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ManualdeprcticasdeParasitologaconnfasisenhelmintosparsitosdepecesdeagua dulceyotrosanimalessilvestresdeMxico

GuillermoSalgadoMaldonado InstitutodeBiologa,UNAM

ProyectoPE209106 Programadeapoyoaproyectosparalainnovacinymejoramientodelaenseanza, PAPIME DireccinGeneraldeAsuntosdelPersonalAcadmico,DGAPA,UNAM 20072009

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CONTENIDO Introduccin:Loshelmintosylascaractersticasdelavidaparasitaria. Grupostaxonmicosdehelmintos Helmintosparsitosdepecesdeaguadulce,prcticadecampo Tincinymontajedehelmintos PhylumPlatyhelminthes:Introduccin Tremtodos Monogneos Cstodos Phylum Acanthocephala Phylum Nematoda Descripcindehelmintiasis,parmetrosbsicos Ecologadeparsitos:distribucinagregadadelaspoblaciones Ecologadecomunidades Cuntasespeciesconstituyenlacomunidaddeparsitos? Distribucindeabundanciadelasespecies Dominancia.Rareza. Diversidad.

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Introduccin Elparasitismoeslaformadevidamsextendidaenelplaneta.Virtualmentetodo servivotieneparsitos,tantolasplantascomolosanimales.Cadaespecietieneespeciesde parsitosquesonespecialistasdeella,queslolaparasitanaella.Porejemplo,entrelos parsitosespecialistasdelhombrecontamosaTaeniasolium,lasolitaria,yaEnterobius

vermicularis,eloxiuro.Delamismaformacadaespeciedeservivotienesuspropios
parsitos.Ademsdelosespecialistascadaespecieseveafectadatambinporespecies generalistas,porejemplo,latriquina,Trichinellaspiralisademsdeparasitaralhombre puedeencontrarseencerdos,perros,gatos,etc. Sonparsitoslosvirus,muchasbacteriasyprotozoarios,perotambinalgunostipos deartrpodos,anlidosymoluscos.Hayparsitosencadagrupo(phylum)deanimales. Podemosdistinguirentremicroparsitosymacroparsitos:losmicroparsitoscomolos virus,bacteriasyprotozoariossonpequeosypuedenmultiplicarsedirectayrpidamente dentrodelapoblacindehospederos encambiolosmacroparsitos,helmintosy artrpodos,sondemayortamaonosemultiplicandentrodelhospedero,supoblacin incrementaporinmigracinnoporreproduccindirectadentrodecadahospedero (Anderson,1993). Losgusanosparsitosdeanimalesseconocen engeneralcomohelmintos. Incluyendotresgrandesgruposlosplatelmintos,acantocfalosynemtodos(Cromptony Joyner,1980WilliamsyJones,1994).Tresclasesdeplatelmintossonfrecuentesentrelos parsitosdeanimalessilvestres,enparticularentrelospeces,lostremtodos,monogneos yloscstodos.Losacantocfalossonpococonocidosinclusoentrelosbilogos,muypocas especiesparasitanaanimalesdomsticosestoshelmintosconunaproboscisarmadade

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ganchosparasitanenanimalessilvestres.Losnemtodossonunodelosgruposbastante conocidosporlasespeciesqueparasitanalhombreyanimalesdomsticoselnmerode susespeciesenanimalessilvestresesaunmayor.

Laparasitologaesunreadeestudioeinvestigacin muydinmicaenel mundo actual,muchasuniversidadesdelextranjerotienenplanesdeposgradoe investigacin bsicayaplicadaenestarea.Losprofesionistas(graduadosy posgraduados)deestarea delconocimientopodrndesarrollarseulteriormenteenlaacademia,laindustria,las institucionesdesalud,medicinaveterinaria,acuicultura,entreotras.Todoestoimponeuna demandarealdealumnosconunaslidapreparacinbsicaenParasitologa. Unodelosproblemasaqueseenfrentaeldocenteennuestromedioesla carenciadedatos,especimenes,prcticasydesarrollosdidcticosderivadosdel estudiodelabiotadenuestropas.Loslibros,losmateriales,ylosejemplosenque nosbasamosparalaenseanzaenparticularenlacarreradeBiologa,procedendel extranjero.Sibien,enparasitologamdicayenparasitologaveterinariacontamos conexcelentespublicacionesquehacenreferenciaanuestroentorno(porejemplo Biagi,1982CruzLpez,1981QuirozRomero,1984FlisseryPrezTamayo,2006), noesasencuantoaparasitologadeanimalessilvestres.Laparasitologade animalessilvestresseenseaactualmentecondatos,ejemplosyorganismos derivadosdeestudiosrealizadosenotraslatitudes,primordialmentedereas templadascorrespondientesapasesdesarrollados(entrelostextosmsusados estnporejemploBushetal.,2001Poulin,1998).Ladiversidadorgansmicayla diferenciadecondicionesambientalesdenotanclaramentelanecesidaddeabordar

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estaproblemtica.Esoportunodesarrollarcaucesparatrasmitirelconocimiento generadoennuestromedioenapoyoalaformacinderecursoshumanos.

Elobjetivogeneraldeestemanualdeprcticasestrasmitirlaexperienciagenerada mediantelainvestigacindeparsitosmedianteladescripcindelosprocedimientosy tcnicasqueaplicamosengeneralennuestrasinvestigaciones.Particularmentenos referimosaloshelmintosparsitos,enespeciallosdepecesdeaguadulce,comoun modelodetrabajo.

Bibliografa Anderson,R.M.1993. Epidemiologypp.75116In:Cox,F. E.G.(Ed.)Modern Parasitology.BlackwellScientificPublications.Londres.

Crompton,D.W.T.yJoyner,S.M.1980.ParasiticWorms.WykehamPublications, Londres.207pp.

Williams,H.yA.Jones.1994.Parasiticwormsoffish.TaylorandFrancis,Londres,593 pp.

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Helmintosparsitosdepecesdeaguadulce,prcticadecampo Introduccin Objetivos Materialesymtodos Recoleccindehospederos Examendehospederos Fijacindehelmintos Conservacindehelmintos Bibliografa

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Helmintosparsitosdepecesdeaguadulce,prcticadecampo Introduccin Esposibledesarrollarestaprcticaexaminandopecesdecualquiercuerpodeagua dulceaccesible,losresultadossiempreserninformativos.Elexamendetilapiasycarpas, entantopecesintroducidos,y depecesdeacuarioocultivadospodraresultarenla observacindepocosparsitosperodesdeluego,ayudarsiloquebuscamoses determinarespeciesdehelmintosintroducidas.Contamoscondatosdelosparsitosde pecesdelagos,Ptzcuaro,Mich.,Chapala,Jal.,Catemaco,Ver.yrospertenecientesalas distintascuencashidrolgicas,Balsas,Lerma,Ayuquila(SierradeManantln,Jal), Santiago,Pnuco,Papaloapan,GrijalvaUsumacinta(yotrosrosdelaLlanuraCosteradel GolfodeMxico,haciaTabascoyCampeche)ydeloscenotesyotroscuerposdeaguade laPennsuladeYucatn(verSalgadoMaldonado,2006Zootaxa http://www.mapress.com/zootaxa/2006f/zt01324p357.pdfyreferenciasenesetrabajo). TambinexistendatossobreloshelmintosparsitosdepecesdelosrosdeChiapas,delro Papagayo,Guerrero,LaAntigua,Veracruz,ydelasdistintascuencasdelestadodeOaxaca (www.ibiologia.unam.mxconsultarpginaSalgadoMaldonado,G.).Huelgadecirquelas preguntasinicialesenunainvestigacincomostason1)qupecesexaminar?2)qu helmintosparsitospodrencontrar? Sibienesposiblequeparalaprcticasejuzguesuficientecomprarpeces(uotros hospederos)alagentedelalocalidad,esnecesarioapuntarquealgunosparsitospodrn perderse,yprimordialmentequenotendremoslacertezadelaprocedenciadelos hospederos.Esteltimodatoessiemprevitalentodainvestigacinformal,lascondiciones

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localespuedenversereflejadasenelcontenidoparasitolgicodeunapoblacin determinada. Todoslosseresvivosestnparasitados,loraroesencontrarunorganismo,plantao animalsinparsitos.Lospecescomolosanfibios,reptiles,avesymamferos,cuentanentre susparsitosmsevidentesaloshelmintos.Cualquiertejidourganodeunpezes susceptibledeestarparasitado. Loshelmintosseencuentran enpiel,aletas,cavidades nasales,cavidadyarcosbranquiales,cloaca,bocayenlasescamasdelalnealateral,es decir,podemosencontrarectoparsitosencualquierrganoexterno,tejidoocavidaddelos peces.Delamismaforma,losendoparsitoshabitan enojos,cerebro,cavidadcelmicao corporaldelpez,mesenterios,grasa,gnadas,riones,hgado,musculaturaparietal,sangre, ydesdeluego,entodoeltractodigestivo,losciegosyelintestino. Enestaprcticaseproponelarevisindepecesdeaguadulceparael reconocimientoyrecoleccindehelmintosparsitos. Eldesarrollodelaprcticapermitir identificarenvivolosdistintostiposdehelmintosyaplicarlosmtodosapropiadosparasu fijacinypreservacin.

