Oliva Hernandez PDF

n vue de I'obtention du
UOC1OkA1 UL L'UH|vLkS|1L UL 1OULOUSL

DeIivre par :

DiscipIine ou speciaIite :

Presentee et soutenue par :

7itre :

1URY

coIe doctoraIe :
Unite de recherche :
Directeur(s) de 7hese :
Rapporteurs :
Ie :
Institut National Polytechnique de Toulouse (INP Toulouse)
Mcanique, Energtique, Gnie civil et Procds (MEGeP)
Etude des capacits mtaoliques de levures fructophiles isoles du Mezcal :
comparaison cintique et molculaire
jeudi 15 novembre 2012
Amanda Alejandra OLIVA HERNANDEZ
Gnie des procds et de l'environnement
Anne Christine GSCHAEDLER MATHIS
Amparo M. QUEROL SIMON
Alberto MENDOZA HERRERA
Claudia Patricia LARALDE CORONA
Anne Christine GSCHAEDLER MATHIS
Amparo M. QUEROL SIMON
Patricia TAILLANDIER
Diana RESENDEZ PEREZ
Laboratoire de gnie chimique - LGC
(Evaluacin cintica y molecular de levaduras fructoflicas aisladas del mezcal tamaulipeco)
Patricia TAILLANDIER
Diana RESENDEZ PEREZ

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LEN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

EVALUACION CINETICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS FRUCTOFLICAS
AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO

Por

AMANDA ALEJANDRA OLIVA HERNANDEZ

Como requisito parcial para obtener el Grado de
DOCTOR EN CIENCIAS

Noviembre, 2012

1

EVALUACION CINETICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS FRUCTOFLICAS
AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO

Comit de Tesis

Dra. Diana Resndez Prez
Director interno de la tesis

Dra. Patricia Taillandier
Director externo de la tesis

Dra. Claudia Patricia Larralde Corona
Secretario

Dra. Cristina Rodrguez Padilla
Vocal

Dr. Jorge A. Verduzco Martnez
Vocal

Dr. Pablo Zapata Benavides
Vocal

2

El presente trabajo se llev a cabo en el Laboratorio de Biotecnologa Industrial
del Centro de Biotecnologa Genmica del Instituto Politcnico Nacional bajo la
asesora de la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona, y en el Laboratorio de
Ingeniera Qumica del Institut National Polytechnique de Toulouse (Toulouse,
Francia) bajo la direccin de la Dra. Patricia Taillandier, y con el apoyo
econmico del proyecto CONACyT-Bsica 2006-57576 Anlisis
metagenmico y de levaduras de alta actividad fructoflica durante la
fermentacin del mezcal tamaulipeco, y de los proyectos institucionales
SIP2008-0597 y SIP2009-0613 (Instituto Politcnico Nacional) Caracterizacin
cintica y molecular de la capacidad fructoflica de levaduras aisladas del
mezcal tamaulipeco de Febrero 2008 a Enero del 2010. A.A. Oliva Hernndez
agradece el apoyo de la beca nacional (CONACyT) as como el apoyo especial
CONACyT PCP-2006, proyecto 04/06 Levaduras fructoflicas aisladas de
mezcal: comparacin cintica y molecular de los procesos de elaboracin del
mezcal y del vino de Enero del 2007 a Diciembre del 2010, en colaboracin
CBG-IPN y el INP-Toulouse (Toulouse, Francia).

3

AGRADECIMIENTOS

Gracias Dios por poner en mi camino todas las cosas bellas que ahora tengo.

Gracias a mi familia querida por respaldarme, soportarme con amor y ser un firme apoyo en
cada una de las decisiones y acciones que emprendo. Gracias mama, Amanda Leticia por
darme tu mano cada vez que lo necesito, con ese incansable amor, estar siempre cerca y
cuidar de mi tesoro ms preciado, mis hijos, Arturo, Emiliano y Airam. Gracias a mi esposo
Arturo, a mis hermanos Enrique, Lety y Cynthia por su cario y apoyo.

Profe Manuel de Jess Hernndez Monreal te quiero entraablemente y le doy gracias a Dios
por quien eres y porque te tengo, con t gran cario, ejemplo y apoyo incondicional has hecho
crecer a los que te rodean. Y en lo personal has sembrado ideales, retos y acciones a seguir,
siempre en el afn de que con un esfuerzo positivo y bien intencionado puedo lograrlo.

Gracias a los Doctores Patricia Larralde, Diana Resendez, Patricia Taillandier, Jos Narvez
por su trabajo y poner alma de artista en esta noble tarea al dirigir con fuerza misionera y
mano delicada el trabajo que implica el quehacer cientfico, por contagiarme de ese espritu de
curiosidad y compromiso en aras de una idea.

Gracias Doctor Felipe Ramn Portugal por tu apoyo y sobre todo tu amistad.

4

TABLA DE CONTENIDO

Seccin Pgina
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................................... 3
LISTA DE TABLAS ......................................................................................................................... 8
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................................... 9
LISTA DE SIMBOLOS .................................................................................................................. 13
RESUMEN ...................................................................................................................................... 16
RSUM ......................................................................................................................................... 18
1. INTRODUCCIN ...................................................................................................................... 20
2 JUSTIFICACION .................................................................................................................... 22
3 HIPOTESIS ............................................................................................................................. 22
4 OBJETIVOS ............................................................................................................................ 22
4.1. Objetivo general ............................................................................................................... 22
4.2. Objetivos particulares ...................................................................................................... 22
5 ANTECEDENTES .................................................................................................................. 23
5.1. Mezcal .............................................................................................................................. 23
5.2. La planta de Agave en Tamaulipas .................................................................................. 25
5.2.1. Tamaulipas regin mezcalera, situacin geogrfica ................................................. 25
5.3. El proceso de elaboracin del mezcal .............................................................................. 26
5.3.1. Seleccin de la planta ................................................................................................ 26
5.3.2. Coccin de las cabezas de agave ............................................................................... 27
5.3.3. Molienda .................................................................................................................... 29
5.3.4. Fermentacin ............................................................................................................. 29
5.3.5. Destilacin ................................................................................................................. 30
5.3.6. Envasado ................................................................................................................... 32
5
5.4. Microbiologa del proceso de fermentacin .................................................................... 32
5.4.1. La levadura Saccharomyces cerevisiae ..................................................................... 34
5.4.2. La fermentacin alcohlica por S. cerevisiae. ......................................................... 35
5.4.3. Tolerancia al estrs ambiental de S. cerevisiae y la produccin de etanol .............. 37
5.5. Transporte de hexosas a travs de la membrana celular en S. cerevisiae ....................... 38
5.5.1. Regulacin transcripcional en S. cerevisiae: sealizacin por glucosa .................... 39
5.5.2. El represor transcripcional RGT1 ............................................................................. 40
5.5.3. Las protenas Grr1, Hxk2 y Reg1 .............................................................................. 41
5.6. La regulacin de los genes HXT1 y HXT3 por glucosa/fructosa ..................................... 43
6 MTODOS .............................................................................................................................. 48
6.1. Aislamiento de levaduras ................................................................................................. 48
6.1.1. Diseo del estudio y tamao de la muestra ............................................................... 48
6.1.2. Tratamiento de la muestra ......................................................................................... 48
6.1.3. Clasificacin microscpica ....................................................................................... 50
6.2. Identificacin molecular .................................................................................................. 50
6.2.1. Extraccin de DNA ................................................................................................... 50
6.2.2. Amplificacin de los genes ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 y 26S por PCR ............... 52
6.2.3. Digestin enzimtica del segmento ribosomal ITSs ................................................ 52
6.2.4. Amplificacin de los genes HXT1 y HXT3 .............................................................. 53
6.2.5. Identificacin molecular por secuenciacin .............................................................. 54
6.2.6. Construccin de dendogramas .................................................................................. 55
6.3. Fermentaciones ................................................................................................................ 55
6.3.1. Medios de cultivo ...................................................................................................... 55
6.3.2. Cuantificacin de la biomasa. ................................................................................... 56
6.3.2.1. Espectrometra .................................................................................................... 56
6.3.2.2. Peso seco .......................................................................................................... 577
6.3.2.3. Cuenta celular ..................................................................................................... 57
6.3.3. Anlisis de azcares .................................................................................................. 57
6.3.3.1. Determinacin de glucosa por un mtodo enzimtico ....................................... 57
6.3.3.2. Determinacin de azucares totales por el mtodo DNS ................................... 588
6.3.3.3. Cromatografa liquida de alta presin (HPLC) .................................................. 58
6.4. Cuantificacin del estrs por etanol .............................................................................. 599
6.4.1. Parmetros cinticos .................................................................................................. 59
6
6.5. Anlisis estadstico ........................................................................................................... 60
7 RESULTADOS ....................................................................................................................... 61
7.1. Identificacin molecular de las levaduras ....................................................................... 61
7.1.1. Anlisis de restriccin del segmento ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 (ARDRA) ........... 62
7.1.2. Amplificacin del segmento ribosomal 26S ............................................................. 63
7.1.3. Identificacin molecular por los segmentos ribosomales ITSs y 26S ..................... 63
7.2. Caracterizacin de la productividad de las levaduras .................................................. 688
7.2.1. Caracterizacin del rendimiento de las levaduras en medio rico en glucosa
(M1) ..................................................................................................................................... 68
7.2.2. Caracterizacin del rendimiento de las levaduras en medio rico en fructosa
(M2) ................................................................................................................................... 722
7.3. Caracterizacin cintica de los aislados de S cerevisiae con una alta actividad
fructoflica ............................................................................................................................. 755
7.4. Caracterizacin de aislados de S cerevisiae con una alta actividad fructoflica
en medio M3 .......................................................................................................................... 855
7.5. Caracterizacin de la tolerancia al etanol de los aislamientos Saccharomyces
cerevisiae fructoflicos ............................................................................................................ 91
7.6. Caracterizacin gentica de los genes transportadores de hexosas HXT1 y
HXT3 de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructoflicos ........................................ 91
8 DISCUSIN ............................................................................................................................ 95
8.1 Identificacin molecular de las levaduras ........................................................................ 95
8.2 Caracterizacin de la productividad de las levaduras ..................................................... 95
8.3 Caracterizacin gentica de los genes transportadores de hexosas HXT1 y
HXT3 de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructoflicos ........................................ 99
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................... 103
10 APNDICES ......................................................................................................................... 104
Apndice 1. Microfotografas de las levaduras Saccharomyces cerevisiae aisladas
de mosto de mezcal. ............................................................................................................... 104
Apndice 2. Secuencias 26S de las levaduras aislados de mostos de mezcal. ...................... 106
Apndice 3. Secuencias ITSs de las levaduras aisladas de mostos de mezcal .................... 110
Apndice 4. Comparacin de las secuencia de los genes HXT1 de las levaduras
seleccionadas por su fructofilia. ........................................................................................... 115
7
Apndice 5. Comparacin de las secuencia de los genes HXT3 de las levaduras
seleccionadas por su fructofilia. ........................................................................................... 116
11 LITERATURA CITADA ...................................................................................................... 117
12 RESUMEN BIOGRFICO .................................................................................................. 135
PRODUCTIVIDAD ............................................................................................................... 135

8

LISTA DE TABLAS

Tabla Pgina

I. Especificaciones fsicas y qumicas para la produccin de mezcal 25
II. Composicin de medios de cultivo 566
III. Parmetros cinticos 59
IV. Aislados de levaduras con morfologa redonda 61
V. Clasificacin e identificacin molecular de las levaduras aisladas de mostos
de mezcal 64
VI. Parmetros cinticos de los aislamientos de S. cerevisiae en medio rico en
glucosa (M1). 71
VII. Parmetros cinticos de los aislados de S. cerevisiae en medio rico en
fructosa (M2) 74
VIII. Evaluacin cintica al final de la fermentacin de los aislados de S.
cerevisiae en medio M3 (glucosa:fructosa 1:1) 86
IX. Prediccin de de la posicin de los polimorfismos en HXT1 y HXT3 para
los aislados de mostos de mezcal 94

9

LISTA DE FIGURAS

Figura Pgina

Figura 1. (A). Planta silvestre de Agave spp. (B) Pias de agave 27
Figura 2. Pozos de cocimiento tradicionales: (A) Horno natural recubierto de
piedra. (B) Pias cocidas 28
Figura 3. Molino o trapiche metlico adaptado en forma transversal, accionado
por traccin animal 29
Figura 4. Tinajas de fermentacin de mostos de agave 30
Figura 5. Serpentn usado en destilacin de mezcal 31
Figura 6. HXT1 Induccin de la transcripcin solo por alta concentracin (Ozcan et
al., 1995) 44
Figura 7. HXT3 Induccin de la trascripcin por glucosa independiente de la
concentracin de azcar (Ozcan et al., 1995) 45
Figura 8. Puntos muestreados en la mezcalera El Palmar. A) Pias en coccin.
B) Trapiche. C) y D) Mostos en fermentacin 49
Figura 9. Gel agarosa al 1.5 %, tenido con SyberGold 10 X. ADN de aislados de
mostos de mezcal; en la tabla IV se especifica la identificacin de las
muestras...18 ADN de cepa control FECHA (Fermichamp) 51
Figura 10. Gel de agarosa al 1 %, teido con SyberGold 10 X, marcador 100 pb
(Promega, Estados Unidos). Amplificacin del gen HXT1 de aislados de
mostos de mezcal 53
Figura 11. Gel de agarosa al 1 %, teido con SyberGold 10 X, marcador 100 pb
(Promega, Estados Unidos). Amplificacin del gen HXT3 de aislados de
mostos de mezcal. 1=Oligonucletidos diseados por.
10
2=Oligonucletidos diseados por el Laboratorio de Biotecnologa
Industrial 544
Figura 12. Gel de agarosa al 1.5% tenido con SyberGold 10 X. Amplificacin de
los segmentos ITSs aislados con morfologa celular redonda. Agua (C-)
control negativo y M: marcador de 100 pb (Promega, Estados Unidos) 622
Figura 13. ARDRAs de aislados de mostos de mezcal. Gel de agarosa al 2.5%,
teido con SyberGold 10X, marcador 100 pb (Promega, Estados
Unidos) 622
Figura 14. Amplificacin de genes ribosomales 26S. Gel de agarosa al 2.5%,
teido con SyberGold 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados
Unidos) de las levaduras de morfologa redonda aisladas de mostos de
mezcal 633
Figura 15. rbol filogentico que agrupa a las levaduras comparando la secuencia
nucleotdica de la regin ribosomal 26S. Este rbol est basado en el
mtodo Neighbor-Joining, un bootstrap de 1000. La distancia
evolutiva fue realizada usando el Mtodo Maximum Composite
Likelihood usando nmero de bases de sustitucin por sitio para el
tamao de los clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El anlisis
filogentico se llevo a cabo en MEGA4 666
Figura 16. rbol filogentico que agrupa a las levaduras comparando la secuencia
nucleotdica de la regin ribosomal ITS1-5.8S-ITS2. Este rbol est
basado en el mtodo Neighbor-Joining, un bootstrap de 1000. La
distancia evolutiva fue realizada usando el Mtodo Maximum
Composite Likelihood usando nmero de bases de sustitucin por sitio
para el tamao de los clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El
anlisis filogentico se llevo a cabo en MEGA4 677
Figura 17. Cinticas de crecimiento por densidad ptica de levaduras S. cerevisiae
aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9) 699
Figura 18. Cinticas de porcentaje (%) de consumo de azcar por levaduras S.
cerevisiae aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa
1:9) 70
11
Figura 19. Cinticas de crecimiento por densidad ptica de levaduras S. cerevisiae
en el medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 733
Figura 20. Cinticas de porcentaje (%) de consumo de azcar por S. cerevisiae en
el medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 733
Figura 21. Cintica de fermentacin a 30C de 3D4. A) Medio M1
(fructosa:glucosa 9:1). Medio B) M2 (fructosa:glucosa 1:9) 766
Figura 22. Cintica de fermentacin a 30C de 3Y2 Cintica. A) Medio M1
(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 77
Figura 23. Cintica de fermentacin a 30C de 3Y3. A) Medio M1
Figura 27. Cintica de fermentacin a 30C de Fermichamp (FECHA). A) Medio
M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 84
Figura 28. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae A)
3Y3 y B) 3Y5 durante la fermentacin en M3 (fructosa:glucosa 100:100) 87
Figura 29. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae C)
3Y8 y D) Fermichamp (FECHA) durante la fermentacin en M3
(fructosa:glucosa 1:1) 88
Figura 30. Comparacin del consumo porcentual de azcar residual durante la
fermentacin de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B) 3Y5 en M1
(fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (fructosa:glucosa
1:1) 89
Figura 31. Comparacin del consumo porcentual de azcar residual durante la
fermentacin de cepas S. cerevisiae A) 3Y8 y B) Fermichamp
12
(FECHA) en M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3
(fructosa:glucosa 1:1) 90
Figura 32. Prdida de viabilidad en clulas de levaduras Saccharomyces aisladas de
mostos de mezcal a 30C en 25% v/v de etanol. La viabilidad al 100% la
representa el valor de 2 x 10
6
cfu/mL 91
Figura 33. Prediccin de la conformacin de los segmentos transmembranales de
las protenas A) hxt1 y B) hxt3 basada en la secuencia de la cepa
Saccharomyces cerevisiae S288c y la posicin de los polimorfismos de
aislados de mostos de mezcal y la Fermichamp 93
Figura 34. Imgenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un
microscopio BX-51 (Olympus, Japn), adquiridas con cmara de video
Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. A) 3D2; B) 3D3;
C) 3D4; D) 3D5; E) 3D6 104
Figura 35. Imgenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un
microscopio BX-51 (Olympus, Japn), adquiridas con cmara de video
Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. F) 3Y2; G) 3Y3;
H) 3Y4; I) 3Y5; J) 3Y6; K) 3Y8 105
Figura 36. Alineamiento Clustal, secuencia de aminocidos del gen HXT1 de
aislados de mostos de mezcal y Fermichamp en referencia a S288c.
Indica residuo de aminocido idntico; color rojo indica cambio en el
aminocido 115
Figura 37. Alineamiento Clustal, secuencia de aminocidos del gen hxt3 de
Aislados de Mostos de Mezcal y Fermichamp en referencia a S288c.
Indica residuo de aminocido idntico; color rojo indica cambio en el
aminocido 116

13

LISTA DE SIMBOLOS

C Grados centgrados
l Microlitro
M Micromolar
A
260
Absorbancia a 260 nm
A
280
Absorbancia a 280 nm
ADN cido desoxiribonuclico
ACP Anlisis de Componentes Principales
ADNg cido desoxiribonuclico genmico
Als, A Alanina
AMOVA Anlisis de Varianza Molecular
Arg, R Arginina
ARN cido ribonuclico
ARNasas cido ribonucleasas
ARNm cido ribonuclico mensajero
Asn, N Asparragina
Pro, P Prolina
Asp, D Asprtico
C/N Relacin carbono-nitrgeno
CFU Unidades formadoras de colonia
Cis, C Cisiteina
CO
2
Dixido de carbono
CV Coeficiente de variacin
dNTPs Desoxirribonuclesidos trifosfatados
DO
550
Densidad ptica a 550 nm
EDTA cido etilendiaminotetractico
G Gramo
Gln, Q Glutamina
14
Glu, E Glutmico
Gly, G Glicina
h Hora
His, H Histidina
HXT Genes transportadores de hexosas
Ile, I Isoleucina
kb Kilobase
L Litro
LB Luria Bertani
Leu, L Leucina
Lys, K Lisina
M Molar
M Marcador de peso molecular.
Mb Megapares de bases
Met, M Metionina
mg Miligramos
min Minuto
ml Mililitro
mM Milimolar
ng L
-1
nanogramos por microlitro
nm Nanmetros
ORF Marco de lectura abierta
pb Pares de bases
PCR Reaccin en cadena de la polimerasa
PDA Agar papa dextrosa
pH Potencial de hidrgeno
Phe, F Fenilalanina
rARN cido ribonucleico ribosomal
rpm Revoluciones por minuto
s Segundos
Ser, S Serina
Thr, T Treonina
Taq ADN polimerasa de Thermus aquaticus.
TGY Medio de cultivo de Triptona-Glucosa-Extracto de levadura
15
Trp, W Triptfano
Tyr, Y Tirosina
TM Regin transmembranal
U Unidades
U L
-1
unidades por microlitro
UPGMA Unweighted paired gropuing method with arithmethic average
UV Ultravioleta
V voltios
v/v Volumen a volumen
Val, V Valina
X Veces de la concentracin
g Microgramo
l Microlitro

16

RESUMEN

Tamaulipas tiene las expectativas de figurar como uno de los estados productores de
mezcal ms importantes, este producto mexicano puede contribuir a la economa del campo
tamaulipeco provocando una derrama econmica importante comparado con otros destilados
de agave ya que adems es una bebida que conserva la tradicin de fabricacin en empresas
pequeas con tradicin, cultura e historia fomentando el arraigo de las comunidades.

A diferencia de la micoflora que interviene en el proceso de produccin de otras bebidas
alcohlicas, la micoflora responsable de la fermentacin alcohlica del mezcal no ha sido
completamente identificada ni caracterizada metablicamente, es de gran inters industrial
conocer si las levaduras nativas involucradas en la fermentacin de mostos de agave poseen,
en primer lugar, una fuerte naturaleza fructoflica (inducida por a la composicin natural del
mosto), y en segundo lugar, caracterizar a nivel cintico y molecular el tipo de transportadores
involucrados en el consumo de la fructosa en estas cepa, ya que los estudios de la utilizacin
de hexosas por Saccharomyces cerevisiae se han concentrado casi exclusivamente en la
glucosa, y no se ha observado que los transportadores discriminen entre la glucosa y la
fructosa.

En este trabajo la poblacin a estudiar fueron 17 aislamientos (de 103 originalmente
aislados) obtenidos de la mezcalera El Palmar del Sr. Emilio Lozoya, situada en San Carlos
(Tamaulipas, Mxico). La toma de muestra se efectu en el horno de cocimiento; el trapiche
(molino) y en las diversas etapas de los mostos en fermentacin. Como control se utiliz la
cepa Fermichamp (DSM) una cepa de vino industrial con capacidad fructoflica. Se
identificaron molecularmente por la secuencia ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 y 26S cinco grupos
de microorganismos, 10 aislados de Saccharomyces cerevisiae, uno Zygosaccharomyces
bailii, tres de Torulaspora delbrueckii, dos de Kluyveromyces marxianus y uno de Pichia
mexicana. Se evaluaron cepas identificadas como S. cerevisiae en tres medios diferentes M1
(fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (glucosa:fructosa 1:1). Las cepas
destacadas en el consumo de azucares en M1 fueron 3Y4, 3Y8 y Fermichamp; en M2 los
mejores fueron 3Y2, 3Y4 y 3Y8; en M3 fueron 3Y3, 3Y5 y 3Y8. Adems se evalu la
17
resistencia a etanol encontrndose que la cepa con que presento mayor porcentaje de
viabilidad fue la cepa 3Y8.

