Microbiologa General Seminario Nro.

Nro 4 Aislamiento e identificacin de Microorganismos

 Para P qu aislar i l microorganismos i i ? Para qu identificar un microorganismo ? Caracterizacin vs. Identificacin

1. Pruebas bioqumicas 2. Pruebas Moleculares

Identificacin presuntiva Identificacin final

Aislamiento e identificacin de microorganismos

Procedencia Caractersticas Expectativas Tratamiento inicial Siembra

Mtodos convencionales Mtodos moleculares

Aislamiento Ai l i t Identificacin

Tratamiento inicial

Enriquecimiento (selectivo o no) Calentamiento Filtracin Filt i Homogeneizacin, etc Seleccin de medios de cultivo

Si b Siembra

Inculo Observacin microscpica

Aislamiento

Agotamiento por estras, dils seriadas, etc Subcultivo Macroscpicos Criterios de pureza Microscpicos

Cultivo puro

Identificacin

Muestras
Agua
Microorganismos indicadores Coliformes P. aeruginosa

Deteccin de B. cereus en leche en polvo, miel, arroz

Alimentos

Deteccin de S. aureus en alimentos procesados y leche cruda Aislamiento de Lactobacillus spp de productos fermentados

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo Seleccin de esporas Calentamiento Enriquecimiento Agotamiento por estras Mossel Colonias aisladas Man (-), Lecitinasa (+) Tinciones Repique Cultivo puro

Morfologa de las colonias

Forma y tamao de las colonias Irregular, g p puntiforme Bordes liso rugoso liso, rugoso. Elevacin C Convexo, elevado, l d umbonado, b d li liso. Color Pigmento, opaca, translucida, brillante. Textura Mojada, mucosa, seca.

Bacillus subtilis Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae

Forma de la colonia y tamao: irregular Bordes: ondulado Tpico movimiento sobre la caja de petri Elevacin: umbonada Color: Blanca crema Textura : seca

Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias

Catalasa
Para determinar microorganismos que producen la enzima catalasa. H2O2 es producido por bacterias aerobias o facultativas mediante reacciones no enzimticas de reduccin de flavoprotenas o por accin enzimtica de radicales superxido.

Micrococcaceae, Staphylococcus Streptococcaceae, Streptococcus Enterococcus

catalasa (+) catalasa (-)

2H2O2

Catalasa

2H2O+ O2

+ +

Oxidasa
Para identificar bacterias que contengan la enzima citocromo oxidasa c (respiracin). Oxidasa negativaoxidasa positiva. La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un donor hacia el aceptor final de la respiracin (oxgeno). En este test un donor de electrones artificial (phenylenediamine) se usa para Reducir la citocromo oxidasa. d

oxidasa (+) Pseudomonas

oxidasa (-) E. coli Neisseria

I M Vi C Indol Rojo de Metilo Vohes h P Proskauer k Citrato

Indol
Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar el indol de la molcula de triptofano

triptofanasa
Triptofano Indol + cido piruvico + amonio

Indol + p-dimetletilenamino-benzaldehido

HCl

Alcohol isoamilico

Rosindol (Rojo)

Reactivo de Kovacs

Indol
El triptofano se adiciona al medio en una concentracin 1%. Se adicionan 10 a 12 gotas del reacc. de KOVACS.

Rojo de metilo Voges Proskauer

Glucosa Piruvato CO2 Acetil-CoA Lactato Succinato Etanol A t t Acetato CO2 H2

+
Formiato

Glucosa

Piruvato

2.3Butanodiol + CO2 Etanol Lactato Succinato Acetato CO2 + H2

Voges-Proskauer (VP)
Daniel Voges Bernhard Proskauer

Para identificar microorganismos capaces de producir acetoina y 2,3-butanediol como resultado de la degradacin de glucosa.