Objetivos 1. Aplicarlastcnicasgeneralesparaelexamendehospederos,(enestecasoparticular poblacionessilvestresdepeces),paralabsquedadehelmintosparsitos. 2. Reconocerlosdistintostiposdehelmintosenvivo. 3. Aplicarlastcnicasdefijacinapropiadasparacadagrupodehelmintos,parasu procesamientoyestudiomorfolgicoposterior.

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MaterialesyMtodos Recoleccindehospederos.Elmuestreodepecesdependedelalocalidadylasespecies queah habiten.Entrminosgenerales,podemosdirigirelmuestreoa unaespecie determinadadepez,especiesdeunafamiliaobien,muestrear todaslasespeciesdepeces deuncuerpodeaguadeterminado.Elconocimientodelascaractersticasyelhbitat preferencialdelaespeciedepezguiarenlaseleccindelartedepesca algunasveceses necesariomuestrearentodosycadaunodeloshbitatsprincipalesdeuncuerpodeagua, porejemplo,elfondo,bajolasrocas,entrelavegetacin,entrelasracesdelosrboles,en lacorrientedeunro,etc.etc. Elequipodeelectropescaesdegranayudayfacilitalacapturademuchasespecies. Enalgunoscuerposdeaguapequeospodemosusarredesdecuchara,enotraslocalidades yparadistintasespeciesdepecesusamostrampas.Desdeluego,lasdiversasredes,como atarrayas,chinchorrosytrasmayossonrecursosquenecesitamosusarendistintasocasiones (Fig.1).Apoyarnosenlospescadoresdelalocalidadfacilitalacaptura. Ancuandoexistanpescadorescomercialesenunalocalidad,esimportantehacerla pescanosotrosmismosparaobtenerlospecesvivos,losdatosdelalocalidad,ydesde luego,certificarsuprocedenciaexacta.Esimprescindiblegeoreferenciar(coordenadasy unidadesUTM)cadalocalidaddemuestreo.Espertinenteanotarlascaractersticas principalesquedescribenlalocalidad,tipodecuerpodeagua,vegetacin,tipodesustrato, profundidad,entreotras.Paralosparasitlogossondatosimportanteslapresenciade moluscos,caracolesybivalvos,ladensidad(asseaaproximada)delaspoblacionesde pecesy lariquezadelascomunidadesictiolgicasenlalocalidadmuestreada.

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Cuntospecesdecadaespeciedeberemosrecolectar?Dependedelobjetivodel muestreo.Cuantosmspecesexaminemosdeunaespecie,mejorreconoceremossus parsitos,msoportunidadestendremosderecolectarmsespeciesdeparsitos,en particularlasespeciesmenosfrecuentesenlapoblacin.Sinembargo,elexamen parasitolgicoesunprocesotardado,ymuchasvecesdeberemosestableceruncompromiso entrelodeseableyloposible.Unareglageneral estratardeexaminar30pecesadultosde cadaespecie(porlocalidadyfechaopocademuestreo).Entrminosgenerales30esel menortamaodeunamuestragrande.Hayprocedimientosadecuadosparaestimarlos nmerosdepecesquedeberemosexaminarenconsideracinalapreguntaqueplanteemos abordar,obien,paravalorarlabondaddenuestromuestreounavezhecho.Parael propsitodeestaprcticaespertinenterecordarqueentremspecesdeunaespecie examinemos,msespeciesdesusparsitosrecuperaremos. Lospecesdebenllegarvivosallaboratorio.Esoportunorecordarquelapieldelpez esmuydelicada,quedeberemosextremarcuidadoensumanejo.Esposibletrasportar vivoslospecesenbolsasdeplsticogrueso,conaguadelmedio,aireandoconbombasde baterasobienburbujeandooxgenoconuntanqueantesdecerraradecuadamentelabolsa (Fig.2).Estasbolsaspuedentransportarseencubetasoen recipientesquepermitansu manejoycuidado.Eltipodepeces,sutamaoynmero,ascomolatemperaturadelagua sonaspectosquedeberemoscuidarmuchoparaeltransporteallaboratorio.Porejemplo, losaterinopsidos(charales,pescadoblanco)sonmuysensiblesyresistenmuymalel manejo,encambio,muchospoeclidosycclidossonmuy resistetesalmanejoyel transporte.Losprocedimientosdetrasportedepecesvivossonusadoscomnmenteporlos

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acuicultores.Pornuestrapartehemostransportadoenbolsasycubetasadecuadamente pecesvivosdesdeAcapulcoodesdeVeracruz,hastalaciudaddeMxico(4,6hs). Enellaboratoriodondeseharelexamenhelmintolgico,lospecesdeben mantenerseenlasmejorescondicionesposibles(Fig. 3).Esrecomendablequelospecesse examineninmediatamenteoen elmenortiempoposibledespusdesucaptura.Porlo generalenlaliteraturaespecializadaseanotaquelosexmeneshelmintolgicosserealizan enlassiguientes24hsalacapturadeloshospederos. Elmantenimientoconjuntodepeces dedistintasespecies,hacinamientoosobrepoblacinconexcesodeejemplares,su disposicinencondicionesinapropiadas,oelmanejoexcesivo,conducenahospederos estresados,locualpuedealterarloscontenidosparasitolgicosdelaspoblacionesbajo estudio. Examendehospederos.Antesdecualquierotroprocedimiento,esimportanteiniciarconel examenparamonogneos.Sonloshelmintosquemsfcilmentesepierden,oque podemosobviarenlarevisindelospeces. Sacrificaralpez(porpuncinenelcerebropor ejemplo).InmediatamentecolocarloenunacajadePetri con (poca) aguadelmedio(del lago,delrodedondeprocedalapesca)yprocederalexamenbajomicroscopio estereoscpico(Fig.4).Durantetodoelprocedimientocuidardemantenerlahumedad suficienteentodoelcuerpodelhospedero,mediantegoteofrecuentedeaguadelmedio. Examinarlapiel,ylasuperficiegeneraldelcuerpo,observarcuidadosamenteambascaras decadaaleta.Separar lasaletasplvicasypectoralescortndolasdesdesubase,loms prximoalcuerpodelhospedero,colocarlasencajasdePetriconpocaaguadelmediopara facilitarsuobservacin.Abrirlosoprculosyretirardelacavidadbranquiallasbranquias completas.ColocarlasenunacajadePetriconaguadelmedioysepararcadaarco

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branquialindividulizndoloparasumejorobservacin. Revisarcadaarcocuidadosamente, porambascaras,yentrelosfilamentosbranquiales,ayudndoseconagujasdediseccin finasypinzasderelojero,todobajomicroscopioestereoscpico,encajasdePetri,conagua delmedio.Conunpincelfino(00osimilar)revisarlosorificiosdelpez,lascavidades nasales,cloaca,yelinteriordelabocaylacarainternadelosoprculos.Conayudade pinzasdepuntaromaretirarunaseriecompletadeescamas,preferentementelasdelalnea lateral,colocarlasenunportaobjetosconaguadelmedio,yexaminarlasalmiscroscopio estereoscpico,porambascaras.EnlospecesdeaguadulcedeMxicoporlogenerallos monogneossonmuypequeos,transparentes,pocoevidentessepararlosconayudade pincelesyagujasdediseccinycolocarlosenportaobjetos,cajasdePetripequeaso discosdeSyracusaapropiadosSIEMPRECONAGUADELMEDIO,parasuestudioen vivoyfijacin.Losmonogneosdebenfijarseinmediatamente(verprocedimientosms abajo). Enlasescamas,lapiel,oenquistadasenlosfilamentosbranquialesesfrecuente encontrarmetacercarias(formaslarvariasdetremtodos),algunasdelascualessonmuy pequeas.Separarlasmetacercariasdelostejidosdelhospederoconpinzasdepuntafina, colocarlasentreportaycubrobjetosoencajasdePetripequeas.Porlogeneralestas metacercariasestnenquistadas,sacarlasdelquistemecnicamente,antesdeprocederala fijacin. Antesdeprocederalasiguienteetapadelexamenhelmintolgicotomarlosdatos mersticosdelhospedero,longitudtotal,longitudpatrn,altura,peso,estosdatos permitirncorrelacionarlashelmintiasisconlascaractersticasgeneralesdeloshospederos (lospecessesexarnposteriormente,duranteladiseccindelosrganosinternos,por

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examendirectodelasgnadas).LaFig.muestraunahojadecampodelasqueusamosen investigacinparaanotarlosdatosdelascolectas.

