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6. SENSORES BIOLGICOS
6.1 Clasificacin y principios de operacin. Estructura jerrquica de sistemas biolgicos: Molculas pequeas: Aminocidos, cidos nucleicos, agua, lpidos, iones. Procesos importantes: polimerizacin de cidos nucleicos para formar RNA y DNA, polimerizacin de aminocidos para formar protenas. Virus: escala de 20-200 nm, infecciosos pero no se reproducen a s mismos. Bacterias (clulas procariontes): escala de 1-10 m, unicelulares, pueden reproducirse a s mismos (organismos vivientes). Clulas eucariontes: clulas animales y vegetales, escala de 10-100 m, estructura compleja, pueden reproducirse a s mismas y son capaces de ensamblarse para formar tejido.

Construccin jerrquica de organismos vivientes: Clulas. Tejido: generado por diferenciacin y asociacin de clulas. rganos: generado a partir de la organizacin para realizar una funcin especfica. Organismos: generado a partir de la integracin de varias funciones.

Definicin de sensores biolgicos: dispositivos analticos que pueden detectar especies qumicas o biolgicas o tambin microorganismos (nivel molecular). Modos de empleo: a) Monitoreo in vivo de concentraciones de una especie endgena en funcin de cambios fisiolgicos inducidos internamente o por una invasin de un microbio. b) Deteccin de toxinas, bacterias y virus (desarrollo reciente e inters muy grande por guerras biolgicas). Aplicaciones: Diagnstico clnico Desarrollo de frmacos
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Monitoreo ambiental (aire, agua y tierra) Control de calidad en alimentos

Esquema general para biosensado: en general, se utiliza un elemento biolgico de reconocimiento que detecta la presencia de la especie a detectar (analyte) y genera una respuesta fsica o qumica que es convertida a una seal por medio de un transductor.

Muestreo

Bioreconocimiento

Transduccin

Deteccin

Estimulacin

El funcionamiento general se basa en las siguientes etapas (ver diagrama): Muestreo: esta unidad introduce la especie a medir en el detector y puede ser tan simple como un circulador de lquido. Bioreconocimiento: liga o reacciona nicamente con la especie a detectar, lo que provee al sensor con especificidad. Estimulacin: de manera general, puede ser proporcionada por campos pticos, elctricos u otra clase de campos que extraigan una respuesta como resultado del bioreconocimiento. Transduccin: en presencia de la estimulacin, transforma la respuesta fsica o qumica del bioreconocimiento en una seal elctrica u ptica para ser detectada posteriormente por la unidad o etapa de deteccin. Deteccin: puede incluir reconocimiento de patrones para identificacin de la especie a detectar (e.g., red neuronal).

Biosensor ptico: en su forma ms comn, la estimulacin utiliza una onda ptica. El proceso de transduccin induce un cambio en la fase, amplitud, polarizacin o frecuencia de la onda ptica como respuesta a los cambios fsicos o qumicos producidos por el proceso de bioreconocimiento.

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Otros tipos: algunos pueden utilizar estimulacin elctrica para producir transduccin ptica (e.g., sensor electro-luminiscente), o estimulacin ptica para producir transduccin elctrica (e.g., sensor foto-voltico).

Los primeros biosensores se basaban en respuestas electroqumicas, y en la actualidad son los que dominan el mercado. Sin embargo, los progresos en fibras pticas y

dispositivos de ptica integrada, en conjunto con el desarrollo de sistemas lser semiconductores, han hecho de los biosensores pticos una opcin muy atractiva para muchas aplicaciones. La sensibilidad en este tipo de biosensores se incrementa gracias a la inmovilizacin del elemento de bioreconocimiento en un elemento ptico tal como una fibra, una gua de onda o en dispositivos para propagacin de plasmones superficiales.

Componentes principales de un biosensor ptico: Fuente de luz Medio de transmisin ptico (fibra, gua de onda) Elemento de bioreconocimiento inmovilizado (enzimas, anticuerpos o microbios) Sondas pticas para transduccin (e.g., marcadores fluorescentes). Sistema de deteccin ptico

Ventajas ofrecidas por biosensores pticos: Alta selectividad y especificidad Sensado remoto Aislamiento de interferencia electromagntica Mediciones rpidas (tiempo real) Deteccin multicanal/multiparmetro Invasin mnima (til para mediciones in vivo) Eleccin de componentes pticos para bio-compatibilidad Informacin qumica detallada sobre la especie a detectar.

