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PROYECTO DE TESIS DOCTORAL

Ttulo: Anlisis de residuos en miel procedentes de tratamientos sanitarios en
apicultura.

Doctorando: Francisco Molino Gahete

Departamento: Produccin Animal y Ciencia de los Alimentos

rea: Nutricin y Bromatologa



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1. INTRODUCCIN
La presencia de residuos de antibiticos en productos alimenticios representa un
peligro potencial para los consumidores, debido a la aparicin de reacciones
alrgicas, desarrollo de resistencias bacterianas y modificaciones en la flora
intestinal.
En el mbito de la sanidad apcola, las tetraciclinas, antibiticos de amplio espectro
que impiden el crecimiento de bacterias mediante la inhibicin de la sntesis proteica,
son utilizadas como tratamientos teraputicos frente a la loque americana
(Paenibacillus larvae) y la loque europea (Melissococcus pluton). La incorrecta
utilizacin de estos medicamentos puede dejar residuos en la miel, lo que constituye
un riesgo para la salud pblica.
En la Unin Europea no hay fijados lmites mximos para estos residuos en miel, ya
que su uso en apicultura est prohibido. Sin embargo, en pases como Cuba, Chile o
Argentina, ste ltimo uno de los principales exportadores de miel a la Unin
Europea, este lmite est establecido en 0,1 g/g miel.
El lmite mximo de estos residuos en otros alimentos como leche y carne est
establecido en 0,1 g/g, si bien este valor ir disminuyendo conforme se desarrollen
nuevos mtodos de anlisis y deteccin ms sensibles.
En la actualidad, hay numerosos mtodos para el anlisis de estos residuos en las
matrices, anteriormente mencionados, pero existen pocos mtodos para determinar
residuos de tetraciclinas en miel, y ninguno de ellos oficial, debido principalmente a
la complejidad de la matriz dada la facilidad de las tetraciclinas para formar
complejos con metales y unirse a protenas. Ello condiciona mucho los procesos de
extraccin al proporcionar recuperaciones muy bajas. Otro problema importante a
tener en cuenta son las interferencias de la propia matriz en el anlisis
cromatogrfico, lo que dificulta su identificacin
Las loques son enfermedades bacterianas y, por consiguiente, potencialmente
tratables con antibiticos. La loque americana (Paenibacillus larvae) es la ms
peligrosa de las dos. Es la enfermedad de la cra de las abejas obreras, la larva se
contagia oralmente al ingerir alimento contaminado con las endoesporas de P.
larvae. La larva muere tras la operculacin. Cursa con oprculos hundidos de color
oscuro, larvas semidescompuestas en una masa lquida. La peligrosidad de la
enfermedad es su difcil erradicacin debido a la gran resistencia de los esporos de


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P. larvae, que sobreviven a temperaturas de 100 C y a muchos desinfectantes
qumicos, unido a una supervivencia de las endoesporas al paso del tiempo,
permitiendo sobrevivir de hasta 35 aos (De J ong, 2004).
En apicultura, siempre que se habla de enfermedades apcolas, hay que tener como
referencia la varroosis. Esta enfermedad, sin duda, produce las mayores prdidas en
el sector. Es una patologa que empez a aparecer en los apiarios europeos al final
de la dcada de los setenta proveniente de Asia (Thompson, 2002).
La varroosis est producida por el caro Varroa destructor, perteneciente a la familia
de los ixdidos. Este caro coloniza la abeja asitica (Apis ceranea), pero debido a
la expansin de la abeja europea productora de miel (Apis mellifera) a zonas
asiticas, el parsito se ha adaptado a esta ltima, aumentando su nicho ecolgico
a cualquier zona donde est presente la Apis mellifera (Anderson y Trueman, 2000).
El caro parasita las larvas de abeja en la propia celdilla y, desde ese momento, la
abeja llevar el ectoparsito que, adems de alimentarse de su hemolinfa, le
producir un tremendo desgaste energtico durante el pecoreo, llevndola hasta la
extenuacin y a la consiguiente muerte (Willians, 2000).
El xito en el control de la varroosis depende de la efectividad del medicamento, el
cual debe permanecer en la colmena durante varias semanas para que todos los
caros mueran, incluyendo los que van saliendo de las celdas junto con las abejas.
Las empresas farmacuticas han desarrollado durante aos medicamentos
tolerados por las abejas, seguros para el consumidor, inocuos para el medio
ambiente y eficaces frente al parasito teniendo en cuenta su ciclo biolgico.
El Reglamento (CEE) n 2377/90 del Consejo, de 26 de junio de 1990, establece un
procedimiento comunitario de fijacin de los lmites mximos de residuos (LMRs) de
medicamentos veterinarios. En virtud de este reglamento, todas las sustancias
farmacolgicamente activas que forman parte de la composicin de los
medicamentos veterinarios administrados a los animales productores de alimentos
en la Unin Europea, estn sujetos a unos lmites.



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2. REVISIN BIBLIOGRAFICA

2.1. La miel como alimento
La miel se define como la sustancia natural dulce producida por la abeja, Apis
mellifera, a partir del nctar de plantas o de secreciones de partes vivas de plantas o
de excreciones de insectos chupadores presentes en las partes vivas de plantas,
que las abejas recolectan, transforman combinndolas con sustancias especficas
propias, depositan, deshidratan, almacenan y dejan en colmenas para que madure
(Real Decreto 1049/2003).
La miel de flores es elaborada por la abeja a partir del nctar de las flores. A travs
de su lengua, el nctar es ingerido y llega al buche donde se mezcla con enzimas de
la saliva que, junto con los que recoge del nctar floral, hidrolizan la sacarosa del
nctar en fructosa y glucosa, principales azcares contenidos en la miel. Cuando la
abeja regresa a la colmena, regurgita la carga del nctar en las celdillas prximas a
la entrada (Sainz et al., 2000), donde la deposita y pierde agua por evaporacin.
Transcurridos unos das, el nctar que ha sido depositado en los alvolos de los
panales, se deshidrata hasta una concentracin de agua de entre 14 y 25%, al
mismo tiempo que la concentracin de azcares se eleva hasta el 70-80% y su
espectro de azcares se modifica por la accin enzimtica. Finalmente, la abeja
recubre la celdilla con miel ya madurada mediante un oprculo de cera (J ean-Prost,
2001).
Adems de estos azcares y enzimas, los principales componentes de la miel son
agua, sacarosa, maltosa, cidos orgnicos, minerales, aminocidos, pigmentos,
protenas y compuestos fenlicos.
En cuanto a las caractersticas organolpticas, la miel tiene un color que puede
variar desde incoloro a pardo oscuro, prcticamente negro. Puede tener una
consistencia fluida, espesa o cristalizada (en parte o en su totalidad). El sabor y el
aroma pueden variar, dependiendo del origen vegetal.