Exameninternodehospederos.Conunatijeradepuntarectaabrirlacavidadabdominaldel hospedero,desdeelanohastalainterseccinbranquial.Retirareltractodigestivo completo,desdelareginoral branquial,hastaelrecto,cortandocuidadosamentelos extremos.ColocarloenunacajadePetridetamaoapropiado(9o15cmdedimetro)con pocasolucinsalina0.7%Generalmente elaparatodigestivoquedaenvueltoenlos mesenterios,untejidodelicadodecolornegroquelocontiene.YaenlacajadePetri ybajo microscopioestereoscpico,extendereltractodigestivocuidadosamente,separndolos mesenterios,elhgadoylostejidosgrasos.Lalimpiezadelexamenesimportantepara determinarconprecisinelhbitatdecadaespeciedehelmintoqueencontremos.Es recomendablesepararcadarganoytejidoencajasdePetriconsolucinsalina0.7% duranteelexamen. Duranteestafasecuidarqueelrestodelcuerpodelhospederonose seque, gotendocontinuamentesolucinsalina0.7%alinteriordelacavidadcorporal. Examinarelinteriordelaparatodigestivodesgarrndolopocoapococonagujasde diseccinbajomicroscopioestereoscpico. Hacialaluzintestinalpodrn encontrarse helmintosadultos,tremtodos,cstodos,acantocfalosynemtodos.Conayudadepinceles finoscolocarlosencajasdePetrichicas,consolucinsalina0.7%parasuobservaciny fijacinposterior.Losacantocfalossefijanalamucosaintestinalintroduciendola proboscisenlostejidos,parasepararlosdesgarrarcuidadosamentelostejidosintestinales alrededordelaproboscis.Enlasparedesintestinalestambinpuedenencontrarse metacercariasolarvasdenematodosenquistadas. Aislarlosdelostejidosdelhospedero,

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colocarlosencajasdePetriconsolucinsalinaysacarlosdelosquistesparaobservarlosen vivoyfijarlosadecuadamente. Losmesenterios,lostejidosgrasosyelhgado,primeramenteexaminarlosconel microscopioestereoscpico,luegocomprimirlosentre2portaobjetosovidriosdetamao adecuado(Fig.)(hacersquash)yobservarlosalmicroscopioestereoscpico.Pueden encontrarsetambinmetacercariasylarvasdenemtodoslibresyenquistadas. Tambinse encuentransobreelhgado,losmesenteriososobrelaparteexternadelapareddel intestino,larvasdeacantocfalosenquistadas(cistacantos)ymetacstodos(larvasde cstodos).Esprecisoretirarlasdelostejidosdelhospedero,sacarlasdelquisteycolocarlas encajasdePetriparasufijacin posterior. Examinarlacavidadcelmicaocavidadgeneraldelcuerpodelhospederobajoel microscopioesteroscpico.Retirarloquequedadelosmesenterios,lasgnadas(noolvidar sexarcadahospederoporexamendirectodelasgnadasenestepaso),lavejiganatatoriay losriones.Examinartodosestos tejidosy rganosprimerosuperficialmenteydespuspor compresinentre2vidriosoentreportaobjetos,comoenelpasoanterior. Retirarambosojosdelpezyexaminarlos.Puedenencontrarsehelmintos (generalmentemetacercarias)sobreelojo,sobreellenteoenelhumoracuosodelglbulo ocularesimportanteprecisarelhbitatdondeseencuentrenlosparsitos.Retirarel cerebro(Fig.)yexaminarloporcompresinentre2portaobjetos. Conunbistur,cuchilloonavajaapropiadaobtenerfiletesdelamusculaturaparietal delpez(Fig.)paraexaminarlostambinporcompresinentrevidrios.Puedenencontrarse tambinmetacercariasolarvasdenemtodos.

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Fijacindehelmintos. Tremtodosymetacercarias:fijarlosdirectamenteconformol4%caliente(casi a ebullicin)(Fig.).Lasmetacercariasdeberndesenquistarseantesdeagregarelfijador. Puedenconservarseenfrascosvialesen elmismoformolhastapor3meses dadoqueel formolendurecelostejidosesrecomendablecambiarlosaalcoholetlico70% para preservarlospormstiempo.Losvialesdebenseretiquetadosclaramenteconlosdatos completosdelacolecta(sedescribemsabajo). Cuandohayejemplaressuficientes,esrecomendablefijaralgunosespecmenesde cadaespeciedetremtodo(ometacercarias)poraplanamientoligero(Fig.):haceruna preparacinfrescaconcadaespcimen,colocndoloenunportaobjetosconunagotade solucinsalina0.7%,cubrirelejemplarconun cubreobjetos.Estosejemplarespueden fijarseconlquidodeBouin,AFAoformolal4%.Elfijadorseleccionadoseintroducepor capilaridad(porunladodelcubreobjetos)entantoqueporelladocontrarioseabsorbela solucinsalinacontrozospequeosdetoalladepapelabsorvente(Fig.). Losespecmenes debenpermanecerenelmontajeentre12a24hs,paralocuallaspreparacionessecolocan encajasdePetrigrandes,alfondodelacualseleagreganalgunasgotasdelfijadoryse tapa, evitando quelaspreparacionessesequen.Transcurridaslas12o24hs,los especmenessedesmontanusandopincelesfinos,paraconservarlosenfrascosviales etiquetadosconlosdatoscompletosdelacolecta. Lafijacinporaplanamientoligeropermiteobtenerpreparacionesmicroscpicas quefacilitanelestudiomorfolgicodelosejemplares.Sinembargo,actualmentemuchas revistasespecializadasnoadmitenparasupublicacindescripcionesdeespeciesconbase

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enespecmenesaplanados,argumentandoquelaproporcinnormaldelosrganossealtera yquedeestaformalasmedicionesnosonprecisas. Cstodosadultos:lostegumentosdemuchasespeciesdecstodosinician el procesode descomposicininmediatamentecuandosonretiradosdelosrganosdelhospederopor stoesimportanteprocederasufijacininmediatamentecuandoselesencuentra(an antesdeconcluirlarevisincompletadelhospedero).Colocarlosejemplaresensolucin salina0.7%enunvasodeprecipitadosde100ml,lavarlosrpidamenteenlasolucin salinaydecantarlatotalidaddesolucinfijaralcstodovertiendodirectamentesobreel ejemplar100mldeformol4%caliente(apuntodeebullicin).Elvolumendeformoles importanteparaayudaraextenderelestrbilodecadaespcimen. Metacstodos.Sonlosdistintostiposdelarvasdecestodosqueencontramosenlostejidos yganosdelospeces,muchosdeellosmaduranenaves.Porlogeneralunavez desenquistadossefijancomolostremtodos,directamenteconformolal4%caliente.Los metacstodosGryporhynchidaepuedenfijarsetambinconpicratoamonio(verfijacinde monogneos)parafacilitarelestudiodelrostelo. Monogneos.Secuentanentreloshelmintosmsfrgilesypequeos,vivos deben permanecersiempreenaguadelmedio.Esimportantefijarsuficientesejemplaresusando variosmtodosparalograrunestudiomorfolgicocompleto. Esmuyprcticofijarlos directamenteenfijadordealcoholisobutlico:colocardirectamenteelmonogneoenuna gotadelfijadorenelcentrodelportaobjtos,cubrirelespecmenconuncubreobjetos. Estaspreparacionessonpermanentes. Puestoquelataxonomadelgruposebasaenelestudiodelaspartesduras (esclerosadas),esposibleusarpicratoamoniocomofijador.Esteesunfijadorquedeshace

