Bioqumica clnica

1. CUALES SON LAS TECNICAS ESPECTROMTRICAS QUE SE UTILIZAN EN BIOQUIMICA CLINICA? Las tcnicas espectromtricas se basan en la interaccin de las radiaciones electromagnticas con la materia. Existen diferentes tcnicas que son: Espectrofotometra de Absorcin Molecular Fluorimetra Quimioluminiscencia Espectrofotometra de Absorcin Atmica Fotometra de Llama Nefelometra y Turbidimetra Espectrometra de Masas Refractometra

Las principales tcnicas espectromtricas empleadas en la actualidad en los laboratorios de bioqumica clnica son: La Fluorimetra La Turbidimetra La nefelometra La luminometra La espectrometra de absorcin atmica La espectrometra de emisin atmica

A. ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN MOLECULAR: La espectrofotometra de absorcin molecular consiste en la medicin de la radiacin que llega a un detector tras producirse un fenmeno de absorcin de luz por parte de una sustancia absorbente. En qumica clnica, el material en estudio es generalmente una solucin, y las medidas se hacen ordinariamente dentro del espectro comprendido entre los 220 y 800 nm. Es aplicable tanto para anlisis cualitativos como cuantitativos. B. FLUORIMETRA El fenmeno de fluorescencia se encuentra dentro de los fenmenos llamados de luminiscencia que incluye adems de ste, la fosforescencia y la quimioluminiscencia. Todos ellos son resultantes de la interaccin de la luz con la materia que acaba con emisin de energa radiante.

Bioqumica clnica
Segn el tipo de energa absorbida por la molcula, se pueden clasificar los distintos fenmenos luminiscentes en: Fotoluminiscencia: cuando la fuente de excitacin electrnica es una radiacin luminosa; son fenmenos de este tipo la fluorescencia y la fosforescencia. Quimioluminiscencia: cuando es una reaccin qumica la que produce la energa capaz de excitar la molcula. Existen otros tipos de luminiscencia termoluminiscencia, radio luminiscencia etc. como son: bioluminiscencia,

Los tipos de luminiscencia que tienen mayor aplicacin en bioqumica clnica son la fluorescencia y la quimioluminiscencia. La fluorescencia se produce cuando una molcula absorbe luz (longitud de onda de excitacin), pasa a un estado excitado y al retornar a su estado fundamental, emite luz (longitud de onda de emisin); la fluorescencia ser por tanto la emisin de esa radiacin. La energa de la radiacin emitida es menor y por tanto, la longitud de onda es mayor que la de la radiacin absorbida. La diferencia o aumento entre estas 2 longitudes de onda se denomina desviacin de Stokes y, de forma general, los mejores resultados de las medidas de fluorescencia se obtienen con compuestos que tienen grandes diferencias entre las 2 longitudes de onda de excitacin y de emisin. Slo ciertas sustancias poseen la propiedad de ser fluorescentes: son los fluorocromos (fluorforos). Compuestos que no son en s mismo fluorescentes, slo dbilmente pueden convertirse en derivados muy fluorescentes mediante reacciones qumicas como condensaciones, sustituciones, deshidrataciones u oxidaciones, o simplemente modificando su pH particular. La fluorescencia es emitida por los compuestos en todas direcciones, pero slo se mide una pequea parte que llega al detector. El tiempo transcurrido entre la absorcin de la radiacin electromagntica y la emisin de la fluorescencia es muy pequeo, del orden de 10-8 segundos (10-8 - 10-4) (es ms lento el fenmeno de fluorescencia que el de absorcin ya que la absorcin se produce en 10-15 seg) La fluorescencia emitida puede cuantificarse; la luz fluorescente se puede utilizar para cuantificar la cantidad de compuesto fluorescente que la emite. Se puede aplicar al fenmeno de fluorescencia la Ley de Beer, siempre que se trabaje con soluciones diluidas: segn ella, la intensidad de la radiacin fluorescente es proporcional a la concentracin de la sustancia en solucin (esta relacin es slo vlida para soluciones diluidas donde la absorbancia es menor del 2% de la radiacin excitante ya que si es mayor aparece el efecto de filtro interno).

