ATLAS de HISTOLOG IA VEGETAL y ANIMAL

TECNICAS HISTOLOGICAS 1. FIJACION

Pilar Molist Manuel A. Pombal Manuel Meg as Depto. de Biolog a Funcional y Ciencias de la Salud Facultad de Biolog a Universidad de Vigo
(Versi on: Noviembre 2011)

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T ecnicas histol ogicas

Denominamos proceso histol ogico a una serie de m etodos y t ecnicas utilizados para poder estudiar las caracter sticas morfol ogicas y moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos para estudiar los tejidos, es decir, series de t ecnicas que se utilizar an dependiendo de qu e caracter stica deseemos observar. En el siguiente esquema se muestran los m etodos y t ecnicas com unmente empleados para el procesamiento de los tejidos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que existen muchas variantes a estos caminos su elecci on depender a del resultado nal que queramos obtener.
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Figura 1: Esquema del proceso histol ogico dicotiled onea. El proceso histol ogico comienza con la obtenci on del tejido objeto de 3

estudio. En el caso de los tejidos vegetales se toman muestras de los distintos organos que componen el cuerpo de la planta, mientras que para los tejidos animales podemos optar por dos opciones: coger una porci on de dicho tejido o procesar una parte, organo o parte corporal, o el animal completo. En cualquier caso las muestras son habitualmente jadas con unos soluciones l quidas que contienen unas sustancias denominadas jadores, las cuales mantienen las estructuras celulares y moleculares en sus posiciones iniciales durante el procesamiento posterior. Tambi en podemos jar las mol eculas de los tejidos por congelaci on r apida. Fijar un tejido es como si hici esemos una fotograf a del tejido que se mantendr a hasta su observaci on. Sin embargo, el uso de jadores o medios de inclusi on afectan a veces las caracter sticas tisulares que queremos observar y por tanto tenemos que recurrir a la congelaci on para endurecer el tejido para despu es poder obtener secciones del mismo. Normalmente, tras la jaci on se procede a incluir el tejido para posteriormente obtener secciones. Cuanto m as delgada queramos que sea nuestra secci on m as tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con sustancias l quidas que posteriormente polimerizar an (resinas) o se volver an consistentes (ceras). Tambi en se puede conseguir el mismo efecto mediante congelaci on r apida. Cortes m as gruesos de 40 m se pueden cortar sin necesidad de inclusi on usando el vibratomo. Los medios de inclusi on son normalmente no hidrosolubles por lo que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes org anicos liposolubles y posteriormente a nadir el medio de inclusi on. Tras la inclusi on o la congelaci on se procede a cortar los tejidos. Existen diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultranas (del orden de nanometros), seminas (de 0.5 a 2 m), nas (entre unas 3 y 10 m) y gruesos (mayores a 10 m). Estas secciones hay que procesarlas para poder observarlas, aunque ciertos tipos de microscop a, por ejemplo con contraste de fase, permiten observar tejidos sin te nir. Normalmente las secciones se ti nen con colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay que eliminar el medio de inclusi on para que los colorantes pueden unirse al tejido. Las secciones, secciones ultranas, que se observan con el microscopio electr onico se pueden contrastar con metales pesados, opacos a los electrones, sin eliminar la resina. Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos tipos b asicos de microscopios: electr onico y optico. Los primeros permiten un gran poder de resoluci on, pudi endose observar caracter sticas ultraestructurales, mientras que los segundos, con menor poder de resoluci on, ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos de observar los 4

tejidos : uorescencia, contraste de fase, polarizaci on o contraste de interferencia diferencial. Como dijimos al comienzo existen m ultiples variaciones sobre este esquema general. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con el microscopio electr onico de barrido sin necesidad de incluir ni cortar, pero s olo observaremos supercies. En las siguientes p aginas veremos con cierto detalle algunas de las t ecnicas m as empleadas para la observaci on de los tejidos.

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FIJACION.

