terminal de la divisin celular llamada
CITOCINESIS Este proceso celular ocurre en todas las regiones
meristemticas puntos de crecimiento de una planta.


Objetivo:

Observar las diferentes etapas de la mitosis en clulas vegetales.


Parte Experimental:

Material por equipo:
Microscopio compuesto
Navajas de afeitar
Toallas Sanitas
Aguja de diseccin (recta)
Portaobjetos y cubreobjetos
Vidrios de Reloj
Lmpara de alcohol

Reactivos:
Acetocarmin
HCl 1N
Aceite de inmersin
Material biolgico:
20 Semillas de haba germinadas de 8 das de edad.
7


Procedimiento:

1.- Realice cortes transversales lo mas delgado posible en los pices
Radicales de las habas.

2.- Coloque los tejidos un vidrio de reloj o en un portaobjetos limpio y
cbralos con gotas de HCl 1 N durante 15 minutos.

3.- Transcurrido el tiempo anterior, quite el exceso de cido y adicione
Acetocarmin tambin por espacio de 15 minutos.

4.- Posteriormente proceda a observar las diferentes etapas de mitosis al
Microscopio.

Presentacin de resultados:

I).- Esquematice cada fase de mitosis observada colocando el aumento, la
etapa mittica y su correspondiente explicacin.

II).- Usted deber ubicar como mnimo 9 fases celulares, estas son: Profase
temprana, Profase media, Profase tarda, Prometafase, Anafase
temprana, Anafase tarda, Telofase temprana, y Telofase tarda.

III).-Para realizar lo anterior, auxliese de las fotografas que se anexan en
esta prctica.
















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Cuestionario:

1.- Explique en que consisten cada una de las etapas de la mitosis.
2.- Por qu se utilizan pices radicales en estudios celulares, que ventaja
representa su utilizacin.
3.- Describa y esquematice la cariocinesis y la citocinesis, asimismo defina
lo que es eucromatina y heterocromatina.








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PRCTICA NMERO 2

CARIOTIPOS EN RAICES DE HABA

Introduccin:

En 1931, Levintsky llam cariotipo al complemento cromosmico
particular de un individuo grupo afn de individuos. Las caractersticas
del cariotipo son constantes para las especies y pueden utilizarse, al igual
que la morfologa externa, para su clasificacin taxonmica. Su anlisis
comparativo nos permite inferir relaciones filogenticas entre los diferentes
taxa.
Definido tanto por el nmero como la forma de los cromosomas, es
posible mediante el anlisis de estas caractersticas detectar la diversidad de
mecanismos citolgicos surgidos en el curso de la evolucin de los seres
vivos. Con base en el cariotipo es posible observar si existen nmeros
anormales de cromosomas e identificar el sexo de los organismos.

Los cariotipos se definen con respecto a las siguientes caractersticas:
1).- Nmero de cromosomas
2).- Tamao absoluto y relativo de cada cromosoma
3).- Relacin de brazos cromosmicos
4).- Posicin centromrica
5).- Constricciones secundarias

Objetivo:
Manejar las tcnicas de obtencin de cariotipos en plantas

Material por equipo:

Microscopio compuesto
Porta y cubreobjetos
Aguja de diseccin (recta)
Toallas Sanitas
Navajas de afeitar o bisturi

Reactivos:

HCl 1 N
Alcohol al 70%
Acido actico al 45 %
Solucin de acetocarmin
Aceite de inmersin
10
Colorante Feulgen
8 Hidroxiquinoleina o Ortho-Para dicloro benceno.
Farmer

Material biolgico:

*Semillas de haba germinadas de 10 das de edad o races recin cortadas
de plantas jvenes. ( Material preparado por el alumno)

Procedimiento:

1.- Se deben seleccionar los pices radicales de las habas que presenten
mejores condiciones, es decir que no tengan lesiones manchas cafs.

2.- Se ponen a pretratar en 8 Hidroxiquinoleina o Ortho-Para dicloro
benceno durante 2 a 3 horas a 4 C.

3.- Se colocan en fijador Farmer (Alcohol etlico absoluto: cido actico
glacial en proporcin 3:1) durante 24 horas y se cambian a Alcohol 70%
hasta su utilizacin.

4.- Despus de la fijacin de las races se lleva a cabo una hidrlisis
colocando las mismas en HCl 1N durante 16 min a 60C.

5.- Inmediatamente se pasan al colorante Feulgen pera la tincin de los
cromosomas por lo menos una hora.

6.- Se realizan cortes muy finos del pice y se colocan estos cortes en un
portaobjetos limpio y seco con gotas de Acetocarmn o acetorceina, las
suficientes para cubrir totalmente los tejidos. Se calientan brevemente en la
lmpara de alcohol evitando que llegue a ebullicin.

7.- Posteriormente se coloca el cubreobjetos y se presiona con la goma de
un lpiz cuidando de no romper el cubreobjetos, se puede presionar con el
pulgar poniendo encima papel filtro o toalla sanita para quitar exceso de
colorante.

Nota: Tenga cuidado de no dejar deshidratar los tejidos, esto es, deber
de agregar un reactivo enseguida del otro, teniendo un breve espacio
para secarlo.

8.- Despus se pueden adicionar gotas de cido actico al 45 % , colocando
el cubreobjetos y observando al microscopio.
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Presentacin de resultados:

I).- Deber ubicar distintos campos celulares, teniendo especial atencin en
aquellas clulas que presenten los cromosomas bien separados.


















Cuestionario:


1.- Por qu cree usted que se observan mejor los cromosomas en metafase
Mittica y no en otra fase celular?

2.- Podra trabajar con semillas sin germinar para poder observar los
cromosomas?

3.- Explique por qu los cromosomas se pueden teir con acetorcena.

4.- Describa al menos 4 cariotipos en plantas, colocando en una tabla
comparativa el nmero de cromosomas, tamao, forma y posicin del
centrmero.







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PRCTICA NMERO 3

MEIOSIS EN CELULAS DE LISTONCILLO


Introduccin:

En eucariontes la reproduccin sexual est asociada a un proceso
especial de divisin del ncleo llamado MEIOSIS. En este fenmeno de
divisin celular existe una profase larga, durante la cual los cromosomas
homlogos se aparean longitudinalmente (sinapsis) e intercambian
segmentos de cromatina o material gentico por un proceso llamado
entrecruzamiento.

La meiosis es un mecanismo que distribuye las unidades hereditarias
( Genes ) permitiendo tambin su recombinacin aleatoria independiente
en grado variable.

Objetivo:

Observar e identificar las distintas etapas de la meiosis.

Parte Experimental:

Material por equipo:
Microscopio compuesto
Pipetas pasteur
Navajas de afeitar
Porta y cubreobjetos
Lmpara de alcohol
Agujas y pinzas de diseccin
Cajas de petri

Reactivos:

Acido actico al 45 %
Acetocarmn al 1 %
Etanol al 70 %

Material biolgico:

Inflorescencias de listoncillo

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Procedimiento:

1.- Fije con anticipacin inflorescencias de listoncillo en solucin Farmer.