El anlisis de las secuencias de los trasportadores de hexosas de Hxt1 demostr que los
segmentos transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de
mezcal y Fermichamp con la secuencia de la clona S228c. El anlisis de Hxt3 mostro que en
TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en S
207
L (cambio de un aminocido no
polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c. TM7 de Hxt1, los aminocidos Q
275
, G
279
y
D
280
estn conservados para todas las cepas, sin embargo en Fermichamp, 3D6, 3Y2, 2Y3,
2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el polimorfismo K
278
T. En Hxt1 se encontraron entre
la regin TM9, en el rizo externo y en la TM10 cambios de aminocidos en la posicin 418-
420 y 431, en Hxt3 se localizaron los polimorfismos en la posicin 418 y 419 solo para
Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las sustituciones Y
402
L y C
401
S; otro cambio
ocurri solo en la cepa 3D3 que present los polimorfismos Y
405
A, A
406
F, S
407
L dentro de la
regin transmembranal 9. En Hxt1 del segmento TM10 est presente el polimorfismo L
377
F,
para 3Y8 cerca de la posicin F
380
. Por otra parte en la cepa 3D3 se encontraron los
polimorfismos F
406
S; G
408
A; G
411
A en Hxt1. En el transportador Hxt1 est presente el
polimorfismo L
439
M en el TM12, en la cepa 3D3. Se considera que los polimorfismos que se
presenten en estos segmentos transmembranales pudieran modificar el tamao del poro y la
forma de sealizacin de la protena con el azucar, evidenciando su importancia en la
formacin de la cadena. Por lo que se pudiera conisderar que estas modificaciones
distorsionarian la conformacion de la estructural exofacial provocando alteraciones entre los
sitios alostricos de la proteina, propiciando una diferente afinidad con las moleculas de
hexosas, provocando cambios en la funcionalidad del transportador. Los resultados
obtenidos en este estudio sugieren la necesidad de realizar un anlisis integral para determinar
las capacidades fructoflicas y de produccin de etanol en una cepa de S. cerevisiae; ya que
los cambios observados en la tasas de consumo de azucares y produccin de etanol para estas
cepas no estn relacionados solo con la expresin y/o actividad de estos genes.

18

RSUM

Ltat de Tamaulipas au Mexique a pour objectif de devenir l'un des plus grands
producteurs de mezcal. En effet ce produit mexicain peut contribuer l'conomie rurale et
prendre un essor conomique important par rapport d'autres distillats d'agave. Cest aussi
une boisson qui maintient la tradition de fabrication dans les petites entreprises conformment
la culture et l'histoire en faisant appel aux racines des communauts.

Contrairement la mycoflore implique dans le processus de production des autres
boissons alcoolises, la mycoflore responsable de la fermentation alcoolique du mezcal n'a
pas t pleinement identifie ou caractrise mtaboliquement. Il est tout dabord d'un grand
intrt industriel de savoir si les levures indignes impliques dans la fermentation de mots
agave ont une forte nature fructophilique (induite par la composition naturelle du mot). Par
ailleurs les caractrisations cintique et niveau molculaire des transporteurs impliqus dans
la consommation de fructose dans cette flore seraient pertinentes tant donn que des tudes
sur l'utilisation des hexoses par Saccharomyces cerevisiae ont port presque exclusivement
sur le glucose, et quil n'a pas t observ que ces transporteurs discriminaient le glucose et le
fructose.

Dans ce travail la population tudie tait de 17 isolats sur 103 levures initialement isols
dune mezcalerie, la "El Palmar" Lozoya M. Emilio, situ San Carlos (Tamaulipas,
Mexique). L'chantillonnage a eu lieu dans la cuisson au four, au moulin et diffrents stades
de mots en fermentation. Comme souche de contrle la Fermichamp (DSM) a t utilise.
Il sagit dune souche industrielle de vin capacit fructophilique. Cinq groupes de micro-
organismes ont t identifis par la squence-ribosomiques ITS1 et ITS2 5,8 S-26S : 10
Saccharomyces cerevisiae, 1 Zygosaccharomyces bailii, 3 Torulaspora delbrueckii, 2
Kluyveromyces marxianus et 1 Pichia mexicana. Les souches identifies comme S. cerevisiae
ont t values dans trois milieux diffrents : M1 (glucose: fructose 9:1), M2 (glucose:
fructose 1:9) et M3 (glucose: fructose 1:1). Les souches prdominantes pour la consommation
de sucres dans M1 taient 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8. Dans M2 la meilleure tait FECHA
suivie de 3D5, 3Y8, 3D3, 3Y2 et 3Y4; dans M3 ctait 3Y3, 3Y5 et 3Y8. En outre la
19
rsistance l'thanol a t value et nous avons constat que la souche tmoin Fermichamp
, conservait la meilleure suivie de 3Y5 et 3Y8.

L'analyse des squences des transporteurs d'hexoses de Hxt1 ont montr que les segments
transmembranaires TM3, TM5 et TM6 sont conservs dans les isolats du mezcal et dans
Fermichamp par rapport la squence du S228c clon. Lanalyse Hxt3 montre que dans le
segment transmebranaire TM5, les souches de mezcal prsentent un polymorphisme dans
S207L (changement d'un acide amin non polaire une autre polaire) par rapport la souche
S228c. Pour le segment TM7 de Hxt1, les acides amins Q275, G279 et D280 sont conservs
pour toutes les souches, mais dans Fermichamp , 3D6, 3Y2, 2Y3, 2Y4, 2Y5 et 3Y8 on
rencontre le polymorphisme K278T. Dans Hxt1 entre TM9, rgion de la boucle extrieure, et
TM10 des changements d'acides amins la position 418 420 et 431 ont t trouvs. Dans
Hxt3 les polymorphismes taient situs la position 418 et 419 seulement pour Fermichamp ;
les isolats du mezcal prsentent les substitutions Y402L et C401S, un autre changement a eu
lieu seulement dans la souche 3D3 qui prsentent les polymorphismes Y405A, A406F, S407L
dans la rgion 9 transmembranaire. Dans Hxt1 dans le segment TM10 le polymorphisme
L377F est prsent, proximit de la position 3Y8 F380. En outre, pour cette souche on trouve
aussi le polymorphismes dans les F406, G408A, G411A dans Hxt1. Sur le trnasporteur Hxt1
le polymorphisme L439M est prsent dans le TM12. On considre que les polymorphismes
survenant dans les segments transmembranaires peuvent modifier la taille des pores et la
forme de signalisation de la protine par du sucre, dmontrant son importance dans la
formation de la chane. Comme ces changements pourraient modifier la conformation
structurelle exofaciale, provoquant entre des altrations des sites allostriques de la protine,
ils peuvent conduire une modification de laffinit pour les hexoses diffrents et donc des
changements dans la fonctionnalit du tranporteur.

Les rsultats obtenus dans cette tude suggrent la ncessit d'une analyse approfondie afin
de dterminer les capacits la fructophilie et la production d'thanol des souches de S.
cerevisiae. Les changements observs dans les taux de consommation de sucre et de
production d'thanol pour ces souches ne seraient pas lis uniquement l'expression et / ou
l'activit de ces gnes.

20

1. INTRODUCCIN

La fuente principal de carbono en el mosto de agave est compuesta principalmente de
azcares fermentables (glucosa y fructosa) aproximadamente en una relacin de 1 molcula
de glucosa por 7 molculas de fructosa, a priori podemos pensar que las levaduras
predominantes durante el proceso de elaboracin del mezcal tendrn una tendencia
fructoflica (fuerte capacidad de asimilacin de la fructosa). La especie de Agave que se
utilice en el proceso va a determinar el tipo y contenido de azcares, con lo cual se observan
variaciones en el rendimiento del producto, que generalmente son ms bajas que el estimado
terico, debido a deficiencias en la etapa de coccin, extraccin de azcares, de la
fermentacin y de la destilacin, dado el poco control que se tiene en cada etapa por lo
artesanal del proceso. El mosto de agave contiene adems una baja concentracin de
nitrgeno asimilable para la levadura.

Las levaduras son el factor ms importante durante el proceso de fermentacin, pues
adems de etanol, producen alcoholes superiores, enzimas extracelulares, precursores de
aromas y compuestos de alto peso molecular que constituyen o participan en el aroma
caracterstico de los productos refinados.

Dentro de la amplia gama de carbohidratos presentes en la naturaleza, y que son utilizables
en el metabolismo, las hexosas ocupan un lugar predominante de importancia, y entre ellas, la
glucosa es la ms importante. Para que las hexosas puedan ser utilizadas deber ser en primer
lugar traslocadas a travs de la membrana celular, para lo cual se ha observado que existe todo
una serie de protenas transportadoras, de afinidad variable y modulable, y las cuales son
reguladas tanto a nivel transcripcional como post-traduccional. Los estudios de la utilizacin
de hexosas por S. cerevisiae se han concentrado casi exclusivamente en la glucosa, y no se ha
observado que los transportadores discriminen entre la glucosa y la fructosa. El que una
levadura posea una naturaleza fructoflica, es decir, que consuma a mayor velocidad la
fructosa que la glucosa a altas concentraciones, le confiere una mayor capacidad de utilizar
21
una fuente de carbono que la mayora de los microorganismos no utilizan como primera
opcin.

Hasta la fecha no se conoce en detalle la micoflora que interviene en el proceso de
conversin del mosto del Agave en mezcal tamaulipeco, as como tampoco se ha
caracterizado cinticamente el transporte y aprovechamiento de azcares, que son la materia
prima fundamental del proceso de obtencin de mezcal. A nivel cientfico el conocimiento de
las levaduras nativas del mezcal, as como las caractersticas de transporte de azcares (y otras
actividades bioqumicas en este sistema de fermentacin) sera de gran importancia, y en
particular, en lo que se refiere a la utilizacin de la fructosa, que es el azcar principal de los
mostos, y sus posibles consecuencias a nivel de la caracterizacin y mejoramiento de la
produccin del mezcal.

22

2 JUSTIFICACION

El conocimiento de las caractersticas de transporte de azcares en las levaduras nativas del
mezcal tamaulipeco, y en particular, en lo que se refiere a la utilizacin de la fructosa, tendra
un impacto positivo en el conocimiento bsico y mejoramiento de la produccin del mezcal.

3 HIPOTESIS

Dada la alta concentracin de fructosa presente en los mostos de mezcal se pueden aislar
levaduras nativas que expresan transportadores con una alta afinidad hacia este azcar.

4 OBJETIVOS
4.1. Objetivo general

Caracterizar a nivel cintico y molecular el consumo de la fructosa en cepas productivas de
alcohol aisladas de mostos de mezcal tamaulipeco.

4.2. Objetivos particulares

Aislar y caracterizar cinticamente las levaduras con una alta actividad fructoflica.

Caracterizar la productividad de etanol de las levaduras Saccharomyces cerevisiae
fructoflicas bajo diferentes relaciones fructosa:glucosa.

Caracterizar la tolerancia al etanol de las levaduras Saccharomyces cerevisiae fructoflicas.

Caracterizar genticamente los genes HXT1 y HXT3 del sistema de transportadores de
azcares de las levaduras Saccharomyces cerevisiae fructoflicas seleccionadas de la
micoflora nativa del mezcal.
23

5 ANTECEDENTES

5.1. Mezcal

La palabra mezcal tiene su origen en vocablos de la lengua nhuatl, algunos sostienen que
deriva de mexcalli (metl o meztl, maguey, y de ixcalli, cocer), la traduccin sera
entonces maguey cocido (Gmez, 2004; Colunga et al., 2007). La planta del maguey desde
tiempo prehispnico era utilizada por los indgenas en todo Mesoamrica obteniendo de l
aguamiel y pulque (Parsons et al., 1990); pero no fue sino hasta la llegada de los espaoles en
el siglo XVIII, quienes controlaron su produccin, que se introdujo por a las costas de Colima
y Jalisco el proceso de destilacin proveniente originalmente de los filipinos (Parsons et al.,
2000; Colunga et al., 2007; Zizumbo et al., 2008). Ciertamente la fabricacin del vino mezcal
tuvo un comienzo modesto, su consumo fue a lo largo de los siglos XVI y XVII estrictamente
local, sin embargo, para fines del siglo XVIII y como consecuencia de su vinculacin a los
centros mineros, experiment un fuerte impulso ya que este emergente mercado vino a
sumarse al tradicional mercado rural y al recin conquistado mercado urbano, articulndose
as una fuerte comercializacin del producto. En Tamaulipas, existen registros de que los
indgenas Janambres, en el invierno consuman mezcal de agave haciendo en barbacoa la
pia del quiote del maguey y la lechuguilla, fueron de verdad los indios ms temidos antes
de y durante la conquista. (Mirafuentes, 1993). Durante la colonia, el auge mezcalero de la
regin lleg a su punto mximo gracias a las actividades mineras en la sierra de San Carlos,
pero pasada la corta bonanza minera en la Sierra de Tamaulipa Nueva y empobrecidos sus
habitantes por la grave dislocacin econmica que gener en todo el Noreste la guerra de
Independencia, las minas fueron abandonadas y sus habitantes obligados a buscar otro medio
de subsistencia (Delay, 2007).

El nombre mezcal se utiliza como genrico para bebidas destiladas a partir de diversas
especies de maguey, fabricadas a partir de variados procesos tradicionales, con una
denominacin de origen que emplea el nombre mezcal para agrupar, sin reconocer sus
diferencias, a variadas especies, bebidas, regiones y procesos de siete estados que son los
nicos que ahora pueden usar el nombre en la comercializacin de sus productos.
24
Actualmente de acuerdo a la NORMA Oficial Mexicana NOM-070-SCFI-1994 Bebidas
Alcohlicas-Mezcal Especificaciones, (Tabla I) el mezcal es la bebida alcohlica obtenida
por destilacin de mostos preparados con los azcares extrados del tallo y base de las hojas
de los agaves mencionados, sometidos previamente a fermentacin alcohlica con levaduras,
permitindose adicionar hasta un 20% de otros azcares en la preparacin de dichos mostos,
siempre y cuando no se eliminen los componentes que le dan las caractersticas a este
producto. (Bebidas Alcohlicas-Mezcal Especificaciones). A peticin de los productores de
maguey, el Instituto de la Propiedad Industrial gestion ante la Organizacin Mundial de la
Propiedad Intelectual, la denominacin de Origen para el Mezcal, misma que obtuvo su
registro en 1994 para los estados de Oaxaca, Guerrero, San Lus Potos, Durango y Zacatecas;
en 2001 para el municipio de San Felipe, Guanajuato, y en 2003 se incorporaron 11
municipios de Tamaulipas entre los que se encuentran Bustamante, Tula, Miquihuana de
Canales, Palmillas, as como de los de San Carlos Arteaga, San Nicols de Degollado y
Burgos, existiendo en estos ltimos el mayor nmero de fbricas de elaboracin de la bebida
alcohlica denominada Mezcal ( Norma Oficial Mexicana 2006). En Tamaulipas el mezcal
se elabora de manera artesanal en pequeas fbricas en donde los campesinos elaboran la
bebida para su propio consumo, las fiestas comunitarias y familiares y para ayudar su
economa familiar mediante la venta. Actualmente el gobierno de Tamaulipas impulsa la
agroindustria del mezcal en el proceso de fortalecimiento en acciones dirigidas a la
modernizacin y terminacin de las fbricas de mezcal existentes, la certificacin de las
mismas, promocin y comercializacin del mezcal para as lograr el posicionamiento nacional
e internacional (COMERCAM; Gaceta parlamentaria, 2008).

Considerando la ubicacin geogrfica, la infraestructura de las vas de comunicacin, la
cercana con el mercado ms grande del mundo y gran consumidor del tequila y mezcal, como
lo es Estados Unidos, Tamaulipas tiene las expectativas de figurar como uno de los estados
productores de mezcal ms importantes y este producto mexicano puede tener una derrama
econmica muy importante, ya que aunque incipiente, posee amplias perspectivas con
impacto social y econmico para las entidades rurales comparado con otros destilados de
agave, este es una bebida que conserva la tradicin de fabricacin en empresas pequeas con
tradicin, cultura e historia fomentando el arraigo de las comunidades.

25
Tabla I.
Especificaciones fsicas y qumicas para la produccin de mezcal
Especificaciones
Mnimo Mximo
Porcentaje de alcohol en el volumen a 20 C. 36.0 55.0
Extracto seco g/l 0.2 10.0
Miligramos por 100 centmetros cbicos referidos a alcohol anhdrido
Acidez total (como cido actico) 170.0
Alcoholes superiores mg/100 ml 100.0 400.0
Metanol mg/100 ml 100.0 300.0
Se pueden utilizar los aditivos permitidos y en la dosis que establezcan las disposiciones
legales correspondientes. NOM-070-SCFI-1994.

5.2. La planta de Agave en Tamaulipas

En el estado de Tamaulipas la denominacin de origen enlista para produccin de mezcal a
Agave esperrima jacobi Amarilidceas (maguey de cerro, bruto o cenizo), A. angustifolia
Haw (maguey espadn), A. weberi cela, Amarilidceas (maguey de mezcal), A.
potatorum, Amarilidceas (maguey de mezcal) A. salmiana Otto Ex Salm SSP Cassispina
(Trel) Gentry (maguey verde o mezcalero); en la literatura menciona tambin se
menciona a A. americana L subsp. Protamericana Gentry (mezcal o maguey cenizo), A
lophiana, A univittata Haw., y Agave funkiana K. Koch Bouch (Ambas conocidas como
lechuguilla o amole); Agave montium-santicaroli (Jarcia) (NOM-070-SCFI-1994;
CONABIO 2002; Garca, 2003; Garca-Mendoza et al., 2007).

En Tamaulipas se encuentran establecidas 1600 hectreas con agaves, sin embargo se
tienen plantas silvestres distribuidas en los 22 mil kilmetros cuadrados de los municipios
protegidos, especficamente en la regin de San Carlos conformada por los municipios de San
Carlos, San Nicols parte de Cruillas y Burgos (Jaques et al., 2003).

5.2.1. Tamaulipas regin mezcalera, situacin geogrfica

El Estado de Tamaulipas se ubica al noreste de la Repblica Mexicana, geogrficamente se
ubica entre los paralelos 22 12 31 y 27 40 52 de latitud norte, y los meridianos 97 08
26
38 y 100 08 51 de longitud oeste. Especficamente la Sierra de San Carlos en donde se
encuentra delimitada la actividad mezcalera, es una unidad orogrfica asilada dentro de la
planicie costera del Golfo Norte de Mxico sobre la cota de los 400 metros sobre el nivel del
mar (msnm); se localiza en la porcin centro-oeste del estado de Tamaulipas, entre los 24 07
y los 24 45de latitud norte y los 99 05y los 98 42de longitud oeste. En esta regin se
presentan climas que van de los templados subhmedo a semiclidos secos con lluvias en
verano y largos periodos de sequa, siendo la precipitacin mayor parte de la sierra son del
tipo rendzina, estos presentan una capa superficial rica en materia orgnica que descansa
sobre roca caliza y ocupan un 76 % del rea, suelos profundos del grupo Chernozem, ocupan
un 10 % de la superficie; tambin estn presentes suelos como los vertisoles y litosoles en
menor proporcin. En cuanto a su orografa la parte norte de la sierra pertenece a las
subcuencas del rio Conchos y de los arroyos Chorreras y Camacho, pertenecientes a la cuenca
del Rio San Fernando y el sur de la sierra a las subcuencas de los ros Piln, San Carlos y el
arroyo La Zanja, pertenecientes a la cuenca del Rio Soto la Marina; no existen corrientes
perennes dentro de la sierra (Trevio et al., 2002).

5.3. El proceso de elaboracin del mezcal

5.3.1. Seleccin de la planta

El agave tarda entre 8 y 10 aos en madurar y es cuando se cortan o jiman las pencas y
las races hasta dejar el centro del maguey al descubierto, a esta forma de maguey se le
conoce comnmente como pia, dependiendo del tipo de Agave y la forma de corte, cada una
llega a pesar cien o ms kilos (Figura 1).

Es necesario observar ciertas caractersticas tales como coloracin verde-amarillenta en la
base de las pencas y parda en la base del Agave, as como la presencia de pencas secas en esta
zona. Desde el punto de vista bioqumico, el estado de madurez apropiado lo marca un alto
contenido de azcares que puedan ser aprovechados por los microorganismos para la
generacin de alcohol (Jaques et al., 2004; Ramales et al., 2002; Salvatierra, 2003).

27

Figura 1. (A). Planta silvestre de Agave spp. (B) Pias
de agave

5.3.2. Coccin de las cabezas de agave

En Tamaulipas el proceso de elaboracin de mezcal es rustico, en la coccin de las pias
de agave se usan pozos cnicos de piedra y tierra construidos para trabajar 800 kg
aproximadamente (Gmez et al., 2004). El proceso inicia haciendo una oquedad en el suelo,
en donde se coloca lea y se recubre con piedras refractarias al calor, se hacen llegar al rojo
vivo (800 a 1000 C aproximadamente), despus se colocan las pias, se cubren con costales
y tierra (Figura 2). Es importante cuidar la temperatura y el tiempo de tapado ya que
repercuten en el sabor de mezcal, quemado en caso de estar muy caliente el horno o ahumado
en caso de un mal tapado. La temperatura ptima del horno se define en base a la experiencia
del procesador, apoyada en el tiempo de combustin de la lea. El horneado tiene una
A
B
B
28
duracin aproximada de tres das, esto es cuando la pia cambia del color blanco a color
caramelo.

Figura 2. Pozos de cocimiento tradicionales: (A) Horno
natural recubierto de piedra. (B) Pias cocidas.

Con este proceso se logra la hidrlisis de los fructanos, principal producto fotosinttico
en la planta de Agave, estos son polmeros solubles de fructosa con generalmente una glucosa
por molcula. Esta reportado que existe ms de una estructura en la familia Agavcea (Sims et
al., 2001), en el Agave tequilana y el Agave americana la principal fuente de almacenamiento
de carbohidratos es la inulina (Snchez et al., 1953). La molcula de inulina es un fructano
con un enlace tipo (2 1) compuesta por ms de 30 unidades de D-fructosa unidas por
enlaces glucosdicos; su hidrlisis produce adems de fructosa (100 a 140 g/L dependiendo de
la especie) 5 a 6 % de molculas de glucosa; la inulina se hidroliza por los cidos y por la
B
A
B
29
enzima, es soluble en agua, levgira, no da color con el yodo y no tiene poder reductor.
(Babor and Aznrez, 1977; Gmez et al., 2004; Aguilar et al., 2007).

5.3.3. Molienda

En la siguiente fase los pedazos de cabezas se desmenuzan y pasan a la molienda, usando
un molino o trapiche vertical metlico accionados por traccin animal o mecnico (Figura
3). El mosto obtenido se coloca en tinas de fermentacin, a travs de canaletas ubicadas
generalmente al ras del suelo.

Figura 3. Molino o trapiche metlico adaptado en
forma transversal, accionado por traccin animal.

5.3.4. Fermentacin

En la fermentacin del mosto se usa como inculo residuos de fermentaciones anteriores,
se lleva a cabo en tinajas de madera o metlicas (Figura 4) donde fermenta en forma natural y
a la intemperie durante cinco a nueve das (dependiendo de la temperatura ambiente, la cual
oscila entre los 25C y 42C). Los procesadores dan por terminado el proceso cuando cesa la
generacin de espuma. En la fermentacin natural del mosto de agave participan e
interaccionan secuencialmente un complejo grupo de microorganismos. En lo que se refiere a
las levaduras, el origen de estos microorganismos puede ser la superficie de los agaves o el
ambiente de las tinajas de fermentacin, hasta las moscas que rondan la molienda sin ningn
30
tipo de inoculacin externa; esta situacin causa que las fermentaciones no sean producto de
una sola especie o cepa de levadura, sino de una biodiversidad de especies y cepas diferentes
a lo largo del proceso. Se tiene la certeza de que en la etapa final invariablemente dominan las
levaduras resistentes a altas concentraciones de alcohol comnmente Saccharomyces
cerevisiae. Es indudable que la calidad del mezcal est directamente relacionada con la
microflora tpica nativa del proceso fermentativo.