Todos los tejidos, cuando se extraen del organismo o el organismo muere, sufren dos tipos de procesos degradativos: autolisis (acci on de enzimas intracelulares, es decir, autodigesti on) y putrefacci on (acci on bacteriana). Adem as, el procesamiento histol ogico posterior del tejido para poner de maniesto y observar determinadas estructuras supone una metodolog a que puede degradar las estructuras tisulares. Fijar un tejido es preservar sus caracter sticas morfol ogicas y moleculares lo m as parecidas posibles a las que pose a en estado vivo. Es como hacer una fotograf a del tejido vivo y poder observarla, tras cierto tratamiento, con el microscopio. As , los jadores deben proteger frente a ataques bacterianos, evitar autolisis, insolubilizar elementos solubles que se quieren estudiar, evitar distorsiones y retracciones tisulares, prenetrar y modicar el tejido para poder llevar a cabo tinciones espec cas posteriores, si es necesario, etc etera. No existe un jador universal, ni un m etodo de jaci on u nico. Incluso podemos usar varios jadores secuencialmente seg un nuestras necesidades. La elecci on depende de las caracter sticas jadoras que necesitemos. Por ejemplo, si queremos estudiar actividades enzim aticas debemos usar un jador que no nos altere el centro activo de dichas enzimas, y quiz a para ello tengamos que sacricar en cierta medida la morfolog a tisular. Si queremos estudiar la ultraestructura celular debemos usar jadores que la preserven y que protejan a las membranas celulares durante el procesamiento de inclusi on en resinas, y quiz a esto altere su apetencia por los colorantes generales. Si queremos te nir un determinado componente celular dif cilmente te nible quiz a debamos usar un jador que lo modique para que sea reconocido m as f acilmente por los colorantes. En cualquier caso, hay caracter sticas de los jadores que tenemos que tener en cuenta antes de su uso: Velocidad de penetraci on. El proceso de jaci on ha de ser r apido y la velocidad de difusi on de la sustancia jadora en los tejidos es un factor determinante. Este par ametro condiciona el tama no de la pieza que queramos jar, m as peque na cuanto menor la velocidad de difusi on, y el tiempo de jaci on, mayor cuanto menor tiempo de difusi on. Velocidad de jaci on. Esta caracter stica no dependen de la velocidad de difusi on sino de las propiedades qu micas del jador y condiciona el tiempo que debe permanecer el tejido en contacto con el jador. Endurecimiento. Los jadores generalmente endurecen los tejidos, lo cual depende del tipo de jador y del tiempo que el tejido haya estado 6

expuesto a el. Osmosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en la c elulas producidos por una osmolaridad del jador diferente a la del tejido. Por tanto, hay que equilibrar la osmolaridad de las soluciones jadoras y la de los tejidos a jar. No es necesario a nadir sustancias complejas. Por ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta con a nadir 0.9 % de cloruro s odico. Son sales que no afectan a la capacidad del jador. Normalmente se suelen usar soluciones tamponadas a un pH semejante al del tejido e isoosm oticas con dicho tejido. Efecto mordiente. Algunas estructuras tisulares son dif ciles de te nir puesto que tienen poca apetencia por los colorantes, pero puede ser incrementada con un tratamiento previo. Algunos jadores, adem as de jar, modican qu micamente a ciertas estructuras celulares para que posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes. Este este tipo de modicaci on qu mica se le denomina efecto mordiente. Artefactos. Los procesos de jaci on pueden acarrear alteraciones tisulares como variaciones morfol ogicas, cristalizaci on de compuestos, desplazamiento de sustancias, etc etera. Estos cambios pueden producirse por las caracter sticas del jador o por un mal uso de este. En cualquier caso deben tenerse en cuenta para no describir como caracter sticas tisulares lo que es un artefacto introducido durante la jaci on.

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METODOS de FIJACION.