2.- El da de la prctica transfiera las inflorescencias a una caja de petri que
contenga Etanol al 70 %.

3.- Utilice sus pinzas para tomar 3 florecillas.

4.- De cada florecilla separe las anteras y colquelas en un portaobjetos
limpio, cubrindolas con gotas de acetocarmn al 1 % durante 15
minutos.

5.- Corte con su navaja las anteras transversalmente, y presinelas para
exprimir su contenido.

6.- Posteriormente remueva las anteras y cubra los granos de polen con
gotas de colorante y cido actico al 45 % .

7.- Enseguida coloque el cubreobjetos sin presionar y caliente la
preparacin levemente utilizando su lmpara de alcohol evitando que el
lquido hierva.

8.- Observe sus preparaciones al microscopio.

















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Presentacin de resultados:

Realice esquemas de las diferentes fases de la meiosis, el aumento
correspondiente, las estructuras y la explicacin de la fase meitica que
est usted observando.

Cuestionario:

1.- Por qu puede observar la meiosis en las inflorescencias y no en otros
tejidos?

2.- Durante la primera profase de la meiosis ocurre un evento de gran
relevancia desde el punto de vista gentico. Descrbalo.

3.- Explique en detalle las etapas de la meiosis. Esquematice.



























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PRCTICA NMERO 4

PURIFICACIN DE ADN EN PLANTAS

Introduccin:

Una de las herramientas ms importantes en la biologa molecular es
precisamente la extraccin y purificacin de cidos nucleicos la cual se
puede realizar de diferentes organismos, tales como virus, bacterias,
humanos, plantas, entre otros.

Para este propsito existe una gran cantidad de mtodos, muchos de
los cuales resultan lentos y costosos, actualmente ya se cuenta con mtodos
ms rpidos y muy eficientes tal es el caso de los kits comerciales
especficos para ciertos tipos de tejidos.

En esta ocasin se utilizar un Kit comercial llamado Plant
DNAZOL.

Objetivo:
Analizar la importancia que tiene la extraccin y purificacin del
ADN en la biologa molecular.

Material biolgico:
Hojas de plantas herbceas sin cutcula gruesa y glabras.

Reactivos:
Agua desionizada estril
Isopropanol
Etanol
Nitrgeno lquido (precaucin 200 C)
TE buffer (pH 8.0)
NaOH 8 mM
cloroformo.
EDTA 1 mM

Cristalera:
Mortero y pistilo previamente enfriados (-20 C) 15 minutos antes de
iniciar el experimento
2 tubos Eppendorf de polipropileno de 1.5 ml fros
1 esptula
Papel Aluminio

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Parte Experimental:

Descripcin:
Plant DNAZOL es un reactivo especficamente formulado para el
aislamiento de ADN genmico de plantas. Y el procedimiento se basa en el
uso de una nueva solucin ltica de un detergente de guanidina, la cual
hidroliza al RNA y permite la precipitacin selectiva del DNA del lizado.

El procedimiento de extraccin es rpido y permite el aislamiento de ADN
de distintos tejidos de plantas. El ADN extrado permite ser usado en
anlisis de Southern blot, hibridacin, clonacin molecular, PCR, etc.

Nota: el reactivo Plant DNAZOL contiene irritantes por lo que es
necesario evitar el contacto con la piel y ojos, en caso de contacto lavar
copiosamente con agua, es necesaria atencin mdica.

Procedimiento:

Extraccin:

1.- Pesar 1 g. de tejido de planta, lavarlo con detergente y enjuagarlo con
agua fra estril y secarlo con una toalla de papel.

2.- Colocar el tejido ya seco en un mortero y congelar lo ms pronto
posible en nitrgeno liquido.

3.- Moler el tejido en un mortero con nitrgeno lquido hasta obtener un
polvo muy fino; colocando aproximadamente 0.2 g. en un tubo
eppendorf de 1.5 ml fro.

4.- Adicionar 0.6 ml del reactivo Plant DNAZOL y agitar suavemente
por unos segundos .

5.- se incuba en agitacin a 25C durante 5 min.

6.- Se adicionan 0.6 ml de cloroformo mezclando vigorosamente y se
incuba en agitacin a 25C durante otros 5 min.

7.- El extracto se centrifuga a 12,000 rpm por 10 min. y se transfiere el
sobrenadante (fase acuosa) resultante a un tubo Eppendorf limpio y estril


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Precipitacin:

8.- Despus de la centrifugacin, el ADN resultante en la fase acuosa del
extracto, se precipita con 0.5 ml de alcohol etlico absoluto (etanol). Se
mezcla por inversin durante 6 a 8 veces y se almacena a temperatura
ambiente por 5 min.

9.- Para sedimentar el precipitado de ADN se centrifuga a 5000 rpm por 4
min. y se remueve el etanol. (En ocasiones el ADN precipitado no se
observa antes de la precipitacin).

10.- en ocasiones es necesario lavar el ADN utilizando 0.3 ml de plant
DNAZOL y 0.3 ml de etanol al 75%, volviendo a centrifugar a 12,000 rpm
por 4 min. Eliminando el sobrenadante.

11.- Por ultimo la pastilla se seca a temperatura ambiente y se solubiliza el
ADN en 500 l. de Buffer TE pH 8 agua desionizada estril.

12.- Se analiza la integridad del ADN en un gel de agarosa al 0.8%.





Cuestionario:

1.- Explica la importancia que tiene el purificar ADN.

2.- Con qu finalidad se emplearon los siguientes reactivos, etanol,
cloroformo, EDTA, Plant DNAsol. Durante el proceso de extraccin y
purificacin del ADN:

3.- Que es un agente caotropico







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PRCTICA NMERO 5
AISLAMIENTO DE ADN PLASMDICO EN BACTERIAS

Introduccin:

El trmino plsmido fue presentado por primera vez por el bilogo
molecular norteamericano Joshua Lederberg en 1952, Los plsmidos son
molculas de ADN extracromosmico circular o lineal que se replican y
transcriben independientes del ADN cromosmico. Estn presentes
normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas
como las levaduras. Su tamao vara desde 1 a 250 kb. El nmero de
plsmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta
algunos cientos por clula.

Los plsmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que le
confieren una ventaja selectiva lo cual les da la habilidad de hacer a la
bacteria, resistente a los antibiticos y permiten seleccionar clones
recombinantes.

Los plsmidos se utilizan en ingeniera gentica por que es
relativamente fcil manipularlos e insertar nuevas secuencias genticas.
Cada plsmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como
un origen de replicacin u ORI (un punto inicial para la replicacin del
ADN,














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Objetivo:

Aislar el ADN bacteriano mediante la tcnica de Mini-Prep (Sambrook y
Col., 1989).