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2.2. Obtencin de la miel
El cumplimiento de Buenas Prcticas de Fabricacin (BPF) en todas y cada una de
las etapas del proceso permite la obtencin de un producto natural sano y de
calidad. La cosecha de miel o cata se realiza tras la mielada, cuando los aportes de
nctar han cesado y al menos tres cuartas partes de las celdillas del panal estn
operculadas. Tras la expulsin de las abejas mediante un ahumador, se extraen los
cuadros de la colmena y, posteriormente, se procede al desoperculado de los
mismos y a la extraccin de la miel de las celdillas mediante una centrifuga, manual
o elctrica. La miel recogida es sometida a un posterior filtrado y, a continuacin,
pasa a un madurador donde las impurezas que han quedado ascienden a la
superficie y son eliminadas. En la etapa de maduracin la miel sufre un proceso de
deshidratacin y cambios qumicos. La pasterizacin es un tratamiento por el que la
miel alcanza una temperatura de 78C/5-7 min., para despus ser enfriada
rpidamente. Finalmente, la miel se envasa para su distribucin.

2.3. Tratamientos sanitarios en apicultura
En cada apiario se realizan dos controles sanitarios al ao, en otoo y primavera, en
pocas postcosecha. Los tratamientos sanitarios frente a determinadas
enfermedades como micosis (Ascosphaera Apis), polilla (Galleria mellonella,
Achorioa grisella) y otras requieren un procedimiento de limpieza y desinfeccin de
las colmenas afectadas. En otras enfermedades, como varroosis, loques y
nosemosis, se hace necesaria la aplicacin de medicamentos, respetando siempre
las buenas prcticas veterinarias, con el fin de lograr la mxima eficacia de su
principio activo y que en la miel no queden residuos por encima de los lmites
mximos permitidos que pudieran afectar a la salud del consumidor.
En la Tabla 1 se recogen los tratamientos sanitarios frente a las enfermedades ms
comunes de las abejas.



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Tabla 1. Tratamientos de las enfermedades ms comunes en apicultura.


Enfermedades


Tratamiento sanitario

Varroosis
Principio activo: Clorobenzilato, Bromopropilato,
Amitraz, Fluvalinato, Flumetrina, Coumafos,
cidos orgnicos y Aceites esenciales
Bacteriosis de las abejas
Eliminacin cera contaminada, aislamiento
colmenas enfermas y desinfeccin del material
Principio activo: Antibiticos (Tetraciclinas y
Sulfamidas)
Nosemosis Principio activo: Antibiticos (Fumagilina)
Amebosis
Eliminacin de cuadros afectados y desinfeccin
del material
Virosis de las abejas
Profilaxis
Micosis de las abejas
Eliminacin de cuadros afectados
Principio activo: Tiabendazol y ecomazol
Piojillo de las abejas
Principio activo: Bromopropilato
Otros (Nicotina, Mezcla de alcohol y aguarrs)
Polilla de la cera
Bacillus thuringiensis (B-401) y desinfeccin del
material
Fuente: http://www.infoagro.com/agricultura_ecologica/apicultura.htm

2.4. Tetraciclinas
Las tetraciclinas son derivados de la naftacenocarboxamida policclica. Son
antibiticos de amplio espectro, que impiden el crecimiento de bacterias mediante la
inhibicin de la sntesis proteica. Actan sobre bacilos y cocos Gram (+), bacilos
Gram (-) (H. influenzae, Brucella, Legionella pneumophyla, Helicobacter pilory,
Borrelia recurrentis), as como sobre Rickettsia, Mycoplasma, Chlamydia y
Spirochaetales.
Las tetraciclinas tienen grupos funcionales que pueden formar varios puentes de
hidrgeno intermoleculares, lo que les confieren propiedades quelantes y la
capacidad de formar complejos insolubles con sales de hierro, calcio, magnesio o
aluminio. Por ello, para una mejor absorcin, no deben administrarse con leche o
con otros productos lcteos, aminocidos u otros productos que contengan estas
sales.
En Espaa, el uso de tetraciclinas en apicultura est prohibido, tanto en tratamientos
paliativos contra la loque como en tratamientos preventivos. Pero en otros pases no


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sucede as, comprobndose que la eficacia del tratamiento con tetraciclinas es muy
variable. Los resultados dependen del grado de contaminacin del colmenar, de la
habilidad del apicultor y de la variabilidad de factores ambientales que influyen en el
curso de la enfermedad.
A pesar de su prohibicin, no es infrecuente la utilizacin de tetraciclinas con fines
sanitarios apcolas en nuestro pas.

2.5 Flumetrina
La flumetrina (-cyano-4-fluoro-3-phenoxybenzyl 3-(,4-dichlorostyryl)-2,2-
dimethylcyclopropanecarboxylate), es un piretroide sinttico apolar, no voltil,
soluble en grasa y termoestable. Pertenece al grupo de piretroides sintticos
llamados de tercera generacin, fotoestables y con sustancia activa ms purificada y
concentrada, lo que les diferencia de los de primera y segunda generacin,
respectivamente.
La flumetrina se utiliza como ectoacaricida en animales de abasto, as como en
perros y caballos. En apicultura se utiliza como varroacida, a modo de tiras
impregnadas con 3,6 mg del principio activo, colocadas en la zona central del nido
de cra, a razn de 4 tiras por colmena. Al ubicarse entre los cuadros, las abejas
contactan con las sustancia activa por ambas caras de la tira.
El tratamiento se realiza al final de la cosecha de miel, pudiendo permanecer las
tiras en la colmena como mximo seis semanas, periodo tras el cual han de ser
retiradas de la misma.

2.6. La miel y la seguridad alimentaria: problemtica de la presencia de
residuos en miel.
Desde el ao 2005 hasta el momento actual, en la Unin Europea se han notificado
73 alertas relacionadas con la miel, de las cuales en el 20%, la miel estaba
destinada al mercado espaol. China fue el pas de origen en el 25% de las
ocasiones.