Existen diferentes formas de jar los tejidos, dependiendo del tipo de jador, de la estructura a jar y de lo queramos observar. Los m etodos de jaci on se pueden clasicar en dos tipos: f sicos y qu micos. Los jadores f sicos est an basados en una congelaci on muy r apida del tejido, en la aplicaci on de calor o microondas. Se utilizan cuando el tipo de muestra lo requiere, cuando los jadores qu micos alteran la estructuras que queremos observar, o cuando necesitamos una jaci on muy r apida. La congelaci on r apida es un buen m etodo de preservaci on de las carater sticas moleculares y es conveniente que sea r apida puesto que as se impide la formaci on de grandes cristales de hielo que nos destrozar an la estructura del tejido. Existen variantes de esta t ecnica como son la criodesecaci on o liolizaci on y la criosustituci on. La criodesecaci on parte de tejido previamente congelado, pero posteriormente se realiza una sublimaci on del hielo, es decir, el agua pasa de estado s olido a gaseoso sin pasar por estado l quido. Al eliminar el agua se impide que se den reacciones qu micas por lo que adem as de la jaci on preserva el tejido en el tiempo. La criosustituci on tambi en parte de tejido congelado pero en este caso se produce una sustituci on lenta del hielo por una soluci on jadora. Con ello se posibilita una jaci on qu mica sobre un material que no ha sufrido deterioro puesto que est a congelado. Los m etodos de jaci on por calor de jaci on no son frecuentemente usados, excepto para observar microorganismos. Los m etodos qu micos utilizan soluciones acuosas compuestas por mol eculas jadoras que establecen puentes entre las mol eculas celulares, manteni endolas en sus lugares originales e impidiendo su degradaci on. Hay dos m etodos de jaci on con jadores l quidos: inmersi on y perfusi on. En cualquier caso el jador debe entrar en contacto con el tejido lo m as r apidamente posible. Inmersi on. Por el m etodo de inmersi on las piezas de tejido se sumergen en la soluci on jadora. Tenemos que tener en cuenta algunas precauciones. 1) Las piezas de tejido no deber an superar los 0.5 cm de espesor para que el jador alcance el interior de la pieza antes de que esta comience a deteriorarse. Esto depende de la velocidad de penetraci on del jador y de las caracter sticas del tejido, por ejemplo, si tiene cavidades por donde penetre la soluci on jadora. 2) El volumen recomendado de jador debe ser 20 veces superior al volumen de la pieza. 3) La osmolaridad entre tejido y soluci on jadora deben estar equilibradas. 8

4) El pH del jador debe ser pr oximo al siol ogico. 5) El tiempo de jaci on depende de cada tipo de jador, pero generalmente existe un tiempo m aximo para cada uno de ellos que no debe ser excedido.

Figura 2: Fijaci on por inmersi on. Perfusi on. Por este procedimiento la soluci on jadora se introduce a trav es del sistema circulatorio mediante el cual accede a todas las c elulas del tejido gracias a la red de capilares. Mediante este m etodo se puede jar un animal completo introduciendo la soluci on jadora a trav es del ventr culo cardiaco, con lo que el jador llegar a a todas las c elulas irriegadas por la sangre bombeada por dicho ventr culo (circuito pulmonar o corporal). Tambi en podemos jar un u nico organo en el caso de que podamos aislar e introducir la soluci on jadora en la arteria principal que irriga dicho organo. La perfusi on no siempre es posible llevarla a cabo, como es el caso de biopsias o tejidos vegetales. Este m etodo es mucho m as efectivo que el de inmersi on, ya que la soluci on jadora llega a escasa distancia de todas las c elulas de la estructura perfundida. Por tanto, la velocidad de penetraci on del jador no es una condici on limitante. El volumen de jador necesario tambi en es menor puesto que la soluci on jadora se va renovando constantemente y por tanto no se diluye con el medio acuoso del tejido y no pierde potencial jador. Antes de introducir el jador en el sistema de vasos sangu neos hay eliminar previamente la sangre con una soluci on de lavado oxigenada, de otra manera su interacci on con el jador produce trombos que impedir an la jaci on de determinadas zonas del animal o del organo. Respecto a las precauciones mencionadas anteriormente en el m etodo de inmersi on debemos cuidar aqu tambi en la osmolaridad, el pH y el tiempo de jaci on. Este m etodo de jaci on requiere conocer la presi on a la que se va a introducir la soluci on jadora en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la que posee la presi on sangu nea normal en estado vivo. La presi on que ejercer a la soluci on jadora se puede regular mediante bombas perist alticas (ver gura) o por gravedad, es decir, variando la altura a la 9