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3.2 Elementos fundamentales: principio de biosensado ptico. Principios fundamentales: bioreconocimiento y transduccin ptica. 3.2.1 Reconocimiento biolgico. Los elementos de bioreconocimiento son sustancias biolgicas tales como enzimas, anticuerpos e inclusive clulas y microorganismos, que reconocen selectivamente a una especie biolgica en particular. Estos elementos son frecuentemente inmovilizados en la vecindad de un elemento ptico con el fin de incrementar su concentracin local y tambin para permitir su reciclaje. Enzimas. Se utiliza como bioreconocedor por su selectividad para ligarse con reactivos especficos (sustrato) y catalizar su conversin a un producto. Adems de selectividad, ciertas reacciones pueden proveer de transduccin ptica a travs de un producto que absorba a una longitud de onda diferente (cambio en absorcin), o bien produzca fluorescencia. Alternativamente, la reaccin puede interactuar con un tinte orgnico para producir una respuesta ptica. Anticuerpos. Son protenas que se ligan de manera selectiva con un antgeno gracias a su compatibilidad geomtrica. Generalmente esta asociacin selectiva se representa como la combinacin de un candado (anticuerpo) y una llave (antgeno). Esta asociacin fsica puede tambin producir una respuesta ptica que puede ser intrnseca como el cambio de una propiedad ptica del anticuerpo o del antgeno como resultado de la asociacin. utilizarse tambin marcadores fluorescentes. Alternativamente, pueden

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Lecitinas. Son protenas que se ligan con residuos de azcares o tambin con otros tipos de protenas. Han sido las ms utilizadas para el desarrollo de

sensores de glucosa en los que generalmente se utilizan marcadores fluorescentes para producir una respuesta ptica.

Neuroreceptores. Estos son compuestos que son neurolgicamente activos como la insulina, hormonas y neurotransmisores que actan como mensajeros a travs de interacciones entre las ligas. Se etiquetan con marcadores

fluorescentes para producir una respuesta ptica a travs de la reaccin qumica.

DNA/PNA. La paridad complementaria que proporciona la estructura del DNA puede ser utilizada para reconocimiento de una secuencia para ciertas bases de cidos nucleicos. El PNA es otro tipo de cido nucleico que presenta tambin una estructura ordenada y que se liga con su secuencia complementaria con gran afinidad y especificidad.

3.2.2 Transduccin ptica. Existen diversas manifestaciones de tipo ptico que puede crear la etapa de bioreconocimiento bajo la presencia de una especie a detectar (analyte) cuando esta se excita con una onda de luz. Algunos de los principios de transduccin pticos utilizados para biosensado se listan a continuacin.

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Cambios de fase: producidos por el cambio en la parte real del ndice de refraccin. Pueden manifestarse como: i) ii) Cambio en la polarizacin de un haz polarizado linealmente Cambio en las caractersticas de propagacin de una gua de onda (fibra o plana) iii) Cambio en la distribucin del campo ptico, particularmente en una interfaz (onda evanescente).

Cambios en amplitud: son los cambios en la intensidad del haz de luz que pueden producirse por absorcin, reflexin u otros mecanismos de prdidas de transmisin.

Cambios en frecuencia: se puede utilizar fluorescencia generada por luz absorbida (la fluorescencia generalmente se presenta desplazada a longitudes de onda mayores por el efecto de Stokes), o bien utilizar dispersin de Raman (excitacin por vibraciones). Tambin puede utilizarse algn efecto no lineal.

3.2.3 Mediciones fluorescentes. Las mediciones fluorescentes pueden realizarse de manera directa o indirecta. Sensado directo: registra directamente el cambio en las propiedades fluorescentes debido a la liga entre la especia a detectar y el elemento de bioreconocimiento (anticuerpo o enzima), o bien, registra la produccin de alguna propiedad fluorescente generada por la reaccin de una enzima especfica catalizada.

Sensado indirecto: se utiliza como etiqueta fluorescente un tinte externo cuyas propiedades de fluorescencia cambian en respuesta al bioreconocimiento de una especie.