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De las 15 alertas sanitarias en las que la miel tena como destino Espaa, el 80 %
de ellas era miel proveniente de China y Argentina. Las notificaciones restantes se
debieron a miel proveniente del Sudeste Asitico y Australia.
La utilizacin de un frmaco como tratamiento sanitario en apicultura, debe respetar
las pautas de aplicacin y realizarse de acuerdo con unas buenas prcticas
veterinarias, para evitar la presencia de residuos en los productos de la colmena.
Por ello, es muy importante valorar la tendencia del principio activo, o de sus
metabolitos, a acumularse en ciertos tejidos, o a ser eliminados con ciertas
secreciones como la leche o la miel (Ivie y Rowe, 1986).
Las fuentes de contaminacin para los productos de la colmena son varias. Debe
tenerse en consideracin la contaminacin de la vegetacin, por tratamientos
fitosanitarios o a partir del medio ambiente, que puede ser incorporada por la abeja
junto con el nctar. Si el pesticida es muy txico para las abejas, el riesgo de
contaminacin en los productos apcolas es bajo ya que stas mueren por llevar el
nctar a la colmena, o sufren alteraciones conductuales que les impiden llegar a la
colmena (Flamini, 1986).
Otra fuente de contaminacin importante la constituyen los tratamientos aplicados
para combatir alguna de las enfermedades de las abejas. En este caso, el producto
es introducido directamente en la colmena, por lo que puede entrar en contacto con
la miel muy fcilmente. Se recomienda evitar la poca de afluencia de nctar para la
aplicacin de los tratamientos por ser la ms peligrosa.
En actuaciones profilcticas, los apicultores administran determinadas mezclas de
antibiticos a travs de la alimentacin artificial, que tambin pueden generar
residuos.
En Espaa, un problema adicional es el uso de la colmena modelo Layens, ya que
en ella se encuentran en el mismo compartimento tanto los cuadros con miel como
los que contienen cra (pollo), por lo que el problema de los residuos se agrava.
Por ltimo, no hay que olvidar la posibilidad de contaminacin de los productos
apcolas a lo largo de su procesado (residuos de semicarbacidas procedentes de los
envases, por ejemplo).
En cuanto a las causas de las alertas sanitarias relacionadas con la comercializacin
de la miel, en un 85% de las ocasiones, el motivo de la alerta fue la presencia de
antibiticos en miel, principalmente tetraciclinas, sulfamidas y cloranfenicol.


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La presencia de estos residuos en los productos apcolas puede influir tambin en su
comercializacin, especialmente en el comercio exterior, como consecuencia de los
mecanismos de control establecidos por los diferentes pases (Gndinger, 1989).

2.7. Aspectos legales de la presencia de residuos de tetraciclinas y flumetrina
en miel
En la Unin Europea no existen Lmites Mximos de Residuos (LMRs) de
tetraciclinas en miel ya que su uso en apicultura est prohibido. Sin embargo, s se
han establecido LMRs de tetraciclinas en otros alimentos como hgado (0,6 g/g),
rin (0,3 g/g), huevos (0,2 g/g), leche (0,1 g/g), carne (0,1 g/g), pescado (0,1
g/g) y grasa (0,01 g/g) (Reglamento CE 2377/1990).
El Reglamento Europeo 2377/1990 no establece lmite mximo de residuos de
flumetrina en miel (Anexo II: sustancias no sujetas a LMR). No sucede lo mismo en
otros alimentos de origen animal (Anexo I): 10 g/Kg en msculo y rin, 20 g/Kg
en hgado, 30 g/Kg en leche y 150 g/Kg en grasa de las especies bovina y ovina.
Sin embargo, algunos pases europeos, s han establecido lmites mximos de
residuos de flumetrina en miel (Alemania e Italia 10 g/Kg, Suiza 5 g/Kg).

2.8. Mtodos analticos de determinacin de residuos de tratamientos
veterinarios en la miel
En la literatura cientfica se describe una gran variedad de mtodos analticos de
residuos de tratamientos veterinarios en miel y en otros productos de la colmena,
siendo la matriz miel sumamente compleja, por lo que el anlisis no se puede
realizar en una sola etapa, y es necesario efectuar varios pasos antes de llegar a la
identificacin y cuantificacin del analito. El procedimiento de anlisis de residuos de
acaricidas en una muestra determinada, se puede dividir en las siguientes etapas:
- Acondicionamiento de la muestra: limpieza, pesada y preparacin
- Extraccin de los analitos
- Purificacin del extracto
- Determinacin: identificacin y cuantificacin de los analitos
- Confirmacin


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2.8.1. Anlisis de residuos de tetraciclinas
Los mtodos para la deteccin de residuos de antibiticos en alimentos se
desarrollaron a finales de la dcada de los 40, poco despus de la introduccin del
empleo de estos compuestos en la produccin animal. Estos primeros mtodos se
basaban en la inhibicin del crecimiento microbiano por la presencia de residuos de
medicamentos en las muestras analizadas en niveles superiores al umbral de
sensibilidad del test. Desde entonces, estas tcnicas han ido evolucionando con
objeto de detectar de forma ms eficiente dichos residuos en diversos alimentos de
origen animal como leche, carne o huevos (Hillerton et al., 1999).
En este sentido, se han desarrollado en las ltimas dcadas otras tcnicas ms
especficas de tipo cromatogrfico o inmunoqumico, dirigidas a la identificacin y
cuantificacin de los residuos presentes.
Actualmente, se emplean tcnicas inmunoqumicas para la deteccin de tetraciclinas
en alimentos, pero stas carecen de diferenciacin y son slo semicuantitativas.
Para la confirmacin se utilizan tcnicas de espectrometria de masas,
extremadamente caras, y cromatografa lquida, tcnica cuantitativa y resolutiva
(diferencia las distintas tetraciclinas).
Los mtodos ms recientes para la deteccin de tetraciclinas en miel, tienen en la
mayora de los casos un punto de partida en comn. Se trata del mtodo publicado
por Oka et al. (1987), aunque desde un par de aos antes ya se utilizaba la
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) para la determinacin de
tetraciclinas en una disolucin cida de miel (Takeba, 1984).
El efecto quelante de las tetraciclinas haca que la fase de extraccin y purificacin
en fase slida (SPE), tuvieran unos porcentajes de recuperacin bajos. Este
problema fue resuelto por Oka et al. (1987), con una disolucin de miel en un
tampn de Na
2
EDTA y el acondicionamiento de la columna de SPE con Na
2
EDTA.
Las columnas SPE de extraccin y purificacin ms comnmente usadas para la
determinacin de tetraciclinas son las columnas de C
18
(Geertsen et al., 2004;
Kochansky et al., 2000 y Oka et al., 1994), aunque otros autores han utilizado
columnas HLB (Pagliuca et al, 2002) o columnas fenil (Vias et al., 2003). Existe la
posibilidad de extraer las tetraciclinas de la miel sin usar columnas de SPE y en su
lugar realizar una extraccin con acetona (Alippi et al. 1999, Dieguez et al., 2000)