Bioqumica clnica

C. QUIMIOLUMINISCENCIA La quimioluminiscencia es la emisin de luz que se produce en algunas reacciones qumicas de oxidacin. La energa qumica que se genera como resultado de la descomposicin de un enlace dbil produce intermediarios de estado excitado que vuelven a su estado basal emitiendo luz. Existen muchos tipos de molculas con caractersticas estructurales muy diversas que producen quimioluminiscencia. Los sistemas quimioluminiscentes tienen en comn el ser detectores de perxido de hidrgeno, producto final de numerosas reacciones que intervienen en los mtodos de medida empleados en el laboratorio clnico. Los ms utilizados son: Luminol y sus derivados: El Luminol es una de las molculas quimio luminiscentes ms estudiadas. Esteres de acridinio: Este compuesto es muy utilizado en inmuno anlisis ya que cumple con todos los requisitos para ser un buen marcador. En los ltimos aos ha aumentado la utilizacin de procedimientos basados en fenmenos bio y quimioluminiscentes en el laboratorio clnico, pues poseen grandes ventajas respecto a otros procedimientos. Las ventajas de la quimioluminiscencia en los ensayos incluyen sensibilidad (lmites de deteccin de moles, nanogramos, picogramos) y velocidad (seal generada en unos pocos segundos y en algunos casos estable por varias horas), sin residuos peligrosos, y procedimientos simples. Gracias a ello estos procedimientos pueden desplazar a los radioinmunolgicos, en muchos casos, utilizando las sustancias quimioluminiscentes como marcadores, como en el Fluoroinmunoanlisis y Quimioluminoinmunoanlisis. La mayora de las aplicaciones son inmuno ensayos, marcaje de protenas, ensayos en molculas de DNA, y se utilizan para el diagnstico de enfermedades del tiroides (TSH, T3 y T4), estudios de fertilidad (hormonas esteroideas, -HCG), cncer (marcadores tumorales), drogas de abuso, frmacos, enfermedades metablicas e infecciosas, etc. D. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA Esta tcnica est basada en el fenmeno de absorcin de luz. Es decir, en la absorcin de luz a longitudes de onda muy definidas por parte de tomos vaporizados en estado de reposo. Las bandas de absorcin son muy estrechas, por lo que el espectro total de absorcin de un tomo se define como espectro de lneas (0,001 a 0,01 nm).

Bioqumica clnica
El elemento de estudio es situado en una llama, donde es disociado de sus enlaces qumicos y, por ganancia de electrones, se sita en un estado atmico base neutra no excitada ni ionizada. En este estado basal, el tomo es capaz de absorber la radiacin emitida por una fuente, consistente en una lmpara de ctodo hueco, construida del metal a estudiar, y que emite el espectro de lneas caracterstico de ste. La longitud de onda de la energa radiante absorbida es la misma que sera emitida si el elemento se encontrase excitado. Por lo tanto, la caracterstica de inters en las medidas por absorcin atmica es la cantidad de luz, a la longitud de onda seleccionada, que es absorbida, cuando la luz pasa a travs de una nube atmica. Con ayuda de un monocromador, se selecciona la longitud de onda de inters, y se mide la atenuacin de la luz incidente a su paso por la nube atmica. Esta atenuacin es consecuencia de las interacciones de los fotones con los tomos en estado fundamental que se encuentran en el vapor atmico E. FOTOMETRIA DE LLAMA Esta tcnica se utiliza fundamentalmente para la determinacin de sodio, potasio y litio en lquidos biolgicos, y est basada en el fenmeno de emisin de luz. Cuando un tomo en estado fundamental es sometido a la energa calorfica de una llama, sus electrones se excitan, pasando a niveles superiores de energa. Los electrones son inestables en ese estado excitado, y al volver a su estado inicial desprenden la energa en forma de luz. La luz desprendida puede poseer distintas longitudes de onda (distintos niveles de energa o lneas de espectro) que son caractersticas de cada elemento, de modo que se selecciona para un elemento, aquella longitud de onda en la que emite con mayor intensidad, y tiene menos probabilidad de que se presenten otras longitudes de onda muy cercanas que puedan interferir. F. NEFELOMETRIA Y TURBIDIMETRIA Estas tcnicas se basan en la propiedad que poseen las partculas en suspensin de dispersar la radiacin electromagntica. Por tanto, la muestra est compuesta por partculas no transparentes en el seno de un lquido: precipitados, suspensiones coloidales, etc. Cuando un haz de luz choca contra una partcula en suspensin parte de esa luz es dispersada, parte absorbida, parte reflejada y parte transmitida. El modelo de dispersin y la intensidad de la dispersin dependen de varios factores como la longitud de onda de la radiacin incidente, el tamao y peso molecular de la partcula, la distancia entre la cubeta de la muestra y el detector y la concentracin de partculas en la muestra.