Figura 4. Tinajas de fermentacin de mostos de agave

5.3.5. Destilacin

Al terminar el proceso de fermentacin los mostos cocidos se pasan hacia los alambiques
de destilacin (Figura 5). Aqu la mezcla se calienta en el alambique evaporndose y
condensndose lentamente a travs de un serpentn que deposita su contenido en un
recipiente; el producto de la fermentacin es destilado en tres partes, la cabeza y la intermedia
A
B
31
son generalmente redestiladas, obtenindose as un producto con mayor porcentaje de alcohol
(aproximadamente 55 % en volumen) y una tercera parte llamada cola es desechada.
Empricamente para conocer el grado alcohlico los productores usan un carrizo y una jcara
donde vierten el mezcal, cuando se forman burbujas se entiende que el mezcal es de calidad.
Este proceso ha sido muy poco estudiado, considerando que es el ltimo paso que define la
calidad de la bebida.

La Norma NOM-070-SCFI-1994 para el mezcal establece los lmites mximos y mnimos
de concentracin permitidos en la bebida (Tabla I), pero en estudios anteriores se observ que
existe una gran variedad de componentes voltiles en el mezcal, sin embargo, solamente
algunos de ellos estn bajo regulacin oficial. Como es esperado, el etanol es el componente
de mayor abundancia en el mezcal, ya que este compuesto es el resultado de la
biotransformacin de la azcar por los microorganismos durante la fermentacin (Salmon,
2005; Suarez et al., 2006; Arrizon et al., 2006).

Figura 5. Serpentn usado en destilacin de mezcal

Anlisis realizados en mezcal por micro extraccin de fase solida- cromatografa de gases-
espectrometra de masas (SPME-GC-MS) mostraron la presencia de alcoholes como metanol,
el cual es producido durante la fermentacin alcohlica a por la biodegradacin de la pectina
y la lignina de la pared de las clulas vegetales; asimismo se encontraron etanol, metanol, n-
propanol, 2-butanol, 2-metilpropanol y mezcla de 2/3 metil-1-butanol, producidos por el
catabolismo de los amino cidos (Lachenmeier et al., 2006; De Len-Rodrguez et al 2006).
Del mismo modo fueron identificado nueve clases de terpenos (-phellandrene, -terpineno,
p-cimeno, limoneno, -trans-ocimene, linalool, 4-terpineol, geraniol, and trans-nerolidol) se
32
ha reportado que estos terpenos son liberados por las -glucosidasas por las levaduras durante
el proceso de la fermentacin. Asimismo ha sido detectado furfural y 5-metilfurfuraldehdo, al
igual que la presencia de steres en su mayora de etilo, los cuales son los responsables del
aroma afrutado en bebidas alcohlicas, como el caso de hexanoato de etilo y octanoato de
etilo (olor a manzana). Igualmente se observ la presencia de alcoholes aromticos
importantes como el feniletanol, que confiere un aroma floral (Escalante et al., 2006;
Lachenmeier, 2006, Molina et al., 2007) otro compuesto que tambin se encuentra en los
mezcales son el acido actico, acetato de etilo y etil-2-hidroxipropanato (Len et al., 2006,
Vera et al., 2009). La presencia de componentes minoritarios juega un papel muy importante
en la bebida ya que le confiere propiedades organolpticas especficas que varan
notablemente con la edad de maduracin. Cabe mencionar que la concentracin de metanol en
conjunto con los alcoholes superiores es un indicativo de que la bebida no se encuentre
diluida o adulterada (Lachenmeier, 2006).

5.3.6. Envasado

De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana sobre bebidas alcohlicas, los mezcales se
clasifican en tres tipos basados en el tiempo de maduracin despus de la destilacin. Los
mezcales jvenes son embotellados justo despus de la destilacin, los reposados permanecen
de 2 a 6 meses en barricas para su estabilizacin, mientras que los aejos son sujetos a un
proceso de maduracin de por lo menos 1 ao. Durante este tiempo el mezcal adquiere color
mbar y sabor caracterstico.

5.4. Microbiologa del proceso de fermentacin

Bioqumicamente en la fermentacin los azcares son transformados a etanol y otros
compuestos como alcoholes con tres o ms tomos de carbono y steres. En general las
propiedades organolpticas de una bebida alcohlica son determinadas por la composicin de
una mezcla de alcoholes, steres, y otros compuestos como terpenos provenientes de la planta.
Es decir, la variedad de compuestos organolpticos generados en la fermentacin, depende del
tipo de microorganismo, de la materia prima y de las condiciones de fermentacin (Berry et
al., 1987; Lachenmeier et al., 2006).

33
A diferencia del mezcal, la dinmica de la flora responsable del proceso fermentativo del
mosto en bebidas como el tequila (Arrizon et al., 2002, 2007), pulque (Estrada et al., 2001), y
vinos de mesa ha sido objeto de numerosos estudios (Pretorius, 2001; Abdel et al., 1999). En
tequila la identificacin de levaduras nativas se encontr que en el agave fresco la microbiota
estaba dominada por Clavispora lusitaniae y especies endmicas como Merschnikowia
agavaveae, en Drosophila spp encontradas alrededor o dentro de la destilera se identific
Hanseniaspora spp., Pichia kluyveri y Candida krusei., en melazas Schizosaccharomyces
pombe, en agave cocido y mostos una considerable diversidad de especies incluida
Saccharomyces cerevisiae, en mostos fermentados se encontr baja la heterogeneidad de
especies, encontrando al inicio de la fermentacin a Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces
marxianus y Hanseniaspora spp, progresivamente en el tiempo se encontr a S. cerevisiae,
Zygosaccharomyces bailii, Candida milleri y Brettanomyces spp., concluyendo que la
principal fuente de inculo para el proceso de fermentacin son los tanques de fermentacin
(Arrizon et al., 2002).

En pulque, han sido aisladas las levaduras Candida lusitaneae, Kluyveromyces marxianus
var. Bulgaricus, Saccharomyces cerevisiae (capensis), C. valida, S. cerevisiae (chevalieri) y
K. marxianus (lactis) (Estrada et al., 2001).

En la fermentacin espontnea del mezcal se han encontrado microorganismos como
Candida spp., C. magnolia, Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum, H. vinae, K.
marxianus, P. membranifaciens, T. delbrueckii, Candida parapsilosis, Clavispora lusitaniae,
Debaryomyces hansenii, Pichia caribbica, P. guilliermondii, y S. cerevisiae (Jaques et al.,
2005; Oliva, 2007; Cceres et al., 2008).

En vino blanco, elaborados a partir de la variedad de uva Rovello bianco se encontraron
levaduras nativas del genero de S. cerevisiae, Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia spp.,
Candida, Pichia, Torulaspora y especies de Cryptococcus flavescens (Francesca et al., 2009).
En otro estudio, se aislaron levaduras nativas de una fermentacin alcohlica se encontraron
microorganismos del genero S. cerevisiae, Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum,
Issatchenkia orientalis, Pichia anmala y Kluyveromyces thermotolerans (Clavijo et al.,
2011). En vinos espumosos, se han realizado estudios sobre la influencia de cepas de
Saccharomyces cerevisiae en la formacin de compuestos voltiles en la fermentacin
(Pretorius, 2001; Abdel et al., 1999). Para optimizar la produccin de vino y otras bebidas
34
fermentadas se han manipulado genticamente cepas de Saccharomyces cerevisiae, se sabe
que esta levadura interviene en la fermentacin y calidad; de tal forma que se han introducido
o eliminado caractersticas genticas con la finalidad de que la cepa intervenga en el proceso
de fermentacin afectando de manera deseable la produccin del vino (influyendo en los
cambios de acidez voltil, sabores y olores agradables), no obstante este tipo de levaduras
estn prohibidas en Europa y en Australia, sin embargo, en Canad o Estados Unidos estn
totalmente permitidas (Querol et al., 1990; Prez et al., 1999; Pretorius, 2001).

5.4.1. La levadura Saccharomyces cerevisiae

Las levaduras del gnero Saccharomyces pertenecen al phylum Ascomycota, clase
Hemiascomycetes, orden Saccharomycetales y familia Saccharomycetaceae. El gnero de
Saccharomyces est compuesto por las especies S. cerevisiae, S. arboricola, S. bayanus, S.
cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus y un hibrido S. pastorianus (Naumov et
al., 2000, 2003; Kurtzman et al., 2003; Wang et al., 2008, Scanell et al., 2011).

Particularmente la especie Saccharomyces cerevisiae constituye el microorganismo
eucariota ms estudiado por su importancia en la elaboracin de alimentos, como en la
panificacin y bebidas como vinos (Barnett, 2000). La palabra Saccharomyces proviene del
latn saccharum (azcar) y mykes (hongo), mientras que cerevisiae de cerevisia (cerveza) y es
un hongo levaduriforme que presenta clulas alargadas globosas, elipsoidales con gemacin o
blastoconidios multilaterales, con ascos con hasta cuatro ascosporas esfricas o elipsoides y
de pared lisa en su interior. Las colonias crecidas en PDA (Agar papa dextrosa) son cremosas
y blandas (Barnett, 2000). El crecimiento vegetativo es la forma principal de reproduccin de
S. cerevisiae, este tipo de reproduccin asexual se lleva a cabo por gemacin y envuelve la
divisin mittica de ncleos haploides. La reproduccin sexual es una alternativa de cuando
faltan nutrientes, la levadura es inducida a esporular y finalmente a propagarse por la
segregacin de cuatro esporas haploides (Saba et al., 1997).

La levadura S. cerevisiae posee un genoma pequeo, esto simplifica de manera importante
el anlisis gentico y molecular del mismo (Dujon, 1996). A diferencia de los genomas de
organismos multicelulares, el genoma de la levadura es muy compacto, dado que el 72% de la
secuencia corresponde a secuencias codificantes. El tamao promedio de los genes de
35
levadura es de 1.45 kb, o 483 codones, y solamente el 3.8% de los ORFs contienen intrones.
Aproximadamente el 30% de los genes se han caracterizado experimentalmente; y del 70%
restante, cuya funcin no se conoce, aproximadamente la mitad contiene al menos un motivo
de algn tipo de protenas ya caracterizadas, o corresponden a genes que codifican para
protenas estructuralmente relacionadas con productos gnicos ya caracterizados en levadura
o en otros organismos (Pandey y Mann, 2000). En S. cerevisiae el ARN ribosomal se
encuentra codificado por 120 copias repetidas y arregladas en tndem en el cromosoma, en
tanto que existen 262 genes que codifican para ARNs de transferencia, 80 de los cuales
poseen intrones. Los cromosomas contienen elementos movibles, retrotransposones, que
varan en nmero y posicin en las diferentes cepas de S. cerevisiae, an cuando la mayora
de las cepas de laboratorio poseen aproximadamente 30 elementos (Pandey y Mann, 2000).

En el ADN ribosomal tanto en S. cerevisiae, como en las dems especies de levaduras y
hongos, hay cuatro genes, el gen 5S, 5.8S, 18S y 26S, estos se encuentran agrupados en
repeticiones a lo largo del cromosoma XII y son regiones altamente conservadas en todas las
especies de levaduras. Los genes 18S y el 26S se encuentran separados uno de otro por
espacios transcritos internos (ITS) y espacios ntergnicos (IGS). Las secuencias de ITS e IGS
pueden ser fcilmente amplificadas por PCR (Reaccin en cadena de la Polimerasa) usando
oligonucletidos homlogos a estas. En S. cerevisiae al igual que en otras especies de
levaduras, estas secuencias han sido ya obtenidas, de manera tal que estos estudios son en
gran medida tiles para identificacin, hacer anlisis de filogenia y diversidad gentica entre
las especies de levaduras (Montrocher et al., 1998; Esteve et al., 1999; Hauser et al., 2001;
Naumova et al., 2003). La digestin de los segmentos ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 con
enzimas de restriccin, es una importante herramienta en la diferenciacin de especies de
levaduras S. cerevisiae a otros gneros presentes en una fermentacin espontanea, no obstante
la comparacin entre un perfil y otro obtenido de la misma especie requiere de anlisis
bioqumicos y moleculares ms puntuales para diferenciarlas entre s (Hierro et al., 2005;
Nisiotou et al., 2007).

5.4.2. La fermentacin alcohlica por S. cerevisiae.

En la fermentacin alcohlica espontanea tradicional, participa un complejo grupo de
microorganismos nativos o autctonos que interaccionan entre s a lo largo del proceso, la
levadura S. cerevisiae tiene un rol central dentro de este proceso; generalmente se obtiene una
36
bebida alcohlica con caractersticas particulares de los insumos usados, la mano de obra que
lo procesa, las condiciones climticas y geogrficas de la regin; atribuyndole una gran
variabilidad organolptica y qumica entre una fermentacin y otra.

La levadura Saccharomyces sp. ha sido seleccionada por su habilidad de fermentar rpida
y eficientemente los mostos de uva los cuales contienen altas concentraciones de azcar, por
su resistencia a alta concentraciones de etanol y al dixido de sulfuro y la capacidad de
supervivencia a elevadas temperaturas durante las fermentaciones produciendo as
fermentaciones controladas mejorando la calidad y composicin qumica del vino (Puig et al.,
2000; Querol et al., 2001; Serra et al., 2006).

Las levaduras presentan la tendencia a utilizar iones de amonio como nica fuente de
nitrgeno por lo que el amoniaco y sales amnicas, parecen ser las fuentes ms adecuadas de
nitrgeno por su fcil disponibilidad y bajo precio (Prescott et al., 1962). El (NH
4
)
2
SO
4
es la
fuente ms favorable ya que provee un beneficio nutricional adicional, como una fuente de
azufre (Pinal et al., 1997; Taillander et al., 2006). Snchez et al., (1953) recomendaron el uso
de sulfato de amonio como una fuente de nitrgeno, en la fermentacin del agave para la
produccin de tequila para favorecer la produccin de alcohol. En otro estudio se observo el
efecto de la concentracin del ion amonio en la produccin de alcohol, y encontraron que la
produccin de etanol fue alta cuando el sulfato de amonio estuvo presente a concentraciones
equivalentes de 750 a 1000 mg N/L (Tern et al., 2002). En agaves o magueyes el contenido
de nitrgeno es bajo, con promedio de 0.02% a 0.03%, en el caso del A. tequilana Weber
variedad azul (Snchez, et al., 1953), y mayor de 0.37% en el caso del A. angustifolia Haw
(Snchez, 1985), por lo cual, los niveles de nitrgeno pueden ser crticos durante la
fermentacin. La falta de nutrientes para la levadura especialmente, la deficiencia en
nitrgeno, provoca fermentaciones lentas (Casey et al., 1984).

Uno de los factores de mayor impacto en una fermentacin espontanea es la alta
variabilidad en las poblaciones de S. cerevisiae (Martnez et al., 1989; Esteve et al., 2001;
Suarez et al., 2006), los resultados genticos sugieren que las diferentes cepas derivan unas de
otras por mutacin, como lo son los rearreglos cromosomales adquiridos por las numerosas
divisiones mitticas; todo esto tiene lugar debido al proceso gradual de adaptacin a las
condiciones de vinificacin (Naumov et al., 1996; Polsinelli et al., 1996; Puig et al., 2000;
Fleet et al., 2003).
37

Desde 1930 han sido utilizados los cultivos lquidos de levadura vnica (Instituto Laclaire,
Francia), mientras que las levaduras vnicas secas no se originaron hasta mediados de los aos
cincuenta utilizndose como inoculo en fermentaciones dirigidas (Rainieri et al., 1998;
Querol et al., 2001).

5.4.3. Tolerancia al estrs ambiental de S. cerevisiae y la produccin de etanol

Las habilidades de las clulas de levadura para detectar y responder a las condiciones
ambientales de estrs son importantes ya que estas afectan directamente la viabilidad de la
clula, los mecanismos de respuesta al estrs responden a molculas sensoras y seales en las
rutas de transduccin las cuales determinan cambios en los niveles de mRNA para cerca de
900 genes (Bauer y Pretorius, 2000; Estruch, 2000; Gasch et al., 2000; Hohmann y Mager,
2003). Como un factor de estrs para la sobrevivencia y el crecimiento de las levaduras,
pueden considerarse el estrs osmtico debido a las altas concentraciones de azcar al inicio
de una fermentacin (glucosa y fructosa en los mostos de uva vara entre 125 y 250 g/L)
(Carrasco et al., 2001), un pH bajo (3.5 a 3), de acuerdo al progreso de la fermentacin la
acumulacin en las concentraciones de alcohol y acetaldehdos, la temperatura alta o baja ya
que la tasa de crecimiento en las levaduras decrece rpidamente daando la membrana celular
y desnaturalizando ciertas enzimas (Beloch, 2008; Cardona et al., 2007; Salvado et al.,
2008), as como la limitacin de nutrientes, y el estrs oxidativo debido al metabolismo
respiratorio.

En una fermentacin vincola, el mosto es preparado con uvas maduras, consecuentemente
con una alta concentracin de azcar. Estas concentraciones de azcar producen vinos con
altos niveles de etanol, algunas veces por encima del 15% (v/v) (De Barros et al., 2003). En
las fermentaciones espontaneas las levaduras que participan presentan un patrn progresivo de
crecimiento hasta el estado estacionario cuando los niveles de etanol son de 3-4% (Fleet el al.,
1993), pero los estados finales de una fermentacin natural invariablemente son dominados
por especies de levaduras alcohol tolerantes como la S. cerevisiae (Campbell, 2003;
Zuzuarregui et al., 2004).

38
5.5. Transporte de hexosas a travs de la membrana celular en S. cerevisiae

La plasticidad en la expresin de un gen es determinante en la adaptabilidad; una de las
manifestaciones fundamentales de esta capacidad es la habilidad de las clulas a usar
diferentes fuentes de carbono. Esto es consecuencia de un complejo grupo de sensores y rutas
de sealizacin que lideran la expresin de transportadores y enzimas metablicas.

En la naturaleza S. cerevisiae tiene la capacidad de adaptarse un amplio rango de fuentes
fermentables y no fermentables de carbono (L-azucares, etanol, acetato, glicerol, etc.). La
glucosa es la fuente de energa ms utilizada en las clulas; en respuesta a esta fuente de
carbono existe una matriz compleja en las rutas de las seales de transduccin coordinadas
con diversas respuestas metablicas, como por ejemplo la gluclisis, la disminucin de la
actividad respiratoria, el incremento de la biognesis de los ribosomas, adems de la
regulacin en el crecimiento y desarrollo.

El primer paso en el catabolismo exgeno de la fuente de carbono es usualmente el
transporte de la molcula a travs de la membrana celular; los genes HXT (transportadores de
hexosas) son los encargados de la expresin de las protenas que facilitan la difusin de
glucosa, fructosa y otros azucares a travs de la membrana (Yin et al., 2003; Flick et al.,
2003). Las protenas HXT pertenecen a la sper familia de facilitadores MFS, se ha
encontrado que para S. cerevisiae existen 17 familias potenciales, estas protenas son capaces
de transportar pequeas cantidades de solutos a travs gradientes quimiostticos, asimismo de
equilibrar los sustratos a travs de la membrana en ambas direcciones (Nelissen et al., 1997;
Saier et al., 2000; Bannam et al., 2004).

La secuencia y los anlisis bioqumicas de diversas MFS sugieren que estn compuestos de
12 segmentos transmembranales (TMs) de estructura tipo -hlice, seis hlices estn
localizadas fuera de la membrana citoplasmtica y 6 hlices dentro, formando un canal que
facilita el transporte bidireccional del sustrato (Hirai et al., 2002). Las protenas HXT son
similares en su secuencia amino terminal y trabajan independientemente, facilitando los
mecanismos de difusin y exhibiendo diferentes afinidades por los diferentes sustratos
(glucosa, fructosa, manosa y/o galactosa). La modulacin de la afinidad de los transportadores
de hexosas HXT por una u otra fuente de carbono y a interaccin entre ellos puede contribuir
a la habilidad de adaptacin a las diferentes concentraciones del azcar por las clulas de
39
levadura (Saloheimo et al., 2007). En S. cerevisiae la expresin de los genes HXT se regula a
travs del balance de dos rutas opuestas, represin e induccin las cuales son reguladas o
inhibidas respectivamente por glucosa. Existen 18 genes que codifican para protenas
transportadoras de hexosas HXT1 a HXT17, GAL2 (Ozcan et al., 1999; Rolland et al., 2001;
Ferrer et al., 2004). En S. cerevisiae hay dos sistemas de transporte, uno constitutivo que es
un sistema de baja afinidad (Km 15 a 20 mM) y uno represivo de glucosa que es un sistema
de alta afinidad (Km 1 a 2 mM).

En investigaciones realizadas encontraron que una cepa mutada en los genes HXT1 al
HXT7 no fue apta para crecer en glucosa, fructosa ni manosa y no presento flujo glucoltico.
Con estos estudios determinaron que HXT2, HXT6 y HXT7 son genes que expresan protenas
transportadoras de hexosas de alta afinidad la presencia de cualquiera de estos genes es
suficiente para que la cepa mutante crezca en una baja concentracin de glucosa (0.1%). Los
genes HXT1, HXT3 y HXT4 son genes que codifican para transportadores de baja afinidad, y
su presencia es suficiente para que la cepa mutante crezca en altas concentraciones de glucosa
(ms del 1%). Los genes HXT8 al HXT17 codifican para protenas que son incapaces de
transportar glucosa (Ozcan et al., 1999; Rolland et al., 2001; Yin et al., 2003).

5.5.1. Regulacin transcripcional en S. cerevisiae: sealizacin por glucosa

La regulacin de la concentracin de hexosas en las clulas de levadura, es mediante la
expresin de los genes HXT va sealizacin desde receptores de baja y alta afinidad de
glucosa (Ozcan et al., 1999, 2002; Flick et al., 2003; Ramakirshnan et al., 2006). El gen
SNF3 codifica una protena situada en la membrana citoplasmtica (Snf3p) que censa bajas
concentraciones de sustrato, en cuanto a hexosas se refiere, esta activa la induccin de un
grupo de transportadores de hexosas de alta afinidad, la deficiencia de la protena lleva a una
prdida de los transportadores. Snf3p es requerida para la induccin de los genes HXT2,
HXT3 Y HXT4 (Flick et al., 2003; Ozcan et al., 1999). El gen RGT2 codifica Rgt2p (protena
censora de altas concentraciones de glucosa) est situado en la membrana citoplasmtica, este
requerido para la expresin mxima de la induccin del gene HXT1 (Ozcan, 1996, 1999).

El alto grado de similitud entre Snf3 y Rgt2 sugiere que ambas protenas censan glucosa de
una forma similar y pueden actuar sobre las mismas protenas o similares para transmitir la
seal de glucosa. Tanto Rgt2p como Snf3p, tienen un 70% de homologa entre ellos y un 30%
40
con otros miembros de la familia HXT. Como se menciono anteriormente, no transportan
glucosa pero sirven como sensores extracelulares de glucosa, fructosa y manosa generando
una seal intracelular de induccin que no requiere del transporte o metabolismo de la
glucosa para la expresin de HXT (Dietvorst et al., 2009). Ambas protenas, estn
constituidas por dos diferentes dominios: 12 dominios transportadores transmembranales y un
dominio C-terminal la cual se predice esta en el citoplasma; Snf3 tiene dos secuencias de 25
aminocidos y Rgt2p solo una, aparentemente esta terminacin es la responsable en la
generacin de la seal de la expresin de los genes HXT. Se ha sugerido que el cambio
conformacional inducido por la unin de la glucosa al dominio transmembranal, afecta el
dominio C-terminal y la forma en cmo interacciona con otros componentes se sugiere que
probablemente sirve como un dominio de sealizacin que interacta con los componentes
cercanos en la ruta de la seal de transduccin (Ozcan et al., 1996, 1999; Lafuente et al.,
2000).