Material biolgico:
Bacterias de la cepa E. coli que contiene el plasmido pRBCS

Material:
tubo eppendorf 1.5 ml frios
centrifuga
Vortex
micropipeta

Reactivos:
Medio LB
Solucin fra Birboin 1 (Glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8.0, EDTA
10 mM pH 8.0)

Solucin Birboin 2 (NaOH 0.2N, SDS 1%)

Solucin Birboin 3 (Acetato de potasio 3M, cido actico glacial 5M)
Isopropanol
Agua desionizada estril
Hielo


La tcnica se describe a continuacin:
a) Inocular una colonia en medio LB con el antibitico especfico, de
ser necesario de 2 a 4 ml de medio.
b) Incubar toda la noche a 37C con agitacin.

c) Vaciar en un tubo eppendorf 1.5 ml y centrifugar a 12 000 rpm a por
2 minutos.
d) Eliminar el sobrenadante.( En agua con cloro)
e) Resuspender la pastilla en 150 l de solucin fra Birboin 1
(Glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8.0, EDTA 10 mM pH 8.0).
Agitar en Vortex o resuspender con pipeta.
f) Adicionar 300 l de solucin Birboin 2 (NaOH 0.2N, SDS 1%)(se
prepara al momento), mezclar suavemente con la mano (no usar
Vortex) y dejar en hielo por 5 minutos.
g) Adicionar 225 l de solucin Birboin 3 (Acetato de potasio 3M,
cido actico glacial 5M), agitar suavemente (no usar Vortex) para
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disgregar los restos celulares. Si se usa Vortex se libera el ADN.
cromosomal a la solucin y se mezcla con el ADN plasmdico, lo
cual no es conveniente. Dejar 10 minutos en hielo.
h) Centrifugar a 12 000 rpm por 10 minutos a 4C.
i) Tomar 600l de sobrenadante limpio sin precipitado.
j) Adicionar 600l de isopropanol. Refrigerar durante al menos una
hora.
k) Centrifugar a 12 000 rpm por 20 minutos.
l) Retirar el etanol con la pipeta evitando arrastrar la pastilla. Dejar
secar a temperatura ambiente.
m) Resuspender en 40 l de agua desionizada estril.

n) Correr 2 l en un gel de agarosa para corroborar la presencia del
plsmido.

Cuestionario:
1.- Que ventajas le representa el ADN plasmdico a la bacteria que lo posee


2.- Describe el proceso de transformacin gentica por Agrobacterium
tumefaciens.


3.- Describe la estructura completa de un plasmido.
















21
PRCTICA NMERO 6
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Introduccin:

La electrofresis es una tcnica comnmente utilizada en biologa
molecular para separar molculas de ADN de una mezcla, utilizando la
aplicacin de un campo elctrico.
Las molculas de ADN en un campo elctrico se mueven migran
en direccin determinada por su carga elctrica.
El ADN se encuentra cargado negativamente y migra del ctodo (- )
al nodo (+) con una movilidad que depende primeramente del tamao de
la molcula.
Por ejemplo: Un fragmento grande de ADN lineal migra a travs de
una matriz de gel (agarosa acrilamida) ms lentamente que uno pequeo.

Objetivo:

Conocer la electroforesis como una tcnica de separacin de molculas de
ADN.

Parte Experimental:

Material:

Cmara de electroforsis horizontal
Fuente de poder

Reactivos:

Agarosa
TAE ( Buffer de electroforesis )
Tris-Base
Acido actico glacial
EDTA 0.5 M ( pH 8.0 )
Colorante de carga 6X Naranja G o azul de bromofenol
Solucin de Bromuro de Etidio (10 mg/ml) (EtBr)





22
Procedimiento:
Preparacin del gel

Preparar 500 ml. de gel de agarosa al 0.8% en un matraz Erlen meyer de
750 ml. pesando 4.0 gramos de agarosa y disolvindola en los 500 ml de
buffer TAE 1X (Tris-Base 0.04M, EDTA 0.01M, cido Actico 0.04M).
Para disolver completamente caliente la muestra en un horno de
microondas. Posteriormente vaca 100 ml. en otro matraz de 250 ml. y
adiciona 0.5l de colorante GelRed GelGreen TM.
(Figuras1-3).



Fig.1 Fig.2 Fig. 3
Vace la solucin de agarosa en la base de la cmara de electroforesis,
ensamblndola previamente o sellndola con cinta adhesiva (Figura
izquierda). Coloque el peine del tamao de dientes adecuado para que se
formen los pozos. Deje enfriar aproximadamente 30 minutos hasta que el
gel se endurezca y adquiera un aspecto blanquecino.
Retire el peine (Figura derecha) y coloque el gel en la orientacin adecuada
para que los pozos queden hacia el polo negativo (negro). Llene la cmara
con buffer TAE 1X hasta que se cubra el gel, aproximadamente 1.0 mm
por encima de l.

23

Para colocar las muestras en el gel mezcle 3 l de solucin del ADN con 3
l de buffer de carga (Azul de bromofenol 0.25%, glicerol 30%). Para esto
se puede auxiliar con papel Parafilm. (Figura izquierda) Tome el
contenido y descrguelo en un pozo teniendo cuidado de no derramar la
muestra (Figura derecha).
















Como control se cargar una muestra con fragmentos de ADN de tamao
conocido (marcadores moleculares) (Figura izquierda)
Coloque los cables de corriente y corra el gel a 90 voltios,
aproximadamente, hasta que el primer colorante migre unas partes del
tamao del gel (Figura derecha).















24
Observe el gel al transiluminador de luz ultravioleta (Figura izquierda) y
capture la imagen con una cmara digital. En la figura derecha se observan
productos de ADN.
















Cuestionario:

1.- Describa en que se basa el principio de electroforesis

2.- Para qu se utiliza el reactivo GelRed

3.- Explique para qu sirve la agarosa y de donde se obtiene.

















25
PRACTICA No. 7
CODIGO GENETICO Y TRADUCCIN
Introduccin
El cdigo gentico es el conjunto de normas por las que la informacin
codificada en el material gentico (secuencias de ADN o ARN) se traduce en protenas
(secuencias de aminocidos) en las clulas vivas. El cdigo define la relacin entre
secuencias de tres nucletidos, llamadas codones, y aminocidos. Un codn se
corresponde con un aminocido especfico.
La secuencia del material gentico se compone de cuatro bases nitrogenadas
distintas, que tienen una funcin equivalente a letras en el cdigo gentico: adenina (A),
timina (T), guanina (G) y citosina (C) en el ADN y adenina (A), uracilo (U), guanina
(G) y citosina (C) en el ARN.
Debido a esto, el nmero de codones posibles es 64, de los cuales 61 codifican
aminocidos (siendo adems uno de ellos el codn de inicio, AUG) y los tres restantes
son sitios de parada (UAA, llamado ocre; UAG, llamado mbar; UGA, llamado palo).
La secuencia de codones determina la secuencia aminoacdica de una protena en
concreto, que tendr una estructura y una funcin especficas.




