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Los solventes utilizados en cromatografa lquida como fases mviles son mezclas
de disolventes en diversa proporcin de metanol, acetonitrilo y una disolucin cida
(Argauer et al., 1991; Oka et al., 1994; Pagliuca et al., 2002; Vias et al., 2003;
Geertsen et al., 2004). El flujo de estas fases mviles suele ser de 1 ml/min e
isocrtico, aunque el flujo en gradiente tambin se utiliza. (Kochansky et al., 2000;
Vias et al., 2003).
El relleno de estas columnas cromatograficas, utilizado para separacin de las
tetraciclinas puede ser de fenil-hexil (Pagliuca et al., 2002), C
8
(Takeba et al., 1984;
Oka et al., 1986), C
16
(Vias et al, 2003) o la ms comnmente utilizada C
18
(Diguez
et al., 2000; Kochansky et al, 2000 y Geertsen et al, 2004). La columna
cromatogrfica usada para la deteccin de tetraciclinas suele tener las dimensiones
de 250 mm de longitud; 4,6 mm de grosor y un dimetro de las molculas de relleno
de 5 micras (Oka et al, 1987; Alippi et al., 1999; Geertsen et al., 2004), aunque en
este punto la diversidad de columnas es muy variada.
De manera general, la sensibilidad de los diferentes mtodos descritos para la
determinacin de tetraciclinas est comprendida entre 1 y 100 ng/g de miel (LD). En
cuanto a los porcentajes de recuperacin de estas tcnicas los valores estn entre el
55 y el 122%.

2.8.2. Anlisis de residuos de acaricidas (flumetrina, fluvalinato, cumafs,
bromopropilato y 4,4-dibromobenzofenona), en miel
En cuanto a la preparacin de la muestra, se pueden observar diferencias entre los
autores. Szerletics-Tri (1999) separa la miel de la cera mediante presin, mientras
que Thrasyvoulou et al. (1988) y Bogdanov et al. (1998) separan la miel de la cera
con un colador o un filtro, respectivamente.
La tcnica de extraccin mayoritariamente utilizada por los distintos autores es la
extraccin lquido-lquido (Klein et al.,1986; Thrasyvoulou et al.;1988; Slabezki et al.,
1991; Sancho et al., 1991; Van Buren et al.,1992; Lodesani et al., 1992; Szerletics-
Tri ,1999; Floris et al., 2001; Korta et al., 2001; Maver et al., 2003; Wasilizewski et
al., 2003; Tremolada et al., 2004) que en algunos casos se combina con una
purificacin en fase slida (Van Buren et al.,1992; Szerletics-Tri ,1999; Tremolada
et al., 2004), o bien con cromatografa de permeacin sobre gel (Klein et al.,1986).
De Greef (1994) utiliza para la extraccin lquido-lquido una columna de Extrelut.


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Tsigouri et al. (2001) disuelven la muestra en agua/etanol seguido de una
centrifugacin y posterior purificacin en fase slida.
Con frecuencia se usa tambin la tcnica de extraccin en fase slida (SPE)
(Bogdanov et al., 1990; Lodesani et al., 1992; Gomis et al., 1996; Bogdanov et al.,
1998), con cartuchos de C
18
y eluyentes como hexano para eluir cumafs, fluvalinato
y bromopropilato (Gomis et al., 1996) o slo bromopropilato (Lodesani et al., 1992).
Lodesani et al. (1992) utilizan tambin cloruro de metilo para eluir fluvalinato.
Adems Bogdanov et al. (1998) aplican una mezcla de eluyentes (hexano/acetato de
etilo) para eluir bromopropilato, cumafs, fluvalinato y flumetrina.
Para la determinacin cromatogrfica, como se ha visto anteriormente, la tcnica
ms comn es la GLC-ECD (Klein et al.,1986; Bogdanov et al., 1990; Slabezki et al.,
1991; Sancho et al., 1991; Lodesani et al., 1992; De Greef et al., 1994; Bogdanov et
al., 1998b; Szerletics-Tri, 1999; Tsigouri et al., 2001; Maver et al., 2003;
Wasilizewski et al., 2003) utilizando mayoritariamente columnas de polisiloxano, 5 %
fenil 95 % metil (Bogdanov et al., 1990; Lodesani et al., 1992; Bogdanov et al., 1998)
y polisiloxano, 100% metil (Slabezki et al., 1991; Tsigouri et al., 2001) como fase
estacionaria.
Otras tcnicas de determinacin cromatogrfica son GC-NPD (Klein et al., 1986;
Floris et al., 2001) y GC-FPD (Thrasyvoulou et al., 1988), GC- MS (Maver et al.,
2003; Tremolada et al. 2004), HPLC-UV (Gomis et al., 1996; Korta et al., 2001) y
HPLC-con detector de fluorescencia (Van Buren et al., 1992).
Van Buren et al. (1992), Korta et al. (2001) y Maver et al. (2003) adems confirman
los resultados de sus mtodos por GC-MS.
La sensibilidad de los diferentes mtodos descritos para le determinacin de
acaricidas de sntesis en miel est comprendida entre 0,5 y 40 g/Kg de miel.



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3. OBJETIVOS:
Con el presente estudio se persiguen los siguientes objetivos:
1. Objetivos metodolgicos:

- Poner a punto y validar un mtodo de anlisis multirresidual de
tetraciclinas en miel.
- Poner a punto y validar un mtodo de anlisis de residuos de
flumetrina y otros acaricidas de sntesis en miel.

2. Objetivos analticos:

- Estudiar la estabilidad de las tetraciclinas en diferentes muestras de
miel:
- Efecto de la pasterizacin.
- Efecto del tiempo de almacenamiento.
- Estudiar la estabilidad de la flumetrina en la colmena.
- Analizar residuos de acaricidas de sntesis en muestras de miel.

3. Objetivos de seguridad alimentaria:

- Evaluar el riesgo sanitario derivado de la presencia de residuos de
tetraciclinas en miel.
- Evaluar el riesgo sanitario derivado de la presencia de residuos de
acaricidas de sntesis en miel.