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laspartesblandas,peroconservalaspartesdurasdecadaespcimen.Cuandoseaplicaeste mtododefijacinnosepretendeconservartodoelejemplar,slolasescleritas,yse intentaquequedenextendidas,enunsoloplano,parafacilitarsuestudioymedicin posterior.Elprocedimientoconsisteen hacerunapreparacinfrescaconcadaespcimena fijaryejercerpresinenrgicamentesobreelportaobjetos(Fig.),conelpropsitode extenderlasescleritas.Sellarelportaobjetosaplicandobarniztransparentedeuas(Fig.). Losmonogneospuedensertransportadosencajasdepreparacionesparamicroscopio,y estudiadosenestaspreparaciones,peroalos5o6mesesesnecesariopasarlosa preparacionespermanentesmontadasenblsamodeCanad. Fijarotrosmonogneosdelamismaespeciedirectamenteconformolal4% caliente,obienporaplanamientoligero(comolostremtodos),locualposibilitartener especmenescompletosparaestudiarlamorfologaylostejidosblandosdelgusano. Acantocfalos. Todoespecmendeacantocfalodebetenerlaprobosciscompletamente evertidaantesdefijarlo.Estosparsitosinvaginanlaproboscisalsermanipuladosdurante ladiseccindelhospedero.Esnecesariocolocarlosenaguadestiladaenrefrigeracinpor8, 12ohasta24hsparalograrlaeversindelaproboscis.Luegopuedenfijarse sumergindolosdirectamenteenalcoholetlico70%caliente,formolal4%calienteoAFA. Tambinesrecomendablefijaralgunosespecmenesporaplanamientoligero(ver tremtodos). Nemtodos. Sefijanagregndolesdirectamenteformolal4%caliente.Algunos nemtodosdepecessonbastantefrgilesyalmanipularlosensolucinsalinaduranteel examendelhospedero,comienzanaromperseylosrganosinternossesalendelacavidad corporaldelparsito por estoesrecomendablefijarlosinmediatamenteconformolsalino

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al4%caliente.Comotodoslosotroshelmintos,unavezfijadossecolocanenvialescon alcoholdel70%oconelmismofijador,etiquetadosconlosdatoscompletosdelacolecta.

Conservacindehelmintos.Parasuestudiomorfolgicoydeterminacintaxonmica,los platelmintosylosacantocfalosseprocesanparahacerpreparacionespermanentesparael microscopiodeorganismostotales.Latincinyprocesamientodehelmintosdamejores resultadossisehaceinmediatamentedespusdelarecoleccinyfijacin.Losespcimenes puedenconservarseindefinidamenteenvialesconalcoholetlicoal70%.Losespcimenes decadaespeciedehelmintoporcadahospederoyrganoseseparancolocndolosenviales llenosconalcoholetlicoal70%.Cadavialseidentificaconunapequeaetiqueta(Fig.) quesecolocadentrojuntoconlosparsitos.Losdatosseescribenconlpizotintachina usandocartulinaresistente,incluyendoelnmeroytipodehelmintos,elhospedero (nombrecientficoynmerodelhospederosiselehaasignadouno),elrganoenque habitabanlosparsitos,lalocalidaddecolectadeloshospederos,lafechayelcolector. Cadadatoessumamenteimportante,ydebeescribirsecorrectamenteconlamxima legibilidad.

Cuestionario 1. Qucaractersticasmorfolgicaspermitenreconocerenvivoalostremtodos, monogneos,cestodos,acantocfalosynemtodos? 2. Queslafijacin?Qucaractersticassondeseablesenun buenagentefijador?

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3. Comparalosmtodosdefijacindestaprcticaconlosqueseaplicanparala fijacindeotrosorganismos,vegetalesyanimalesyparaotrosprocedimientos(por ejemploparaestudioshistolgicos,oparaaspectosdebiologamolecular).

Bibliografa

LamotheArgumedo,R.1997. Manualdetcnicasparaprepararyestudiarlosparsitosde animalessilvestres.AGTEditor,MxicoD.F.43pp.

SalgadoMaldonado,G.1979.ProcedimientosyTcnicasgeneralesempleadosenlos estudioshelmintolgicos.DepartamentodePesca.Mxico,D.F.55 pp.

SalgadoMaldonado,G.2006. Checklistofhelminthparasitesoffreshwaterfishesfrom Mexico.Zootaxa:1324:1357. http://www.mapress.com/zootaxa/2006f/zt01324p357.pdf http://www.mapress.com/zootaxa/

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Fig.1 Recoleccindepeces, equipodeelectropesca

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Fig.Recoleccindepecesconchinchorro

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Fig.3Trasladodepecesvivosal laboratorioenbolsasdeplsticoaireadas

Fig.4.Loshospederosenel laboratoriodebenmantenerse encondicionesadecuadashasta suexamenhelmintolgico.

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Fig.Mantenervivoslospecesenel laboratorioesesencialparaun buentrabajoparasitolgico; permitemayoreficienciaenla bsquedayrecoleccinde helmintos,yposibilitamayor tiempoparaexaminarlos.Almorir lospeceslosectoparsitoscomo losmonogneosvirtualmentese dehacenyperdemosesta informacin.

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Fig.Examendehospederos:iniciarsiempreconlasaletas,branquias,etc.yaquelos monogneossonmuyfrgilesypuedenperdersefcilmente.Todoelexamendebe llevarseacabobajomicroscopioestereoscpico,encajasdePetridetamaos apropiadosyusandopocoaguadelmedioparalasuperficieexternaosolucinsalina 0.7%paralasvscerasyrganosinternos.Notarlaspinzasdepuntafina(derelojero), lospincelesfinosylasagujasdediseccin.

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Fig.Elusodevidriosdetamaosapropiados permiteaplanartejidosyrganos(musculatura, riones,hgado,mesenterios,grasa,cerebro)de loshospederosparasuobservacinpor transparencia;losparsitospuedenrecuperarse posteriormenteparasufijacinadecuada.

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Fig.Esimportantetenerunmtodoadecuadoparalacapturadelosdatosdecampo.En nuestrolaboratorio,elusodehojasdecampoparacadahospederoqueexaminamosha permitidohacereficienteestacapturadedatos,puestoquefacilitaelmanejodelosdatos detodosloshospederosexaminadosenunacolecta,tantoenconjuntoyalavezcon idependencia.Lashojasdecampocontienenenunciados(nombresdeloscampos,ode losrganosytejidos)queguanlaactividadadesarrollar.Sirvenademscomo recordatoriodeloque debemoshacerycomolistaparaverificarqueyahemoshecho todolocorrespondientealexamendecadahospedero.

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Tincinymontajedehelmintos Introduccin Objetivos Materialesymtodos Fijacin Deshidratacin Aclaramiento Montaje Procedimientos:tcnicasdetincin Hematoxilina ParacarmndeMayer BoraxCarmndeGrenacher CarmncidodeMayer TricrmicadeGomori Apndice1 Hematoxilina cidocarmnico Anilinas Mordentes ApndiceII.Formulario Bibliografa

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Tincinymontajedehelmintos Introduccin Enestaprcticaseprocesarnejemplaresdeplatelmintosyacantocfalospara elaborarpreparacionestotalesparamicroscopio,permanentesymontadasenblsamode Canad.Elestudiomorfolgicoyladeterminacintaxonmicadelosejemplaresse desarrollaconestaspreparacionesquesedepositanenColeccionesBiolgicasestablecidas yreconocidas,yconstituyenlareferencianecesariadeltrabajocientficodesarrollado.Los nemtodosnosetien,losprocedimientosparasuestudioydeterminacintaxonmicano implicanlatincinysedescribenporseparado. Paraestudiarlosobjetosenelmicroscopioesnecesarioqueseandelgadosy transparentesyaquelamayoradelasveceslosexaminamosusandoluztrasmitida,es decir,elestudiodelaspreparacionessehaceportransparencia. Laspartesqueconstituyenlasclulasyelmaterialintercelularporlogeneralson incolorasytransparentes,porloquenosedistinguenunasdeotras.Esdifcilprecisarlos contornosderganosyestructurasamenosquepresentendiferenciasapreciablesensus ndicesderefraccin.Parasolucionarestadificultadteimoslosejemplaresaplicamos colorantesparacontrastarentrelasdiferentespartesdeunespcimen.Loscolorantes usadoscomoreactivosseempleanparadeterminarlapresenciadealgunassustancias qumicasoparaevidenciarladistribucindealgunasestructuras,porejemplofibras elsticasenhelmintologaaplicamoscolorantesparaelucidarlaanatomadeorganismos pequeos. Contrastarmeramenteunespcimenensconloquelerodeaseradepocautilidad, yaqueloquepretendemosesestudiarlasestructurasinternas.Lasdiferentesestructurasy