26
Traduccin del ARN
La informacin gentica llevada por el ARNm deber ser traducida en el
citoplasma por los ribosoma (ste est compuesto por varios tipos de protenas ms una
forma de ARN, denominado ARN ribosmico). En el ribosoma no se podr comenzar la
lectura de un mensajero ms que por una secuencia particular, distinta en las clulas
eucariontes y en las procariontas. Asido el ARNm en el ribosoma, el tercer tipo de ARN
-ARN de transferencia (ARNt)- entra en accin.
Existen muchos tipos de ARNt y cada uno es capaz de reconocer determinados
grupos de tres bases (codones) del ARNm. A cada triplete de nucletidos, los ARN de
transferencia hacen corresponder uno de los veinte aminocidos que constituyen las
cadenas polipeptidicas, las protenas. La informacin es inscrita de un trazo en el ADN
bacteriano, pero en los organismos superiores se ha descubierto hace una decena de
aos que la informacin gentica constituye un mosaico en los que la informacin til
es interrumpida por secuencias no codificantes, aparentemente intiles, llamadas
intrones (las secuencias codificantes son llamadas exones).En la clula eucarionte, en
principio, el ARNm transcribe todo, intrones incluidos.



















Los objetivo de este laboratorio son los siguientes:
1.-Estudiar la relacin entre la secuencia de nucletidos de una molcula del mRNA y la
sntesis de protenas.
2.- Demostrar cmo una mutacin en la secuencia de nucletidos de una molcula de
ARNm modifica los resultados en la secuencia de aminocidos de una protena.

27
El cdigo gentico
Un paso importante fue el descubrimiento del cdigo gentico por Nirenberg en
1961. El observo que al agregar ARN a un extracto libre de clulas de E. coli este era
capaz de traducirlo en protenas, la composicin de las nuevas protenas sintetizadas
pudieron ser cuantificadas por la incorporacin radiactiva de aminocidos dentro de las
protenas traducidas.
Para iniciar Laboratorio de TranslationLab primero haz click en el botn de Start
Experiment












1. Selecciona cada uno de los nucletidos haciendo click en las flechas de cada botella,

2. Trata primero con AU, haz click en make ARN para que veas la secuencia del
mensajero que creaste y gurdala en tus notas,
3. Para traducir tu secuencia a aminocidos haz click en el botn de Translation Mix y
adicinalos a tus notas.
4. Luego contina con AAU, y AUU. Notaste algn cambio?, Cmo puedes explicar
este resultado?

5. Ahora intenta con GGG, GGA, GGC, y GGU. Qu aminocido sobresali en los 4
experimentos?


Mutaciones en el cdigo gentico


Esta simulacin te permitir estudiar los efectos de mutaciones en un gen de
globina y aprender como una sola mutacin afecta la secuencia de la estructura de una
protena.

Escalofros, fiebre, dolor de cabeza y vmito son algunos sntomas de la
enfermedad llamada Malaria. La Malaria es causada por un protozoario, Plasmodium
vivax, que se reproduce en un mosquito llamado Anopheles y vive en pases tropicales.

28
Primero selecciona de la Web la Pagina HemoglobinLab. Y Presiona el botn de Start
lab y posteriormente selecciona de la lista de caso a la paciente Miriam Dembele.

















Lee el caso de Miriam. Ella es un caso consistente con aumento en resistencia a
la enfermedad de Malaria. Compara la muestra de sangre de Miriam con la muestra del
control sano. Hay deferencias obvias? Selecciona la vista de microscopio y toma nota
de las diferencias que hay en la estructura de las clulas rojas. La sangre muestra
caractersticas fenotpicas de la enfermedad de clulas falciformes?
Selecciona la vista de secuencia del pptido y haz click en el botn de
diferencias para identificar el aminocido cambiado en la hemoglobina de Miriam
comparada con el control de hemoglobina normal. Qu aminocido ha sido sustituido
para el gen de Miriam?, Anota la posicin del aminocido, es importante para
identificar el cambio en la secuencia de nucletidos del gen de la globina.
Selecciona Edit DNA Sequence view. Y va a aparecer la secuencia del gen de
la hemoglobina de Miriam comparado con la secuencia del gen normal, localiza el
triplete o codn con la secuencia ATG del ADN que indica la posicin del codn de
inicio que debera aparecer en el ARNm producido por la transcripcin de este gen.
Puedes teclear la secuencia ATG en la ventana de Search.


Esta accin te colocar en el nucletido 87con un delineado rojo, haz click en
Bracket Codons y te delinea los tripletes de cada codn, usando las flechas avanza hasta
el codn 6 (nucletidos 105-107).
Haz click en el nucletido 106 y cambia la A por una T y selecciona traducir
para que compares la protena que usaste para mutar, la protena de Miriam y la protena
normal.
29
Esta simple mutacin en una base, provoca la alteracin en el gen de la hemoglobina?
Explica los resultados.
Se han identificado muchas posiciones invariables en el grupo Hemo de la
hemoglobina de vertebrados e invertebrados, cambios en esos aminocidos dan como
resultado un gran nmero de serias enfermedades en la sangre, incluyendo una gran
variedad de anemias. La anemia es una condicin que involucra una anormalidad en la
capacidad para acarrear oxigeno en los glbulos rojos ya sea por la baja produccin de
glbulos rojos en el individuo o por la produccin anormal de hemoglobina en las
clulas, (Anemia o Talasemia) lo que se manifiesta por fatiga, palidez y baja de
temperatura corporal.
Una de estas variantes en los aminocidos de la beta globina es la Hemoglobina
Hammersmith, localizada en el aminocido nmero 42 del polipptido de la globina, la
mutacin da como resultado una hemoglobina inestable que no puede asir ni mantener
la posicin del grupo Hemo en la orientacin adecuada para la unin de oxigeno.
Selecciona la vista de las secuencias de los pptidos en Hemoglobin lab y
compara las secuencias de cada una de las mujeres de la lista de pacientes presionando
el botn de Find Difference hasta que encuentres a la paciente con la hemoglobina
Hammersmith. (Asegura que la secuencia del pptido inicie desde el primer
aminocido)
Qu aminocido esta sustituido para esta paciente?
Usa edit DNA Sequence para que identifiques el codn para este aminocido,
altera el codn cambiando las posiciones hasta que reproduzcas la mutacin
Hammersmith.
Puedes guiarte en la tabla de codones para confirmes la mutacin creada.