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4. METODOLOGA Y RESULTADOS

4.1. Puesta a punto y validacin de un mtodo de anlisis de residuos de
tetraciclinas en miel
El mtodo puesto a punto y validado en nuestro laboratorio se basa en el descrito
por Oka et al. (1987). Estos autores preparan la muestra disolviendola en tampn a
pH 4, la filtran, extraccin en fase slida con columna Paker 10 C
18
acondiciona,
elucin de los analitos con acetato de etilo, columna COOH, nueva elucin con
metanol, acetonitrilo, y ac.oxlico y por ltimo la determinacin de las tetraciclinas se
realiza con HPLC-UV.
Para obtener resultados ptimos en nuestro laboratorio fue necesario modificar
algunas condiciones. Los distintos parmetros ensayados han sido: Eleccin de la
fase slida, solventes y volmenes de elucin, y fases mviles para la determinacin
cromatogrfica. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
SPE: Eleccin de la fase slida:

Las fases slidas ensayadas fueron las siguientes: 1g de C
18
, 0,5 g de C
18
y 1g de
Fenil (estas columnas eran de la misma marca (Isolute).Para realizar este estudio
se fortificaron muestras de miel con una mezcla de tetraciclinas para obtener una
concentracin final de 350 ng/g miel.
Los resultados obtenidos con cada tetraciclina se compararon con la media de tres
extractos fortificados. Los mejores porcentajes de recuperacin se obtuvieron con la
columna de 1 gr de C
18
.
SPE: Tipo y volumen de solvente de elucin:

Se ensayaron diversos solventes: Acetonitrilo, metanol, agua, acido oxlico,
metanol, hexano, tolueno y acetato de etilo. Una vez seleccionado el solvente de
elucin, se ensayaron diferentes volmenes con objeto de optimizar los resultados.
As, se ensayaron los siguientes volmenes: 6, 10 y 13 ml. El solvente de elucin
ms adecuado fue acetato de etilo:metanol (9:1)(v/v). Con sta mezcla el volumen
de elucin ptimo es el de 13 mL.



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HPLC: Fase mvil y pH:

Se ensayaron las siguientes variables: fase mvil (metanol, acetonitrilo, agua, acido
oxlico y flujo (gradiente e isocrtico).
La fase mvil que dio mejores resultados fue cido oxlico 0,01 M a pH 3 y
acetonitrilo. El mejor gradiente de elucin fue: hasta los 3 min. un 12% de
acetonitrilo, hasta los 13 min. un 20 % de acetonitrilo y hasta los 23 min. un 25% de
acetonitrilo.
Una vez incorporadas todas las modificaciones, el mtodo puesto a punto en nuestro
laboratorio es el siguiente:
Tras homogeneizar la muestra de miel, se pesan 3 gramos de miel y se disuelven en
6 ml de un tampn de EDTA-McIlvaine pH 4. La solucin resultante se homogeniza
en un Vibromatic a 800 rpm durante 10 minutos.
La muestra homogeneizada se carga en una columna de 1g de C
18
, previamente
acondicionada y activada con acetonitrilo, cido oxlico a pH 3 y disolucin saturada
de EDTA, sometindose a una extraccin en fase slida. El solvente de elucin es
una mezcla de metanol en acetato de etilo al 10% (v/v).
A continuacin, el eluato se concentra a sequedad en un vacuum Manifold, bajo una
corriente de nitrgeno y, finalmente, se reconstituye con una mezcla de acetonitrilo y
cido oxlico a pH 3, solventes que ms tarde se usarn como fase mvil en la
determinacin cromatogrfica por HPLC.
Esta separacin cromatogrfica se lleva a cabo mediante una columna C
18
y una
elucin en gradiente. La determinacin de los analitos se realiza a una longitud de
onda de 357 nm.
Tras la puesta a punto se procedi a la validacin del mtodo. Para ello se realizaron
estudios de linealidad, precisin (repetibilidad y reproducibilidad), exactitud
(recuperacin) y sensibilidad (lmite de deteccin y lmite de cuantificacin).
El rango lineal se define como aquel intervalo de concentraciones para los que la
variacin de la respuesta del detector es proporcional al cambio en la cantidad de
analito (FDA, 2000). En nuestro estudio de linealidad se fortificaron mieles con 100
l de disoluciones patrn con concentraciones comprendidas entre 700 y 10 ng/g En
la determinacin del rango de respuesta lineal se han seguido los criterios que


16
recomienda la Food and Drug Administration de EE.UU., que considera lineal el
rango de concentraciones de un compuesto para las que el factor respuesta es
constante dentro de un margen del 10%. (FDA, 2000)
Para realizar los estudios de precisin (repetibilidad y reproducibilidad) y de
exactitud (recuperacin), nos hemos basado en las recomendaciones de la Comisin
Europea Documento SANCO/3103/2000) y del ORA (1995) para la validacin de un
mtodo analtico.
De acuerdo con estas recomendaciones, para el estudio de repetibilidad, los anlisis
han sido llevados a cabo en el mismo laboratorio, por el mismo analista, en el mismo
da y con el mismo equipamiento en cada caso. Se ha realizado un total de nueve
anlisis sobre mieles fortificadas con las cuatro tetraciclinas a 350 ng/g miel.
Para el estudio de reproducibilidad, los anlisis se han llevado a cabo en el mismo
laboratorio, por el mismo analista, con el mismo equipamiento, pero en 3 das
distintos, en dos semanas distintas. Para ello, se han realizado 9 anlisis sobre
mieles fortificadas con las cuatro tetraciclinas a 350 ng/g miel.
El estudio de recuperacin evala la eficacia de la extraccin de este mtodo. El
ensayo de recuperacin se realiz por triplicado, a dos niveles de fortificacin, 350
ng/g miel y 50 ng/g miel.
De acuerdo con las Guidelines for Residues Monitoring de la Comisin Europea
(1999/2000) y la Decisin de la Comisin Europea del 12 de Agosto de 2002, se
aceptan coeficientes de variacin inferiores al 20% en los estudios de precisin y
recuperaciones comprendidas entre el 80 y el 110%.
Por ltimo, la sensibilidad del mtodo se ha evaluado mediante la determinacin de
los lmites de deteccin y de cuantificacin. El Grupo de Discusin para el Anlisis
de Residuos (ORA, 1995), define el lmite de deteccin como la menor cantidad de
analito a partir de la cual se puede establecer la presencia de analito en la muestra
con una certeza estadstica razonable, y lmite de cuantificacin como la menor
cantidad de analito en la muestra que puede ser medida cuantitativamente con una
certeza estadstica razonable. Para establecer estos lmites se ha estudiado,
adems, la presencia de interferencias coincidentes con los analitos en los
cromatogramas de los anlisis blancos.
Los resultados del estudio de validacin, se pueden observar en la tabla 2.