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rganosporlogeneral absorbendiferentescantidadesdelmismocolorante.Astambin, diferentescolorantespuedenfijarsedemaneradistintaalmismorgano.Laafinidaddeun rganootejidopordiversoscolorantespuedetenerrazonesqumicasofsicas:suafinidad qumica,densidadypermeabilidad.Usamosloscolorantesparaobtenercontrastes marcadosentrelosrganosyestructurasdeunejemplarypoderestudiarlosalmicroscopio. Enmicroscoparealmenteseusanpocostintes.Conpocasexcepciones,los colorantespuedenclasificarsecomocidosobsicos(Baker,1958).Unaclasificacin precisaatenderasucomposicinqumica,loquequedafueradelosobjetivosdeestanota. Ejemplosdecolorantesbsicossonelvioletademetilo,violetadegenciana,cristalvioleta, azuldeanilina,azuldeNiloA,azuldetoluidina,ascomoelrojoneutroyelazulde metilenoentreloscolorantescidostenemoselazuldemetilo,elverdebrillante,la alizarina,laEosinaY,elcidocarmnico,ylahematoxilina. Procesamosloshelmintostindolosconhematoxilinasoalgnpreparadodecido carmnico.ElDr.RafaelLamotheArgumedorecomiendaelusodelaTricrmicade Gomori.EstastcnicasfueronoriginalmentederivadasdelatcnicahistolgicaporelDr. EduardoCaballeroyCaballero,quienfueunodelosfundadoresdelInstitutodeBiologa delaUNAM(noviembrede1929),ellaboratoriodeHelmintologadeesteInstitutoseha desarrolladodesdeeseentonces.AlumnadistinguidaycolaboradoradelDr.Eduardo CaballerofuelaMaestraMargaritaBravoHollis,quientrabajtambinenelInstitutode BiologaeimpartilamateriaTcnicasSelectasdeLaboratorioenlacarreradeBiologa delaFacultaddeCiencias,UNAM.Mstarde,desdelos70selDr.RafaelLamothe ArgumedosehahechocargodelLaboratorio,yaldebemoslaenseanzadelastcnicas quedescribimosenesteapartado,yaplicamosenellaboratorio.

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Objetivos Queelalumnoserelacioneconlosmtodosgeneralesdeprocesamientodemacroparsitos parasuestudiomorfolgico,determinacintaxonmicayelaboracindematerialesde referencia(vouchers)pormediodelaaplicacindetcnicasdetincinparaelaboracin depreparacionestotalespermanentesdehelmintosparsitos.

Materialesymtodos Lametafinaldeestaprcticaeslograrpreparacionesdeejemplarestotales(no seccionados)teidasymontadasdemanerapermanenteenblsamodeCanad.Losmedios resinososcomoelblsamodeCanaddandurabilidadamontajesdetejidosyorganismos teidos,ademselblsamoproporcionamayortransparenciayaqueincrementaelndice derefraccincuandoelespcimenestcompletamenteimpregnadoporestaresina.El blsamonosemezclaconelaguaporestodeberemosdeshidratarcompletamenteel espcimen,posteriormentereemplazarelagentedeshidratanteconalgnmaterialconel cuallaresinasemezcle,esteeselaclarante.Entonceslospasosdelprocesamientoincluyen despusdelafijacin,elteido,deshidratacin,aclaracinymontaje(Gray,1954).

Fijacin.Algunosfijadorescontraenelcitoplasmafuertemente,deformaque
dificultanlapenetracindelcoloranteylaapreciacindelacantidaddecolorantequeel tejidohatomado.Elformolfavorecelaaccindeloscolorantesbsicosmsqueningn otrofijador.Elalcoholetlicoyelcidoacticousadoscomofijadoresfacilitanlatincin delasprotenasyelcitoplasmaconcolorantescidosobsicos,entantoqueelcido pcricocoagulalasprotenasyfavoreceloscolorantescidos(Baker,1958).

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Cualquieraqueseaelmtododefijacinempleado(formol4%,Bouin,AFA),antes deiniciarelprocesamientoesnecesariohaberlavadoyalosejemplareseliminandotodoel fijador(varioscambiosdealcoholetlico70%),debenconservarseenalcoholetlico70%.

Deshidratacin.Paradeshidratarusamospreferentementeetanolparaestose
empleanlosalcoholesgradualesde30%,50%,70%y96%hastaalcoholetlicoabsoluto. Losalcoholesgradualessepreparanapartirdealcoholetlicodel96%queesmsbarato queelabsoluto.Elalcoholabsolutoeshigroscpicoesdecir,absorberpidamenteaguadel airesehidratamuyfcilmente,porloqueesnecesariomantenerlotapadosiempre.La acetonayelmetanoltambinpuedenusarseparadeshidratar,perosonmsvoltilesqueel alcoholetlico.Nohayformaprcticadesabersiunespcimenestbiendeshidratado,slo hastaintentaraclararlo(sinoestdeshidratadoseoscurecer).Ladeshidratacin insuficienteeslacausamsfrecuentedemalaspreparaciones.Losejemplarestienenque sermanipuladosconmuchocuidadoypermanecereltiempoadecuado(algunasvecesms de12hs)enlosalcoholesde96%yabsoluto.Sinembargo,untiempoexcesivoenalcohol absolutotornaquebradizosalosejemplares.Ladeshidratacinesunodelospasoscruciales delprocesamiento,debehacersemuycuidadosamente,conmaterialesmuylimpios,y alcoholespreparadosconexactitud,Pantin(1964)recomiendaqueelprocesosehagamuy lentamente(de1a12horasparacadacambiodealcohol)paraasegurarunadeshidratacin completa.Losalcoholesusadosnodebenregresarsealosfrascosdealcoholnuevos.

Aclaramiento.Elaclaranteesunasustanciamiscibleconelalcoholabsolutoycon
elblsamo.Seempleanaceitesesencialesqueimpartentransparenciaalosejemplaresdela mismamaneraqueloharelblsamocuandosehayaimpregnadototalmenteenel espcimen.Elterpineolesunaceitesintticoquetienelaventajadesermiscibleconel

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alcoholde96%,yporlotantoayudaralacompletadehidratacindelosejemplares. Tambinseusaelaceiteesencialdeclavos,sinembargoesteaceitetornaquebradizosalos ejemplares.OtroaclarantequeusamoseselsalicilatodeMetilo(Metilsalicilato).La creosotadehaya,seushacetiempocomoaclarante,actualmentehadejadodeusarse porqueestconsideradacomocarcingeno.Lacreosotaesunamezcladequmicosensu mayorahidrocarburosaromticospolicclicosderivadosdelbenceno,queseoriginandela quemadelamaderadehaya(Fagus),irritalapielylasmucosas.Tambinelxilolseusa comoaclaranteparahelmintos,sinembargolosresultadossonmenossatisfactoriosque cuandoseaplicaparacorteshistolgicosenparafinaporejemplo.Trataralosejemplares conxilolpormsde15minutosloshacequebradizos.Engenerallosaclarantestiendena absorberaguadelambiente,esnecesariomantenerlostapadosycambiarlos peridicamentedesecharlosusadosdurantealgntiempoyqueyasehanhidratado.

Montaje. ElmediodemontajeporexcelenciaeselblsamodeCanad,unaresina
naturalqueseobtieneapartirdeAbiesbalsamica yquesediluyecomnmenteensolventes comoelxilol,toluenoobenceno.Lostressolventessontxicos.Caractersticasdestacables delblsamodeCanadsonsutransparencia,unndicederefraccinmuyprximoaldel vidriodelosportaobjetosycubreobjetos(1.5)ysudurabilidad(hayregistrosde preparacionesconmsde100aos,yenlaColeccinNacionaldeHelmintosdelInstituto deBiologa,UNAMseconservanpreparacionesdemsde70).Existenresinassintticas tilescomomediosdemontajeparamicroscopa,perosudurabilidadescuestionable tratndosedeejemplaresdereferenciaquesedepositarnenunacoleccin,necesitamos tratardeasegurarenlamedidadeloposiblelamslargapermanencia.Pantin(1964) contradiceelrazonamientoanteriorcuandoargumentaquelacausaprincipaldela

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decoloracindelosespecimenesenpreparacionesconeltiempo,eselusodexilolyde blsamodeCanad.Esteautorrecomienda(pg.48)paraprevenirladecoloracinde ejemplares,evitarelusodexilolyblsamodeCanadconsideraquelacausadeesta regresinenelmaterialprocesadoeslaimpurezadelxilolyelblsamoylaincompleta remocindemordentes.