Glucosa

Piruvato

Acetoina + - naphtol 40% KOH Alcohol O2

2.3-butanediol

Barritt's Barritt sA

Barritt Barritt's sB

Diacetilo + Creatina (Rojo)

- naphtol en etanol absoluto

KOH 40%

Rojo de metilo
Rojo de metilo (MR) Para identificar bacterias que producen fermentacin mixta de la glucosa y liberan cidos estables estables.
Este medio de cultivo incluye, peptona, glucosa, y buffer fosfato. El indicador de pH rojo j de d metilo til se adiciona di i a un cultivo lti crecido id 48 hs. h Por P debajo d b j de d 4.4, 4 4 el l indicador i di d cambia a rojo (positivo).Amarillo con pH por encima de 6.0 (negativo)

Citrato
Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar Citrato como nica fuente de carbono.

Ci Citrato de d Sodio S di

Citrato p permeasa Citrasa

Acido A id piruvico i i + Acido A id oxalacetico l i + CO2

Exceso de Sodio + CO2 + H2O

(liberado luego de usar el citrato)

Na2CO3
(Alcalino --> pH)

Citrato
Agar Citrato de Simmon: Es un medio definido que contiene Citrato de Sodio como nica fuente carbonada y amonio como nica fuente de nitrgeno. nitrgeno Un MO que utiliza citrato como fte de C tambin utiliza las sales de amonio como su nica fte de N dando como resultado amonaco que alcalinizan el medio. El indicador de pH , azul de bromofenol, cambia de verde a pH neutro (6.9) a azul a pH mayores que 7.6.

Tree Sugar Iron Agar (TSI)

Para diferenciar bacterias basado en su habilidad para fermentar glucosa, lactosa y/o sacarosa, y para producir sulfuro de Hidrogeno. Se usa para distinguir entre bacterias de la familia Enterobacteriaceae, Que adems d son capaces de d fermentar f glucosa l y producir d d como producto cidos d f l final.

Azcar

Productos cidos

pH (Amarillo)

Peptonas

Amoniaco (NH3)

pH (Rojo)

Fermentacin (medio cido) + Tiosulfato de Sodio SH2 + iones frricos

SH2 (gas)

Sulfuro ferroso (precipitado negro insoluble)

Triple Sugar Iron Agar (TSI)

Fermentacin

Utilizacin de Las peptonas p p

Produccin de gas

Produccin de SH2

Resultados (Tubo/Base) Rojo/Amarillo j Amarillo/Amarillo Rojo/Rojo Rojo/sin cambio Amarillo/Amarillo con disrupcin del agar Rojo/Amarillo con disrupcin del agar Rojo/Amarillo con disrupcin del agar y PP negro Rojo/Amarillo y PP negro Amarillo/Amarillo y PP negro Sin cambio/ Sin cambio

Smbolo K/A A/A K/K K/NC

Interpretacin Solo fermenta la Glucosa, y luego utiliza las peptonas Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa No hay fermentacin, Solo se utilizan l las l Peptonas No hay fermentacin, Solo se utilizan las Peptonas aerbicamente Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa con produccin de gas Solo fermenta la Glucosa, Glucosa con produccin de gas Solo fermenta la glucosa con produccin de gas y H2S Solo fermenta la glucosa y produce H2S Fermentacin de glucosa, lactosa y / o Sacarosa con produccin de H2S No hay crecimiento

A/A,G

K/A,G K/A,G, H2S K/A, H2S A/A, H2S NC/NC

Fermentacin de carbohidratos (Caldo - rojo fenol)

Se adiciona un azcar al medio: Lactosa, sacarosa, glucosa, etc. Propsito: Se usa para determinar fermentacin de ciertos azcares y produccin de gases. Se usa para identificar bacterias entricas Gram negativas. negativas

1- Control sin inocular 2- Amarillo: 2 A ill Utilizacin Utili i del d l azcar, produccin d i de d cido id sin gas. 3- Amarillo y produccin de gas. 4- Fermentacin negativa. Oscurecimiento del medio de cultivo producto de utilizacin de peptonas liberacin de amonio. y

Fermentacin de sacarosa Fermentacin de glucosa Fermentacin de lactosa organismos

1. . Control Co t o 2. S. aureus 3. P. vulgaris 4 P. 4. P aeruginosa i 5. E. coli

resultados
Negative Negat ve Acid Acid, Gas N ti Negative Negative

orgamismos
1 Control 1. 2. S. aureus 3. P. vulgaris 4. P. aeruginosa 5. E. coli

resultados
Negative Acid Acid, Gas Negative Acid, Gas

organismos
1 Control 1. 2. S. aureus 3. P. vulgaris 4. P. aeruginosa 5. E. coli

resultados
Negative Acid Negative Negative Acid, Gas

Reduccin de nitrato
Muestra la capacidad de un m.o de reducir nitrato (NO3) a nitrito (NO2) u otros componentes del nitrgeno como (N2), usando la enzima nitrato Reductasa.