Bioqumica clnica
Todos estos factores se relacionan entre s mediante frmulas matemticas complejas que constituyen la ley de Rayleigh. El modo de dispersin depende de la relacin entre la longitud de onda de la radiacin incidente y el tamao de la partcula. Cuando el dimetro de las partculas es mucho menor que la longitud de onda del haz incidente es simtrica a un eje de 90 y adems la radiacin dispersada a ngulos cercanos sera muy poco, esta dispersin se llaman Rayleigh. Cuando el tamao de la partcula es un poco mayor, es decir que se aproxima al de la longitud de onda del haz incidente. En este caso la dispersin no es simtrica y se dispersa ms luz en el sentido de avance de la radiacin incidente que en sentido contrario y la dispersin ser mayor para ngulos cercanos a los 0. Este tipo de dispersin se llama Rayleigh-Debie Cuando el dimetro de las partculas es muy superior a la longitud de onda del haz incidente. En este caso la luz se dispersa en el sentido del avance de la luz incidente. La dispersin sera mayor para ngulos cercanos al 0. Esta dispersin se llama Mie. La intensidad de la dispersin es: directamente proporcional al peso molecular de la partcula y a la concentracin de las partculas. inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz incidente. A menor longitud de onda, mayor intensidad.

Tambin es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia de la muestra al detector. Para que las medidas sean reproducibles ser necesario fijar unas condiciones de trabajo que mantengan constantes y controladas las longitudes de onda, la distancia detector cubeta, temperatura etc. G. ESPECTROMETRA DE MASAS La Espectrometra de masas es una tcnica analtica que se utiliza para establecer las masas moleculares y la estructura qumica de determinadas sustancias. Aunque est incluida entre las tcnicas espectroscpicas, la espectrometra de masas no es una de dichas tcnicas pues no utiliza ninguna radiacin del espectro electromagntico para irradiar la muestra y observar la absorcin de dicha radiacin. Al contrario que en aquellas en la EM la muestra es ionizada (y por tanto destruida) usando diversos procedimientos para ello. De todos ellos el ms

Bioqumica clnica
usual y/o utilizado es la tcnica denominada de Impacto Electrnico (EM-IE) consistente en el bombardeo de la muestra (previamente vaporizada mediante el uso de alto vaco y una fuente de calor) con una corriente de electrones a alta velocidad. Ello produce que la sustancia pierda a su vez algunos electrones y se fragmente dando diferentes iones, radicales y molculas neutras. Los iones (molculas o fragmentos cargados), y solo ellos, son entonces conducidos mediante un acelerador de iones a un tubo analizador curvado sobre el que existe un fuerte campo magntico y conducidos a un colector/analizador sobre el que se recogen los impactos de dichos iones en funcin de la relacin carga/masa de los mismos. Posteriormente dichos impactos son transformados en un espectro de masas en el que la intensidad de los picos nos indica la cantidad relativa de iones que poseen dicha relacin carga/masa. El espectro de masas de una sustancia es una representacin X-Y en la que en abscisas se representa la relacin carga/masa (m/z) de los fragmentos inicos producidos y en ordenadas su abundancia relativa. En general, la mayor parte de los iones producidos tienen carga unidad, lo que supone en la prctica la equivalencia del trmino m/z y la masa molecular del fragmento inico. En idnticas condiciones experimentales, una sustancia producir siempre los mismos fragmentos inicos y con idntica abundancia. Esto equivale a decir que el espectro de masas es siempre el mismo y, por lo tanto, la identificacin de un compuesto determinado se facilita enormemente, sobre todo si se dispone de patrones o de un archivo de espectros de masas. APLICACIONES CLINICAS Debido a su gran especificidad analtica, no superada por otra tcnica, y a la existencia de diversos sistemas de introduccin de muestra y deteccin, la EM permite el anlisis de prcticamente cualquier compuesto, independientemente de su composicin qumica o estado fsico. Las principales aplicaciones en bioqumica clnica son: Establecer valores definitivos a materiales de referencia y estndares. Identificacin y cuantificacin de compuestos en un intervalo de concentraciones nmol/L y mol/L. Por ejemplo, anlisis de contaminantes ambientales en aguas, sustancias prohibidas (dopaje) o txicos en fluidos biolgicos. Estudio del metabolismo y de la cintica de frmacos etc. En el caso, por ejemplo de sustancias prohibidas (control de dopaje), es posible identificar compuestos minoritarios tras su anlisis por EM, simplemente por comparacin de su espectro de masas con los contenidos en las bases de datos. Una vez identificados, se seleccionan varios iones de su espectro de