Procedimientos:Tcnicasdetincin Parallevaracabolastincionesobservalasfotografasquesepresentanenesta prcticaysiguelasindicacionesquesedescribenenlastcnicas.Losespecimenesno debendejarsealaire,nuncadebenpermanecerenseco.Nodejarlosfrascosconsoluciones oespcimenesabiertosmsdeltiempoabsolutamentenecesario.Lahumedadambiental puedecausarquelosespcimenesseopaquenylaspreparacionesquedenmalalmontarlas enblsamo.CambialosfludossiempreusandopipetasPasteurlimpias.Losmejores resultadosencuantoalatincindeespecimenesseobtienensobretindolosyluego diferencindolos(decolorndolospocoapoco),hastaalcanzarelcolordeseado.La preparacin dereactivosycolorantessedetallaenelApndiceII. Engeneral,decimosquelastincionessonacuosasoalcohlicasconsiderandosiel colorantehasidodiluhdoenaguaoenalcohol.Lahematoxilinacomoladescribimos abajoesunatincinacuosa,y elparacarmndeMayeresunejemplodetincinalcohlica.

HematoxilinadeDelafieldodeEhrlich 1.Losespecimenesestarnenalcoholetlico70%lavadosyadelfijador

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2.Hidratarenalcoholesgraduales50%,30%(15minutosencadauno)hastaagua destilada. 3.TeirenhematoxilinadeDelafieldodeEhrlich(eltiempodetincindependedelas dimensionesdelparsito,sobretododesugrosor,ydelamadurezdelcolorante,los colorantesquellevanmstiempodehabersidopreparadossedicequeestnmadurosy tienmsrpidamente.Puedeprobarseconuntiempoinicialde30segundosa1minutoy dareltiemponecesariodeacuerdoconlacoloracinqueelparsitovayatomando. Algunasveceseltiempodetincinexcededelos30minutos)(Latincin puedehacerse muylentamentesidiluimoselcolorante,1gotao2dehematoxilinaen30mldeagua detilada,teirelejemplardurante24hsenestasolucin) 4.Lavarconaguadestiladaparaeliminarelexcesodecolorante 5.Diferenciarconaguaaciduladaal2%concidoclorhdrico,hastaqueelparsitotome uncolorrosaplido 6.Lavarenaguadestiladadurante1o2minutosparaevitarquesigaactuandoelagua acidulada 7.Virarelejemplaracolorazulplidoovioletaenaguadelallaveduranteunos3a5 minutos(paraacelerarelviradopuedeagregarsesolucinsobresaturadadecarbonatode litioalaguadestilada) 8.Deshidratarlentamentedesdeaguadestilada,enalcoholesgradualesde30%,50%,70%, 96%almenos15minutosencadacambio.Recordarqueentremslentaseala deshidratacintendremosmsprobabilidadesdeobtenermejoresresultados. 9.Completarladeshidratacinenalcoholetlicoabsoluto(100%)2cambiosde20a30 minutoscadacambio.Mantenerelalcoholabsolutotapado.

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10.Aclararenterpineol,aceitedeclavososalicilatodeMetilo 11.MontarconblsamodeCanad.

HematoxilinadeVanCleave DenominamoshematoxilinadeVanCleaveaunamezcladehematoxilinadeDelafield conhematoxilinadeEhrlichyalumbredepotasio(verformulario),estamezclaes recomendadaporVanCleave(1953)paralatincindeacantocfaloselprocedimientode tincinenestecasoeselmismoquesedescribianteriormente.

ParacarmndeMayer 1.Losespecimenesdebernestarenalcoholetlico70%lavadosyadelfijador 2.Alcoholetlico96%,2cambios,10minutoscadauno 3.TeirenparacarmndeMayer,porlogeneraleltiempovarade2a3hasta10a15 minutos 4.Lavarenalcoholetlico96%paraquitarelexcesodecolorante 5.Diferenciarenalcoholde96%aciduladoal2%concidoclorhdrico,hastaquelos bordesdelcuerpoquedenmsplidosqueelrestoylosrganosinternosseanvisiblespor transparencia. 6.Lavarenalcoholde96%paraevitarqueelcidoclorhdricosigadecolorandoel ejemplar. 7.Deshidratar,2cambiosdealcoholde96%15minutoscadauno. 8.Alcoholetlicoabsoluto(100%),2cambiosde20minutoscadauno

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BoraxCarmndeGrenacher (TincinrecomendadaporBullock,1969paraacantocfalos) 1.Losespecimenesdebernestarenalcoholetlico70%lavadosyadelfijador 2.ColocarlosespecimenesenboraxcarmindeGrenacherdurante7.5a8.5horas 3.pasadoestetiempoagregar1gotadecidoclorhdricoporcada5mldecolorantey mezclarbigorosamente

CarmncidodeMayer (Amin,1998recomiendaestatincinenespecialparaacantocfalos)(paraestatincinvan Cleave,1953recomiendaprimerotratarlosejemplaresconsolucindefosfatotrisdico) 1.Losespecimenesdebernestarenalcoholetlico70%lavadosyadelfijador 2.Pincharlosacantocfalosconalfileresentomolgicosparafacilitarlapenetracindelos fluidosalacavidaddelcuerpoylosrganosinternos.Losespecimenesdemayortamao debenpincharsemsveces.Cuidardenopincharlosrganosreproductores. 3.TeirenCarmncidodeMayerdurantetodaunanoche 4.Diferenciarenalcoholde70%aciduladoal4%concidoclorhdrico,hastalograrcolor rosaplido.Ladiferenciacinpuedellevarvariashoras,incluso2o3das(Amin, comunicacinpersonal) 5.Lavarenalcohol75%variasveces(almenos3)hastaqueelespcimennodesprenda mscolorante. 6.Deshidratarenalcoholesde85%y95%de12a24hs,2cambiosenelalcoholde95%. 7.Completarladeshidratacinenalcohol etlicoabsoluto(100%)apor12a24hs

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8.Aclararenmezclasgradualesdeterpineolyalcoholabsoluto(25%terpineol,75% alcoholabsoluto50%terpineoly50%alcoholabsoluto75%terpineoly25%alcohol absolutoterpineol100%)12a24hsencadamezcla. 9.ColocarlosejemplaresenunamezclamitaddeterpineolymitablsamodeCanad 10.MontarenblsamodeCanad

TricrmicadeGomori 1.Losespecimenesdebernestarenalcoholetlico70%lavadosyadelfijador(se recomiendausarlquidodeBouincomofijador,yaqueactacomomordentedebelavarse muybien,conalcohol70%hastaeliminartodorestodefijador) 2.Hidratarhastaaguadestilada,alcohol50%,25%15minutosencadauno 3.TeirenHematoxilinadeWeigertdurante10minutos 4.Lavarenaguacorrientepor10minutos 5.TeirentricrmicadeGomoripor10a15minutos 6.Diferenciarenaguaaciduladaal0.5%concidoactico(cidoacticoglacial0.5mlen 99.5mldeaguadestilada) 7.Deshidratarlentamente,aclararymontar.

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ApndiceI Hematoxilina Anhoyendacuandoelavancetecnolgicopermitelasntesisdemuchas molculas,unodeloscolorantesmsusadosenbiologaeslahematoxilina(hematena) (Titford,2005).Suimportanciasederivadelavariedaddeobjetosquepuedeteir,la facilidadconquepuedemanejarse,suinsolubilidadenmediosneutrosalcohlicoso acuososdespusdelatincin,ylaposibilidaddeobtenerunacoloracinoscurapermanente enelblsamodeCanad.Lahematoxilinaesuncompuestoderivadodelamaderaoscura deunaleguminosanativadeCentroAmrica,Haematoxyloncampechianum.LosMayasla usabanparateiralgodn,yaprovechabantambinsuspropiedadesmedicinaleslos EspaoleslatransportaronaEuropa,dondelostextilesseteanconcolorantesderivados deplantasylqueneshastaeladvenimientodelasanilinas(1830s).Porestaraznlaplanta fueintroducidadesdeYucatnalasislasdelCaribe,Brasil,IndiayMadagascar.Desdeel puntodevistaqumicolahematoxilinaesunflavonoide,unafamiliadesustancias ampliamentedistribuidaentrelasplantas.Cuandoseexponealairelahematoxilinase oxidaahematenadecolorpardorojizo,quenodebeconfundirseconelpigmento sanguneohematina.Lacoloracinqueimpartelahematoxilinaporssolanoesmuy durable,peroelusodesalesdemetalespesadoscomomordentespermitemayor permanencia:lassalesdehierrodancoloracionesgrisesaoscuras,lasdecromodantonos azules,ylasdealuminioproporcionancoloresviolceos.Lahematoxilinaseusaen microscopadesdeiniciosdelsigloXIX.