5.5.2. El represor transcripcional RGT1

El controlador final en la ruta de traduccin en la seal de glucosa es RGT1, ruta la cual
inicia con el sensado en la superficie de la membrana y termina en el ncleo, regulando la
expresin de los transportadores de glucosa. RGT1 pertenece a la familia GAL4 de factores
de transcripcin, es requerido para la represin transcripcional de HXT1-HXT4 en ausencia
de glucosa; este gen codifica para un represor transcripcional, Rgt1p, una protena que
contiene un grupo Zn
2
Cys
6
responsable de la unin al ADN, la cual reconoce varios sitios de
unin a los promotores de los genes HXT ya que un solo sitio de unin no es suficiente para
una represin significativa (Ozcan et al., 1999; Kim et al., 2003; Flick et al., 2003). La
funcin de Rgt1p es regulada por una interaccin intramolecular entre la regin-N terminal y
la regin media de RGT1, se sugiere que esto inhibe la unin al DNA con el dominio de
RGT1 (Dombek et al., 2004). RGT1 sirve tambin como activador transcripcional y es
requerido para la completa expresin del gen HXT1 cuando los niveles de glucosa son altos,
aunque la forma en cmo se convierte de represor transcripcional a un activador no es clara
aun. Lo cierto es que el nivel de glucosa determina el estado de fosforilacin de Rgt1p; esta
hipofosforilado en ausencia de glucosa e hiperfosforilado cuando los niveles de glucosa son
altos (Lafuente et al., 2000; Kim et al., 2006).

41
En ausencia de glucosa Rgt1p, en conjunto con Mth1, un regulador negativo en la
sealizacin de glucosa y Std1p una protena involucrada en el control de la regulacin de
glucosa, se une a los promotores de los genes HXT y a los correpresores transcripcionales
Ssn6 y Tup1, esto estabiliza el dominio represivo en la cromatina e inhibe directamente a la
RNA polimerasa reprimiendo la expresin de los genes HXT (Lafuente et al., 2000; Flick et
al., 2003; Ramakirshnan et al., 2006).

En presencia de glucosa, cuando la seal es generada por Snf3 y Rgt2, es transmitida a
Rgt1 a travs de Grr1, inhibiendo la represin transcripcional de Rgt1, aunado a la
degradacin inducida por glucosa de Mth1 y Std1, permitiendo que los genes HXT se
expresen (Kim et al 2003, 2006; Ramakirshnan et al., 2006). En la activacin por glucosa la
PKA (cAMP-proteinquinasa) cataliza la fosforilacin de Rgt1 inhibindolo, permitiendo la
expresin de los genes HXT. La PKA est involucrada en diversos procesos celulares, entre
los que se encuentra el crecimiento celular, resistencia al estrs y en el metabolismo en
general. Diversos estudios han demostrado que las clulas de levaduras deficientes en PKA no
son capaces de expresar los genes HXT1 y HXT3 en presencia de glucosa (Lafuente et al.,
2000; Polish et al., 2005; Kim et al., 2006; Belinchon et al., 2006).

5.5.3. Las protenas Grr1, Hxk2 y Reg1

La represin en la expresin de los genes HXT en presencia de glucosa requiere de la
protena Grr1p, una protena que se expresa constitutivamente a muy bajos niveles y
pertenece al complejo SCF (Skp1/cullin/F-box) cada una de las cuales poseen diferentes
componentes F-box. La naturaleza de la protena F-box determina la especificidad de la
interaccin con el complejo de enzimas de ubiquitinacin (Ubcs) y su blanco. Grr1 se une a
los sustratos en la protelisis mediante ubiquitinacin, esta incluye un motivo carboxilo
terminal capaz de interaccionar protena-protena, unido as Rgt1 con Grr1 se elimina la
interaccin con el correpresor dando lugar a una activacin transcripcional (Hsiung et al.,
2001; Flick et al., 1991, 2003; Vallier et al., 1994). En ausencia de glucosa, Rgt1 est
presente en la forma no-ubiquinada y acta como represor al unirse a Ssn6 y Tup1, protenas
que forman un complejo correpresor que reprime la transcripcin de algunos genes
interaccionando directamente con las histonas H3 y H4 (Watson et al., 2000; Davie et al.,
2003; Zhang et al., 2004; Fagerstrom-Billai et al., 2007).

42
La levadura S. cerevisiae es capaz de detectar los niveles extracelulares de glucosa y
generar seales intracelulares que resultan en respuestas adecuadas a las variaciones en la
composicin del medio; la mayora de estas respuestas involucran alteraciones en la expresin
de los genes, una parte de estas alteraciones ocurren por los niveles de trascripcin del
mARN, por la represin o activacin en la trascripcin de diversos genes implicados en la
codificacin de enzimas en el metabolismo de carbono; entre estas se encuentra una
isoenzima hexoquinasa 2 (Hxk2). Cuando las clulas de la levadura estn creciendo en un
medio fermentable compuesto por glucosa, fructuosa o manosa como fuente de carbono, el
gen HXK2 codifica la enzima Hxk2p, la cual cataliza la fosforilacin de glucosa en el carbn
6 en el citosol. Se encontr que la interrupcin del gen HXK2 tuvo un profundo efecto en las
transcripciones de genes relacionados con el ciclo TCA (Ciclo de los cidos tricarboxlicos o
de Krebs), al igual que en la tasa de respiracin, y en la sntesis de ATP. Al realizar la cintica
de produccin de etanol con la mutante hxk2-delta present una menor produccin que la
cepa que no tena interrumpido el gen HXK2. Hxt2p juega un rol especfico durante la
sealizacin de glucosa ya que es requerida para la represin de algunos genes por glucosa, es
especficamente requerida para una fuerte induccin de HXT1 por altas concentraciones de
glucosa y para HXT4 en bajas concentraciones (Belinchon et al., 2006; Westergaard et al.,
2007). Hxk2 depende de la cantidad de Mig1 presente en el ncleo, Moreno et al. (2005)
analizaron la interaccin tanto in vivo como in vitro de Hxk2-Mig1; encontraron que el
complejo es necesario para la translocacin de Mig1 al ncleo. Dilucidaron que el mayor
funcionamiento de Mig1 en inhibir la funcin de la proteinkinasa Snf1 cuando la bloquea por
fosforilacin. Mig1 en un factor involucrado en la represin transcripcional de glucosa, que
tiene una secuencia especifica de unin al ADN y es regulado por SNF1 (serinprotena/treonin
quinasa) y GLC7 fosfatasa (Nehlin et al., 1990; Verma et al., 2005). De la Cera et al. (2002)
demostraron que HXK2 Y MED8 estn asociados fisiolgicamente ya que ambas protenas
Hxk2p y Med8p se encuentras interaccionando juntas en las uniones con los segmentos de
DNA que contienen los sitios MED8, concluyeron que Hk2p opera a travs del sitio MED8
por interaccin con Med8p, en la traduccin en la ruta de sealizacin de glucosa en
Saccharomyces cerevisiae. MED8 es una subunidad mediadora del complejo de la ARN
polimerasa II cuando acta como represor previene que la polimerasa se una al promotor,
cuando acta como activador se une a la polimerasa e incrementa la afinidad con el promotor
o simula la transicin de cerrado a abierto complejo promotor-polimerasa (en la burbuja de
trascripcin en la cual la doble hlice de ADN se une para facilitar el inicio de la trascripcin)
(Kornberg et al., 2005; Westergaard et al., 2007). Otra protena que participa en el proceso
43
inhibidor de los genes represivos es Reg1p, una protena magnesio dependiente serin-treonina
fosfatasa (AMD fosfatasa) contiene una subunidad cataltica de 38 kDa y una subunidad
moduladora de 23KDa, tiene actividad fosfatasa. Reg1p interacciona fuertemente con Glc7p,
una proteinfosfatasa tipo-1 que participa en diferentes procesos que incluyen represin de
glucosa, crecimiento celular y acumulacin de glicgeno. Reg1 interacciona a travs de Glc7p
con el dominio kinasa de Snf1p resultando la desfosforilacin e inactivacin de Snf1p y de
algunos genes involucrados en la represin de glucosa. Esta interaccin juega un rol
importante en el transporte de Fbp1p (fructosa 1-6 bifosfatasa) como intermediario de
importacin y degradacin de las vesculas a las vacuolas durante la induccin de glucosa
(Tung et al., 1992; Cui et al., 2004; Kenneth et al., 2004).

5.6. La regulacin de los genes HXT1 y HXT3 por glucosa/fructosa

La forma en la que los genes HXT son regulados transcripcionalmente, esto es por
protenas que se unen a secuencias reguladoras de ADN, en respuesta a glucosa es consistente
con su funcin de alta o baja afinidad. (Ozcan et al., 1999; Reifenberger et al., 1997.). Estos
genes exhiben diferentes tipos de regulacin por glucosa: El gen HXT1, localizado en el
cromosoma VIII, (Figura 6) se expresa en concentraciones mayores al 1% de glucosa o
fructosa; la expresin mxima de este gen es durante la fase lag y la fase temprana-
exponencial de crecimiento de la levadura (Ozcan et al., 1995; Greatrix et al., 2006). La
prdida del gen HXT1 resulta en la disminucin del transporte de glucosa y manosa pero no
de fructosa, sugiere que esta protena puede ser especfica para las aldohexosas. Se sabe que
Hxt1p funciona como transportador de baja afinidad para xilosa, cerca de 10 veces ms que
para glucosa (Lewis et al., 1991; Saloheimo et al., 2007). La secuencia de HXT1 es de 1,707
nucletidos, posee un marco de lectura abierto que codifica para 569 aminocidos y una
protena de 64,044 Da. La protena Hxt1 es altamente hidrofbica (de acuerdo al anlisis de
hidrofobicidad de Kyte-Doolittle) contiene dos grupos de seis dominios hidrofbicos
separados por un giro de 68 aminocidos hidrofbicos, una regin con 59 aminocidos
hidrofilicos N-terminal y 58 aminocidos del dominio C-terminal (Lewis et al., 1991), esta
protena es la nica que tiene 200 sitios de glucosilacin, cuatro sitios hipotticos de
glucosilacin estn situados en la regin N-terminal Asn
2,14,36,42
y uno ms en TM5 Asn
277
.
Esta protena no contiene motivos PEST (sitios potenciales proteolticos de unin,
Szkutnickaet al., 1989; Lewis et al., 1991). Como se muestra en la figura 6, Rgt1 es represor
de la expresin de HXT1 en ausencia de glucosa. En presencia de glucosa Rgt1 es
44
hiperfosforilado y disociado del complejo represor formado por las protenas Ssn6p y Tup1p,
esto requiere de la presencia de la protena Grr1p (Ozcan et al., 1999; Flick et al., 2003;
Ferrer et al., 2004). Igualmente en presencia de glucosa por un mecanismo aun desconocido la
protena Hxk2 interacciona con la protena Reg1p produciendo una fuerte induccin del gen
HXT1 (Ozcan et al., 1999; Belinchon et al., 2006; Westergaard et al., 2007). HXT3 es un
gen que induce un transportador de glucosa de baja afinidad Hxt3p inducido por bajas o altas
concentraciones de glucosa. La presencia de glucosa por si sola induce la expresin de HXT3
cerca de 10 veces con un valor de Km de 28.65 a 6.8 mM. Est reportado que la expresin de
HXT3 es mxima cuando las clulas estn en fase estacionaria (Ozcan et al., 1995, 1999;
Maier et al., 2002). HXT3 codifica por una protena de 567 aminocidos con una masa
molecular de 62 KDa; tiene cuatro secuencias TATA (-111, -177, -265 y -280); el anlisis de
hidrofobicidad de la protena predice que contiene 12 dominios transmembranales; una regin
hidroflica entre TM6 y TM7 de 68 aminocidos (Ko et al,. 1993).

Figura 6. HXT1 Induccin de la transcripcin solo por
alta concentracin (Ozcan et al., 1995).

45
Como se muestra en la Figura 7, Rgt1 inhibe la expresin de los genes HXT en ausencia
de glucosa. La protena Grr1p es requerida para la inhibicin de la funcin de Rgt1. La seal
de glucosa intracelular generada por Snf3 (alta concentracin de glucosa) y Rgt2 (baja
concentracin de glucosa) es responsable de la inhibicin de Rgt1 por Grr1, adems de la
induccin y la expresin de HXT3 (Ozcan et al., 1995, 1999). Ko et al. (1993) encontraron
que al restaurar los genes HXT1 y HXT3 en clulas mutadas fueron capaces de crecer en
condiciones extracelulares bajas en potasio (7mM). En una fermentacin alcohlica por S.
cerevisiae la glucosa tiene una tasa mayor de consumo que la fructosa, como en la mayora de
las levaduras industriales usadas en vinicultura, quedando una alta discrepancia entre el
consumo de las cantidades de las dos azucares, por lo que la habilidad de la levadura para
fermentar la fructosa es de importancia crtica para mantener la fermentacin hasta el final del
proceso (Bertheles et al., 2004; Guillaume et al., 2007).

Figura 7. HXT3 Induccin de la trascripcin por
glucosa independiente de la concentracin de azcar
(Ozcan et al., 1995).

46
Luyten et al. (2002) encontraron que Hxtp1 y Hxtp3 tienen un rol predominante en las
condiciones enolgicas debido a los altos contenidos de glucosa y fructosa, Hxt1p tiene una
funcin importante durante el inicio de la fermentacin, mientras que ha sido evidenciado que
Hxt3 es el nico transportador que asegura el perfil normal de fermentacin, a dems se
expresa durante todas las fases y presuntivamente responsable de la capacidad de algunas
levaduras de consumir fructosa. Estudios en la levadura Fermichamp, caracterizada como
fructoflica ya que la diferencia entre el consumo de glucosa y fructosa es mucho ms
pequeo, revelaron que en el gen HXT3 existen 38 mutaciones en la regin codificante, 10 de
los cuales son resultado de sustituciones, encontrando que estas se encuentran en la regin
transmembranal nueve y diez (TM9 y TM10) (Guillaume et al., 2007). El flujo metablico en
la fermentacin de la fructosa es muy similar al de la glucosa como lo hemos mencionado
anteriormente y el transporte del azcar a travs de la membrana es el primer factor en la
diferencia de fermentacin entre las dos azucares; la segunda causa de discrepancia son los
pasos de fosforilacin ya que la glucosa despus del transporte es fosforilada por tres enzimas,
la glucoquinasa, la hexoquinasa 1 y la hexoquinasa 2 mientras que la fructosa solo es
fosforilada por la hexoquinasa 1 y la hexoquinasa 2; otro factor importante en el transporte
son las propiedades fisicoqumicas de los azucares, la glucosa es transportada en forma de
piranosa y la fructosa en forma de furanosa (Colville et al., 1993; Bertheles et al., 2004).

En conclusin, la habilidad de degradar el azcar a etanol y dixido de carbono (CO
2
) de
la levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada por los humanos desde
hace miles de aos en la fermentacin de bebidas alcohlicas. A diferencia de la micoflora
que interviene en el proceso de produccin de vino, las levaduras responsables de la
fermentacin alcohlica del mezcal no han sido completamente identificadas ni caracterizadas
metablicamente, ya que el proceso es ms bien artesanal; sin embargo, se sabe que la especie
S. cerevisiae, al igual que en el proceso de vinificacin, es la ms productiva. A nivel
cientfico y gentico la complejidad del sistema de transporte de azcares no ha sido
estudiado durante la obtencin de mezcal, por lo tanto tampoco sus consecuencias a nivel del
proceso de elaboracin, mejoramiento y optimizacin de los procesos de produccin, para
realizar la bsqueda de cepas de levaduras con capacidades metablicas interesantes desde el
punto de vista de utilizacin y aprovechamiento de residuos agroindustriales.

47
El presente trabajo propone analizar en detalle el proceso de fermentacin y obtencin del
mezcal, poniendo nfasis, en primer lugar, en la caracterizacin de los perfiles metablicos de
las levaduras responsables de la produccin de alcohol y metabolitos que le confieren sus
caractersticas organolpticas singulares a ste producto; y en segundo lugar, se analizara
desde el punto de vista molecular la expresin y regulacin de los transportadores de hexosas
involucrados en la asimilacin de la fructosa, que se sabe es el azcar principal de los mostos
de agave, y cuya utilizacin completa determina una mayor productividad del proceso.

La importancia de este trabajo es, en primer lugar, la informacin cientfica que se
generara en cuanto al conocimiento microbiolgico (metablico y molecular) de la
produccin de mezcal, el cual es casi inexistente. En segundo lugar, la industria mezcalera
tamaulipeca se beneficiara, en el corto plazo, con la caracterizacin precisa del componente
biolgico presente en sus procesos, lo cual les permitira tener un mayor control e
implementar esquemas de optimizacin y seguimiento de sus procesos. A mediano y largo
plazo podran contar con un inculo preciso y nico que les garantice la calidad de su
producto, adems de la posible aplicacin de cepas especficas en la utilizacin del agave y
otros subproductos agrcolas con una alta concentracin de fructosa.

48

6 MTODOS

6.1. Aislamiento de levaduras

6.1.1. Diseo del estudio y tamao de la muestra

La poblacin a estudiar fueron 17 aislamientos (de 103 originalmente aislados) obtenidos
de la mezcalera El Palmar del Sr. Emilio Lozoya, situada en San Carlos (Tamaulipas,
Mxico), que se ubica a una altitud 609 m y con coordenadas N 24 43.241 y W 98 52.934.
La toma de muestra se efectu en el horno de cocimiento, directamente de la pared del equipo
y agave cocido; el trapiche (molino) al rea de molienda, mostos y bagazo de agave; y en las
diversas etapas de los mostos en fermentacin (Figura 8). Como control se utiliz la cepa
Fermichamp (DSM) una cepa de vino industrial con capacidad fructoflica.

6.1.2. Tratamiento de la muestra

En cada punto (Figura 8) las muestras fueron homogeneizadas; en el caso de la muestra de
consistencia solida se suspendieron 10 g en 10 mL de solucin salina al 0.9%, en las muestras
liquidas se analizaron 15 mL. En ambos casos se realizaron diluciones seriadas con el mismo
diluyente y fueron sembradas en medio AN (Agar nutritivo, DIFCO, Francia), YEPD
(Extracto de levadura 5 g/L; peptona 3 g/L; glucosa 20 g/L; agar 20 g/L con antibitico
(Kanamicina de SIGMA, Alemania). Los aislados obtenidos fueron cultivaron en medio
YEPD y conservadas en glicerol al 86% mantenindose a -70 C.
49

Figura 8. Puntos muestreados en la mezcalera El
Palmar. A) Pias en coccin. B) Trapiche. C) y D)
Mostos en fermentacin.

50
6.1.3. Clasificacin microscpica

Se realizaron frotis en fresco de los aislados de mostos de mezcal con el fin de observar la
morfologa celular. La observacin se realizo primero con el objetivo 40X y posteriormente se
tomaron imgenes de las clulas con campo claro con el objetivo ocular 100X, en un
microscopio BX-51 (Olympus, Japn), y se adquirieron con una cmara de video Hitachi
KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. Las clulas fueron clasificadas y agrupadas por
su morfologa redonda u ovalada.

6.2. Identificacin molecular

6.2.1. Extraccin de DNA

Se utiliz el protocolo modificado de extraccin de ADN propuesto por Raeder y Broda
(1985). Se recolectaron 50-80 mg de clulas de levadura en un tubo Eppendorf estril de 1.5
mL, se sumergieron en nitrgeno liquido por 20 min y se maceraron con pistilos plsticos por
5 min. Fueron agregados 500 L de buffer de extraccin (200 mM Tris HCL pH 8.5; 250 mM
NaCl 25 mM EDTA, 0.5 % SDS) se homogeneiz la muestra e incub por 5 min a
temperatura ambiente. Para la separacin de las fases acuosa, interfase y orgnica se le aadi
500 L de fenol-cloroformo (50:50 v/v a 4 C) y se mezcl en el vortex a mxima velocidad
por 5 min. La muestra se centrifug a 13000 rpm por 30 min y la fase acuosa se transfiri a un
tubo Eppendorf limpio, donde se adicionaron 400 mL de cloroformo (4 C), se mezcl
minuto en vortex y se centrifug durante 5 min. Se recuper el sobrenadante en un tubo
Eppendorf estril y se trat con 8L de RNAasa (PROMEGA, Estados Unidos) se incub
por 30 minutos a 37 C en un block caliente. Posteriormente se le adicionaron 500 mL de
isopropanol fro (-20 C). Para ayudar a la precipitacin de los cidos nucleicos la muestra se
coloc a -20 C durante 1 h. Los cidos nucleicos se recuperaron centrifugando a 10,000 rpm
durante 10 min y se colocaron en un tubo Eppendorf, realizando un lavados con etanol 70
%. La pastilla se suspendi en 50 L de agua mili-Q estril. El DNA obtenido se visualiz en
un gel de agarosa al 1.0 %, teido con SyberGold 10 X (Figura 9). Este se conserv a -20
C, para su uso en las amplificaciones de PCR.
51

Figura 9. Gel agarosa al 1.5 %, tenido con SyberGold
10 X. ADN de aislados de mostos de mezcal; en la tabla
IV se especifica la identificacin de las muestras. 18
ADN de cepa control FECHA (Fermichamp).

La cantidad de ADN obtenida se determin por su absorbancia a 260 nm en un espectrmetro
GBC (Cintra 10e.), y aplicando la frmula siguiente:

[ADN] = 50 * A260nm * FD [g/ml]

Donde el factor de dilucin se calcul como:

FD = (Vol. Agua miliQ) + (Vol.de la muestra) / Vol. de la muestra

La calidad del ADN se cuantific mediante el valor de la relacin de absorbancia a 260 y
280 nm de acuerdo a la siguiente frmula:

Calidad de ADN= A260 / A280

Donde un valor entre 1.8 y 2 indica que la solucin est libre de protena, por lo que se
tiene una buena calidad de ADN. El ADN se visualiz en un gel de agarosa por 1 h. El ADN
obtenido fue suspendido en 100 l de TE 1X. y fue conservado a 4 C, para su empleo en las
amplificaciones por PCR.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
52
6.2.2. Amplificacin de los genes ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 y 26S por PCR

En la reaccin de PCR para la amplificacin de los segmentos ITSs se utilizaron los
oligonucletidos reportados por White et al. (1990), ITS1 (5
TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (5 TCCTCCGCTTATTGATATGC); esta se realiz
en un volumen final de 25 L, utilizndose 1L de ADNg (50 ng), 2.5 L de Buffer (10 X),
1.5 L de cloruro de magnesio (50m L), 1 L de cada uno de los oligonucletidos (10 M),
0.5 L de dNTPs (10 mM), 0.5 L de la enzima Taq DNA polimerasa (5 U/L) y
completando el volumen a 25 L con agua MiliQ estril. El programa en el termociclador
incluy un ciclo inicial de 5 min a 94 C y 35 ciclos con temperaturas de desnaturalizacin
(94 C/ 30 seg), alineacin (59 C / 30 seg) y alargamiento (72 C/ 30 seg). Finalmente se dio
un paso de extensin final de 7 min a 72 C. El producto amplificado fue procesado mediante
electroforesis en gel. El segmento ribosomal 26S se amplific con los oligonucletidos NL1-
(5 GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG) y NL4 (5 GGTCCGTGTTTCAAGACGG);
esta se realiz en un volumen final de 25 L, utilizndose 1 L de ADNg (50 ng), 2.5 L de
Buffer (10 X), 1.5 L de cloruro de magnesio (50m L), 1 L de cada uno de los
oligonucletidos (10 M), 0.5 l de dNTPs (10 mM), 0.5 L de la enzima Taq DNA
polimerasa (5 U/L) y completando el volumen a 25 L con agua MiliQ estril. El programa
en el termociclador incluy un ciclo inicial de 5 min a 94 C y 35 ciclos con temperaturas de
desnaturalizacin (94 C/ 30 seg), alineacin (63 C/ 30 seg) y alargamient0 (72 C/ 30 seg).
Finalmente se dio un paso de extensin final a 7 min a 72 C. El producto amplificado fue
procesado mediante electroforesis en gel.