30
CUESTIONARIO
1.- Describe como se lleva a cabo la traduccin en el ribosoma.
2.- Investiga que es un ORF (Marco de Lectura Abierto) y cul es su importancia.
3.- Describe los tipos de mutaciones que existen en la naturaleza





































PRCTICA No. 8
31

EJERCICIOS DE BIOLOGA MOLECULAR


Diagnstico de infeccin por papiloma virus humano (VPH) en
cncer de cuello uterino mediante PCR

A. Introduccin
Corre el ao 1971. Susana Jimnez, una mujer de 31 aos de Colima,
Colima, est enferma. Ella visita a su mdico, quien la explora y le extrae
algunas clulas de su crvix uterino. Estas clulas fueron enviadas a un
laboratorio para determinar si ella tena un cncer de cuello uterino. Las clulas
eran increblemente malignas con Virus del Papiloma Humano y Susana
Jimnez muere ocho meses ms tarde.
Las clulas de Susana Jimnez permanecen vivas 30 aos despus de
su muerte en los laboratorios de todo el mundo.
B. Planteamiento prctico
Se trata de efectuar un diagnstico de laboratorio de la presencia del VPH
(Virus del Papiloma Humano) mediante PCR (Reaccin en Cadena de la
Polimerasa) en 5 muestras de clulas: 2 obtenidas de lneas celulares
utilizadas en los laboratorios de virologa para el cultivo de los virus (HeLa y
MRC5) y 3 obtenidas del crvix uterino de 3 pacientes (1, 2 y 3) .
1. PCR en VPH
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una de las ms
recientes y ms nuevas tcnicas disponibles y que presenta enormes ventajas
para el diagnstico de enfermedades infecciosas.
Una de ellas es la tremenda sensibilidad. En una reaccin de PCR con 30
ciclos aunque exista en el tubo una sola copia del ADN molde puede
potencialmente hacer
1 + 2
1
+ 2
2
+ 2
29
= 1.061.109.567 copias del ADN molde
Aunque la reaccin no presenta una efectividad del 100%, el PCR es
una tcnica tremendamente sensible pues consigue muchos millones de copias
a partir de una sola.

2. VPH y Cncer.
La mayora (80-90 %) de los carcinomas cervicales (cnceres)
contienen el Virus del Papiloma Humano (VPH) bien el tipo 18 (VPH18, el ms
frecuente) o bien de tipo 16 (VPH16). La relacin entre la infeccin por VPH
(que es frecuente) y la transformacin en clulas malignas (que es rara) es
compleja y todava no bien comprendida. Sin embargo el cncer cervical es
uno de los cnceres ms frecuentes en las mujeres alcanzando la cifra del 6-8
32
% del total. Por otro lado, los estudios epidemiolgicos han demostrado que el
mayor riesgo para el desarrollo de un carcinoma cervical es la infeccin por
VPH.

3. Diagnstico de infeccin con VPH.
Las infecciones por Virus del Papiloma Humano (VPH) no pueden ser
diagnosticadas por los mtodos tradicionales utilizados en los laboratorios de
diagnstico virolgico, pero el PCR permite la deteccin de estos virus.


4. Tcnica.
La tcnica a utilizar en este protocolo experimental es la deteccin del ADN del
VPH18 que se realiza en dos fases:
-Amplificacin del ADN mediante la PCR y dos iniciadores (primers) especficos
para el VPH18

-Comprobacin mediante electroforesis en gel que la zona amplificada en la
PCR con esos primers tiene un tamao molecular de 270 bp (pares de bases)
C. Protocolo experimental
1.- Reactivos
Agua destilada estril
Muestras de ADN celular
o HeLa
o MRC-5 (una lnea celular de clulas diploides humanas)
Primers especficos sintticos (2) para el Virus del Papiloma Humano tipo 18
(VPH18 o HPV18)
Buffer para PCR 10X
Taq ADN polimerasa
Aceite mineral
2.- Preparacin de muestras
Marque 6 pequeos tubos
de Eppendorf de la
siguiente manera:

N ( control negativo)
H (HeLa)
M (MRC-5)
1 (paciente 1)
2 (paciente 2)
3 (paciente 3)
33

Cuidadosamente y sin
contaminacin cruzada de
los reactivos (cambio de las
puntas de la micropipeta)
aada a cada tubo y en
este orden lo siguiente:
9l de agua
destilada estril

2l del buffer para
PCR 10X

2l de la pareja de
primers

5l del
correspondiente
ADN para cada
tubo (agua para el
control negativo)

2l de Taq
polimerasa


3.- Amplificacin del ADN en Termociclador
Este es un modelo de
termociclador o equipo de PCR
donde se procesan las muestras

34
Colocar las muestras ya
preparadas en el termociclador

En este protocolo experimental el termociclador se ajusta para que las muestras se
incuben en las siguientes condiciones:
Fase o paso T y T Accin
x 30
(30
"ciclos")
Desnaturalizacin
30
segundos
a 95C
Desnaturaliza el ADN molde
Hibridacin
30
segundos
a 65C
Los primers se unen
especficamente a las regiones
complemetarias del ADN molde
Extensin
60
segundos
a 72C
La Taq polimerasa incorpora
nucletidos entre los dos dos
primers utilizando como molde
las cadena de ADN previamente
desnaturalizada y elaborando 2
cadenas complementarias del
ADN

Las muestras ya se han procesado durante los 30
ciclos
He aqu las muestras procesadas:


4.- Colocacin de muestras amplificadas en gel de agarosa
Extraer 10 l de cada reaccin y
colquela en un nuevo tubo
Eppendorf.




35
Colocar las muestras sobre el gel de
agarosa al 2 %

Colocar tambin la muestra
suministrada del marcador de
tamaos moleculares.

Anotar en que carril se coloca cada
muestra




5.- Separacin de los fragmentos amplificados mediante electroforesis en gel de
agarosa

Realizar la electroforesis
Esperar hasta que el colorante control azul
de bromofenol haya emigrado hasta la
mitad del gel




36
6.- Visualizacin de las bandas en luz ultravioleta
Examinar el gel a la luz ultravioleta (UV) para revelar al ADN teido con el
bromuro de etidio
(PRECAUCION: No exponer directamente los ojos a la luz UV)
Este son los resultados o el aspecto que presenta el gel:




7.- Interpretacin de los resultados:
Tener en cuenta si las muestras problemas dan alguna
banda. En caso positivo tener en cuenta la posicin de
la banda para estimar el tamao molecular

La posicin indica el tamao molecular del fragmento
de ADN amplificado teniendo en cuenta la posicin de
las bandas del marcador de tamao molecular
N Banda
Marcador
Tamao molecular
(bp)
1 100
2 200
3 300
4 400
5 500
6 600
Qu muestras tienen el Virus del Papiloma Humano tipo18?
37