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cidocarmnico Elcidocarmnicoesuncolorantemuyempleadoenmicroscopa,entreotras razonesporquepuedeemplearsedirectamentecomouncolorantebsico,oconun mordentecomocolorantecido,puedeusarsetambindirectamentecomocolorantecidoy yaenlostejidoscambiarseabsicoespermanenteenblsamodeCanadytiemuybien laspreparacionestotalesdehelmintos. Elcidocarmnicoeselnicocolorantedeorigenanimalqueseempleaen microscopa,seobtienedecccidos,cochinillasDactylopiuscacti(Coccuscati)cuyas hembrascarecendealasysealimentandeunnopalnativodeCentroAmrica,Nopalea

coccinellifera .Elcidocarmnicoseextraedeloscuerposdesecadosdelashembras,en
ellasconstituyecasiun10%desupesoseco.Puedenobservarsecorpsculosrojosdel pigmentoenloslbulosdeloscuerposgrasosdelashembrasapesardequeelmacho tambintieneestoscuerposgrasosnoproduceenellostantoscorpsculosdelcolorante.El carmnesunaformacrudadelcidocarmnico,seextraetambindelascochinillas,pero contienetansloun56%decidocarmnicomezcladoconotrassustanciasorgnicas.El carmntienelaventajadeserconsiderablementemsbaratoqueelcidocarmnico,pero lasimpurezaslotornancasiinsolubleenaguadestilada.Puedeemplearsetambinenlas tincionesparamicroscopa.HaciafinesdelSigloXIX,P.Mayerprodujodiferentesmezclas colorantesusandocidocamnicoypopularizsuusoenmicroscopa.

Anilinas

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LaTricrmicadeGomoriesunatcnicadetincinquesebasaenelusodelCromotropo 2R,uncolorantesintticocido.Genricamentealoscolorantessintticosselesdenomina anilinas.

Mordentes Loscolorantesdisueltosenaguaoenunamezcladeaguayalcoholseadhieren directamenteaciertosconstituyentesdelostejidos.Algunoscolorantesparticularessin embargotienenmtodosalternativosdeadhesinqueinvolucranlapresenciadeotra sustanciaentreelcoloranteensyelsolvente,ycuandoestasustanciasepresentael comportamientodelcoloranteesuntantodistinto.Estassustanciasintermediariasentre colorantesytejidosseconocencomomordentes.Porlogenerallassalesdeciertosmetales seusancomomordentes:lossulfatosdehierro,aluminioycromo(comolosalumbresde potasio,deamonio,dehierroyeldecromo).Unmordentereaccionaqumicamenteconel coloranteformandounalaca.Algunaslacaspenetranmsalostejidosquelospropios colorantesquelasoriginan.Estoscomplejostejido/mordente/colorante,soninsolublesen todoslosfluidosneutrosqueseusangeneralmenteenmicroscopa,deformaquela coloracinsubsecuenteconotroscolorantessefacilitayladeshidratacinpudellevarsea cabogradualmente.Ejemplosdecolorantesqueseusanconmordentessonlahematoxilina deEhrlichyelcarmalumdeMayer.

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ApndiceII Formulario HematoxilinadeDelafield Puedenprepararsedistintostiposdehematoxilina,dependiendodelmordente,delmtodo deoxigenacin,elpH,etc.LahematoxilinadeDelafieldsepreparaconalumbre,similara ladeHarris,requieredemaduraralmenosunpardesemanas(sinembargolaoxigenacin delpigmentopuedeacelerarseparasuusoinmediato,verNeild,1934). Hematoxilina(cristales) Alcohol95% Solucinsaturadadealumbredeamonio 4g 25ml 400ml

HematoxilinadeVanCleave(VanCleave,1953) HematoxilinadeDelafield HematoxilinadeEhrlich Aguadestilada Alumbredepotasio 1ml 1ml 100ml 6g

Disolvercompletamenteelalumbredepotasioenelaguadestilada,agregarlas hematoxilinas.

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TricrmicadeGomori Estatcnicadetincincombinaunahematoxilinaconunamezcladecolorantes incluyendocromotropo2Ryverdebrillanteoverderpidoyazuldeanilina.Seutilizapor logeneralparaidentificarpormicroscopapticaeltejidoconectivoenmuestrasdetejidos. Permiteladiferenciacinentrefibrasdecolgenaydemsculoliso posibilitala identificacindefibrasdecolgenaentejidohepticoyrenal,seutilizaparademostrarel incrementoenladeposicindelcolgenoasociadosconlasustitucindetejidofuncional portejidocicatricial.Haymuchasvariantesdeestatcnica(Ellis,2008). Principiosdeaccin:uncolorantegeneral(plasmastain,Cromotropo2R)se combinaconuntintequecolorealasfibrasdetejidoconjuntivo(verderpido[FastGreen FCF],verdebrillante[lightgreen],oazuldeanilina),enunasolucindecido fosfotngsticoalacualselehaagregadounasolucindecidoactico.Elcido fosfotngsticofavorecelacoloracinrojadelmsculoyelcitoplasma.Eliontungstatolo tomaespecficamentelacolgena,yelcolorantedelasfibrasdetejidoconjuntivose adhiereaestecomplejocoloreandolacolgenaenverdeoenazuldependiendodel colorantedecontrastequesehayaempleado.Puedeusarsecualquierfijador,sinembargo serecomiendaampliamentefijarlosespecimenesenlquidodeBouin sisevaateirconla tricrmicadeGomori,yaqueelBouinactacomomordentealbajarelpH,intensificando lasreaccionesquedanloscolores. Interpretacindelatincin: Citoplasma,fibrasmusculares,queratina rojo Fibrina rosa

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Colgenaverde Ncleos azulonegro

ParalatricrmicadeGomoriseempleanlossiguientescolorantes: HematoxilinafrricadeWeigert SolucinA Hematoxilina 10g Alcohol95% 1000ml SolucinB Aguadestilada 475ml cidoclorhdricoconcentrado5ml Clorurofrrico,solucin29% 20ml

Solucinparateir: MezclarpartesigualesdelassolucionesAyB

TricrmicadeGomori Cromotropo2R 0.6g FastgreenFCF,Lightgreeoanilinablue0.3g cidofosfotngstico 0.8g cidoacticoglacial 1ml Aguadestilada100ml

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Disolvercadareactivoporseparadoenalcuotasde25mldeaguadestilada,luegomezclar lascuatrosoluciones.Dejarreposarduranteunanoche,yfiltrar.Lamezclaesdecolor prpura.Puedeconservarseatemperaturaambiente,perodebeprotegersedelaluz.Esta solucinsedeterioraconeltiempo,porlotantoserecomiendaprepararpocoyusarlalo msfrescaposible.Inclusoserecomiendaprepararlasemanalmente.

ParalatricrmicadeGomori,Ellis(2008)recomiendaprimeroteirlosncleosconazul decelestinapreparadadelasiguientemanera: AzuldeCelestina0.5g Sulfatofrricodeamonioal5%(alumbredehierro) 100ml SepreparaaadiendoelazuldeCelestinaalsulfatofrricodeamonioehirviendopor3 minutos,dejarenfriaryluegofiltrar.Conservarlasolucinrefrigerada.

PuedeusarsetambinlahematoxilinadeHarrisenlugardelahematoxilinafrrica deWeigertsiguiendolosmismosprocedimientosdescritos.

Bibliografa

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PhylumPlatyhelminthes Introduccin

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Phylum Platyhelminthes Introduccin Losplatelmintosconstituyenun Phylumdeorganismosgrandeydiverso,algunos deellossondevidalibre,perolamayorasonectooendoparsitosdevertebradose invertebrados.Presentansimetrbilateral.Elcuerpoesaplanadodorsoventralmentey slido,carecendecavidadcorporal(celoma).Nosonsegmentados,aunqueloscstodos presentanelcuerpoconstitudoporprogltideos.Algunosgruposdeplatelmintospresentan unaparatodigestivoincompleto,entantoqueloscstodoscarecenporcompletoderganos digestivos.Carecendesistemascirculatorio,esquelticoyderganosdeintercambio gaseoso.Presentanunsistemaexcretorprotonefridial,constitutdoporclulasenflama.En generalsonhermafroditas,conciclosdevidacomplejos,sibienlosmonogneostienen ciclodevidadirecto. Laclasificacindel Phylumincluyevariasclases,delascualeslostremtodos (Trematoda),losmonogneos(Monogenea)yloscstodos(Eucestoda)sonfrecuentes comoparsitosdeanimalessilvestres,enparticulardepeces.