6.2.3. Digestin enzimtica del segmento ribosomal ITSs

Los segmentos ITSs amplificados fueron sometidos a un proceso de restriccin con las
enzimas EcoRI (Promega). A 10 L de la reaccin de PCR le agreg 12 u de enzima, a lo cual
se le adicion el buffer 10 x correspondiente a la enzima en una concentracin final de 1 x; la
mezcla de reaccin fue ajustada a 20 L con agua MiliQ estril. Se centrifug 15 segundos y
se mezcl suavemente. Finalmente se incub por 6 horas a 37 C. El producto de la digestin
se visualiz en un gel de agarosa al 2.5 %. El gel fue fotografiado y los patrones de restriccin
comparados entre si. Los productos amplificados fueron procesados mediante una
electroforesis en gel de agarosa al 1 %, teido con SyberGold 1 X, en regulador Tris-
borato-EDTA 1% (para un litro, 108 g trizma-base, 55 g cido brico, 40 mL EDTA 0.5 M
53
pH 8) a 100 V por 45 min. Los geles se documentaron en fotografas bajo luz UV a 320 nm
con un digitalizador de imgenes Gel Doc (Kodak, Estados Unidos).

6.2.4. Amplificacin de los genes HXT1 y HXT3

En la amplificacin del gen HXT1 (Figura 10) se usaron oligonucletidos reportados por
Ramakrishnan et al. (2006), HXT1F (5 GTGAAAGTCAAGTGCAACCC) y HXT1R (5
CGGTCAACGGTGTACGAG) adems los oligonucletidos diseados en nuestro laboratorio
JAHXT1F (5 ATGAGAGCCGCTGGTACTGCATCT) y JAHXT1R (5
CTATTTCCTGCTAAACAAACTCTTG).

Figura 10. Gel de agarosa al 1 %, teido con
SyberGold 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados
Unidos). Amplificacin del gen HXT1 de aislados de
mostos de mezcal.

Para la obtencin del gen HXT3 (Figura 11) se utilizaron los oligonucletidos HXT3F (5
GATTTCCAAGCTGAGGCCG) y HXT3R (5 ACATGGCCGGCTTACCAGTG)
(Ramakrishnan et al., 2006); adems de un par de oligonucletidos diseados en este trabajo,
FHXT3J (5-ATTTCTGAAGTCGCTCCTAAGG) y RHXT3J (5 -
ACATAACAGCAGACCATACC).

54

Figura 11. Gel de agarosa al 1 %, teido con
SyberGold 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados
Unidos). Amplificacin del gen HXT3 de aislados de
mostos de mezcal. 1=Oligonucletidos diseados por.
2=Oligonucletidos diseados por el Laboratorio de
Biotecnologa Industrial.

La reaccin de amplificacin para los cuatro pares de oligonucletidos se realiz en un
volumen final de 25 L, utilizndose 1L de ADNg (50 ng), 2.5 L de Buffer (10 X), 1.5 L
de cloruro de magnesio (50m L), 1 L de cada uno de los oligonucletidos (10 M), 0.5 l
de dNTPs (10 mM), 0.5 L de la enzima Taq DNA polimerasa (5 U/L) y completando el
volumen a 25 L con agua MiliQ estril. El programa que se utiliz consisti de 1 ciclo de 5
min a 94 C y 35 ciclos de 30 seg a 94 C, 30 seg a 63 C y 30 seg a 72 C. Finalmente se dio
un paso de extensin final a 7 min a 72 C. Los productos de la amplificacin fueron
visualizados en gel de agarosa al 1 %.

La reaccin de PCR obtenida fue purificada por columnas con el kit Wizard SV Gel and
PCR for Clean-up System (PROMEGA, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del
fabricante. La secuenciacin se realizo con el kit Sequence BigDye Terminator v3.1 Cycle
Sequencing (Applied Biosystems, Estados Unidos). La reaccin de PCR de secuenciacin fue
purificada con el kit Big Dye XTerminator
TM
Purification (Applied Biosystems, Estados
Unidos).

6.2.5. Identificacin molecular por secuenciacin

La reaccin de PCR obtenida en la amplificacin de los genes ITSs, 26S, HXT1 y HXT3
fue purificada por columnas con el kit Wizard SV Gel and PCR for Clean-up System
(PROMEGA, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciacin se
55
realiz con el kit Sequence BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied
Biosystems, Estados Unidos). La reaccin de PCR de secuenciacin fue purificada con el kit
Big Dye XTerminator
TM
Purification (Applied Biosystems, Estados Unidos). Se utilizo el
equipo secuenciador ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Estados Unidos). Las
secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa BioEdit Sequence Aligment Editor
(Hall, 1999) y comparadas en la base de datos depositadas en el NCBI usando el BLAST
(Basic local alignment search tool).

6.2.6. Construccin de dendogramas

En el anlisis filogentico de las secuencias 26S e ITSs obtenidas se utiliz el mtodo de
agrupamiento promedio de Neighbor-Joining con un Bootstrap de 1000 repeticiones y
para las distancias de evolucin se utiliz el modelo Nucleotide Maximum Composite
Likelihood mxima similitud, con el objeto de ver las relaciones entre aislamientos.

6.3. Fermentaciones

6.3.1. Medios de cultivo

Con el fin de disminuir la fase de adaptacin del microorganismo al medio en el inicio de
la fermentacin, las levaduras se activaron en un pre-cultivo (Taillander et al., 2006). Esta
etapa se realiz en matraz erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 100 mL de medio (Tabla II), el
pH se ajust a 5 con una solucin de cido ortofosfrico el medio fue esterilizado en
autoclave a 120 C durante 20 minutos. El microorganismo se incub a 250 rpm a 30 C por
12 horas. Se cuantific el nmero de clulas con el fin de determinar el volumen necesario
para iniciar la cintica a 3x10
6
clulas por mililitro.

56
Tabla II.
Composicin de medios de cultivo

Reactivo
Precultivo Medio 1 Medio 2 Medio 3
(g/L)
Extracto de levadura 1.0 1.0 1.0 1.0
KH
2
PO
4
5.0 5.0 5.0 5.0
MgSO
4
(H
2
O)
7
0.4 0.4 0.4 0.4
(NH
4
)
2
S0
4
2.0 2.0 2.0 2.0
Glucosa 20.0 90.0 10.0 100.0
Fructosa 0.0 10.0 90.0 100.0

Los aislados fueron evaluadas en los medios uno y dos con la composicin indicada en las
Tabla II (Taillander et al 2006). Los aislados con mejores caractersticas en consumo de
azcar y produccin de etanol fueron evaluados en el medio 3 (Tabla II). En todos los casos
ajustando el pH a 5.

Las condiciones de la cintica de crecimiento se llevo a cabo en matraz Erlenmeyer de
500mL conteniendo 300 mL de medio a 30 C y 125 rpm. La cintica de fermentacin se
realiz en matraces de 1 L con 500 mL de medio de cultivo y un inculo inicial de 3 X10
6
clulas /mL, a una temperatura de 30C.

6.3.2. Cuantificacin de la biomasa.

6.3.2.1. Espectrometra

La densidad ptica (DO) fue evaluada a 600 nm en un espectrofotmetro modelo Hitachi*
U-2000TM equipo monocromtico Seya-Namioka
. Las medidas se realizaron en cubetas de

2 mm de trayecto ptico; se efectuaran diluciones a partir de DO> 0.8 con el fin de mantener
la tendencia lineal.

57
6.3.2.2. Peso seco

La concentracin celular en g/L fue determinada por el mtodo de peso seco, esta tcnica
permite la estimacin de la biomasa total. Consisti en tomar un volumen conocido de la
muestra para centrifugarlo a 13000 rpm, por 10 minutos a 10 C. El paquete celular fue
lavado dos veces con agua desionizada para eliminar restos del medio de cultivo,
posteriormente se llev peso constante utilizando un analizador de humedad (modelo HA60;
Precisa, Zurich, Suiza). Este mtodo se llev en paralelo con el de espectrometra, con el fin
de obtener la correlacin entre DO
600nm
y concentracin en biomasa (peso seco).

6.3.2.3. Cuenta celular

Este mtodo consiste en la determinacin de la concentracin celular utilizando un
hematocmetro (cmara de Neubauer o d Thoma) visualizando en el objetivo 40X de un
microscpico (BH-2 Olympus, Japn).

6.3.3. Anlisis de azcares

6.3.3.1. Determinacin de glucosa por un mtodo enzimtico

El mtodo utilizado por el instrumento YSI (YSI Life sciences, Estados Unidos) consiste
en la determinacin de glucosa por medio de la enzima glucosa-oxidasa inmovilizada entre
dos membranas, una de policarbonato y otra de celulosa acetato. El sustrato es oxidado al
entrar en contacto con la enzima produciendo perxido de hidrgeno, el cual pasa a travs de
la membrana de celulosa acetato hacia el electrodo de platino. El resultado es la cuantificacin
de la concentracin en el sustrato de acuerdo a la siguiente reaccin:

D-glucosa+O
2

glucosa oxidasa
D-glucono--lactona+H
2
O
2
.

58
6.3.3.2. Determinacin de azucares totales por el mtodo DNS

El mtodo DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico) se realiz comparando los resultados con una
curva patrn de glucosa, con el objeto de obtener la curva correspondiente para determinar los
equivalentes de azucares reductores. La solucin DNS fue compuesta por 8 g de sodio; 5 g de
cido dinitrosaliclico; 150 g de tartrato de sodio y potasio; completando a 500 mL de agua y
evitando su exposicin a la luz; el reactivo puede ser utilizado despus de 15 horas de su
preparacin. El anlisis se efectu en un tubo de ensayo conteniendo 1 mL de reactivo DNS y
1 mL de la muestra a analizar, previamente diluida a la concentracin de la gama patrn (A
partir de una gama de soluciones patrn de glucosa y fructosa equivalente a 0-2 g/L), fue
incubada a 100 C durante 10 minutos; enfriada por 10 minutos en hielo y determin DO
570nm
,
se diluy convenientemente con agua destilada, mientras que si fue demasiado pequea, se
repiti el ensayo pero con una mayor cantidad de solucin de glucosa (por ejemplo 0.2 a 0.3
mL). El mtodo cido 3,5-dinitrosaliclico se basa en la reduccin del DNS (de color
amarillo) por el azcar reductor al cido 3-amino-5-nitrosaliclico (de color rojo), cuya
presencia puede detectarse por lectura de absorbancia en la zona de 540-570 nm (Montreuil et
al., 1986).

6.3.3.3. Cromatografa liquida de alta presin (HPLC)

La cromatografa liquida de alta presin es una tcnica analtica, utilizada para separar e
identificar compuestos mediante intercambio inico, basada en la atraccin electrosttica
entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. El equipo utiliza
una columna de intercambio inico Aminex HPX-87 C de 30 cm de longitud precedida de una
precolumna con un gradiente de interaccin GC 801. Las sustancias resultantes del
metabolismo de la levadura en el proceso de fermentacin en glucosa y fructosa, como
glicerol, cido actico, cido ctrico, cido succnico y etanol fueron evaluadas por HPLC.
Para llevar a cabo el anlisis por HPLC se utiliz una fase mvil preparada con agua miliQ y
acido sulfrico (H
2
SO
4
0.005 M). Las muestras a analizar se centrifugaron a 13000 rpm a
10C y fueron filtradas. La curva de calibracin para los anlisis fue obtenida utilizando la
ecuacin lineal de la recta obtenida con el rea contra la concentracin del compuesto a
analizar, y para todos ellos el cuadrado de coeficiente de correlacin de Person (r
2
) no fue ser
mayor a 0.98.
59
6.4. Cuantificacin del estrs por etanol

Se inocularon 50 mL de medio rico en fructosa (Medio 2) con clulas precultivadas con a
una DO
660nm
=1 (aproximadamente a las 12 horas), se incubaron por 24 horas a 125 rpm y 30
C. De las clulas cultivadas bajo estas condiciones, 25 mL fueron centrifugados a 3000 rpm
(Allegra 6G Centrifugue Beckman Coulter, Japn) por 10 min., se recolectaron y
suspendieron en 25 mL del medio lquido YM (25% Etanol v/v; y en g/L: extracto de malta 3;
extracto de levadura 3; peptona 5; glucosa 10 y agar 20). Se tom 1 mL de muestra a los 0.5,
1.5, 3 y 5 min, cada mililitro se diluyo en 9 mL de solucin Ringer (cada 100 mL contiene
NaCl 0.85g, KCl
2
0.04g, CaCl
2
2H
2
O 0.034 g) las diluciones seriadas de cada muestra se
sembraron por duplicado en YM agar e incubaron por 72 horas a 28 C. (Pina et al., 2003).
Para el control se tomaron 25 mL de clulas, estas fueron centrifugadas, recolectadas y
suspendidas en 25 mL del medio lquido YM sin etanol, 1 mL de muestra se diluyo en 9 mL
de solucin Ringer, se hicieron diluciones seriadas y se sembraron por duplicado en YM agar
e incubaron por 72 horas a 28 C. Se us el conteo de UFC (Unidades Formadoras de
Colonias) como ndice de viabilidad.

6.4.1. Parmetros cinticos

Los valores experimentales obtenidos fueron evaluados en general para cada tratamiento
analizndose los parmetros indicados en la tabla III.

Tabla III.
Parmetros cinticos

Parmetro Unidades
Velocidades
Velocidades de produccin de biomasa (g/L/h): r
x
dX/dt
Velocidades de consumo de substrato (g/L/h): r
s
dS/dt
Rendimientos
Rendimientos de produccin de biomasa por sustrato consumido Yx/s (g/g)
Rendimiento de sustrato Yp/s (g/g)

60
6.5. Anlisis estadstico

Los datos cinticos obtenidos de los tratamientos fueron evaluados estadsticamente por
ANOVA.

61

7 RESULTADOS

De 103 aislamientos iniciales, y basado en su imagen microscpica y macroscpica se
seleccionaron 17 cepas (Tabla IV) con morfologa celular presuntiva de S. cerevisiae.

Tabla IV.
Aislados de levaduras con morfologa redonda

Aislado Observaciones
AN2, 1Y1, 1Y9, AN1, 1Y14,
AN5
Aislamiento realizado a los dos das de inicio
de la fermentacin. Los mostos presentaron
una concentracin de 13.2 Brix.
3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6,
3Y1, 3Y2, 3Y3, 3Y4,3Y5,
3Y8
El aislamiento se realiz al sexto da de
inicio de la fermentacin. Los mostos
presentaron una concentracin de 10 Brix.

7.1. Identificacin molecular de las levaduras

Los aislados se concentraron en cuatro grupos diferentes de acuerdo al patrn de
amplificacin de los segmentos ITSs, A) integrado por 3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y3,
3Y4, 3Y5, 3Y8 y 1AN5 con 750 pares de bases (pb) aproximadamente; B) grupo compuesto
por 3Y1, 1AN2, y 1AN1 con 700 pb aproximadamente; el C) formado por 1Y1, 1Y9 con 650
pb y D) constituido por 1Y14 con cerca de 600 pb (Fig. 12).

62

Figura 12. Gel de agarosa al 1.5% tenido con
SyberGold 10 X. Amplificacin de los segmentos
ITSs aislados con morfologa celular redonda. Agua (C-
) control negativo y M: marcador de 100 pb (Promega,
Estados Unidos).

7.1.1. Anlisis de restriccin del segmento ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 (ARDRA)

Los productos de amplificacin ITSs de todos los aislados fueron sometidos a un proceso
de restriccin con la enzima EcoRI; se encontr que los aislados se agruparon en cinco
ARDRAs diferentes (Fig. 13), constituidos por I) 3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4,
3Y5, 3Y8 y FECHA; perfil II) 3Y1; el III) 1AN2, 1AN1, 1AN5; el IV) 1Y1 Y 1Y9; el V)
1Y14.

Figura 13. ARDRAs de aislados de mostos de mezcal.
Gel de agarosa al 2.5%, teido con SyberGold 10X,
marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos).

63
7.1.2. Amplificacin del segmento ribosomal 26S

La amplificacin del segmento 26S (Figura 14) fue para todos de 750 pb
aproximadamente.

Figura 14. Amplificacin de genes ribosomales 26S.
Gel de agarosa al 2.5%, teido con SyberGold 10 X,
marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos) de las
levaduras de morfologa redonda aisladas de mostos de
mezcal.

7.1.3. Identificacin molecular por los segmentos ribosomales ITSs y 26S

En el anlisis de la secuencia se identificaron cinco grupos de microorganismos, 10
aislados de Saccharomyces cerevisiae, uno Zygosaccharomyces bailii, tres de Torulaspora
delbrueckii, dos de Kluyveromyces marxianus y uno de Pichia mexicana (Tabla V); de los
aislados 3D6 y AN1 solo se obtuvo la secuencia del segmento 26S.

64
Tabla V.
Clasificacin e identificacin molecular de las levaduras aisladas de mostos de mezcal
Aislado Especie Accesin
*1

Identidad
(%)
Accesin
*2

Identidad
(%)
3D2 Saccharomyces cerevisiae JQ824871 100 EF457564.1 99
3D3 Saccharomyces cerevisiae JQ824873 100 AB212257.1 89
3D4 Saccharomyces cerevisiae AB279746 100 AB279746.1 96
3D5 Saccharomyces cerevisiae AF321540 100 AF321540.1 87
3D6 Saccharomyces cerevisiae JQ824876 100 ----------------
3Y2 Saccharomyces cerevisiae JQ824877 100 EF151450.1 98
3Y3 Saccharomyces cerevisiae JQ824872 100 EF457565.1 98
3Y4 Saccharomyces cerevisiae JQ824875 100 AM900396.1 98
3Y5 Saccharomyces cerevisiae JQ824869 100 EU145764.1 97
3Y8 Saccharomyces cerevisiae JQ824874 100 FJ231432.1 99
3Y1 Zygosaccharomyces bailii FM201320.1 99 X84640.1 93
1AN1 Torulaspora delbrueckii FJ468458.1 97 ----------------
1AN5 Torulaspora delbrueckii GQ179981.1 99 FN401197.1 100
1AN2 Torulaspora delbrueckii GQ179981.1 98 AB469378.1 99
1Y1 Kluyveromyces marxianus FJ896140.1 99 FN401197.1 99
1Y9
*
3,1
Torulaspora delbrueckii
*
3,2
Kluyveromyces marxianus
GQ121696.1 97 AY046214.1 98
1Y14 Pichia mexicana EF042032.1 99 EM199966.1 98
*1. 26S. *2. ITS1-5.8S-ITS2. *3.1 por 26S y *3.2 por ITS1-5.8S-ITS2.
65
Al realizar la comparacin por secuencia en el gen 26S el dendrograma (Fig. 15) agrup
genotipos iguales, es decir organismos del mismo gnero y especie destacando la similitud
alcanzada para la unin de 99% para los cinco grupos formados, A) S. cerevisiae, B) T.
delbrueckii, C) Z. bailii, D) K. marxianus, F) y G) P. mexicana.

El anlisis de comparacin por secuencia del segmento ITS1-5-8S-ITS2 (Fig. 16) el
dendrograma agrup A) con una similitud de unin de 81% a los aislados identificados como S.
cerevisiae; B) con 84% de similitud a los aislados identificados como Z. bailii; C) con un 88%
uni a 1AN2 con T. delbrueckii; D) en un clado separ al aislado 1Y9 y lo coloc en medio de
los grupos C y E; E) 91% de similitud agrup a los aislados identificados como T. delbrueckii
(AN5) y K. marxianus (1Y1); y F) con 97% de similitud a P. mexicana (1Y14).

Cabe mencionar que en el dendrograma se expresan las diferencias entre clases o grupos con
un intervalo de cero a uno, por lo que para la interpretacin de los resultados se calcul el
complemento (la similitud) y se expres en porcentaje, es decir, se analiz la homologa
molecular detectada entre y dentro de genotipos.

66

Figura 15. rbol filogentico que agrupa a las levaduras comparando la secuencia nucleotdica
de la regin ribosomal 26S. Este rbol est basado en el mtodo Neighbor-Joining, un
bootstrap de 1000. La distancia evolutiva fue realizada usando el Mtodo Maximum Composite
Likelihood usando nmero de bases de sustitucin por sitio para el tamao de los clados. El
grupo de salida fue P. mexicana. El anlisis filogentico se llevo a cabo en MEGA4.
3D2
3Y4
3Y8
3Y3
3D5
3D4
3D3
3D6
3Y5
3Y2
S. cerevisiae (GU080049)
S. cerevisiae (FJ 972215)
S. cerevisiae EF192587)
S. cerevisiae (HM191656)
S. cerevisiae (HM191650)
S. cerevisiae (FN393977)
1AN2
1AN1
1AN5
T. delbrueckii (FN393992)
T. delbrueckii (GU373796)
T. delbrueckii (FR691642)
T. delbrueckii (GQ121628)
3Y1
Z. bailii (GU080052)
Z. bailii (AJ 966343)
Z. bailii (FM201320)
Z. bailii (AJ 966522)
1Y1
1Y9
K. marxianus (GU565207)
K. marxianus (FJ 896140)
K. marxianus (EU439450)
P. mexicana (EF042031)
1Y14
P. mexicana (DQ409143)
P. mexicana (FM180550)
Pichia sp (AM911003)
66
74
99
99
99
93
50
99
72
92
99
67

Figura 16. rbol filogentico que agrupa a las levaduras comparando la secuencia nucleotdica
de la regin ribosomal ITS1-5.8S-ITS2. Este rbol est basado en el mtodo Neighbor-Joining,
un bootstrap de 1000. La distancia evolutiva fue realizada usando el Mtodo Maximum
Composite Likelihood usando nmero de bases de sustitucin por sitio para el tamao de los
clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El anlisis filogentico se llevo a cabo en MEGA4.

3D3
S. cerevisiae (FN393995)
S. cerevisiae (GQ376091)
S. cerevisiae (AB279744)
S. cerevisiae (FM199962)
S. cerevisiae (EU145764)
3D5
3D4
3Y2
3Y3
3D2
3Y4
3Y5
3Y8
Z. baili (X84732)
Z. bailii (FJ 914883)
Z. bailii (AY796194)
3Y1
Z. bailii (DQ872858)
Z. bailii (X84640.1)
Z. bailii (AY046191)
T. delbrueckii (AB469378)
1AN2
1Y9
T. delbrueckii (DQ249191)
1AN5
1Y1
T. delbrueckii (FM173070)
K. marxianus (AB480229)
K. marxianus (EF568057)
T. delbrueckii (AY939806)
T. delbrueckii (AB480229)
P. mexicana (EF568069)
P. mexicana (AB054110)
1Y14
54
77
97
88
91
74
96
55
69
84
54
81
51
68
7.2. Caracterizacin de la productividad de las levaduras

En la primera evaluacin se seleccionaron y caracterizaron 11 microorganismos de acuerdo a
la imagen micro, macroscpica y perfiles de ARDRA, este anlisis se dividi en dos grupos, 1)
aislados no Saccharomyces y 2) aislados Saccharomyces cerevisiae. Se evaluaron los aislados
identificados como S. cerevisiae cinticamente evaluando crecimiento y consumo de azucares
reductores en dos medios sintticos, uno rico en glucosa M1 (glucosa:fructosa 9:1) y el otro rico
en fructosa M2 (glucosa:fructosa 1:9). Posteriormente se evaluaron solo al inicio y al final de la
fermentacin las caractersticas productivas de todos los aislados identificados como S. cerevisiae
con el fin de seleccionar los microorganismos S. cerevisiae con una alta actividad fructoflica.

