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ZAMORANO
Carrera de Ciencia y Produccin Agropecuaria

Mdulo de Biotecnologa Aplicada Area de Actividad: Cultivo de Tejidos Vegetales y Propagacin In Vitro

IV. PREPARACION E !E IO" E C#$TIVO

Esta parte del laboratorio permitir al estudiante llevar a cabo todos los pasos correspondientes en la preparacin de un medio de cultivo usando como base las sales minerales del medio de Murashige y Skoog (MS) Este medio !ue originalmente desarrollado para cultivo de te"idos de tabaco pero ha sido utili#ado en muchas otras especies con muy buenos resultados $a caracterstica distintiva del medio MS es su alto contenido de sales% especialmente las sales de & y de ' (ambi)n utili#a B% Mn y *n en cantidades altas $a manipulacin de los niveles de au+ina y citocinina va a in!luenciar la respuesta en cuanto a mor!ologa de los te"idos, esta respuesta puede variar desde la !ormacin de te"ido calloso no di!erenciado% hasta la !ormacin de races% yemas% o embrioides !acroele%entos -a-l../.0 &/.501 &'08 MgS016/.0 '/1'08 !icroele%entos /8B08 -o-l.:/.0 -uS017/.0 &; MnS011/.0 'a.Mo01./.0 *nS016/.0 (ierro =eS016/.0 'a.E>(A %g&$ 112 462 4922 862 4:72 %g&$ :. 2 2.7 2 2.7 2 <8 .. 8 2 .7 <: %g&$ .6 < 86 8 Co%ponentes org'nicos myo3inositol cido nicotnico pirido+ina3/-l tiamina3/-l %g&$ 422 2 27 27 24

A;A (u otra au+ina) . 2 (4382) &inetina (u otra citocinina) 2 . (2 21342) (Se pueden usar otros reguladores del crecimiento en lugar de% o en adicin a las au+inas y citocininas) p/ 7 6 3 7 <

).*

!odi+icaciones del %edio !":

87 $as cantidades recomendadas para los compuestos orgnicos del medio de !uras,ige y "-oog (MS) (49:.) !ueron desarrolladas como producto de una investigacin e+tensiva ?na modi!icacin en las cantidades de orgnicos dio origen al medio $ins%aier."-oog (49:7) Este medio contiene los mismos compuestos inorgnicos @ue el medio MS% y los orgnicos @ue incluye son el myo3inositol con la misma dosis y la tiamina en una dosis de 2 1 mgA$, el resto de compuestos orgnicos (pirido+ina y cido nicotnico) se omiten En aBos recientes el hierro ha sido incorporado al medio en !orma de =e'aE>(A a ra#n de 72 mgA$ en lugar de la me#cla de =eS016/.0 y 'a.E>(A @ue se utili# en el medio original

)./

Pasos a seguir en la Preparacin de !edios Nutritivos

$os pasos a seguir en la preparacin de un litro de medio de cultivo sonC 4 En un beaker agregar la mitad (722 ml) de agua bidestilada del volDmen total de medio a preparar -olocar una barra agitadora magn)tica en el !ondo del beaker y mantener en agitacin constante con la ayuda de un agitador automtico, Si el medio utili#a el 422E de las sales minerales MS entonces agregar las siguientes solucionesC a) 422 ml de la solucin madre de macroelementos @ue ha sido previamente preparada a una concentracin de 42+, b) 4 ml de la solucin madre de microelementos @ue ha sido previamente preparada a una concentracin de 4222+, c) 7 ml de la solucin madre de hierro @ue ha sido previamente preparada a una concentracin de .22+, A continuacin agregar los compuestos orgnicos (vitaminas% aminocidos% reguladores del crecimiento) de acuerdo al protocolo del cultivo con @ue est) traba"ando 5ara la mayora de compuestos orgnicos @ue se utili#an se preparan con anticipacin soluciones madres en varias diluciones (4C4% 4C42% 4C422% 4C4222% etc )% recuerde de utili#ar la dilucin correcta de acuerdo a la concentracin re@uerida del compuesto, Seguidamente agregar la sacarosa y esperar a @ue se disuelva totalmente, A!orar al volDmen deseado (en este caso es de 4$) con un !rasco volum)trico de 4222 ml, -olocar el medio nuevamente en el beaker y nivelar el p/ de acuerdo al cultivo con el @ue est) traba"ando El p/ se regula con soluciones 2 4'% 4' o .' de &0/% 'a0/ o /-l, Si el medio es slido entonces este es el momento de agregar la cantidad recomendada de agar Si el medio es l@uido entonces no se agrega agente gelatini#ador y se pasa directamente al paso 9, Si se agreg agar% )ste necesita ser disuelto en un horno microondas Se coloca el beaker con el medio en el horno microondas y se calienta su!iciente tiempo hasta @ue el agar este disuelto >urante el tiempo @ue esta calentndose es conveniente estar agitando el medio

1 7 : 6

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8: en el agitador automtico cada dos minutos apro+imadamente El tiempo @ue va a permanecer el medio en el microondas calentndose va a depender del volDmen de medio @ue se est) preparando, 9 >ispensar el medio en los contenedores Es importante @ue los contenedores est)n previamente identi!icados con el nombre del cultivo @ue se va a sembrar y la etapa en el proceso de micropropagacin a @ue corresponde ese medio,

42 (apar los contenedores, 44 Esterili#ar en el autoclave ?na ve# @ue los contenedores con el medio salen del autoclave hay @ue de"arlos en!riar y luego re!rigerarlos hasta @ue se vayan a utili#ar Es recomendable utili#ar el medio dentro de una semana despu)s de haber sido preparado

).0 Co%o Preparar "oluciones !adre

Siempre antes de preparar una solucin madre hay @ue estar seguro cunto del @umico se debe agregar a la cantidad de medio nutritivo @ue estamos preparando 5or e"emploC Si la cantidad re@uerida de BA en un medio de cultivo es de 4 mgA$% esto e@uivale a decir @ueC 2 4 mg de BA se re@uieren para preparar 422 ml de medio% y 2 .7 mg se re@uieren si es @ue la cantidad a preparar es de .72 ml de medio Entonces% si vamos a preparar solamente .72 ml de medio de cultivo% vamos a necesitar agregar 2 .7 mg de BA Esta cantidad de BA se puede agregar utili#ando una solucin madre de 4C4 (4mg F 4ml) As @ue con una pipeta de 4 ml% se agregan 2 .7 ml de esta solucin madre de 4C4 al medio de cultivo para llenar el re@uisito correspondiente a 2 .7 mg de BA en el medio nutritivo 5ara la preparacin de soluciones madre dependiendo del tipo de solvente y de la dilucin a utili#ar re!erirse a la in!ormacin @ue aparece a continuacin