17

Tabla 2. Resultados del estudio de validacin:
Rango lineal
(ng/g)
Repetibilidad
(%C.V.)
Reproducibilidad
(%C.V.)
Recuperacin (%) LD
(ng/g miel)
LQ
(ng/g miel) (50 ng/g) (350 ng/g)
OTC 700-10 4,4 8,9 99 99,6 5 10
TC 700-10 8,4 6,9 99 102,4 5 10
CTC 500-40 8,4 7,7 96 102,2 30 40
DC 500-30 7,3 8,6 82 100,4 30 40
OTC: oxitetraciclina; TC: tetracilina; CTC: clortetraciclina; DC: doxiciclina
LD: lmite deteccin
LQ: lmite cuantificacin
CV: coeficiente de variacin

4.2. Puesta a punto y validacin de un mtodo de anlisis de flumetrina y otros
residuos de acaricidas de sntesis en miel (fluvalinato, cumafs,
bromopropilato y 4,4-dibromobenzofenona)

Se han ensayado distintas condiciones para poner a punto el mtodo de anlisis de
residuos de acaricidas sintticos en miel. Una vez optimizado, se ha sometido a un
procedimiento de validacin en el que se han determinado los parmetros de
sensibilidad, exactitud y precisin de acuerdo con las recomendaciones del ORA
(1995), la Comisin Europea (1999/2000), la FDA (2000) y la Decisin de la
Comisin (2002/657/CE).
Debido a la similitud qumica de la flumetrina y el fluvalinato es posible la aparicin
de resistencias cruzadas entre ambos principios activos (Thompson et al, 2000). Por
ello, nuestro laboratorio se plante como objetivo acoplar la determinacin del nuevo
principio activo, flumetrina, al mtodo multurresiduo que aplicbamos para la
determinacin de fluvalinato, bromopropilato, cumafs, y 4,4-dibromobenzofenona
en miel.
Dicho mtodo de anlisis, basado en el descrito por Gomis et al. (1996), consiste en
una extraccin en fase slida y una posterior determinacin cromatogrfica mediante
HPLC-DAD.


18
El mtodo puesto a punto en nuestro laboratorio consta de un paso previo de
preparacin de la muestra con metanol:agua (15mL) y un acondicionado de la
columna con metanol y agua en distinta proporcin. Posteriormente, se adiciona la
muestra de miel (5g) disuelta a la columna de C18 (0,5g), se lava con solvente
metanol:agua (3x3 mL), y se seca con una bomba de vaco conectada a un vacuum
Manifold (10 min. y 15mm Hg). Tras este proceso se colocan unos cartuchos de
sulfato sdico anhidro de 2,5 g. Para la elucin de los analitos se utiliza hexano (10
mL) y se lleva a sequedad bajo una corriente de nitrgeno. Finalmente, el extracto
se recontituye con metanol (1ml) y se almacena en congelacin (-20C) en viales de
rosca hasta su determinacin cromatogrfica con HPLC-DAD. Las condiciones
cromatogrficas son la siguientes: fase mvil de agua y acetonitrilo con un flujo de 1
mL /min. en gradiente en el que hasta los 12 min la proporcin de acetonitrilo es del
100% y que hasta los 15 min es del 80%.
Los primeros resultados en los que aplicbamos el mtodo para la determinacin de
la flumetrina dieron resultados satisfactorios, por lo que se procedi a validar el
mtodo para este nuevo acaricida, de acuerdo con las especificaciones presentes en
la Decisin Europea del 12 de Agosto del 2002.

4.3. Estudio de la estabilidad de las tetraciclinas en diferentes muestras de
miel (efecto de la pasterizacin y efecto del tiempo de almacenamiento)

Se ha realizado un estudio con el fin de determinar la degradacin que sufren los
antibiticos tetraciclinas en la miel por efecto de la pasteurizacin y a lo largo del
tiempo. Para ello, se utilizaron 11 mieles comerciales de diferentes orgenes
botnicos.
Es necesario comprobar la ausencia de contaminacin antes de fortificar con
tetraciclinas, para lo cual, se realiza un anlisis previo de residuos de estos
contaminantes. Tras verificar la ausencia de tetraciclinas en estas mieles se fortifican
de la siguiente manera (los resultados de estos anlisis se considerarn como los
resultados a tiempo 0):
A 250 g se aadi 1 mL de una mezcla de las cuatro tetraciclinas estudiadas
(Oxitetraciclina, Tetraciclina, Clortetraciclina y Doxiciclina) disueltas en acetonitrilo-


19
c. oxlico (15:85). La concentracin de la disolucin de las tetraciclinas es de 125
g/mL, por lo tanto la concentracin en los 250 g de miel, es de 500 ng/g de miel.
50 gr de cada una de estas mieles son separados para realizar un estudio de
degradacin de los residuos de tetraciclinas en miel tras ser sometida sta a un
proceso de pasterizacin, similar al que se aplica en la elaboracin industrial de miel.
La miel restante (150 gr), se almacena en oscuridad a temperatura constante de
25C, para posteriores anlisis a los 30 das, 90 das y 180 das.

4.4. Estudio de estabilidad de flumetrina en la colmena

Dentro de un estudio ms amplio que abarca la parasitacin de las colmenas y el
efecto del tratamiento veterinario en la colmena con, se ha realizado un estudio de
estabilidad de los residuos de flumetrina en la propia colmena.
Con el objetivo de ver la evolucin del tratamiento veterinario a lo largo del periodo
indicado en el prospecto del medicamento (6 semanas) se ha seguido las pautas
indicadas en la posologa del prospecto del medicamento especifico para abejas
Bayvarol(una tira contiene 3,6 mg de flumetrina), indicado para la eliminacin de
infestaciones de ectoparsitos como la varroa.
Se trataron cinco colmenas de un mismo colmenar ubicado en la localidad
zaragozana de Litago (zona del Moncayo), colocndose las tiras tanto, sobre
panales con la cmara de cra, como sobre panales alejados de estas zonas. El
resto de colmenas quedaron como colmenas control.
Las cinco colmenas elegidas, no haban sido tratadas con anterioridad, para eliminar
la posibilidad de la aparicin de resistencias a la flumetrina, o resistencias cruzadas
debidas al fluvalinato, sustancia activa de la misma familia que la flumetrina, ambos,
piretroides indicados para la lucha contra la varroosis.
Anteriormente al tratamiento veterinario con flumetrina, se sustrajeron trozos de
panal de unos 8 cm de largo por 5 cm de ancho, de los cuales se extrajo la miel, que
sirvi como referencia y blanco matriz en el posterior proceso analtico. Esta miel fue
almacenada en congelacin (-20C) hasta su posterior anlisis.