NO3 + 2 H

2eNO2 + H2O nitrato reductasa

Nitrato (NO3) puede ser reducido por diferentes compuestos incluso por respiracin anaerobia o por denitrificacin. El medio de cultivo contiene nitrato de potasio como sustrato. sustrato

NO2

NH3

N2

Reduccin de nitrato
(Reactivo A) (Reactivo B)
Acido Sulfanilico + NN dimetil-1-naftalenamina + inoes nitrato

Sulfobenzeno azo-NN dimelethylen-1-naptalenamino (rojo) Si luego l d agregar los de l reactivos ti A y B no aparece coloracin se agrega Zn. El Zn es capaz de formar un complejo coloreado con el Nitrato. Por lo tanto si no aparece p coloracin este fue utilizado y entonces el MO es capaz de reducir el Nitrato

- +

Prueba de decarboxilacin de aminocidos

Muestra la capacidad de un microorganismo para decarboxilar un aminocido para formar una amina, con al consiguiente alcalinidad. Indicador de pH: prpura de bromocresol. bromocresol Se coloca aceite mineral para crear un ambiente de anaerobiosis para promover la fermentacin. Se necesita un ambiente cido porque la enzima solo funciona en estas condiciones.

Aceite mineral

Arginina Ornitina Lisina (-) (+) (+)

Control

Prueba de fenilalanina-desaminasa
Se utiliza para identificar accin de la enzima phenilalanina phenilalanina-deaminasa. Usado para distinguir Morganella, Providencia, y Proteus (Positivos) de otros grupos como Enterobacteriaceae (negativos). El medio contiene el aminocido fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH2) y libera amonio (NH3). Se obtiene acidofenilpiruvico, que puede ser detectado por la adicin di i de d un agente t oxidante id t (Cloruro (Cl F i al Ferrico l 10%). 10%) Un U cambio bi de d color l al l verde d indica una reaccin positiva. Negativo Positivo

Prueba de ureasa
Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, formando dos molculas de amoniaco por accin de la enzima ureasa Urea + 2 H2O

ureasa

CO2 + H2O + 2 NH3

(NH4) CO3

1.

No inoculado

2. Proteus vulgaris: Positivo 3. Escherichia coli: Negativo

Prueba de hidrlisis de caseina

D t Determinar i la l capacidad id d de d producir d i enzimas i proteilicas t ili capaces de d hidrolizarla casena

S aureus (-) S. E. Coli (-)

B ill subtillis Bacillus btilli (+) ( )

Prueba de licuefaccin de Gelatina

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo preoteltico (gelatinasas) que licuan gelatina

Protena + H2O Polipptidos + H2O

Gelatinasas

Polipptidos Aminocidos individuales

Prueba de hidrlisis de Almidn

Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidn mediante enzimas del tipo amilasas

Almidn

-amilasa il
H2O

dextrinas + maltosa
polisacridos disacrido

+ glucosa
monosacrido

Lugol

(-) ( )

( (+) )

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo Seleccin de esporas Calentamiento Enriquecimiento Agotamiento por estras Mossel Identificacin y caracterizacin
Catalasa Fermentacin de azcares Hemlisis

Colonias aisladas Man (-), Lecitinasa (+) Tinciones Repique Cultivo puro

Deteccin de genes de virulencia (toxinas-PCR (toxinas PCR hblA, B, C, D.)

Tests Multipruebas

API 50 CH
Se utiliza para Bacterias del cido lctico Patrn de fermentacin de 49 fuentes de carbono

API 20 E
Contiene 20 pruebas para la identificacin de bacterias Entricas

API Staph Para Staphilococcus

API 20NE Para bacterias gram - no entricas