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Tremtodos Introduccin Desarrollo Bibliografa

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Tremtodos Introduccin Algunosautoresserefierenalostremtodoscomodigeneosocomotremtodos digenticos.Lamayoradelostremtodosadultos sonendoparsitosyseencuentranen todaslasclasesdevertebrados.Unadelascaractersticasmsdistintivasdeestaclasede platelmintosesquepresentanunpardeventosas,laanterioreslaventosaoralenelcentro delacualseencuentralaboca,yunaventosaventraloacetbulo.Algunasespeciesno presentanestaconstitucin entantoqueotraspuedenpresentarventosasaccesoriasenla parteanterior.Latalladelostremtodosque parasitan animalessilvestresesmuyvariable, deunospocosmilmetroshastaalgunoscentmetros.Lapareddelcuerpodelostremtodos esuntegumentosincicial,unacapavivaquepuedeestarcubiertaporespinasotubrculoso algunasotrasestructurasaccesorias. Existeun cerebroprimitivoenlaparteanteriordelcuerpo,apartirdelcualse extiendencordonesnerviososlongitudinalespareadosqueseinterconectanpormediode comisuraslaterales.El sistemanerviosoperifricoinervaeltegumentoylascapas musculares,elaparatodigestivoyelreproductor. Losrganossensorialesexternos incluyenmecanoreceptores,quimiorreceptoresyosmoreceptores. Losrganosysistemasinternosquedanembebidosenelparnquima.Elaparato digestivoseabreenlabocasituadaporlogeneralenlaparteanteriordelcuerpo,enel centrodelaventosaoral.Lamayoradelasespeciespresentanunafaringemuscular conspcua,quesecontinaconelesfagoqueporlogeneraldalugaradosciegosquese extiendenlateralmenteypuedenllegarhastaelextremoposteriordelcuerpo.Enalgunas especiesestosciegospuedensercortos,oramificarse,obien,enotrasespeciespueden

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unirseenlaparteposteriorformandounasa,incluso,abrindoseenunano.Comovemosla variabilidadmorfolgicadelostremtodosesmuygrande,comoentodoslosgrupos. Elsistemaexcretoresprotonefrial,lasclulasenflamaexhibenpatronesde disposicinespecficos,ysimtricosenelorganismoslaobservacindeestasclulases mssencillaconejemplaresvivos.Losconductosexcretoresdesembocanaunavescula excretorasituadahaciaelextremoposteriordelcuerpoyquepuededescribirsecomoen formadeI,deYodeVlaobservacindeestavesculaesmsaccesibleconejemplaresen vivo,peromuchasvecessepuedeobservarenlosejemplaresyaprocesadosen preparacionespermanentes. Sibienlosesquistosomtidossonunisexuales,haymachosyhembrasporseparado, lamayoradelosgruposdetremtodossonhermafroditas,conrganosreproductivos masculinosyfemeninosenelmismoindividuo.Ladisposicindelosrganosyestructuras reproductorasesmuyvariable,ladescripcinquehacemosacontinuacinesgeneral, puedeemplearsecomounaguaenlaobservacindeejemplares. Porlogeneralsepresentaunpardetestculosdetamaosimilar,deloscualessale elespermaporlosvasoseferentes,quesefusionan originandoelvasodeferenteo espermaducto. Enalgunosgruposelespermaductodesembocaenunavesculaseminal.La porcinterminaldelsistemamasculinoporlogeneralexhibeunsacodelcirroconuncirro (papilapeneal)protusible.Estesacoseabredirectamenteenelgonoporo,situadosobrela superficieventraldelanimal,obienformandounatriogenital. Lafecundacinporlogeneralescruzada.Elcirrotransfiereelespermahaciael gonoporodeotroorganismoparaqueviajeporlosconductosgenitalesfemeninoshaciael repectculoseminaldondesealmacena.Losvulosseproducenenelovarioysedesplazan

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poreloviducto.Amedidaquepasanporelreceptculoseminalsonfecundados.Elcigoto diploidecontinahaciaelootipo,queestrodeadoporlaglnduladeMehlis.Elootipo tambinrecibeladesembocaduradelreservoriodevitelo.Lasglndulasvitelgenas generalmenteseencuentrandistribudaslongitudinalmentehacialasmrgenesdelcuerpo, aunqueenalgunasespeciespuedenconstituirmasascompactas.Lasvitelgenasaportanel viteloparaeldesarrolloembrionario,ytambinproducensustanciasquevanaformarel cascarndelhuevo.LasenzimasquesegeneranenlaglnduladeMehlisendurecenel cascarnamedidaqueloshuevospasandelootipoaltero.Elembrincontinasu desarrolloeneltero,deformaquecuandosalendelcuerpodeladultoenrealidadson embrionescontenidosenelcascarndelhuevo.

Desarrolloyciclodevida.Eldesarrolloembrionariodentrodelcascarndelhuevodalugar aunaprimeraformalarvaria,elmiracidio,queenalgunasespeciesyaestcompletamente formadocuandoelhuevoespuesto.Enotrasespecieselhuevorequierehabersalidopara completarsudesarrollo. Todoslostremtodostienenunmolusco,gastrpodoobivalvo,comoprimer hospederointermediario.Lamayoradelasespeciesdetremtodosponenhuevosdelos cualeseclosionael miracidioquepenetraalcaracolhospederointermediario.Algunas especiesdepositanhuevosquesoningeridosporelmolusco,ydentrodesteeclosionael miracidio.Losmiracidiossonlarvasciliadas,librenadadoras. Dentrodelmoluscoeldesarrollocontinapormediodeunprocesoasexualmuy especializadoconocidocomopoliembriona,medianteelcualselogramsdeunindividuo porcadacigotoendesarrollo.Losmiracidiosdesprendensusciliosyseestablecenen

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sitiosespecficosdelcaracolsegnlaespeciedeparsito,ysetransformanenesporocistos. Losesporocistossonsacosgerminalesquecontienenclulassomticasyclulasde desarrollo.Apartirdelasclulassomticastienelugarlaformacindeunasegunda generacindeesporocistos.Obien,elesporocistodalugaraotroestadiodedesarrollo llamadoredia.Lasrediastambinsonsacosquecontienenclulassomticasyclulas germinalessinembargoyaposeenlaventosaoral,labocaylafaringe,ascomoun sistemadigestivoprimitivo.Lasclulassomticasdelasrediaspuedendarlugarauna segundageneracinderedias(rediashijas)obiendarorigenaotroestadiodedesarrollo, lascercarias.Estascercariasenlamayoradelasespeciesemergendelcaracolprimer hospederointermediarioynadanlibrementebuscandoalsiguientehospedero.Lascercarias sonmuyparecidasyaalosadultos,perocarecenderganosreproductoresdesarrollados,y ademspresentanunacola.Enmuchasespecies,lascercariaspenetranaotrohospedero intermediario(elsegundohospederointermediario),endondesetransformanen metacercarias,queporlogeneralpermanecenenquistadas.Lasmetacercariascasisonya adultosinmaduros.Cuandosoningeridosporelhospederodefinitivoapropiado,se transformanenadultosreproductivos.

Objetivo Queelalumnoreconozcalascaractersticasmorfolgicasdistintivasdelos tremtodos.

Desarrollo

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Estudiomorfolgicodetremtodosadultos:

CrassicutiscichlasomaeManter,1936parsitodecclidosnativos(mojarras),parasitael
intestinodevariasespeciesdeCichlasoma enloscuerposdeCentroamrica,desdela cuencadelroPnucoporlavertientedelGolfodeMxico,ylacuencadelroPapagayo porlavertientedelOcanoPacfico,hastaNicaraguayPanam(SalgadoMaldonado, 2008).

Estudiomorfolgicodelarvasdetremtodos(metacercarias):

Posthodiplostomumminimum(MacCallum,1921)parsitodemesenterios,musculatura,
hgado,cavidaddelcuerpo,ojos,riones,grasa,degrancantidaddepecesdedistintas familias,ampliamentedistribuidoenMxico.Losadultosparasitanavesictifagascomo garzas.

Clinostomumcomplanatum(Rudolphi,1814)parasitaenlaboca,cavidadbranquial,
branquias,oprculos,aletas,msculo,mesenterios,musculatura,cavidaddelcuerpo,de grancantidaddepecesdedistintasfamilias,ampliamentedistribuidoenMxico.Los adultosparasitanavesictifagascomogarzasycormoranes.

Bibliografa Bush,A.O.,J.C.Fernndez,G.W.Esch,yJ.R.Seed.2001. Parasitism,thediversityand ecologyofanimalparasites.CambridgeUniversityPress.CambridgeUK.566pp.