Interpretacin:
Control Negativo : negativo
HeLa : banda amplificada de 270 bp
MRC-5 : negativo
Paciente 1 : negativo
Paciente 2 : banda amplificada de 150
bp
Paciente 3 : banda amplificada de 270
bp
D. Cuestionario
1.- La tcnica de la PCR es tremendamente sensible aunque no sea eficiente al 100 %. Si
la PCR fuese efectiva al 100 % en 30 ciclos se obtendran un mnimo de copias del ADN
molde de:
a) Menos de 10 millones de copias
b) Unos 100 millones de copias
c) mas de 1.000 millones de copias
2.- La amplificacin ha sido negativa en las siguientes muestras:
a) HeLa, paciente 2 y paciente 3
b) Control negativo, MRC-5 y paciente 1
c) Control negativo, MRC-5, paciente 1 y paciente 2
3.- La amplificacin ha sido positiva en las siguientes muestras:
a) HeLa, paciente 2 y paciente 3
b) HeLa paciente 2
c) En ninguna de las muestras
4.- El tamao de los polinucletidos amplificados en las diversas muestras han
sido de aproximadamente:
a) Solo de 270 bp
b) Solo de 150 bp
c) de 150 y 270 bp
5.- Mediante esta tcnica se ha podido detectar el ADN del VPH18 en las clulas:
a) Paciente 2
b) Paciente 3 y HeLa
c) Paciente 2, paciente 3 y HeLa
38
DIAGNSTICO DE ANEMIA FALCIFORME
A. Objetivos del ejercicio
Se trata de interpretar los resultados de laboratorio para detectar una
enfermedad gentica mediante el estudio de los polimorfismos de ADN. Los
cambios en el gen defectivo pueden ser detectados aunque nicamente
afecten a los nucletidos que codifican un slo aminocido, si se utiliza la
adecuada enzima de restriccin que acte precisamente aL nivel de esa
secuencia bien sea sobre la normal o sobre la alterada.
Tambin se trata de familiarizarse en la utilizacin de pipetas, puntas, tubos y
equipo de electroforesis para tener una idea, aunque sea de forma virtual, de
los protocolos o procedimientos de la tcnica en el laboratorio. Este ltimo
objetivo se refiere nicamente al ejercicio realizado en la modalidad alta de
dificultad que utiliza los simuladores.

B. Planteamiento prctico
Se intenta diagnosticar en 4 pacientes (Pt1, Pt2, Pt3 y Pt4) la presencia
en su ADN del gen codificador de la hemoglobina S comparndolo con el ADN
de anemia falciforme (SS) (homocigtico de hemoglobina S) y el ADN de
hemoglobina normal (WW) (homocigtico de hemoglobina normal).
La hemoglobulina S es una protena anormal que se encuentra en los
pacientes con la enfermedad de anemia falciforme. Consta de 2 cadenas alfa
normales y dos cadenas beta mutantes en las que el aminocido en posicin 6
ha cambiado de glutamato a valina.
El diagnstico se fundamenta en el aislamiento del ADN codificador de
la cadenas betas de las hemoglobinas y la deteccin de la mutacin mediante
la enzima de restriccin Bsu36I, que fragmenta la hemoglobina normal pero
no la hemoglobina S por la mutacin.
La hemoglobina S tiene una solubilidad baja y precipita formando largos
filamentos que son los responsables de la deformacin de los eritrocitos que se
observa en la enfermedad. Esta enfermedad solo la padecen los individuos
homocigticos para el gen de la hemoglobina S.
Los glbulos rojos que contienen hemoglobina normal son redondos y
flexibles. Pero cuando los glbulos rojos de las personas afectadas con esta
enfermedad (homocigticos de hemoglobina S) liberan el oxgeno, la anomala
de la hemoglobina hace que las clulas se endurezcan y se deformen, a
menudo hasta tener la forma de una letra C, como una hoz (falciformes). Los
glbulos falciformes tienden a quedar atrapados y a ser destruidos en el hgado
y en el bazo. Como consecuencia, se produce una falta de glbulos rojos, o
anemia, la cual, en casos graves, puede provocar palidez, dificultades
respiratorias y cansancio.
Hay otros factores, como el agrandamiento del bazo y algunas
infecciones, que pueden empeorar la anemia al acelerar el proceso de
39
destruccin de glbulos rojos. Los nios que padecen anemia falciforme son
especialmente propensos a contraer graves infecciones bacterianas como las
que causan la meningitis y las infecciones de la sangre (septicemia). Las
infecciones son la principal causa de muerte entre los nios que padecen esta
enfermedad.
C. Protocolo experimental
1.-Reactivos virtuales
Muestras de ADN:
ADN de anemia falciforme (SS) de individuo homocigtico para
hemoglobina S
ADN de individuo homocigtico de hemoglobina normal (WW)
ADN de 4 pacientes para ser genotipados (Pt1, Pt2, Pt3, Pt4)
Enzima de restriccin Bsu36I
Marcador de pesos moleculares
Agua
Solucin tampn universal 10X para enzimas de restriccin

2.-Digestin de ADN por enzima de restriccin
En unos tubos marcados con los nmeros 1 al 12 se han puesto los siguientes
reactivos
Reactivos
Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
4 l de solucin tampn 10X + + + + + + + + + + + +
25 l de agua + + + + + + + + + + + +
11 l de ADN de anemia falciforme (SS) + +
11 l de ADN de individuo normal (WW) + +
11 l de ADN de paciente problema Pt1 + +
11 l de ADN de paciente problema Pt2 + +
11 l de ADN de paciente problema Pt3 + +
11 l de ADN de paciente problema Pt4 + +
1 l de la enzima de restriccin Bsu36I + + + + + +

Los tubos 1 a 6 no llevan enzimas de restriccin
Se han incubado los tubos a 37C durante 10 segundos



40
3.- Electroforesis en gel de agarosa
Mediante micropipeta se han transferido muestras de los 12 tubos a un gel de
agarosa colocndolos en los primeros 12 carriles (muestra de tubo 1 en carril 1,
muestra de tubo 2 en carril 2, etc.
En el carril 13 se ha colocado el control del tamao molecular o marcador de
pesos moleculares
Se ha efectuado la electroforesis a 300 voltios durante 2 horas
Finalizada la electroforesis y apagadas las luces de la habitacin con el
transiluminador ultravioleta se han observado las bandas con fluorescencia
4.- Interpretacin de los resultados
Tener en cuenta lo que se ha
puesto en cada carril
Los tubos 1 a 6 no llevan enzimas de restriccin

Tener en cuenta el tamao
molecular de las bandas del
marcador
N Banda
Tamao
molecular (bp)
1 150
2 300
3 450
4 600
5 750
6 900
Considerar los genotipos posibles
teniendo en cuenta el carcter
homocigtico o heterocigtico:
WW=homocigtico
hemoglobina normal

SS=homocigtico
hemoglobina S

WS=heterocigtico

41



Los resultados que se han
obtenido despus de la
electroferesis en gel de agarosa
han sido los que se recogen en
la imagen de la derecha

D. Cuestionario
1.- Las muestras de los 6 primeros tubos con ADN sin digerir con la enzima de
restriccin: han dado todas.
a) han dado toda una nica banda de unos 150 bp.
b) han dado toda una nica banda de unos 430 bp.
c) han dado toda una nica banda de unos 810 bp.
2.- En las muestras de ADN se han encontrado el siguiente nmero de
genotipos
a) Uno. b) Dos. c) Tres.
3.- La banda especfica del gen mutado de la hemoglobina S tiene un
tamao aproximado de:
a) 210 bp. b) 280 bp. c) 430 bp.
4.- El genotipo homocigtico de la hemoglobina S se han encontrado en las
siguientes muestras:
a) Pt2. b) Pt3. c) Pt2 y Pt4.
5.- El genotipo heterocigtico de la hemoglobina S se han encontrado en las
siguientes muestras:
a) Pt2. b) Pt3. c) Pt2 y Pt4.