20
Tras esperar las seis semanas indicadas en el prospecto, se retiraron las diversas
tiras y se sustrajeron trozos de panal tanto de las zonas prximas a la ubicacin de
las tiras como de los panales ms alejados de estas tiras. Los trozos tenan las
mismas dimensiones que los anteriormente citados, 8 x 5 cm.
La miel fue extrada de estos trozos de panal por procesos puramente fsicos, el
panal se coloca sobre un colador y se presiona cuidadosamente con una varilla de
vidrio para hacer pasar la miel a travs de la maya sin arrastrar impurezas
(Adamczyk et al., 2005). De esta manera se obtiene una miel fluida, limpia y se evita
cualquier posible alteracin de la sustancia activa debida a la temperatura. Esta miel
fue almacenada inmediatamente en congelacin (-20C).
Ocho semanas despus de la aplicacin del tratamiento, se volvi a repetir la misma
operacin realizada a las seis semanas, se retiraron los trozos de las zonas ms
prximas a las tiras y de los panales ms alejados a stas para posteriormente
extraer la miel.
A continuacin, se procedi al anlisis de las mismas. Para ello, se utiliz el mtodo
de extraccin de residuos de cumafs, bromopropilato, 4,4dibromobenzofenona,
fluvalinato y flumetrina, citado anteriormente en la metodologa.
Inmediatamente tras la extraccin en fase slida de los posibles residuos de
flumetrina, se procedi a su determinacin por cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC).
Los resultados del estudio indican que siguiendo el modo de empleo, posologa y
dems indicaciones presentes en el prospecto del medicamento Bayvaroltiras, no
existen residuos de flumetrina en miel procedente de las colmenas sometidas a
estudio, en los periodos de tiempo ensayados (6 y 8 semanas).

4.5. Anlisis de residuos de acaricidas de sntesis en muestras de miel

Se analizaron 20 muestras de miel de las campaas 2005-2006 y 2006-2007 de
diversos puntos de la geografa aragonesa, con el objetivo de determinar el
contenido de flumetrina y otros varroacidas de sntesis que estas pudieran contener.
La metodologa utilizada para determinar dichos acaricidas es la desarrollada en
este estudio.



5. BIBLIOGRAFA

1. Adamczyk S., Lzaro R., Prez- Arquillu C., Conchello P., Herrera A.
(2005). Evaluation of residues of essential components in honey after
different Anti-Varroa treatments. J. Agric. Food Chem., 53, 26, 10085-10090.
2. Alippi, A., Albo, G., Leniz, D., Rivera, I., Zanelli, M., Roca, A., 1999.
Comparative study of tylosin, erythomycin and oxytetracycline to American
foulbrood of honey bees. J . of Apicultural Research. 38, 149-158.
3. Anderson D.L. y Trueman J .W.H., 2000. Varroa jacobsoni (Acari: Varroidae)
is more than one species. Exp. Appl. Acarol. 24, 165-189.
4. Argauer, RJ ., Moats WA., 1991. Degradation of oxytetracycline in honey as
measured by fluorescence and LC assays. Apidologie. 22, 109-115.
5. Ayet J . (2007). Document de travail des services de la Commission -
Document accompagnant le troisime rapport de la Commission au Conseil
et au Parlement europen sur l'application du rglement (CE) n 797/2004 du
Conseil relatif aux actions visant amliorer les conditions de la production et
de la commercialisation des produits de l'apiculture. Fecha de recepcin: 23
de marzo de 2007.
6. Bayvarol Tiras. Flumetrina, acaricida para el diagnstico y control de los
caros de la varroasis en las abejas. Prospecto del medicamento de la casa
Bayer AG, Alemania, distribuido en Espaa por CEVA Salud Animal S.A.
7. Bogdanov S., Imdorf A., Kilchenmann V. (1998). Acaricide residues in some
bee products. J ournal of Apicultural Research 37, 2, 57-67.
8. Bogdanov S., Imdorf A., Kilchenmann V., Gerig L. (1990). Residues in
beeswax, winter sugar stores and honey after treatments with Apistan and
Folbex VA. Proceeding of the Fourth International Symposium on the
Harmonization of Methods for Testing the Toxicity of Pesticides to Bees, May
15-18, 1990, Rez near Prague, Czechoslovakia., 1-3.
9. Comisin Europea (1999/2000) Guidelines for Residues Monitoring.
10. De Greef M., De Wael L. y Van Laere O. 1994. The determination of the
fluvalinate residues in the Belgian honey and beeswax. Apiacta XXIX, 83-87.
11. De Greef M., De Wael L., Van Laere O. (1994). The determination of the
fluvalinate residues in the Belgian honey and beeswax. Apiacta XXIX, 83-87.
12. De J ong, D. 2004 diagnstico y control de loque americana. Vida Apcola
126, 44-45.


13. Decisin de la Comisin, de 12 de agosto de 2002, por la que se aplica la
Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los mtodos
analticos y la interpretacin de los resultados.
14. Dieguez, S., Soraci, A., Bedascarrasbure, E., Libonatti, C. 2000.
Metodologa analtica para la deteccin de residuos de oxitetraciclina en miel
RIA (1): 159-166.
15. Documento SANCO/3103/2000 Recomendaciones de la Comisin Europea
para la validacin de un mtodo analtico.
16. Flamini C., 1986. Analyse de divers types de rsidus en apiculture. Tesis de
la Universidad de Niza.
17. Floris I., Satta A., Garau V.L.,Melis M., Cabras P., Aloul N. (2001).
Effictiveness, perisistence , and residues of amitraz plastic strips in apiary
control of Varroa Destructor. Apidologie 32, 577-585.
18. Food and Drug Administration de EE.UU (FDA). 2000. Guideline for Industry.
Analytical Procedures and Methods Validation.
19. Geertsen G., Pedersen, B. 2004 Determination of residual Tetracyclines in
honey by HPLC-UV; Optimizing and validation. Danish Veterinary and Food
Administration.
20. Gndinger F., 1989. The beekeepers and the residues in honey. Present
status in Europe and progress in the varroa mite control, Proc. Meet. EC-
Expert Group, udine 1988, R Cavalloro ed., CEC Luxemburg, 365-368.
21. Gomis D.B., Mangas J .J ., Castao A. y Gutirrez M.D. 1996. Determination
of Acaricides in Honey by Liquid Chromatography Anal. Chem. 68, 3867-
3870.
22. Grupo de trabajo de Eurachem para LGC. 1998. The fitness for purpose of
Analytical Methods: A Laboratory Guide to Method Validation and Related
Topics. 1 Edicin. Reino Unido.
23. Hillerton J .E., Halley, B.I., Neaves, P. y Rose, M. D. 1999. Deteccin of
antimicrobial substances in individual cow and quarter milk samples using
Devoltest microbial inhibitor test. J . Dairy Sci., 82, 704-711.
24. Ivie G. y Rowe L., 1986. Chemistry of drugs used against arthropod
Parasites. Chemotherapy of parasitic diseases. Plemun Press New York,
507- 529.
25. J ean-Prost P. (2001) Apicultura. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid-Barcelona-
Mjico.