Figura 3: Fijaci on por inmersi on. cual se coloca la soluci on jadora respecto a la del animal. Esto es importante porque una presi on muy baja prodr a impedir que la soluci on jadora alcanzara todas las partes de la estructura y un presi on muy alta podr a provocar roturas de los vasos sangu neos y de la propia estructura tisular.

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Figura 4: Fijaci on por perfusi on de un organismos completo. Mediante este tipo de

perfusi on se introduce la soluci on jadora en el sistema sangu neo. La bomba perist altica aporta la presi on suciente permitiendo al jador entrar a trav es del ventr culo izquierdo (Vi) y pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar por la red capilar, la soluci on jadora pasa a los vasos venosos que terminan por verter su contenido en la aur cula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una abertura para que la soluci on jadora, una vez realizada su funci on, salga del circuito. Ai: aur cula izquierda; Vd: ventr culo derecho.

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4.

FIJADORES.

Existen multitud de jadores en los manuales de t ecnicas histol ogicas. Aqu s olo trataremos aquellos que consideramos de uso m as com un para la observaci on de tejidos al microscopio, es decir, aquellos que mejor preserven la estructura celular. Los jadores qu micos son los m as frecuentemente empleados, bien con un solo tipo de sustancia jadora o con mezclas de varias de ellas. Atenci on! La mayor a de las sustancias jadoras son t oxicas por inhalaci on o por contacto, algunas de ellas cancer genas. Hay que seguir las indicaciones de seguridad para su manejo y utilizaci on. Fijadores simples

Figura 5: Etanol: CH3 -CH2 -OH Alcohol et lico. Fija por deshidrataci on y se usa entre el 70 y 90 %. Es un buen elemento para preservar mol eculas, como ciertas enzimas, propiedades antig enicas, gluc ogeno, pigmentos y para las extensiones citol ogicas. Debido a que deshidrata, a la vez que ja, se puede usar tambi en como un conservante de las muestras. Tiene inconvenientes como el endurecimiento y la retracci on de los tejidos. Carece de efecto mordiente.

Figura 6: Acido ac etico: CH3 COOH

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 Acido ac etico. Su proceso de jaci on consiste en cambiar el estado coloidal de las prote nas. Se utiliza a una concentraci on que var a entre el 1 y el 5 %. Es el jador ideal para acidos nucleicos y nucleoprote nas. Como inconvenientes cabe destacar la destrucci on de las mitocondrias y mala jaci on de membranas y citoplasma. Se suele usar en combinaci on con otros jadores

Figura 7: Acido p crico: C6 H2 OH(NO2 )3

Acido p crico. La jaci on la produce porque sales del tipo picrato coagulan con las prote nas de los tejidos. Se suele usar el 2 % de una soluci on saturada de acido p crico. Preserva bien la estructura celular, no produce retracciones cuando el tiempo de jaci on es optimo, preserva bien gluc ogeno y l pidos. Es un buen jador para tinciones generales puesto que favorece la uni on de los colorantes. Hay que eliminarlo completamente antes de proceder a la inclusi on en ceras como la parana. Se suele usar combinado con otros jadores.

Figura 8: Formaldeh do: CH2 =O Formaldeh do. Act ua mediante la formaci on de puentes entre las mol eculas tisulares. Se utiliza a concentraciones pr oximas al 4 %. Es un jador ampliamente usado por la buena preservaci on del tejido, act ua como conservante, produce poca retracci on tisular, es un buen jador para l pidos, es compatible con la mayor a de las tinciones histol ogicas, incluidas las de inmunocitoqu mica e hibridaci on de acidos ribonucleicos. 13

Normalmente se usa en soluci on tamponada e isot onica.