42
Huellas dactilares del ADN

A. Objetivos del ejercicio
Comprender como las enzimas de restriccin se utilizan para cortar las molculas de ADN en
fragmentos.
Comprender como las molculas de ADN son separadas durante la electroforesis en gel de
agarosa segn su tamao.
Comprender como los polimorfismos de ADN o la tcnica de los RFLPs (Fragmentos
Polimrficos de diferente Longitud originados por enzimas de Restriccin) se utilizan para
identificar secuencias de ADN.
Familiarizarse mediante el laboratorio virtual con la tcnica de la digestin con enzimas de
restriccin.
Familiarizarse mediante el laboratorio virtual con la tcnica de separacin de los fragmentos
obtenidos en la digestin por medio de una electroforesis en gel de agarosa.
Ser capaz de determinar los tamaos de los fragmentos de ADN por sus movilidades
electroforticas.
B. Planteamiento prctico
Tpico caso de medicina legal o forense, en la que se han encontrado clulas
sobre la victima que permite identificar al sospechoso.

Sobre el ADN de espermatocitos recogidos en la victima de un asesinato con
violacin (Perp) se efecta un anlisis del polimorfismo del ADN para
compararlo con los resultados obtenidos con el ADN de clulas de 5
sospechosos (S1, S2, S3, S4 y S5)

C. Protocolo experimental
1.- Material y equipo virtual
Micropipeta y puntas amarillas 0-100 l
Equipo de electroforesis horizontal en gel de agarosa
Transiluminador UV
2.- Reactivos virtuales
Muestras de ADN:
ADN de espermatocitos recogidos en la victima de un
asesinato con violacin (Perp)
ADN de clulas de 5 sospechosos (S1, S2, S3, S4 y S5)
Enzima de restriccin BamHI y EcoRI
Marcador de pesos moleculares
Agua
Buffer universal 10X para enzimas de restriccin
Agarosa
43
Buffer para electroforesis 0.5X TBE (Tris/Borato/EDTA)
Colorante fluorescente de Bromuro de etidio
Dos colorantes con diferentes movilidades (azul de bromofenol y xilen-
cianol).
3.-Digestin de ADN por enzima de restriccin
En unos tubos marcados con los nmeros 1 al 12 se han puesto los siguientes
reactivos
Reactivos
Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
4 l de solucin tampn 10X + + + + + + + + + + + +
25 l de agua + + + + + + + + + + + +
11 l de ADN de espermatocitos sobre
victima (Perp)
+ +
11 l de ADN de clulas de sospechoso
S1
+ +
11 l de ADN de clulas de sospechoso
S2
+ +
11 l de ADN de clulas de sospechoso
S3
+ +
11 l de ADN de clulas de sospechoso
S4
+ +
11 l de ADN de clulas de sospechoso
S5
+ +
1 l de la enzima de restriccin BamHI + + + + + +
1 l de la enzima de restriccin EcoRI + + + + + +

Los tubos 1 a 6 no llevan enzimas de restriccin
Se han incubado los tubos a 37C durante 10 segundos

4.- Electroforesis en gel de agarosa
Mediante micropipeta se han transferido muestras de los 12 tubos a un gel de
agarosa colocndolos en los primeras 12 carriles (muestra de tubo 1 en carril 1,
muestra de tubo 2 en carril 2, etc.
En la carril 13 se ha colocado el control del tamao molecular o marcador de
pesos moleculares
Se ha efectuado la electroforesis a 300 voltios durante 2 horas
Finalizada la electroforesis y apagadas las luces de la habitacin con el
transiluminador ultravioleta se han observado las bandas con fluorescencia


44
5.- Interpretacin de los resultados:
Tener en cuenta los patrones electroforticos
obtenidos : nmero de bandas y su posicin
para determinar si alguno de los ADN de los
sospechosos (S1,S2, S3, S4 y S5) da el mismo
polimorfismo que el ADN de la evidencia
(Perp)

La posicin indica el tamao molecular del
fragmento teniendo en cuenta la posicin de las
bandas del marcador de tamao molecular
N Banda
Marcador
Tamao
molecular (bp)
1 150
2 300
3 450
4 600
5 750
6 900
En la prctica real se efecta con ms enzimas de restriccin para que la probabilidad de encontrar dos
ADN con iguales patrones electroforticos sea menor de 1/1 billn, de all el nombre de 'huellas
dactilares del ADN'


D. Cuestionario
1.- Las bandas con un tamao molecular superior a 750 pb se
encontraron:
a) Solamente en las 6 muestras no tratadas con enzimas
b) En las 6 muestras no tratadas con enzimas y en la S1 y S3 tratadas
con enzimas
c) Solamente en las muestras tratadas con enzimas Perp, S2, S4 y S5
45

2.- Las bandas con un tamao molecular ms bajo (inferior a 130 bp) se
encontraron en las muestras digeridas con enzimas
a) Perp y S4
b) S1 y S2
c) S3 y S4

3.- Los patrones electroforticos o polimorfismos o genotipos
presentados en las 6 muestras digeridas con enzimas de restriccin:
a) Son todos ellos (los 6) diferentes
b) Existen dos de ellos idnticos (Perp y S4)
c) Existen dos parejas de idnticos (Perp-S4 y S2-S5)

4.- Los polimorfismos detectados con solo 2 enzimas de restriccin
BamHI y EcoRI, permiten descartar a los siguientes sospechosos por
presentar ADN diferente
a) S1
b) S1 y S3
c) S1, S2, S3 y S5

5.- Aunque los ensayos se realizan con ms enzimas de restriccin, la
presentacin de un polimorfismo idntico significa que el ADN de la
evidencia 'Perp' es el mismo que el ADN del sospechoso:
a) S2
b) S4
c) S5
















