DETERMINACN DE AFLATOXINAS

B
1
-B
2
-G
1
-G
2.
METODO HPLC
OBJETIVO
Detectar y cuantificar la presencia de aflatoxinas B
1
- B
2
- G
1
- G
2
en
alimentos.
CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE
El mtodo es aplicable a alimentos, especialmente semillas y granos.
FUNDAMENTO
Se basa en la extraccin de la toxina con acetonitrilo, purificacin a tra!s de columna
multifuncional, deri!ati"acin con #cido trifluoractico y cuantificacin por $%&' con
detector de fluorescencia.
Term!"#"$%&
( )flatoxinas* +etabolitos txicos producidos por ,ongos, consideradas cancer-genas para
el ,ombre y los animales.
&as aflatoxinas son producidas por dos gneros de ,ongos filamentosos
Aspergillus y Penicillium, estos representan el crecimiento t-pico de los ,ongos
microscpicos. &as especies productoras son* Aspergillus flavus, Aspergillus
parasiticus, Penicillium puberalis y Aspergillus oryzae. En 1./0, 1uli2 y
$oliday reportaron tambin a las especies Aspergillus niger, Aspergillus gruber,
Aspergillus wentii, Penicillium frecuentans, Penicillium variable y Penicillium
citrinum 3Bolet 4 Socarr#s, 25567.
8arios estudios ,an re!elado 9ue las cuatro aflatoxinas m#s importantes* B
1
3):B
1
7,
B
2
3):B
2
7, G
1
3):G
1
7, G
2
3):G
2
7, est#n directamente relacionadas con la
contaminacin de alimentos y culti!os, poseen una estructura similar
entre ellas y forma un ;nico grupo de compuestos ,eteroc-clicos altamente
oxigenados7. Sus estructuras moleculares fueron deducidas alrededor de 1./2 por
el grupo )S<).
=abla 1.1* Estructura molecular de las )flatoxinas. )daptado de* (European
Mycotoxins Awareness Network, 2!".
Informe De Anlisis Instrumental II
Elaborado por: Est. Jorge Luis Chambi LauraPgina 1
( $%&' 'romatograf-a l-9uida de alta resolucin
En la $%&' isocr#tica el compuesto pasa por la columna cromatogr#fica a tra!s de la
fase estacionaria 3normalmente, un cilindro con pe9ue>as part-culas redondeadas con
ciertas caracter-sticas 9u-micas en su superficie7 mediante el bombeo de l-9uido 3fase
m!il7 a alta presin a tra!s de la columna. &a muestra a anali"ar es introducida en
pe9ue>as cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de
las interacciones 9u-micas o f-sicas con la fase estacionaria a medida 9ue adelantan por
la columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la
naturale"a del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase m!il.
El tiempo 9ue tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de
retencin y se considera una propiedad identificati!a caracter-stica de un compuesto en
una determinada fase m!il y estacionaria. &a utili"acin de presin en este tipo de
cromatograf-as incrementa la !elocidad lineal de los compuestos dentro de la columna
y reduce as- su difusin dentro de la columna me?orando la resolucin de la
cromatograf-a. &os disol!entes m#s utili"ados son el agua, el metanol y el acetonitrilo.
El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el #cido trifluoractico,
9ue ayudan a la separacin de los compuestos.
@na me?ora introducida a la tcnica de $%&' descrita es la !ariacin en la
composicin de la fase m!il durante el an#lisis, conocida como elucin en gradiente.
@n gradiente normal en una cromatograf-a de fase re!ersa puede empe"ar a un AB de
acetonitrilo y progresar de forma lineal ,asta un A5B en 2A minutos. El gradiente
utili"ado !ar-a en funcin de la ,idrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los
componentes de la muestra como una funcin de la afinidad del compuesto por la fase
m!il utili"ada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el e?emplo, utili"ando
un gradiente aguaCacetonitrilo los compuestos m#s ,idrof-licos eluir#n a mayor
concentracin de agua, mientras 9ue los compuestos m#s ,idrofbicos eluir#n a
concentraciones ele!adas de acetonitrilo. ) menudo, ,ace falta reali"ar una serie de
pruebas pre!ias con tal de optimi"ar el gradiente de forma 9ue permita una buena
separacin de los compuestos.
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MATERIALES' INSUMOS Y E(UIPOS
MATERIALES Y E(UIPOS
( E9uipo $%&' con detector de fluorescencia.
( Espectrofotmetro @8-8isible.
( 'olumnas de clean up +ycoSep 226 de &aboratorio Domer 3el 2it consta de columna y
un tubo de ensayo silani"ado de 15 m&7
( Balan"a de precisin 5.51 g
( Ba>o termoregulado /5E 2 F'
( Blender C s,a2er C ?uguera
( Erlenmeyer #mbar con tapa de 2A5 m&
( 8iales #mbar de 2 m& para autosampler.
( %apel filtro G,atman 1F 6 o e9ui!alente.
( +icropipetas de 255 y 1555 H&.
( +atraces de aforo 15 m& #mbar.
REACTIVOS
( Est#ndar de )flatoxinas B
1
-G
1
-B
2
-G
2
( )cetonitrilo, grado $%&'
( Benceno, p.a.
( Solucin deri!ati"adora* 15 m& de #cido trifluoractico, A m& #cido actico glacial,
IA m& de agua destilada
( Solucin stoc2 de aflatoxinas 9ue contengan las siguientes concentraciones* I55 ng de
B
1
, A5 ng de B
2
, 1A5 ng de G
1
y A5 ng de G
2
por m&. Estas soluciones son preparadas
en benceno C acetonitrilo 3.JK27 a partir de est#ndares certificados y la concentracin
de cada est#ndar se puede !erificar por espectrofotometr-a seg;n mtodo )<)'
.05.66 ed.