7.2.1. Caracterizacin del rendimiento de las levaduras en medio rico en glucosa (M1)

Los microorganismos identificados como S. cerevisiae (Fig. 17) fueron caracterizados en el
medio M1 (fructosa:glucosa 1:9), se encontr que los aislamientos 3Y2, 3Y4 y 3Y8 presentaron
mayor crecimiento a las 72 horas, 3D6 y 3D3 fueron las que menor crecimiento tuvieron.

En el consumo de azcares reductores (Fig. 18) se observaron tres patrones de
comportamiento, los aislamientos 3Y4 y 3Y8 a las 72 horas fueron los que menos azcar residual
dejaron (5 g/L de azcar residual en el medio aproximadamente), seguidos por FECHA, 3Y2 y
3Y6 (23 -29 g/L de azcar residual aproximadamente) y 3Y5, 3D4 y 3D2 (58-059 g/L
aproximadamente). Al final de la fermentacin (120 horas) en M1 (Tabla VI), los que mayor
rendimiento presentaron en cuanto a consumo de sustrato fueron Fermichamp, 3Y2, 3Y8 y
3Y4; las cepas que terminaron la fermentacin 3Y8, 3Y4 y Fermichamp ya que dejaron una
concentracin menor a 2 g/L de azcar residual, el resto de las cepas si fermentaron la glucosa
pero dejaron una alta residualidad (menor del 50%) en el medio.

En cuanto a los parmetros cinticos (Tabla VI), 3Y4, 3Y8 y FECHA tuvieron la mayor
velocidad de consumo de sustrato en M1; los que mayor velocidad en la produccin de biomasa
fueron 3Y4 y 3D2, pero 3D3, 3D6 y 3D5 fueron las que ms biomasa produjeron al final de la
fermentacin (2.9 a 3.71 g/L). En cuanto a etanol 3D4, 3Y3 y 3Y5 presentaron mayor
69
rendimiento pero 3Y3, 3Y4 y Fermichamp fueron las que ms g/L produjeron. La mayor
produccin de acido actico la tuvieron 3Y8 y 3D2; 3D4 y 3D6 mayor concentracin de glicerol;
3D4 y Fermichamp mayor concentracin de acido lctico.

Figura 17. Cinticas de crecimiento por densidad ptica de levaduras S. cerevisiae aisladas de
mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9).
0
2
4
6
0 24 48 72
D
O
6
0
0

n
m

Tiempo (h)
3D2 3D3 3D6 3Y2 3Y4 3Y8 FCHA
70

Figura 18. Cinticas de porcentaje (%) de consumo de azcar por levaduras S. cerevisiae
aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9).
0
20
40
60
80
100
0 12 24 36 48 60 72
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e

(
%
)

d
e

a
z
c
a
r

r
e
s
i
d
u
a
l

Tiempo (h)
3D2 3D4 3D6 3Y2 3Y3 3Y4 3Y5 3Y8 FCHA
71

Tabla VI.
Parmetros cinticos de los aislamientos de S. cerevisiae en medio rico en glucosa (M1) a las 120 horas
Aislado
Velocidad de
consumo de
azcares
Velocidad de
produccin de
biomasa
Y
Etanol/azcar

Biomasa
Azcar
residual
Etanol
Acido
actico
Glicerol
Acido
lctico
g/L*h g/L*h g/g g/L
3D2 0.67+0.00 0.09+0.00 0.40+0.00 2.78+0.45 19.70+1.60 31.72+0.10 0.83+0.00 5.34+0.24 0.75+0.10
3D3 0.76+0.00 0.01+0.00 0.40+0.00 3.71+0.09 9.10+1.40 36.42+0.90 0.47+0.03 4.86+0.25 0.59+0.01
3D4 0.57+0.00 0.03+0.00 0.48+0.00 2.88+0.29 31.36+1.40 36.89+2.20 0.73+0.15 7.61+2.08 1.39+0.36
3D5 0.64+0.00 0.00+0.00 0.42+0.00 3.30+0.00 22.91+1.20 32.20+1.60 0.46+0.01 4.27+1.22 0.57+0.01
3D6 0.75+0.00 0.02+0.00 0.40+0.00 3.34+0.01 10.00+1.60 35.56+1.30 0.62+0.02 5.82+0.40 0.47+0.06
3Y2 0.70+0.00 0.01+0.00 0.36+0.00 2.89+0.16 15.83+1.20 35.38+0.00 0.70+0.32 4.07+0.48 0.67+0.52
3Y3 0.57+0.01 0.03+0.01 0.46+0.01 2.63+0.03 31.36+3.10 39.86+0.20 0.82+0.01 4.03+1010 0.79+0.18
3Y4 0.82+0.00 0.04+0.00 0.44+0.00 2.80+0.00 1.52+1.40 43.90+5.20 0.74+0.03 3.59+0.32 0.00+0.00
3Y5 0.43+0.01 0.03+0.01 0.45+0.01 2.90+0.03 45.95+1.90 34.64+3.20 0.47+0.00 1.70+0.53 0.76+0.00
3Y8 0.82+0.00 0.03+0.00 0.32+0.00 2.10+0.10 1.41+1.20 31.83+1.90 1.26+0.64 3.50+0.12 0.52+0.06
FECHA 0.81+0.00 0.01+0.00 0.42+0.00 2.89+0.04 1.68+1.20 42.31+0.00 0.46+0.00 3.85+0.00 1.33+0.09
FECHA: Cepa de referencia Fermichamp
72
7.2.2. Caracterizacin del rendimiento de las levaduras en medio rico en fructosa (M2)

Los microorganismos identificados como S. cerevisiae fueron caracterizados en el medio M2
(fructosa:glucosa 9:1) De los aislados evaluados los que tuvieron mayor crecimiento fueron 3Y2,
3Y4 y 3Y8 (Fig. 19) y los que tuvieron menor crecimiento en este medio fueron 3D2 y Fecha.

En el consumo del sustrato a las 72 horas (Fig. 20) se observaron tres tipos de
comportamiento, los aislamientos 3Y8, 3Y4 a las 72 horas fueron los que menos azcar residual
dejaron (5g/L aproximadamente), seguidas por FECHA, 3D6 y 3Y2 (50 g/L aproximadamente)
y las que mayor residualidad dejaron fueron 3Y5, 3D4 y 3D2 (ms de 60 g/L).

En M2 (Tabla VII) los aislados con mayor velocidad de consumo de sustrato 3Y8, 3D5 y
3D3; pero las que dejaron menor concentracin de azcar fueron 3D3, 3Y4 y 3Y8 (menos de 2
g/L aproximadamente). El aislado que mayor velocidad en la produccin de biomasa tuvo fue
3Y5 y las que ms biomasa produjeron al final de la fermentacin fueron 3D3, 3D5 y 3Y4 (3.06
a 3.78 g/L). Los aislados que rendimiento en produccin de etanol fueron 3Y3, 3Y5 y FECHA y
adems fueron los que produjeron la mayor concentracin (38.72 a 42.84 g/L). La mayor
produccin de acido actico la tuvieron 3D3; 3D5 y 3D6 (5.66 a6.50 g/L); mayor concentracin
de glicerol; 3Y5 y 3Y8 (4.21- 4.37g/L) la mayor concentracin de acido lctico.3Y5 y FECHA
(1.02-1.32 g/L).

73

Figura 19. Cinticas de crecimiento por densidad ptica de levaduras S. cerevisiae en el medio
M2 (fructosa:glucosa 9:1).

Figura 20. Cinticas de porcentaje (%) de consumo de azcar por S. cerevisiae en el medio M2
(fructosa:glucosa 9:1).

0
2
4
6
0 24 48 72
D
O
6
0
0

n
m

Tiempo (h)
3D2 3D3 3D6 3Y2 3Y4 3Y8 FCHA
0
20
40
60
80
100
0 12 24 36 48 60 72
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e

(
%
)

d
e

a
z
c
a
r

r
e
s
i
d
u
a
l

Tiempo (h)
3D2 3D4 3D6 3Y2 3Y3 3Y4 3Y5 3Y8 FCHA
74

Tabla VII.
Parmetros cinticos de los aislados de S. cerevisiae en medio rico en fructosa (M2) a las 120 h
Aislado
Velocidad de
consumo de
azcares
Velocidad de
produccin de
biomasa
Y
Etanol/azcar

Biomasa
Azcar
residual
Etanol
Acido
actico
Glicerol
Acido
lctico
g/L*h g/L*h g/g g/L
3D2 0.80+0.01 0.02+0.01 0.2+0.01 2.94+0.14 5.05+2.80 22.47+0.10 3.74+0.01 0.75+0.27 0.75+0.27
3D3 0.82+0.03 0.02+0.00 0.34+0.02 3.78+0.05 1.17+1.80 33.80+0.10 6.14+0.80 0.58+0.08 0.57+0.07
3D4 0.56+0.06 0.01+0.01 0.33+0.02 2.68+0.02 32.01+1.70 31.74+1.30 3.69+0.00 0.98+0.00 0.98+0.00
3D5 0.83+0.00 0.01+0.00 0.34+0.01 3.06+0.31 52.17+1.50 33.38+1.40 5.66+1.05 0.52+0.06 0.52+0.06
3D6 0.74+0.01 0.02+0.00 0.38+0.01 3.34+0.19 11.05+1.50 33.60+0.40 6.50+0.91 0.73+0.11 0.73+0.11
3Y2 0.68+0.03 0.03+0.00 0.29+0.00 2.66+0.19 18.26+1.20 28.58+5.20 0.64+0.03 3.13+0.38 0.00+0.00
3Y3 0.57+0.00 0.03+0.00 0.41+0.01 2.68+0.02 32.01+1.40 39.28+0.10 0.58+0.44 2.96+0.55 0.00+0.00
3Y4 0.82+0.00 0.03+0.00 0.34+0.00 3.30+0.10 1.71+2.10 32.71+0.90 0.70+0.01 3.38+0.06 0.38+0.01
3Y5 0.44+0.04 0.04+0.00 0.49+0.02 2.73+0.03 36.43+1.70 33.65+0.50 1.00+0.02 4.37+0.03 1.02+0.16
3Y8 0.83+0.00 0.01+0.00 0.39+0.15 2.25+0.15 1.00+0.81 38.72+4.41 0.77+0.03 4.21+0.12 0.77+0.00
FECHA 0.68+0.02 0.01+0.00 0.43+0.00 2.35+0.13 18.92+1.30 42.87+4.30 0.54+0.01 3.31+0.12 1.32+0.06
FECHA: Cepa de referencia Fermichamp

75
7.3. Caracterizacin cintica de los aislados de S cerevisiae con una alta actividad
fructoflica

Fueron evaluadas las caractersticas cinticas de produccin de etanol, glicerol biomasa y
consumo de azucares residuales de 3D4, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5 y 3Y8 identificados
molecularmente como S. cerevisiae usando como control la cepa Fermichamp.

La levadura 3D4 (Figura 21 A y B) tuvo crecimiento similar en M1 y M2 (2.26-2.88 g/L) al
final de la fermentacin. En cuanto al comportamiento en la cintica de fermentacin se observ
tanto en M1 como en M2 de las 72 a las 100 horas una fase estacionario en el consumo del azcar
de mayor concentracin, al igual se observa como la produccin de etanol se encuentra en fase
log hasta las 72 horas en ambos medios. Al final de la fermentacin en ambos medios tuvieron un
produccin similar de glicerol (2.30 g/L aproximadamente)

La levadura 3Y2 (Fig. 22 A y B) se observo tanto en M1 como en M2 una fase de
crecimiento hasta las 48 horas, la levadura tuvo poca diferencia en la produccin de biomasa al
final de la fermentacin en ambos medios (2.14- 2.70 g/L). En relacin a la produccin de
etanol, glicerol y consumo de azucares reductores tanto en glucosa como en fructosa
aproximadamente a 36 horas inicia la etapa estacionaria. En M1 tanto el etanol como el glicerol
tienen una fase log de produccin hasta las 36 horas aproximadamente; en M2 el etanol sigue
producindose hasta el final de la fermentacin, la produccin mxima de glicerol se da hacia las
60 horas.
76

Figura 21. Cintica de fermentacin a 30C de 3D4. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 9:1). Medio
B) M2 (fructosa:glucosa 1:9).

0
10
20
30
40
50
0
20
40
60
80
100
0 24 48 72 96 120
E
t
a
n
o
l
,

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B
FRUCTOSA GLUCOSA ETANOL GLICEROL PESO SECO
77

Figura 22. Cintica de fermentacin a 30C de 3Y2 Cintica. A) Medio M1 (fructosa:glucosa
1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).

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B
FRUCTOSA GLUCOSA ETANOL GLICEROL PESO SECO
78
La cepa 3Y3 presento un patrn de crecimiento similar en los dos medios (Fig. 23 A y B), la
etapa estacionaria inici aproximadamente a las 32 horas exhibiendo en esta etapa el crecimiento
mximo para la cepa en los dos medios, al final de la fermentacin en ambos medios esta cepa
tuvo una produccin final de biomasa de 2.44 g/L aproximadamente; en la cintica de
fermentacin la cepa dejo una alta concentracin del azcar con mayor concentracin, en M1
(glucosa) y M2 (fructosa) al final de la fermentacin (mayor a 48g/L aproximadamente), en
cuanto el azcar de menor concentracin en M1 (fructosa) a las 72 h fue totalmente consumida y
en M2 (glucosa) hasta las 120 h fue consumida en su totalidad; 3Y3 tuvo una produccin similar
en M1 y M2 (2.5 g/L aproximadamente); en cuanto a la produccin de etanol, produjo una
concentracin mayor en M1 (40 g/L aproximadamente) que en M2 (28 g/L aproximadamente)

El crecimiento en M1 de 3Y4 (Fig. 24 A y B) la fase estacionaria apareci a las 48 horas,
despus de este periodo, aproximadamente a las 72 horas, se observo una nueva fase log de
crecimiento, esto se ve reflejado en el comportamiento del microorganismo (Figura 24 A y B) ya
que en la cintica de fermentacin a las 48 horas consumi la mayor parte, de igual forma se
observa que despus de las 72 horas se presenta una nueva fase de produccin de etanol. En M2
se observa marcadamente una etapa diauxica en el crecimiento del microorganismo hacia las 48
horas, la cual coincide con las ltimas etapas de fermentacin del sustrato predominante del
sustrato (Figura 24 C) y el cambio a la fermentacin del sustrato presente en menor cantidad; en
cuanto a la produccin de etanol se observa una produccin exponencial de este hasta las 36
horas, observndose que se reactiva la produccin despus de las 60 horas,

79

Figura 23. Cintica de fermentacin a 30C de 3Y3. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B)
Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).

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B
GLUCOSA FRUCTOSA ETANOL PESO SECO
81
En M1 la cepa 3Y5 present crecimiento (Figura 25 A) y consumo de azcar exponencial,
hasta las 36 horas (Figura 25 B) este microorganismo tuvo un paro en la fermentacin a las 72
horas y dejo una alta residualidad del azcar en el medio, la mxima produccin de etanol se dio
hacia las 96 horas. En M2 (Figura 25 D) a las 24 horas se observo un punto diauxico, aqu se
observo el mximo crecimiento del microorganismos y un paro en la fermentacin del azcar; en
cuanto a la produccin de etanol a las 72 horas se observo una nueva etapa de produccin.

Para el aislamiento 3Y8 (Fig. 26A) tanto en M1 como en M2 el microorganismo present un
crecimiento exponencial hasta las 12 horas, mantenindose en fase estacionaria hasta el final de
la fermentacin; a las 72 horas el microorganismo termino la fermentacin de glucosa y fructosa
dejando una residualidad menor de 5 g/L de ambos (Figura 26 A y B). En ambos medios la
produccin de etanol fue exponencial hasta las 60 horas. Este microorganismo tuvo
comportamiento similar en ambos medios.

En la cepa control Fermichamp (Fig. 27 A) presento crecimiento exponencial en ambos
medios; el consumo de glucosa (Figura 27 B) se dio de forma exponencial, a las 72 horas
consumi el 78 % de la glucosa y al final de la fermentacin el 99%; en M1 (Figura 27 C) el
consumo de la fructosa se dio de forma exponencial con dos cambios diauxicos, uno a las 4 horas
y otro a las 24 horas aproximadamente, al final de la fermentacin se consumi el 83% de esta
azcar. El etanol se produjo de forma exponencial aproximadamente hasta las 72 horas en ambos
medios encontrndose mayor produccin en glucosa (41.4 g/L) que en fructosa (22.01 g/L)
82

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B
GLUCOSA FRUCTOSA ETANOL PESO SECO
84
\

Figura 27. Cintica de fermentacin a 30C de Fermichamp (FECHA). A) Medio M1
(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).

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B
85
7.4. Caracterizacin de aislados de S cerevisiae con una alta actividad fructoflica en medio
M3

Los aislados de S. cerevisiae con una alta actividad fructoflica fueron evaluadas en M3 (Tabla
VIII). Las levaduras 3Y3, 3Y5 y 3Y8 consumieron la glucosa al final de la fermentacin y no
presentaron diferencia significativa entre ellas. La cepa control Fermichamp consumi la
totalidad de la fructosa presente en el medio, mientras que los aislamientos 3Y8 y 3Y5 tuvieron
un consumo mayor al 86.5% sin diferencia significativa. En cuanto a la produccin de etanol no
se presento diferencia significativa entre las mejores 3Y5 y 3Y8.

En el medio M3 (Fig. 28) en general ms del 50% de la glucosa es consumido a las 72 h por
las cepas 3Y5 (Figura 28 B) consume la mayora de la glucosa a las 150 h, dejando en el medio
menos de 6 g/L; 3Y3, y 3Y8 a las 200 h; la cepa testigo deja alta concentracin (30 g/L) al final
de la fermentacin. En cuanto a fructosa las cepas a las 92 h consumen ms del 50% de la
fructosa, 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejan una alta concentracin de fructosa en el medio al final de la
fermentacin, solo Fermichamp termina la fermentacin a las 150 h dejando menos de 1 g/L de
esta azcar residual. El proceso inicia con la misma concentracin de ambas azucares
observndose que las cuatro cepas en estudio consumen ms rpido la glucosa que la fructosa,
dando lugar a una diferencia entre el consumo de estos azucares (Discrepancia GF) en el curso
completo de la fermentacin. Al inicio de la fermentacin se observa una mayor discrepancia,
cuando la glucosa empieza a ser limitante en el medio esta se reduce notablemente, observndose
que cuando la fermentacin cesa las cepas aisladas del proceso de mezcal dejan una alta
concentracin de fructosa en el medio, a excepcin de la 3Y8 que hacia las 100 horas la relacin
G/F tiene un valor de uno, ya que el microorganismo consume de igual forma la glucosa y la
fructosa. El etanol solo se midi al final de la fermentacin, 3Y5 y 3Y8 fueron las cepas que
mayor concentracin de este produjeron.

86

Tabla VIII.

Evaluacin cintica al final (12 das) de la fermentacin de los aislados de S. cerevisiae en medio M3 (glucosa:fructosa 1:1)

Cepa
Glucosa
residual
Fructosa
residual
Azcar residual Etanol Y
Etanol/azcar

Velocidad de
consumo
g/L g/g
Glucosa
g/L*h
Fructosa
g/L*h
3Y3 0.52+0.34
A
15.41+2.10
C
15.92+5.62
B
68.63+1.05
B
0.38+0.01 0.32+0.02 0.31+0.02
3Y5 0.22+0.13
A
13.25+3.10
B,C
13.47+4.13
A,B
78.16+2.59
A
0.43+0.01 0.29+0.00 0.32+0.02
3Y8 0.86+0.75
A
9.29+4.38
B
10.15+2.62
A
76.25+4.60
A,B
0.42+0.01 0.30+0.00 0.34+0.00
FECHA 31.88+3.73
B
0.00+0.00
A
31.65+7.67
C
61.62+4.56
C
0.35+0.00 0.21+0.01 0.36+0.00
FECHA: Cepa de referencia Fermichamp. A, B, C agrupados por ANOVA con Prueba de Diferencia Mnima Significativa
87

Figura 28. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B)
3Y5 durante la fermentacin en M3 (fructosa:glucosa 100:100).
0
20
40
60
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0 50 100 150 200 250
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c
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(
%
)

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Tiempo (horas)
A
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%
)

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Tiempo (h)
B
FRUCTOSA GLUCOSA
88

Figura 29. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae C) 3Y8 y D)
Fermichamp (FECHA) durante la fermentacin en M3 (fructosa:glucosa 1:1).

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0 50 100 150 200 250
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Tiempo (h)
C
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0 50 100 150 200 250
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(
%
)

d
e

a
z
c
a
r

Tiempo (h)
D
FRUCTOSA GLUCOSA
89

Figura 30. Comparacin del consumo porcentual de azcar residual durante la fermentacin
de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B) 3Y5 en M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa
9:1) y M3 (fructosa:glucosa 1:1).

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0 50 100 150 200 250
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Tiempo (h)
A
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(
%
)

A
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u
c
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Tiempo (h)
B
M1 M2 M3
90

Figura 31. Comparacin del consumo porcentual de azcar residual durante la fermentacin
de cepas S. cerevisiae A) 3Y8 y B) Fermichamp (FECHA) en M1 (fructosa:glucosa 1:9),
M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (fructosa:glucosa 1:1).

0
20
40
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0 50 100 150 200 250
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(
%
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Tiempo (h)
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0 50 100 150 200 250
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a
j
e

(
%
)

A
z
u
c
a
r

Tiempo (h)
B
M1 M2 M3
91
7.5. Caracterizacin de la tolerancia al etanol de los aislamientos Saccharomyces
cerevisiae fructoflicos

De acuerdo a este protocolo, la cepa con mayor resistencia al etanol a los tres minutos fue
3Y8 (5.4 x 10
5
cfu/ml), seguida por Fermichamp (1.5 x10
5
cfu/ml) y 3Y5 (8.1 x 10
4
cfu/ml);
mientras que la 3Y3 (0% a 3 min) result ser el aislado ms sensible (Figura 30). A los cinco
minutos la cepa con mayor resistencia al etanol fue la 3Y8 (2.1 x 10
5
cfu/ml).

Figura 32. Prdida de viabilidad en clulas de levaduras Saccharomyces aisladas de mostos
de mezcal a 30C en 25% v/v de etanol.