46
Secuenciacin de ADN
A. Objetivos del ejercicio
Se trata de determinar la secuencia de nucletidos de un fragmento de
ADN para poder conocer o identificar a que ADN pertenece ese ADN problema
y poder realizar un diagnstico o identificacin. Se utiliza una zona del ADN
conocida y de la que se conocen las variaciones (de lo que se trate: individuos,
especies o gneros). Para llegar a esa zona del ADN conocida se utiliza un
'primer' o cebador que se una a una parte inmediata de ese ADN variable
conocido, parte inmediata que tiene que ser comn a todos ellos (los
individuos, las especies, los gneros segn sea el caso).
El objetivo concreto de este ejercicio es conseguir leer una secuencia
en un gel de secuenciacin y por lo tanto conocer o determinar la secuencia de
nucletidos de esa zona de ADN variable conocida.
Tambin se trata de familiarizarse en la utilizacin de pipetas, puntas,
tubos y equipo de electroforesis de alto voltaje para la separacin de
nucletidos en el gel de secuenciacin para tener una idea, aunque sea de
forma virtual, de los protocolos o procedimientos de la tcnica en el laboratorio.
B. Planteamiento prctico
Se intenta conocer la secuencia de nucletidos de una zona del ADN de
2 microorganismos aislados del suelo para poderlos identificar, es decir, para
poder determinar a que gneros pertenecen.
El diagnstico se fundamenta en el aislamiento del ADN ribosmico 16S
que presenta secuencias diferentes especficas y conocidas para cada gnero.
De ese ADN ribosmico 16S se selecciona una zona que varia en cada gnero
y una zona inmediata constante en todos los gneros para el primer o cebador.
Determinando la secuencia de ese fragmento variable de ADN se puede
identificar el gnero a que pertenece las bacterias aisladas o problemas. Se
trata, pues, de determinar la secuencia de ADN para poder diagnosticar al
gnero al que pertenecen.
C. Protocolo experimental
1.- La tcnica de la secuenciacin
Consiste en la sntesis de ADN mediante la ADN polimerasa, a partir de
la unin con el primer o cebador. La diferencia con una sntesis de ADN normal
es que adems de los nuclesidos trifosfato normales (dNTP) se aaden una
pequea cantidad de unos didesoxinucletidos trifosfato (ddNTP). Estos
ddNTP son molculas que parecen nucletidos normales excepto por carecer
de un grupo hidroxilo en posicin 3'. Se aaden a una cadena de ADN en
crecimiento, pero finalizan o interrumpen la sntesis de ADN porque no se
pueden aadir ms nucletidos para ampliar la cadena debido a esa carencia.

En la reaccin se mezcla la cadena sencilla del ADN que se quiere secuenciar
junto con el primer o cebador, la ADN polimerasa, los nuclesidos normales y
una pequea cantidad de uno de estos ddNTP marcados (con istopos o
47
colorantes fluorescentes). La sntesis de ADN se inicia con el cebador y finaliza
cuando se incorpora un ddNTP en lugar de un dNTP normal. El resultado es
una serie de fragmentos de longitudes diferentes. Se producen cuatro
reacciones, cada una de ellas con un ddNTP diferente:
La reaccin con ddATP produce fragmentos con A
terminal
La reaccin con ddCTP produce fragmentos con C
terminal
La reaccin con ddGTP produce fragmentos con G
terminal
La reaccin con ddTTP produce fragmentos con T
terminal
Los fragmentos se someten a electroforesis en gel de poliacrilamida, para
separar unos fragmentos de otros segn su tamao. Los fragmentos ms
pequeos, presentan un desplazamiento ms veloz y dan lugar a bandas ms
desplazadas.



2.- Material y reactivos virtuales
ADN problemas.
ADNr1= ADN ribosmico de la bacteria problema n 1.
ADNr2= ADN ribosmico de la bacteria problema n 2.
Primer para el ADN ribosmico agagtttgat
ADN polimerasa.
Buffer.
dNTP/ddNTP para las reacciones A, C, G, T.
Radionclido (a32PdATP).
48
Pelcula sensible a rayos X.
Equipo de secuenciacin en gel.
Poliacrilamida/bisacrilamida/TMED.
Urea (7 M de concentracin final en gel).
Buffer TBE 0.5X.
3. Secuenciacin
En las 4 primeras carriles del gel de secuenciacin se colocan los resultados
de las reacciones A, C, G, T del ADN ribosmico de la bacteria problema n 1
(ADNr1). Para llevar a cabo estas reacciones se utilizado el primer para el ADN
ribosmico agagtttgat, ADN polimerasa, el dNTP/ddNTP para cada una de
dichas reacciones A, C, G, T y el radionclido (a32PdATP).
En las 4 ltimas carriles del gel de secuenciacin se colocan los resultados de
las reacciones A, C, G, T del ADN ribosmico de la bacteria problema n 2
(ADNr2).
Se efecta la electroforesis a 1.000 voltios durante 40 minutos
Una vez finalizada la separacin electrofortica se realiza el auto-radiograma
para visualizar las bandas de secuenciacin

4. Interpretacin de los resultados
Tener en cuenta que la 4
primeros carriles corresponden a
la muestra ADNr1 y las 4 ltimas
a la muestra ADNr2
Tener en cuenta que en cada
muestra el orden de las
reacciones de izquierda a
derecha es de A C G T
Empezar la determinacin por
las bandas ms desplazadas (1,
2, 3...) segn el carril en la que
aparecen (CCT)
Leer unos doce nucletidos o
ms si son necesarios





49
Conociendo la secuencia determinar el gnero al que pertenece la muestra problema
Secuencia Gnero Bacteria
cctggctcag aacgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg
caagtcgagc
Agrobacterium
cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg
caagtcgagc
Bacillus
cctggctcag agcgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg
caagtcgaac
Brevundimonas
cctggctcag attgaacgct ggcggcatgc cttacacatg
caagtcgaac
Burkholderia
catggctcaa attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg
caagtcgaac
Escherichia
gagagtttga tcctggctca gagtgaacgc tggcggcgtg
cctaatacat
Helicobacter
catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg
caagtcgagc
Pseudomonas
cccggctcag agtgaacgct ggcggtaggc ctaacacatg
caagtcgaac
Stenotrophomonas
catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg
caagtcgaac
Xanthomonas
Auto-radiograma obtenido :












D.
50
Cuestionario

1.- En las dos muestras ADNr1 y ADNr2 el primer nucletido obtenido despus
del primer es:
a) A.
b) C.
c) G.
2.- En la muestra ADNr1 los 10 primeros nucletidos obtenidos son:
a) CAGAGTTTGA.
b) CCTGGCTCAG.
c) CATGGCTCAA.
3.- En la muestra ADNr2 los 10 primeros nucletidos obtenidos son:
a) CAGAGTTTGA.
b) CCTGGCTCAG.
c) CATGGCTCAA.
4.- La secuenciacin obtenida indica que la muestra ADNr1 pertenece a una
bacteria del gnero:
a) Bacillus.
b) Pseudomonas.
c) Helicobacter.
5.- La secuenciacin obtenida indica que la muestra ADNr2 pertenece a una
bacteria del gnero:
a) Rhizobium.
b) Escherichia.
c) Agrobacterium.