Bioqumica clnica
masas para realizar el anlisis cuantitativo mediante registro selectivo de iones. De este modo se lleva a cabo el anlisis cuantitativo y cualitativo con cantidades mnimas de muestra. H. REFRACTOMETRA Se denomina Refractometra, al mtodo de calcular el ndice de refraccin de una muestra para conocer su composicin o pureza. Los refractmetros son los instrumentos empleados para determinar este ndice de refraccin. La luz se mueve a diferentes velocidades en diferentes materiales. Si un rayo de luz con una longitud de onda definida en un ngulo fijo cruza una superficie lmite entre dos materiales diferentes el ngulo del rayo cambiar de acuerdo con el ndice de refraccin de los medios. En condiciones constantes con caractersticas de material conocidas se puede determinar el ndice de refraccin de un segundo medio desconocido mientras se mantenga el ngulo de refraccin y el ndice de refraccin del material conocido. Los refractmetros actuales funcionan con luz natural o con la iluminacin de una lmpara blanca. La luz llega a travs de una ventana sobre una superficie de entrada del prisma superior. 2. Para que utilizamos un Blanco, Estndar, un Desconocido y cul es su composicin. El blanco (B) es para llevar a cero y calibrar el espectrofotmetro, ya puede ser agua destilada u otra sustancia. El estndar (S) es una sustancia comercializada que tiene concentracin conocida de cierto metabolito y nos permite medir control y el factor de una muestra. Desconocido (D) es la muestra que se va a tratar. 3. Que contiene una solucin Estndar de glucosa fabricada artificialmente? Estndar de Glucosa: solucin que contiene 5 mmol/L (90 mg/dL) de glucosa y un conservador. Reactivo de Glucosa: solucin que contiene (despus de reconstituido) amortiguador (pH 7.5 a 25C), 2 mmol/L de cloruro de magnesio, 2.1 mmol/L de ATP, 2 mmol/L de NAD, > 2000 U/L de hexocinasa (microbiana), > 4000 U/L de G-6-PDH (microbiana), y un conservador. 4. Qu es un fotmetro y cules son sus componentes? En un amplio sentido, un fotmetro es cualquier instrumento usado para medir la intensidad de la luz. Los que se utilizan para la fotometra, son instrumentos para detectar Intensidad de luz dispersa. Absorbancia.

Bioqumica clnica
Fluorescencia.

Tcnicamente el fotmetro mide la cantidad de luz que incide o es reflejada por el sujeto, dando as las combinaciones correctas de diafragma y velocidad para lograr la fotografa perfecta. Muchas cmaras actualmente vienen con un fotmetro incorporado cuya informacin se puede ver fcilmente en el visor. Se tiene que tener en consideracin que el fotmetro de la cmara puede tambin equivocarse cuando se enfrente a escenas muy contrastadas o con temas mucho ms claros u oscuros de lo normal. Artsticamente su error puede consistir en no avisar cuando debe reducir la exposicin para conseguir una silueta o una atmsfera de tristeza o aumentarla para darle vivacidad a los colores. Incluso los mejores exposmetros carecen de gusto artstico.

5. Cmo preparamos una dilucin de muestra con solucin salina fisiolgica de 1/50? Solucin: Primero lo dividimos entre 10.

Este resultado lo dividimos entre 2

Respuesta. La preparacin seria: 0.05 de muestra con 2.45 de solucin salina.