26. Klein E., Weber W., Hurler E., Mayer L., 1986. Gaschromatographische
Bestimmung von Isopropyl-4,4-dibrombenzilat (Brompropylat),4-
Dibromobenzophenon und verschiedenen Akariziden in Honig und
Warbenwachs. Deutsche Lebensmittel-Rundschau. 82., 6, 185-187.
27. Kochansky, J . 2000. Anlisis of oxytetracycline in extender patties.
Apidologie 31, 517-524.
28. Korta E., Bakkali A., Berrueta L.A., Gallo B. y Vivente F., 2002. Study of an
Accelerated Solvent Extraction for the Determination of Acaricide Residues in
Honey by High-Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector.
J . of Food Protection. 65, n1, 161-166.
29. Lodesani M., Pellacani A., Bergomi S., Carpana E., Rabitti T. y Lasagni P.
1992. Residue determination for some products used against Varroa
infestation in bees. Apidologie. 23, 257-272.
30. Maver L. y Poklukar J . 2003. Coumaphos and amitraz residues in Slovenian
honey. Apiacta 38, 54-57.
31. Oka, H., Ikai Y., Hayakawa, J ., Harada, K., Asukabe, H., Suzuki, M., Himei,
R., Horie, M., Nakazawa, H., McNeil, J ., 1994. Improvent of Chemical
Analysis of Antibiotics. Identification of Residual Tetracycline in Honey by frit
FAB/LC/MS Using a Volatile Mobile Phase. J . of Agri. And Food Chemistry.
42, 2215-2219.
32. Oka, H., Ikai, Y., Kawamura, N., Uno, K., Yamada, M. 1987. Simultaneus
anlisis of seven tetracyclines in honey. J . of Chromatography. 400, 253-
261.
33. ORA (Dutch Discussion Group for Residues Analysis). 1995. Definitions for
the determination of drugs residues in food of animal origin.
34. Pagliuca, G., Gazzotti, T., Serra, G, Sabatini, A., 2002 A sienctific note on
the determination of oxytetracycline residues in honey by HPLC-UV
detecion. Apidologie. 33, 583-584.
35. Real Decreto 1049/2003, de 1 de agosto, por el que se aprueba la Norma de
calidad relativa a la miel. BOE nm. 186.
36. Reglamento (CEE) n 2377/90 del Consejo, de 26 de junio de 1990, por el
que se establece un procedimiento comunitario de fijacin de los lmites
mximos de residuos de medicamentos veterinarios en los alimentos de
origen animal.
37. Sinz C., Gmez C. (2000) Mieles Espaolas. Caractersticas e
identificacin mediante el anlisis del polen. Ediciones Mundi-Prensa.
Madrid-Barcelona-Mxico.


38. Sancho T., Muniategui S., Huidrobro J .F., Simal J . (1991). Anlisis de
residuos de fluvalinato en la miel mediante GC/ECD. Rev. Agroqum. Tecnol.
Aliment. 31, 3, 417-422.
39. Slabezki Y., Gal H., Lensky Y. (1991). The effect of fluvalinate application in
bee colonies on population levels of Varroa jacobsoni and honey bees (Apis
mellifera L.) and on residuos in honey and wax. Bee Science 1, 4, 189-195.
40. Szerletics-Tri M., 1999. Determination and control of bee-acaricide
flumethrin in honey and beewax. Acta Alimentaria. 28, 85-94.
41. Takeba, K., Kanzaki, M., Murakami, F., Matsumoto, M., 1984. Simplified
Analytical Method for Tetracyclines Residues in Honey by HPLC. Ann. Rep.
Tokyo Metr. Res. Lab. P.H. 35, 187-191.
42. Thompson H.M., Ball R.F., Brown M.A., y Bew M.H, 2002. Varroa destructor
resistence to pyrethroid treatments in the U.K.. Apidologie.
43. Thrasyvoulou, A.T. y Pappas, N. 1988. Contamination of honey and wax with
malathion and coumaphos used against the varroa mite. J ournal of
Apicultural Research 27, 1, 55-61.
44. Tremolada P., Bernardinelli I., Colombo M., Spreafico M., Vigh M. (2004).
Coumaphos distribution in the Hive Ecosystem: Case study for modeling
applications. Exotoxicology 13, 589-601.
45. Tsigouri A., Menkissoglu-Spiroudi U., Thrasyvoulou A. (2001). Study of Tau-
fluvalinate persistence in honey. Pest Management Science 57, 467-471.
46. Van Buren N., Marien J ., Velthuis H.H.W., Oudejans R.C.H.M. (1992).
Residues in beeswax and honey of Perizin, an acaricide to combat the mite
Varroa J acobsoni Oudemans (Acari: Mesostigmata). Environ. Entmol. 21, 4.
860-865.
47. Vias, P., Balsalobre, N., Lpez-Herroz, H., Hernndez-Crdoba, M., 2004.
LC with ultraviolet absorbance detection for the analisis of tetracycline
residues in honey. J . of Chromatography A. 1022, 125-129.
48. Waliszewski S.M., Infanzn R.M., Carvajal O., Maxwell Hart M. (2003).
Removing T- fluvalinate residues from press-extracted honey. J . Sci. Food
Agri. 83, 1225-1227.
49. Willians D.L., 2000. A Veterinary Approach to the European Honey Bee (Apis
mellifera). The Veterinary J ournal 2000, 160, 61-73.
50. http://www.infoagro.com/agricultura_ecologica/apicultura.htm