1..A - 6. p.I
( :ase +!il* .5 m& de acetonitrilo grado $%&', .5 m& de metanol grado $%&', 655
m& de agua desioni"ada y filtrada.
( Solucin extractante* acetonitrilo C agua 3.K17
Informe De Anlisis Instrumental II
Elaborado por: Est. Jorge Luis Chambi LauraPgina
PROCEDIMIENTO)
EXTRACCIN
( %esar A5 g de la muestra pre!iamente molida en un matra" Erlenmeyer 3/.1.07.
( )gregar 155 m& de la solucin extractante 3/.2.07
( )gitar por una ,ora en s,a2er o me"clar a alta !elocidad por 2 minutos en ?uguera o
( Blender.
( :iltrar a tra!s de un filtro plegado y recolectar el filtrado en material #mbar.
PURIFICACION
( %ipetear I m& del extracto filtrado al tubo de la
columna de clean up 3/.1.I7.
( 'olocar la columna en una mano y el tubo de
ensayo en la otra, lentamente presionar la
columna dentro del tubo de ensayo, ,asta
obtener E 5.A m& de extracto purificado 3se
recomienda no colocar los dedos sobre la
parte superior del residuo de la columna7.
:igura 1* modo de empleo de las columnas +ycoSep 226
DERIVATI*ACIN
( =ransferir 255 & del extracto purificado al !ial del autosampler.
( )gregar 055 & de la solucin deri!ati"adora 3/.2.67.
( )gitar y colocar en ba>o a /5 F' por J,A minutos.
( Enfriar a temperatura ambiente y proceder a la cuantificacin por $%&'
(
PREPARACION DE LA CURVA DE CALIBRACIN
( Soluciones de traba?o 3denominadas '1-'2-'I7 de B
1
-G
1
-B
2
-G
2
. %reparar
estas soluciones a partir de la solucin stoc2 3/.2.A7. =omar los !ol;menes indicados
en la tabla ) en matra" de aforo de 15 m& y e!aporar con una sua!e corriente de
nitrgeno, aforar con acetonitrilo.
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=)B&) )* %reparacin de las soluciones est#ndar de traba?o
Sol. est#ndar
& a tomar
de solucin
B
1
gnom
B
2
ngCm
G
1
ngCm
G
2
ngCm
'
1
2
0
J
.
1.
IA
6.
5A
1.
IA
'
2
1
J
A
.
5
.
2
.
5
. '
I
.
5
2
.
5.
6A
1.
IA
5.
6A L'oncentracin de las soluciones expresadas en ngCm& de solucin deri!ati"ada
( =omar 255 & de cada una de estas soluciones y proceder como las muestras a
partir de 30.I7
CONDICIONES CROMATOGR+FICAS
'olumna * &i',ro')D= 2A5, D%-1J, A m
:lu?o* 5.J m&Cmin. Excitacin* I/5 nm Emisin* 665 nm
=emperatura columna* 65 F' 8ol. inyectado* A5 &
CALCULOS
A , V
gCMg 3ppb7 N
-------------
------- p
Dnde*
)* concentracin entregada por el e9uipo, en ngCm&
8* !olumen de la solucin extractante agregada, en m&
p* peso de la muestra, en gramos
Esta frmula es aplicable cuando se cumplen las instrucciones establecidas en el
procedimiento, considerando 9ue las muestras y los est#ndares se tratan de la misma
forma y se inyectan los mismos !ol;menes.
&-mite de deteccin para cada aflatoxinas* 5.2A gCMg
&-mite deteccin aflatoxinas totales* 1.5 gCMg
&-mite de cuantificacin para cada aflatoxinas* 1.5 gCMg
&-mite de cuantificacin aflatoxinas totales* 2./6 gCMg
CONFIRMACIN
En el caso de determinar 9ue una muestra contiene una cantidad de aflatoxinas superior
a la permitida por el Deglamento Sanitario de alimentos 3A ppb de aflatoxinas totales7 se
deber# confirmar su presencia si es posible por medio de &'C+S+S.
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CROMATGRAFO L-(UIDO)
- =emperatura del ,orno de columna* 6AF'
- =emperatura de la muestra* 12F'
- :lu?o* 5.2A5 m&Cmin
- 8olumen de inyeccin* 25 u&
- =iempo de an#lisis* 15 min.
- :ase m!il*
)cuosa* A m+ acetato de amonio, 5.1B de #cido frmico, enrasar con agua $%&'.
<rg#nica* A m+ acetato de amonio, 5.1B de #cido frmico, 2A m& de $2< $%&', enrasar con
)'1 a 2A5 m&.
-Gradiente*
Tem." /m!0 A
1
B
1 5,5 .
A
A
5,1 .
A
A
5,J 5 1
5
1,J 5 1
5
I,5 .
A
A
J,5 .
A
A
REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
( +todo 6..2.1.) O)<)' <fficial +et,od ..6.5J )flatoxins in 'orn, )lmonds,
Bra"il nuts, %eanuts, and %istac,io nutsP +ultifunctional 'olumn 3+ycosep7 +et,od.
( O+ultifunctional column coupled Qit, li9uid c,romatograp,y precolumn deri!ati"acin
for determination of aflatoxins in corn, almond, bra"il nuts, peanuts and
pistac,ios* collaborati!e studyP Domer &abs Rnc.
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Elaborado por: Est. Jorge Luis Chambi LauraPgina #