Figura 9: Glutaraldeh do Glutaraldeh do. Forma puentes entre las mol eculas de los tejidos. Se usa a una proporci on de entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular, por lo que es el jador de referencia para observaci on de ultraestructuras celulares con el microscopio electr onico. Pero hay que tener cuidado con su baja penetraci on tisular y puede producir retracciones. Se usa en soluciones tamponadas isot onicas.

Figura 10: Tetr oxido de osmio. OsO4 Tetr oxido de osmio. Forma puentes entre mol eculas. Se emplea al 1 % en soluciones tamponadas. Es buen jador de la ultraestructura de la c elula por lo que se emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio electr onico. Es un buen jador para grasas y membranas celulares. Por su fuerte car acter oxidante no se usa para tinciones convencionales, excepto para las impregnaciones arg enticas como el m etodo de Golgi. Mezclas jadoras La mayor parte de los procesos de jaci on usan distintas sustancias 14

jadoras, bien mezcladas en la soluci on acuosa inicial o utilizadas sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las ventajas de cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas. Hay multitud de formas de usar los diferentes jadores, tanto en sus componentes como en las proporciones de estos, dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, qu e tipo de tejido queremos jar y qu e queremos ver de dicho tejido. A continuaci on vamos a mencionar algunas combinaciones usadas frecuentemente porque tienen unas propiedades de jaci on que las hace apropiadas para las observaci on de una gran variedad de tejidos y de t ecnicas de tinci on. L quido de BOUIN : Est a formado por acido p crico, formaldeh do y acido ac etico glacial. Es una soluci on muy utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluir an en parana (ver cap tulo de inclusi on) y a cuyas secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones. Es muy u til para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el n ucleo y el gluc ogeno. Hay que tener cuidado con el tiempo de jaci on, que no debe exceder de 48 h en el caso de jaciones por inmersi on. Tras la jaci on las muestras de tejido se pueden conservar en alcohol de 70 . No est a recomendado para el ri n on ni para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusi on en parana es conveniente eliminar el acido p crico mediante lavados en alcohol de 70 porque puede hacer que no se produzca una buena inclusi on o que las tinciones no sean adecuadas. Karnoy : Es un buen jador para el gluc ogeno, para los hidratos de carbono simples y para las prote nas brosas. Es bueno para visualizar los acidos nucleicos, aunque no la morfolog a nuclear, y para los grumos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Est a formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y acido ac etico glacial 10 %. Mezclas con formaldeh do : El formaldeh do es quiz a el jador m as usado hoy en d a, tanto para t ecnicas histol ogicas rutinarias como para otras como la inmunocitoqu mica o la hibridaci on de acidos nucleicos. Lo m as frecuente es utilizarlo en soluci on al 4 % junto con otros jadores. Por ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende jar. Para jaciones de tejidos destinados a microscop a electr onica se suelen utilizar soluciones jadoras que contienen formaldeh do y glutaraldeh do. La funci on del formaldeh do es iniciar una jaci on r apida, por su mayo capacidad de penetraci on, mientras que el glutaraldeh do realizar a una jaci on m as poderosa, pero m as lenta que afectar a a la estructura tisular puesto que el formaldeh do ya ha realizado una jaci on previa. 15

Glutaraldeh do-tetr oxido de osmio :Los jadores en combinaci on no tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos destinados a microscop a electr onica sean inicialmente jados en glutaraldeh do (1 al 3 %) y paraformaldeh do (2 al 4 %), para posteriormente ser postjados en tetr oxido de osmio al 1 % en soluci on tamponada. Este u ltimo es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre todo membranas, en cooperaci on con los aldhe dos. Esto es importante porque el proceso para microscop a electr onica supone incubar el tejido en solventes org anicos y polimerizaci on de resinas a 60 C, durante las cuales el tejido debe ser preservado.

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