7.6. Caracterizacin gentica de los genes transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 de
los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructoflicos

Las secuencias de los genes que codifican para la protenas de los transportadores Hxt1p y
Hxt3p de los aislados identificados como S. cerevisiae fueron comparadas con secuencias de
la clona S228c (publicadas en el Saccharomyces Genome Database) y la cepa de referencia
Fermichamp (obtenidas de Guillaume et al., 2007). Con la secuencia aminoacdica de S228c
se predijo el modelo conformacional de los 12 dominios de los segmentos transmembranales
(TM) para Hxt1p y hxt3p (Figura 33 A y B) adems la posicin de los polimorfismos
encontrados en las cepas aisladas de mostos de mezcal (AMM).
1.E+00
1.E+02
1.E+04
1.E+06
0 1 2 3 4 5
V
i
a
b
i
l
i
d
a
d

(
U
F
C
/
m
l
)

Tiempo (min)
3Y3 3Y5 3Y8 FECHA
92

El anlisis de las secuencias (Tabla IX) de Hxt1p revel que los segmentos
transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de mezcal y
Fermichamp. En Hxt3 revelo que en TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en
S207L (cambio de un aminocido no polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c. Para
TM7 de Hxt1p, los aminocidos Q275, G279 y D280 estn conservados en todas las cepas,
pero en Fermichamp, 3D6, 3Y2, 2Y3, 2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el
polimorfismo K278T.

En Hxt1 se encontraron entre la regin TM9, en el lazo externo y en la TM10 cambios de
aminocidos en la posicin 418-420 y 431, en Hxt3 se encontraron los polimorfismos en la
posicin 418 y 419 solo para Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las
sustituciones Y402L y C401S; otro cambio notable que ocurri solo en la cepa 3D3 que
present los polimorfismos Y405A, A406F, S407L dentro de la regin transmembranal 9. En
Hxt1 del segmento TM10 est presente el polimorfismo L377F, para 3Y8 cerca de la posicin
F380. En la cepa 3D3 se encontraron los polimorfismos F406S; G408A; G411A en Hxt1. En
se encontr que en Hxt1 est presente el polimorfismo L439M en el TM12, en la cepa 3D3.

Probablemente los polimorfismos que se presenten en estos segmentos transmembranales
pueden modificar el tamao del poro y la forma de sealizacin de la protena con el azcar,
evidenciando su importancia en la formacin de la cadena, es probable que estas
modificaciones puedan distorsionar la conformacin de la estructural exofacial ocasionando
alteraciones entre los sitios alostricos de la protena propiciando una diferente afinidad con
las molculas de hexosas, alterando de manera importante la funcionalidad del transportador.
93

Figura 33. Prediccin de la conformacin de los segmentos transmembranales de las protenas A) hxt1 y B) hxt3 basada en la
secuencia de la cepa Saccharomyces cerevisiae S288c y la posicin de los polimorfismos de aislados de mostos de mezcal y la
Fermichamp.

A)
B)
94
Tabla IX.
Prediccin de de la posicin de los polimorfismos en HXT1 y HXT3 para los aislados de mostos
de mezcal
Sustitucines
aminoacdicas
Tansportador de hexosas
HXT1

Sustitucines
aminoacdicas
Tansportador de hexosas
HXT3
S. cerevisiae aislados S. cerevisiae aislados
V1A AMM
b

L211S AMM
b

T4M AMM
b

I213V
FECHA
a

F19I 3Y5

G241C
3D2, 3D6
F19R 3Y8

M328I
FECHA
a

T34I 3Y4

L392M
FECHA
a

D34E
FECHA
a

Y393W
FECHA
a

F55N
FECHA
a

I396V
FECHA
a

P223S
3D6

C401S
AMM
b

S239G AMM
b
, FECHA
a

Y402L
AMM
b

F255Y 3D2

Y405A 3D3
G258D 3Y4

A406F 3D3
R264T
3D2

S407L 3D3
T265G
3D2

G409R 3D5, 3Y2
M266K
3D2

V410A 3D2
T278K
FECHA
a
, 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5,
3Y8

V410L 3Y2
V294L 3Y5

E418Q
FECHA
a

F300L 3Y2

G419N
FECHA
a

G307S 3D3

V432C 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8
V308I 3D3

I266L AMM
b
, FECHA
a

V308L 3D2

A555D 3D3
A334T 3D3

M567L AMM
b

V349G 3Y8
D358N AMM
b
, FECHA
a

Q359N
AMM
b,
FECHA
a

P360G
AMM
b,
FECHA
a

V371C AMM
b,
FECHA
a

I372L 3Y8
E394Q 3Y8
F396G 3Y8
V400I 3Y8
S406F 3D3

A408G
3D3

A411G
3D3
I430F 3Y8
Y433F 3Y8
M439L 3D3
G471S 3D4, FECHA
a

L473P 3D3
G487S 3Y5, 3Y8
D489E 3D5

FECHA
a
(Fermichamp) = datos tomados de Guillaume et al. (2007).
AMM
b
=Aislados de mostos de mezcal (3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y2, 3Y4, 3Y5, 3Y8
95

8 DISCUSIN

En Tamaulipas, el proceso de elaboracin del mezcal es realizado de forma artesanal bajo
condiciones no controladas, en la fermentacin alcohlica generalmente se usan levaduras
nativas, originando largos tiempos y una gran variabilidad en la calidad en la fermentacin.

8.1 Identificacin molecular de las levaduras

La fermentacin de los mostos de mezcal es realizada por un complejo grupo de
microorganismos nativos que interaccionan entre s (Cceres et al., 2008), pero la levadura
que finalmente predomina en el proceso y produce la mayor concentracin de etanol es la
Saccharomyces cerevisiae. En el proceso de fermentacin espontanea de los mostos de
mezcal tamaulipeco a los dos y seis das se encontraron 9 cepas de S. cerevisiae, 3 de T.
delbrueckii, 1 de Z. bailii, 2 de K. marxianus y 1 de P. mexicana. El anlisis de las secuencias
de los segmentos ribosomales 28S e ITS revelaron la diversidad entre estas, la posicin
filogentica con el anlisis de la secuencia 28S mostro un alto nivel de relacin entre
organismos de la misma especie (99%); a diferencia de el anlisis con ITS que las asoci con
un bajo nivel de relacin a S. cerevisiae (81%), T. delbrueckii, Z. bailii y K. marxianus (64%)
y separ a P. mexicana (97%), a dems no asoci a 1Y9 con K. marxianus, esto es debido a
que la regin ribosomal 5.8S-ITS exhibe una mayor diferencia interespecfica que los
segmentos 26S ribosomales (Kurtzman et al., 1998, 1992) no obstante 26S permite la
diferenciacin de especies relativamente cercanas esto es resuelve diversidad interespecfica e
intraespecfica.

8.2 Caracterizacin de la productividad de las levaduras

El mayor reto al identificar cepas de levadura recae en la necesidad de diferenciar grupos y
especies que taxonmicamente estn muy cerca, pero que tienen propiedades muy diferentes
en lo que respecta a sus aptitudes fermentativas y organolpticas dado el complejo grupo de
96
microorganismos que participan en una fermentacin alcohlica es necesario el uso un
mtodo de aislamiento rpido y confiable como rutina de laboratorio como lo es el ARDRA
(Baere et al., 2002; Escalante et al., 2006; Prez et al., 2007). En esta investigacin el
ARDRA evidenci un alta similitud en la huella gentica de organismos del mismo gnero y
especie, especialmente en lo que se refiere a S. cerevisiae, con excepcin de los identificados
como K. marxianus esto concuerda con el anlisis de la secuencia 26S e ITS1-5.8S-ITS2.

En cuanto a la evaluacin de crecimiento por DO
(600nm)
y consumo de azcar residual las
cepas S. cerevisiae 3Y2, 3Y4 y 3Y8 (DO
600
=4.5

en promedio) fueron los que mejor se
adaptaron al ambos medios (M1 y M2) y consumieron casi en la totalidad tanto la glucosa
como la fructosa a dems presentaron mayor crecimiento que las levaduras analizadas por
Arroyo y colaboradores 2009, en donde evaluaron la inhibicin por efecto del sustrato, ellos
encontraron que en 69.57% de fructosa (v/v) haba una D.O
600
>1.

En la industria es importante encontrar levaduras con una alta preferencia a la fructosa o
tolerancia, ya que las altas concentraciones de esta azcar incrementan el riesgo de la
contaminacin al final de la fermentacin causando detrimento en la calidad, al evaluar los
parmetros cinticos de las levaduras aisladas de mostos de mezcal identificadas como S.
cerevisiae estas tuvieron comportamientos diferentes.

Las cepas destacadas en M1 fueron 3Y4, 3Y8 y Fermichamp ya que al final de la
fermentacin la concentracin en el medio fue menos de 2 g/L de azcar residual; en M2 los
mejores fueron 3D3, 3Y4, 3Y8 y al final de la fermentacin la concentracin fue menos de
g/L de azcar residual; en M3 las tres cepas en evaluacin 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejaron menos de
1 gr/L de glucosa residual; en cuanto a fructosa 3Y8 dej una concentracin menor a 10 g/L y
slo FCHA consumi en su totalidad esta azcar. Estos resultados son comparables con los
reportados por Daz et al (2008) ellos analizaron S. cerevisiae aisladas de mostos para
produccin de tequila, encontraron de 8-11 g/L de azcar residual en el medio al final de la
fermentacin en mostos de A. tequilana (a las 72 h y 955 g/L azcares reductores), Cortes et
al (2009) realizaron fermentaciones en mostos de agave (100g/L de azucares reductores) con
S. cerevisiae y encontraron una residualidad de 6+1 g/L, Pinal et al (2009) analizaron
levaduras S. cerevisiae aisladas de mostos de agave encontraron una concentracin menor a
los 5 g/L de azucares a las 72h de fermentacin en mostos con 10 Brix; en otros estudios
encontraron que una levadura aislada de mostos de vino en fermentaciones de mostos de
97
agave para produccin de tequila (108 g/L de azcares reductores inicial) dej alrededor de
15 g/L (Pinal et al., 1997). Berovic et al (2007), en mostos de uva (109g/L de glucosa y 103
g/L de fructosa) encontraron al final de la fermentacin 6.5 0.23 de azcar residual. Dumont
et al (2009), analizaron cepas que dejaron menos de 5 g/L de ambos azucares reductores.

Los aislamientos que mayor biomasa produjeron en M1 fueron 3D3, 3D6 y 3D5 (Tabla
VI); en M2 los mejores fueron 3D3, 3D5, 3Y4 (Tabla VII). Las cepas evaluadas en el presente
estudio produjeron una menor cantidad de biomasa que la reportada en estudios realizados por
Daz et al (2008), en donde encontraron de 4-5 g/L aproximadamente a las 12h.

Para la produccin de etanol los aislamientos ms destacados en M1 fueron 3Y3, 3Y4 y
Fermichamp (Tabla VI); para M2 fueron 3Y3, 3Y5 y Fermichamp (Tabla VII); en M3 fue
3Y5 y 3Y8 (Tabla VIII). Estos resultados concuerdan con los publicados por Daz et al.,
2008, ellos encontraron en mostos de agave con 12 Brix 39.9-43.5 g/L de etanol, en otros
estudios realizados en fermentaciones de mostos de agave (10 Brix) encontraron 37 g/L al
final de la fermentacin (Pinal et al., 2009), en mostos de agave una concentracin de etanol
de 45+2 (Cortes et al., 2009), una S. cerevisiae aislada de mostos de vino en fermentaciones
de mostos de agave para produccin de tequila (108 g/L de azcares reductores inicial) tuvo
una produccin de de 50 g/L de etanol (Pinal et al., 1997), en fermentaciones en mostos de A.
tequilana Weber variedad azul (100g de azucares reductores) evaluaron 8 aislamientos de S.
cerevisiae encontrando una produccin de 35.85 a 46.16 g/L de etanol (Gutirrez et al.,
2009); en mostos de uva encontraron 84.7+2.18 de etanol (Berovic et al., 2007). Polsinell et
al (1996), encontraron cepas que produjeron 97 g/L de etanol en mostos de uva; Dumont et al
(2009), analizaron cepas que produjeron 120g/L etanol.

En cuanto al acido actico en M1 la menor produccin la tuvo FCHA, 3Y5, 3D5 y 3D3 con
concentraciones inferiores a 0.5 g/L. M2 la menor produccin la tuvo FCHA, 3Y3, 3Y2, 3Y4
y 3Y8 en concentraciones inferiores a 0.7 g/L. En fermentaciones de mostos de agave para
produccin de mezcal al final de la fermentacin se han encontrado de .2 a .4 g/L de cido
actico (Vera et al., 2009). Es importante determinar la concentracin final de cido actico
presente en una fermentacin ya que en concentraciones de 1.2 a 4.8 g (20-80 mM) causa
muerte en las clulas de S. cerevisiae en la etapa exponencial induciendo condensacin de la
cromatina a lo largo de la envoltura nuclear, exponiendo la fosfatidilserina sobre la superficie
98
citoplasmtica de la membrana con posterior fragmentacin de ADN (Loudovico et al.,
2001), a dems de que tiene un severo impacto negativo en el sabor de los vinos.

En la produccin de acido lctico de menor produccin en M1 fuero 3D6 (0.47+0.06 g/L)
y 3Y4 (0.00+0.00 g/L) (Tabla VI); para M2 los aislamientos 3Y2 (0.00+0.00 g/L), 3Y3
(0.00+0.00 g/L), 3Y4 (0.38+0.01 g/L) (Tabla VII). Daz et al (2008) encontraron en
fermentaciones de mostos de Agave tequilana Weber una concentracin de acido lctico de
0.0752 a 0.110 mg/L; la concentracin usual producida por S. cerevisiae en fermentaciones de
vinos es de 0.1 a 0.5 g/L (Vasserot et., al 2010), es importante conocerlo ya que altas
concentraciones de acido lctico (ms de 1 g/L) pueden modificar el metabolismo de la
levadura, inhibir el crecimiento, el efecto ms obvio es el alargamiento de la fase lag,
(Vasserot et., al 2010); adems de que puede provocar paro en la fermentacin (Pampulha et
al., 2000).

La mayor concentracin de glicerol en M1 la produjeron los aislamientos 3D4 (7.61+2.08
g/L) y 3D6 (5.82+0.40 g/L) (Tabla VI); en M2 fueron los aislamientos 3Y5 (4.37+0.03 g/L) y
3Y8 (4.21+0.12 g/L) (Tabla VII). Nuestros resultados son comparables a los obtenidos en
fermentaciones de mostos de agave en los que se encontr una concentracin de 4.3 a 4.7 g/L
(Daz et al., 2008), Cortes et al (2009) en mostos de agave encontraron 2.8 a 3.9; en mostos
de uva se encontr una concentracin de 6.8 (Berovic et al., 2007). Es importante conocer la
concentracin de glicerol en una fermentacin ya que este compuesto le confiere calidad, en
vinos no es deseable que exceda 6 g/L.

Dado el carcter glucoflico de la levadura Saccharomyces cerevisiae y la importancia que
este microorganismo tiene en la industria vincola, es necesario contar con levaduras que
fermenten en igual o similar proporcin tanto la glucosa como la fructosa ya que
generalmente dejan una alta concentracin de fructosa en el medio, causando una
discrepancia entre la cantidad de glucosa y fructosa consumidas durante la fermentacin (GF)
(Berthels et al., 2004; Guillaume et al., 2007). Investigaciones realizadas por Berthels et al.
(2004) en mostos de la variedad de uva Colombard mostraron que las levaduras utilizadas
fermentaron ms rpido la glucosa, no obstante que al inicio del proceso estaban presentes
cantidades similares de los dos azucares (110 g/L de cada una) la lenta utilizacin de la
fructosa dej una diferencia (GF) y que cuando la glucosa es limitante en el medio la relacin
GF decrece tambin, a los doce das estaba presente aproximadamente 5 g/L de glucosa, 30
99
g/L de fructosa y 85 g/L de etanol. En la evaluacin de las levaduras en medio sinttico tipo
mostos de uva (M3) se observ que solo la cepa control Fermichamp consumi totalmente a
la fructosa aproximadamente en 180 horas, seguido por el aislamiento 3Y8; en cuanto a la
glucosa los aislamientos 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejaron menos de 1 g/L de azcar residual. En este
estudio se observ que las cepas consumen ms rpido la glucosa que la fructosa, coincidente
con el carcter glucoflico de las cepas S. cerevisiae empleadas en procesos fermentativos
vincolas.

Al caracterizar una levadura fermentativa, es importante analizar la resistencia al estrs por
etanol ya que este perturba la homeostasis de las clulas impactando negativamente a diversas
actividades celulares, por ejemplo el metabolismo de los trasportadores de hexosas puede ser
bloqueado, causando desnutricin en las clulas y ocasionando por consecuencia un paro en la
fermentacin; o bien la reproduccin celular puede verse afectada factor importante en las
fermentaciones ya que se necesita que las cepas sean capaces de generar la biomasa requerida
para completar eficientemente la fermentacin (Nagodawithana et al., 1975; Thomas et al.,
1978). En esta investigacin se usaron niveles de etanol de 25% v/v debido a que causan
estrs en la clula, generando inactivacin cintica tan rpida que no puede interferir los
factores debidos al rgimen de cultivo, adems de que es medible a travs de un periodo corto
de tiempo (Pina et al., 2004). Se encontr que la cepa con que presento mayor porcentaje de
viabilidad fue la cepa control Fermichamp, seguida por 3Y5 y 3Y8. Thomas et al (1978),
analizaron organismos S cerevisiae encontrando cepas que toleraban concentraciones de
etanol arriba del 20% a 30C. Estrada et al (2001) reportaron cepas de S cerevisiae aisladas de
mostos de agave con una resistencia a ms del 10% v/v de etanol considerando un crecimiento
positivo cuando se presentaba una DO
(650nm)
arriba del 0.020 unidades.

8.3 Caracterizacin gentica de los genes transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 de
los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructoflicos

Los genes que codifican para los transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 estn
presentes en mamferos bacterias, plantas y levaduras, estos genes exhiben una estructura
conservada en los Segmentos Transmembranales (TM) 1, 3, 5, 7, 8, regiones que se
caracterizan por formar -hliceses anfipticas las cuales hipotticamente interactan,
formando un poro acuosos a travs del cual pasa la hexosa, se sugiere que el hidroxil y la
amina del aminocido forman cadenas de estas hlices unindose con la hexosa a travs de
100
puentes de hidrgeno con los grupos hidroxilos del azcar (Mueckler et al, 1999; Kasahara et
al., 2007), estudios sugieren que la hexosa es transportada de acuerdo a su polaridad, debido a
la unin estructural entre las fuerzas internas y externas entre el azcar y el transportador,
iniciando desde el exterior por el C-1 (Carbono 1) siguiendo con C-4 y el C-6 (Hashiramoto et
al, 1992), probablemente los polimorfismos que se presenten en estos segmentos
transmembranales pueden modificar el tamao del poro y la forma de sealizacin de la
protena con el azcar.

Las investigaciones han revelado en los FMS (sper familia de los principales
facilitadores, por sus siglas en ingls) el TM5 de levaduras es importante para el
reconocimiento y paso del substrato, especficamente en el transportador HXT2 se encontr
que en esta regin el aminocido Leucina (L
201
) es esencial para una alta afinidad de
transporte bajo condiciones limitadas de glucosa (Kasahar et al, 2003); igualmente se
encontr que la Glutamina (Q)

esta altamente conservada en otros transportadores para
glucosa, fructosa, galactosa, xilosa y arabinosa (Glut1 Q
161
, en HXT1 Q
149
y HXT3 Q
206

)
evidenciando su importancia,

estudios previos sugieren la participacin de este aminocido
en la formacin exofacial de la cadena, bsicamente en el sitio de unin con el sustrato
(Mueckler et al, 1994). En nuestro caso el anlisis de las secuencias de Hxt1 revel que los
segmentos transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de
mezcal y Fermichamp con la secuencia de la clona S228c. El anlisis de Hxt3 revel que en
TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en S
207
L (cambio de un aminocido no
polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c; Fermichamp presenta el polimorfismo
V
209
I; considerando su cercana al aminocido conservado Q
206
y a las caractersticas del
cambio de Leucina por Serina del transportador en las cepas aisladas de mezcal, como en
Fermichamp, es probable que estas modificaciones puedan distorsionar la conformacin
estructural exofacial ocasionando alteraciones entre los sitios alostricos de la protena
propiciando una diferente afinidad con las molculas de hexosas.

El segmento TM7 tiene un alta homologa en otros SMF y est situado en la parte superior
de la membrana, probablemente este cumple el papel de reconocimiento del sustrato por parte
de la clula, esto es en la interaccin exofacial de la protena con el azcar, adems de que
participa en el doblamiento de la hlice; Hashiramoto (1992) mostr que en GUT1 el
aminocido Q
282
(HXT1 Q
275
; HXT3 Q
332
) se encuentra en una regin conservada, es posible
que una modificacin en esta zona, altere de manera importante la funcionalidad del
101
transportador; hipotticamente este aminocido forma puentes de hidrgeno con el C-1 de la
glucosa (Liang et al., 1977; Mueckler et al., 2009), adems de que puede participar en la
unin de la estructura conformacional externa entre TM7 y TM12 propiciando el movimiento
helicoidal ascendente cuando un sustrato es incorporado del exerior hacia el interior; en otros
estudios se encontr que el aminocido glicina (HXT1 G
279
y HXT3 G
336
) esta altamente
conservado en transportadores de mamferos y hongos, y es crtico para el transporte de
glucosa (Liang et al., 1997, 1998); Kasahara (2010) encontr que el segmento Hxt7 tiene una
regin hidroflica y que posee el aminocido D
340
(HXT2 D
331
; HXT1 D
280
; HXT3 D
337
) en la
parte central de la cadena, posocin que hipotticamente afecta la estructura de unin al
sustrato o el papel que tiene de unirse a otros residuos, estos ensayos sugieren que Asp
340
interacciona con el C-1 de la D-glucosa (Mueckler et al, 1994; 2004). En este estudio el
anlisis, el segmento TM7 de Hxt1, los aminocidos Q275 (GUT1 Q
282
; Hxt3 Q
332
), G
279
y
D
280
(D
340
) estn conservados para todas las cepas, pero en Fermichamp, 3D6, 3Y2, 2Y3,
2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el polimorfismo K278T, considerando que la Lisina
(K) es un aminocido positivo mas grande y puede estar sujeto a ubiquitinacin/acetilacin, se
sugiere que hipotticamente esta modificacin cambia el plegamiento de la regin TM7
pudiendo afectar el tamao del poro y la forma de sealizacin de la protena con el azcar
afectando en forma importante la funcionalidad del transportador.

Guillaume et al (2007) encontraron 6 mutaciones situadas entre la regin TM9, en el lazo
externo y en la TM10 de Hxt3, esta regin no ha sido identificada como crtica en el
transporte del azcar, no obstante las mutaciones presentes pueden tener un efecto en la
protena, ya que es se encuentran situadas exofacialmente; en Hxt1 se encontraron en la
misma regin cambios de aminocidos en la posicin 418-420 y 431, el anlisis de cepas
nativas y comerciales con caracteristicas vincolas reportaron los mismos polimorfismos en la
misma regin, sugiriendo que estos cambios pueden afectar positivamente el desarrollo de la
fermentacin (Guillaume et al., 2007; Karpel et al; 2008). Para este trabajo, se encontr en el
transportador Hxt1 de la cepa testigo y en los aislados de mezcal, los polimorfismos
reportados por Karpel (2007) en la misma regin (418-420 y 431) (TM9, el rizo medio y la
TM10). En Hxt3 se encontraron los polimorfismos en la posicin 418 y 419 reportados por
Karpel (2007) pero solo para Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las
sustituciones Y
402
L y C
401
S; otro cambio notable que ocurri solo en la cepa 3D3 que
present los polimorfismos Y
405
A, A
406
F, S
407
L dentro de la regin transmembranal 9. Todos
los cambios mencionados anteriormente pueden afectar considerablemente la conformacin
102
estructural de ambas protenas favoreciendo o disminuyendo el transporte de la hexosa en la
fermentacin.

En ensayos realizados con levaduras mutantes (Kasahara et al, 1997; 1998; 2006; Dietvorst
2009), se encontr que en el gen Snf3 el aminocido conservado Phe
462
(Glut1 F
379
, Hxt1 F
380
,
Hxt2 F
431
,Hxt3 F
437
) situado en la TM10, este aminocido est relacionado como sitio de
reconocimiento (o punto de unin) en la parte interna de la hlice para los azcares fructosa,
glucosa y manosa. En las cepas analizadas se encontr que en Hxt1 del segmento TM10 esta
presente el polimorfismo L
377
F, para 3Y8 cerca de la posicin F
380
, probablemente esto y
otras caractersticas (no evaluadas), favorezca el transporte tanto de la glucosa como la
fructosa a travs de la membrana ya que es de las cepas que ms consume estos azcares.

Existen reportes de que en la TM11 el Triptfano se encuentra conservado en Glu1 (W
412
)
Hxt1 (W
413
), Hxt3 (W
470
), Muecler et al (2009) sugieren que este aminocido aromtico se
une al sustrato interaccionando con el C-6 de la piranosa. En la cepa 3D3 los polimorfismos
presentes en Hxt1 (F
406
S; G
408
A; G
411
A) encontrados en la TM11 se localizan cercanos al
amincido Triptfano (W
413
). Kasahara (2000), report que la posicin 504 (Phe) en Gal2 en
TM12 es crtica para el transporte de galactosa, y que este aminocido aromtico est
conservado en un gran nmero de transportadores de azcar o protenas relacionadas, se
report que este aminocido fue remplazado en Hxt3 por (Phe
945
) y se obsev una
disminucin en el transporte de glucosa, observndose por el crecimiento de la clula sobre la
placa en medio YNB, sugiriendo que este sitio contribuye fuertemente a la discriminacin del
reconocimiento en el sustrato, aun que Liang (1997) realiz ensayos con insercin y delecin
en TM12 del transportador Hxt3 encontrando que esta regin no es crtica para el transporte
de glucosa. En nuestro estudio se encontr que en Hxt1 esta presente el polimorfismo L
439
M
en el segmento transmembranal 12, adyacente a la posicin F
438
(Gal2 F
504
) en la cepa 3D3,
posiblemente estos cambios interfieren con el sitio de reconocimiento de la glucosa ya que
3D3 es de los aislados que dej mas de 5 g/L de glucosa residual al final de la fermentacin
(dejando menos de 2 g/L de fructosa). Los polimorfismos encontrados en los genes de los
transportadores Hxt1 Y Hxt3 de las cepas aisladas de mostos de mezcal podran ser cambios
naturales debido al proceso evolutivo incrementado por las condiciones especficas de estos
mostos, con la posibilidad acumulativa de mutaciones neutrales o tal vez negativas y/o
positivas pero es necesario realizar ms investigacin al respecto.

103

9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

El contar con un mtodo rpido de deteccin y aislamiento para levaduras Saccharomyces
cerevisiae, adems que sean candidatas a consumir eficientemente la fructosa es una
herramienta predictiva muy til en microbiologa con fines de uso industrial. Debido a la
fuente fructoflica de los mostos de agave el aislamiento de levaduras con caractersticas
fructoflicas y de produccin de etanol adems de tolerancia a altas concentraciones de etanol,
son susceptibles de ser usadas en otros modelos fermentativos, como lo son los mostos de uva
ya que la composicin de estos es aproximadamente 100 g/L de glucosa y 100g/L de fructosa,
siendo esta ultima una azcar residual de alta concentracin al final de la fermentacin.

Por lo que es de gran relevancia la evaluacin de la cepa 3Y3, 3Y5 3Y8 en mostos de
agave, as como en mostos de uva con un fin productivo para mezcal y vinos de mesa ya que
es necesario encontrar cepas de S. cerevisiae productivas y adaptadas a las diversas
condiciones de fermentacin por que la calidad de estas bebidas alcohlicas depende entre
otras cosas al rpido establecimiento y la eficiencia de la levadura durante la fermentacin.

Los resultados obtenidos del anlisis de las secuencias de los transportadores mostraron
que las cepas con mayor consumo de azcares reductores presentaron un mayor despliegue de
polimorfismos relacionados con cambios en la regin interna del poro y/o en las regiones
regulatorias de acuerdo a la literatura. La cepa 3Y8 present el mayor nmero de cambios
importantes en Hxt1, Para el HXT3 los polimorfismos analizados mostraron en todas las
cepas menores cambios en relacin a la Fermichamp y en lo particular para las cepas
analizadas con ms detalle (3Y3, 3Y5, 3Y8) se present el polimorfismo Val432Cys. Los
resultados obtenidos en el anlisis de los HXT1 y HXT3, sugieren la necesidad de realizar
estudios de expresin y mutagnesis en sitio dirigida para determinar las capacidades
fructoflicas de cepas de S. cerevisiae aisladas de mostos de mezcal.
104

10 APNDICES

Apndice 1. Microfotografas de las levaduras Saccharomyces cerevisiae aisladas de mosto
de mezcal.

Figura 34. Imgenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un microscopio BX-
51 (Olympus, Japn), adquiridas con cmara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular
del microscopio. A) 3D2; B) 3D3; C) 3D4; D) 3D5; E) 3D6.

A B
C D
E
105

Figura 35. Imgenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un microscopio BX-
51 (Olympus, Japn), adquiridas con cmara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular
del microscopio. F) 3Y2; G) 3Y3; H) 3Y4; I) 3Y5; J) 3Y6; K) 3Y8.

F G
H
I
J
K
106
Apndice 2. Secuencias 26S de las levaduras aislados de mostos de mezcal.

>3D2 Saccharomyces cerevisiae
CCGGGGTTGCCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG
GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT
GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT
CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG
AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG
TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC
TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG
TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG
GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACC

GGGGCATGGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACCC

AGGGAATCCCTTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG
107
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACCGCGAACCA

CGGGGAATGCCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTG

GGGGAAAAGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG
TACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGT
CTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA
GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTC
TAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACACACGGGACCA

108
>3Y2 Saccharomyces cerevisiae
CGGTATgCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCTAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACC
TTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTcTAT
GTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGC
GGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAG
TGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACA
AGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGT
GAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGC
TCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGC
AGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAA
TACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATG
GTTATATGCCGCCCGTCTTGAAAAACCCGGAACCAAA

CAAAGGGAATGCTTATACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAAATCTG
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACCACGGACCAAAA

CGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGT
ACCTTCGGTGCCCSAgTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGtCT
aTGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTG
CGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAA
GTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAAC
AAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTAC
GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCT
109
GCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTG
GCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGG
AATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAA
TGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAA

ACAGGGGGATGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG
CTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA
GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTC
TAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG
AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTG

CgGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG
CTATgTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAG
TGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCT
AAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGA
ACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGT
ACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCT
CTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGT
GGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGG
GAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATA
ATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACAAACGGACCAA

110
Apndice 3. Secuencias ITSs de las levaduras aisladas de mostos de mezcal

ATATTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGCAA
GAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGGGGGGTCTTGC
TAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTT
GTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTT
TGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAA
AGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAA
ATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAA
GAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCG
AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAG
CGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAA
CTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTG
CGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTA
ATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGG
CGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAA

CAAATTTGATAATTTTGAAATGGATTTTTTTATTTTTGGGAATGGAGAGCGAGCTT
TTACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTG
CGCGGCCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTGGGCATACAAAACGGGGAGAGTT
TTCGGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAGCACTAGGGGGT
ATTTTCCTATCTTTTCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCAAGAGG
TAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTT
TCGTAACAGGAATTTTGAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC
TCGCATCGATGAAAAACACATCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTC
CKGGAATCATCGAATCTTTGAACGCTAATTGTTCCCTTTGGTATTCCTGGGGGCTT
GGGTGTTGGAGCGAAATTACCTACCCAAAGATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACT
CTTTGTAATAAATTTTAACTAAACGGCCTTTTCATTGAAATTTTTTTTTCTAAAAAT
TGGTTCCACGGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCTTTTTGGGTTTAACCA
CCTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAATAAGAA
AGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAAACGGGKAGGAAGAC
CCCCCTGAACTTAAGCTTCACTAAGAGCGGGGGAAGATAAA
111

CAAAGATTATATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAACAAGAGAGCTTTT
ACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCG
CGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTC
TGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTT
TCAAATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAA
CAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCG
TAACKGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCG
CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTCCG
GGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCAKG
CCTGTTTAAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCT
TTGGAGTTAACTTGAAATKGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGA
GGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAA
CTGCGGCTAATCTTTTTTTATACCGGAGCGTTTTGGAACGTTTTCGAAAAAAAAA
AAGCGTCCTAGGCGAACAATTGTTTTAAAGTTTGACCCTCAAATCAGGTAGGAGK
ACCCCGCTGAACTAGCCTAAAAAGAGGGCGGGGGGAGAGAGTACAAAATTTTTA
TATTTTTGTAAAATGGAATTTTTTTTTTTTTTTTGG

CAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGCTAAGAACTGAAGACCTT
TCTCTGGGTAAGAAGACAAAAAAGGGAGAGCCCAGCTGGGCCTGCGCTTAAGGG
CGCGGCTTTGCTAGGTTTGCAAGTTTCTTGCTCGCTCTTCCAAACGGTGAAATATT
TCTGAGCTTTTGTTATAGGACACTTAAAGCCGTTTCATTACATCACGCTGTGGAGT
TTTCACAGCTTAGCAACTTTTTCTTGGGGCTTTCAAGCAAGCGGGGCCCAGAGGT
ACCAAACACAAAAAATTTCATTTCTGCATTAATTTTTAGCCAAAAACAAGAATTT
TCGTAACTGGAAATTTTAAAACATTAAAACCTTACAACAACGGATCACTTGTTTC
TCGCATCGATTAACACCCCACCGAAATGCTAATCGTACTGTGAATTGCAAAATTC
CGTGAATCATCGATTCTTTGAACACACATTGCGCCCCTKGGTATTCCGGGGGGCA
GGCCGGTTTTAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATCCT
CTTAGTAGTTAACTTGAAATTGCCGGCCTTTACCTTGGAGGTTTTTTTTCCAAAAA
TAGTTTCCTCTGCTTGCTTGAGGCATAATGCAAGTACGGTCTTTTTAGGTTTAACC
ACCAGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCCAAAAAAAAA
112
AAGCTTCTAGGCCAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAACCAGGGAGGAGTCC
CCGCTGAACTTAACCATTCAAAAAAGCGGAGGAAAAAAAG

CAGTAATAGTTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTAC
TGGGCAAGAAAACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAKTGCGCG
GTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTG
TGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTC
ATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACA
AACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTA
ACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT
CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGA
ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTKGGTATTCCAGGGGGCATGCCT
GTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTG
GAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGT
TTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTG
CGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTA

ATGATGATTCTTTTCGTTGGGCAAGAGCTGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGAAG
GCGATGGAGAGTCGGCCGGGCCTGCGCTTAAGGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAA
GTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACA
ATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTT
CTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATT
TATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATA
TTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCG
AAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAAC
GCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTT
CTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCT
GGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGT
ATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATAC
TGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTC
TTAAAAGTTTGACCT

113
CAAAGAAAATTAATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAAGCATGAG
AGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTT
AAGTGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAG
AGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGT
GGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAG
AGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGA
ATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG
TTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGA
ATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGG
GGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGA
TACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAA
AGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTT
ACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACCGAGCGTATTGGAACGTTATCGAAAAAA
AAAGAGCGTCTAGGCGAACAAGGTTTTAAAAGTTTGCCTC

TATGATGATTTTTTTCGTTGGGCAAGAGCGGAGGTTACGGAAAAAAAAGAAGGG
AGAGCAGCGGGCTGCGTTAAGTGGGGGCTGGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTG
CTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGAAAATTAAAACCGTT
TCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTC
GAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAAT
TTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTC
AACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACG
TAATGTGAATTGCAGAATTCCKTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC
CCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCT
GTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATT
GGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTA
CGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGG
AACGTTATCGATAAGAAAAAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTT

TAAATTTATAATTTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTT
TTACTGGGCAAGAAGAAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGC
114
GCGGTTTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTT
CTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTT
TTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAA
CAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCG
TAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGC
ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGT
GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGC
CTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTT
GGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGG
TTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACT
GCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGC
GTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGC
TGAACTTAAGCATATCAATAAACGGGGGAAAAGATCATTAAAGAAATTTAATAA
TTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCMARGGCATGGAGAGCTTTT

115
Apndice 4. Comparacin de las secuencia de los genes HXT1 de las levaduras seleccionadas
por su fructofilia.

Figura 36. Alineamiento Clustal, secuencia de aminocidos del gen HXT1 de aislados de
mostos de mezcal y Fermichamp en referencia a S288c. Indica residuo de aminocido
idntico; color rojo indica cambio en el aminocido.

116
Apndice 5. Comparacin de las secuencia de los genes HXT3 de las levaduras seleccionadas
por su fructofilia.

Figura 37. Alineamiento Clustal, secuencia de aminocidos del gen hxt3 de Aislados de
Mostos de Mezcal y Fermichamp en referencia a S288c. Indica residuo de aminocido
idntico; color rojo indica cambio en el aminocido

117

11 LITERATURA CITADA

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135

12 RESUMEN BIOGRFICO

Amanda Alejandra Oliva Hernndez
Candidata para el Grado de Doctor en Ciencias

Tesis: EVALUACIN CINTICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS
FRUCTOFLICAS AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO

Campo de Estudio: Biotecnologa con acentuacin en Microbiologa

Datos Personales: Nacida en Reynosa, Tamaulipas el 3 de Mayo de 1968, hija de Amanda
Leticia Hernndez Monreal y Gerardo Enrique Oliva Guzmn

Educacin: Egresada del Tecnolgico de Estudios Superiores de Monterrey, grado
obtenido Ingeniera Agrnoma en Produccin en 1993.

Egresada de la Universidad Autnoma de Tamaulipas, grado obtenido Maestra en
Ciencia y Tecnologa de Alimentos en 2007.

Experiencia Profesional: Puesto de Profesor Asociado C de Tiempo Completo en el
Instituto Politcnico Nacional, desde el 2003, asociada de investigacin en el
Laboratorio de Biotecnologa Industrial (CBG-IPN).

PRODUCTIVIDAD

Presentaciones orales en congresos nacionales e internacionales

De la Torre F. J., Guido N., Oliva-Hernndez A., Narvez-Zapata Jos A. y Larralde-
Corona P. (2010) Monitoreo por tcnicas moleculares (FISH y ARISA) de un
cultivo mixto de levaduras durante la fermentacin del mosto de agave. 7 Encuentro
Nacional de Biotecnologa del IPN. 11 al 13 de Octubre 2010. Mazatln, Sinaloa.

136
De la Torre- Gonzlez F, Tarqui-Callejas N., Oliva-Hernndez A., Narvez-Zapata J.,
Larralde-Corona P. 2012. Determinacin de la Tolerancia de Tres Especies de
Levaduras Aisladas del Mezcal Tamaulipeco. VII Congreso Nacional y XXVIII
Internacional de Ingeniera Bioqumica.. 28, 29 y 30 de Marzo. Ixtapa Zihuatanejo,
Guerrero, Mxico.

Artculos cientficos indexados

Amanda A. Oliva Hernndez, Patricia Taillandier, Diana Resndez Prez, Jos A.
Narvez Zapata, Claudia Patricia Larralde Corona. The effect of hexose ratios on
metabolite production of Saccharomyces cerevisiae strains obtained from the
spontaneous fermentation of mezcal. En prensa: Antonie van Leeuwenhoek Journal
of Microbiology, DOI 10.1007/s10482-012-9865-1

Flores-Magalln R., Oliva-Hernndez A.A., Narvez-Zapata J.A. (2011).
Characterization of microbial traits involved with the elaboration of the Cotija
cheese. Food Science and Biotechnology 20(4): 997-1003.

Larralde-Corona C.P., Ramrez-Gonzalez S., Oliva-Hernndez A., Prez-Snchez G.
Narvez-Zapata J.A. (2011). Identification of differentially expressed genes in the
citrus epiphytic-yeast Pichia guilliermondii during interaction with Penicillium
digitatum. Biological Control 57: 208-214.

Reyes-Lpez, M. A., Salazar-Marroqun, E. L., Oliva-Hernndez, A. A., Salinas-Lpez,
N., Narvez-Zapata, J. A. (2009) White-spot syndrome virus diagnostic in frozen
shrimp stocks imported to Mexico. CyTA Journal of Food 7: 89-94.

Captulos en libros institucionales

Arratia-Mireles J. M., Larralde-Corona C.P., Oliva-Hernndez A. A., Narvez-Zapata
J.A. (2009) Estudio de la diversidad de levaduras asociadas a los mostos de mezcal.
En: Avances en el Estudio de la Biotecnologa. Narvez Zapata J. A., Villegas-
Hernndez M. C. & Mendoza Herrera A. Editorial Politcnico. 2009. ISBN: 978-
607-414-060-6. pp: 42-45.

Oliva-Hernndez A. A, Narvez-Zapata J.A., Resendez D., Taillander P., Larralde-
Corona C.P. (2009) Evaluacin de levaduras fructoflicas aisladas del mezcal
tamaulipeco. En: Avances en el Estudio de la Biotecnologa. Narvez Zapata J. A.,
Villegas-Hernndez M. C. & Mendoza Herrera A. Editorial Politcnico. 2009.
ISBN: 978-607-414-060-6. pp: 191-194.

Posters en congresos nacionales e internacionales
137

Larralde-Corona C.P., Oliva-Hernndez A.A., Narvez-Zapata J.A., Resendez-Prez D. y
Taillander P. 2009. Caracterizacin productiva de levaduras fructoflicas aisladas del
mezcal Tamaulipeco. XIII Congreso nacional de Biotecnologa y Bioingeniera y el
VII Simposio Internacional de Produccin de Alcoholes y Levaduras (SIPAL). Del
21 al 26 de Junio. Acapulco, Guerrero, Mxico. Poster

Arratia-Mireles M., Oliva-Hernndez A., De la Torre-Gonzlez F., Trujillo-Negreros E.,
Narvez-Zapata J.A. y Larrralde-Corona C.P. (2009). Diversidad gentica y
capacidad fermentativa de levaduras involucradas en la produccin del mezcal
tamulipeco. XIII Congreso nacional de Biotecnologa y Bioingeniera y el VII
Simposio Internacional de Produccin de Alcoholes y Levaduras (SIPAL). Del 21 al
26 de Junio. Acapulco, Guerrero, Mxico.

Oliva Amanda, Narvez Jos, Resendez Diana, Strehaiano Pierre, Taillandier Patricia,
Larralde Patricia. 2009. Mezcal fermentation: yeast diversity and their productive
characterization on high fructose synthetic medium and Agave must. 27th
International Specialised Symposium on Yeasts. Institut Pasteur. Paris, France.

De la Torre-Gonzlez F. J., Narvez-Zapata Jos A., Oliva-Hernndez A. y Larralde-
Corona C.P. 2010 Caracterizacin de la cintica de cultivos mixtos de levaduras
aisladas del mezcal Tamaulipeco. XXXVII Congreso Nacional de Microbiologa. 29
de junio al 2 de Julio. Morelia, Michoacn. Mxico

Oliva-Hernndez A., Resendez D., Taillandier P., Narvez-Zapata J., Larralde-Corona
C.P. 2011. Fructose utilization by yeasts isolated from agave must. 29th
International Specialised Symposium on Yeasts. Guadalajara, Jalisco. Mxico

Narvez-Zapata J., Segura-Cabrera A., Oliva-Hernndez A., Larralde-Corona C.P. 2011.
Predictive homoplasic sites in HXT1 and HXT3 transporters related to fructophilic
profiles in yeasts isolated from agave must. 29th International Specialised
Symposium on Yeasts. Guadalajara, Jalisco. Mxico..

Estancias de investigacin

Estancia de Investigacin de 3 meses en "Laboratoire de Gnie Chimique UMR CNRS
5503" . INP-Toulouse, Francia. 2007.

Estancia de Investigacin de 3 meses en "Laboratoire de Gnie Chimique UMR CNRS
5503". INP-Toulouse, Francia. 2009.

138
Rsum

Au Mexique ltat de Tamaulipas est susceptible de devenir l'un des plus grands producteurs
de mezcal. Contrairement dautres boissons alcoolises, la mycoflore responsable de la
fermentation alcoolique du mezcal n'a pas t pleinement identifie ou caractrise
mtaboliquement. Il est d'un grand intrt industriel de savoir si les levures indignes
impliques dans la fermentation de mots dagave ont une forte nature fructophilique qui
serait induite par la composition naturelle riche en fructose du mot. De plus, la
caractrisation cintique des levures et au niveau molculaire des transporteurs impliqus
dans la consommation de fructose par cette flore est pertinente tant donn que des tudes sur
l'utilisation des hexoses par Saccharomyces cerevisiae nont pas montr que les transporteurs
de glucose et de fructose taient diffrents. Dans ce travail, la population levurienne tudie
tait de 17 isolats, partir de 103 initialement isols de la mezcaleria "El Palmar" Emilio
Lozoya, situ San Carlos (Tamaulipas, Mexique) au niveau de diffrentes tapes. Seules les
levures de lespce Saccharomyces cerevisiae ont t retenues et tudies. En particulier de
polymorphismes des 2 gnes des transporteurs principaux de sucres associes au fructose
consume HXT1 et HXT3, a t valu en comparaison une souche de rfrence. Les
rsultats obtenus dans cette tude suggrent la ncessit d'une analyse approfondie afin de
prciser les liens entre la fructophilie et l'expression et / ou la structure des gnes des
transporteurs de sucres lors de la fermentation alcoolique.

Mots cls: Mezcal, Saccharomyces cerevisiae, transporteurs dhexoses HXT, fructophile,
fermentation alcoolique

Abstract

The Mexican state of Tamaulipas has the potential to become one of the main producers of
mezcal. But contrary to what is known about other alcoholic beverages, the mycoflora
involved in this alcoholic fermentation has not been completely identified nor characterised
from the metabolic point of view. There is an increasing industrial interest on knowing if the
native yeasts associated to agave must fermentations possess a fructophilic behaviour,
favoured by the natural high fructose composition of the agave musts. Moreover, the kinetic
characterisation of these yeasts and the molecular analysis carried out on the hexose
transporters genes reported to be involved in the glucose and fructose consumption is
pertinent, and several studies on Saccharomyces cerevisiae have demonstrated a differential
preference for each hexose. In this study, a set of 17 yeast isolates were chosen from an
original collection of 103 yeast isolated at the mezcalera El Palmar Emilio Lozoya, which is
located at San Carlos (Tamaulipas, Mexico) from different stages of the fermentation. Only
those belonging to S. cerevisiae specie were studied, mainly concerning the polymorphisms
found on their two main hexose transporter genes associated to a preferential consumption of
fructose, HXT1 and HXT3, and results compared to a control strain. The results obtained
showed that there is no a direct link between the fructophilic phenotype and/or the structure of
these genes and that more studies are needed to establish such relationships.

Keywords: Mezcal, Saccharomyces cerevisiae, hexose transporters HXT, fructophilic,
alcoholic fermentation

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