3.3 Elementos para inmovilizacin. Los elementos de bioreconocimiento se inmovilizan generalmente sobre un soporte slido, por ejemplo, membranas, polmeros o vidrios fabricados con el proceso de sol-gel. Los mtodos para inmovilizar pueden ser de carcter fsico, qumico y, en algunos casos,

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pueden tambin basarse en la confinacin de bioreconocedores en el volumen de una matriz con porosidad controlada (el tamao del poro proporciona tambin especificidad).

Mtodos de inmovilizacin.

Membranas semipermeables. Utilizadas en muchos sensores de fibra ptica; es el mtodo ms simple. Adsorcin. Se basa en la atraccin de la biomolcula por medio de fuerzas inicas, hidrofbicas o de van der Waal (depende de la naturaleza de la molcula). Se utiliza mucho en sensores de pH y es un mtodo muy simple aunque carece de especificidad. Otras desventajas: variacin en la densidad de material adherido y prdida de bioreconocedores por desorcin.

Ligado inico. Se basa en interacciones electrostticas entre el soporte slido y el bioreconocedor. La polaridad o la carga del bioreconocedor puede ajustarse mediante el pH, mientras que en el soporte se utiliza un polmero con cargas generalmente negativas.

Trampas fsicas. El bioreconocedor queda atrapado en una matriz porosa. Este mtodo es de los ms flexibles y permite disear sensores para diversas molculas gracias al control del tamao de los poros. La desventaja ms importante de este mtodo es que no puede controlarse la orientacin de los bioreconocedores y algunos quedan atrapados en la matriz sin ejercer accin alguna sobre la molcula.

Inmovilizacin qumica. Se basa en la formacin de un enlace covalente entre el soporte slido y el bioreconocedor. Se utiliza mucho en sensores de fibra ptica, en sensores SPR.

3.4 Tipos de sensores. Los biosensores pueden clasificarse de acuerdo a la tcnica ptica utilizada para medir, o bien, de acuerdo al dispositivo utilizado para confinar la luz. En algunos casos, el dispositivo utilizado como gua de onda puede incluir al elemento sensor, o tambin pueden presentarse combinaciones de tcnicas especiales con alguna gua de onda en particular (e.g., sensores de fibra ptica utilizando SPR).
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3.4.1 Sensores de fibra ptica. Han sido los ms estudiados debido a la madurez alcanzada por la tecnologa de fibras pticas gracias a los desarrollos en sistemas de comunicaciones. Existen diversos tipos de fibras y dispositivos de fibra ptica que pueden ser utilizados para implementar sensores con topologas diversas. Algunas caractersticas atractivas incluyen: Pueden utilizarse grandes longitudes de fibra; esto permite incrementar la longitud de interaccin adems de la superficie disponible para realizar deteccin de molculas mltiples. Compatibilidad con catteres y/o endoscopios para sensado in vivo. Esto ofrece la posibilidad de realizar mediciones de flujo sanguneo, contenido de glucosa y otras. Algunas clasificaciones de estos sensores: Extrnsecos o intrnsecos. Modulados en intensidad, modulados en fase (generalmente interferomtricos): mientras que los primeros pueden utilizar fuentes de luz no coherentes, los sensores interferomtricos requieren muchas veces de sistemas lser

monomodales y de alta coherencia. Sensores modulados en intensidad: al igual que los sensores basados en fluorescencia, estos elementos utilizan fibras pticas de varios tipos y en las puntas se inmovilizan los elementos de reconocimiento biolgico (e.g., enzimas o anticuerpos). Algunas

configuraciones se muestran en las siguientes figuras. Los sistemas de deteccin pueden ser tan simples como un fotodetector, hasta basarse en tcnicas espectroscpicas (sobre todo de absorcin). Pueden utilizar tambin sistemas de deteccin balanceados (i.e., con sistemas de referencia) u otras tcnicas de supresin de ruido.

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Sensores modulados en fase: Adems de utilizar tcnicas interferomtricas, pueden usarse tambin tcnicas polarimtricas.

3.4.2 Sensores de guas de onda planas. Al igual que en los sensores de fibra ptica, las guas de onda planas utilizan elementos de inmovilizacin en la superficie. La mayora de estos sensores se basan en la

interaccin con la onda evanescente. Ofrecen tambin la posibilidad de realizar anlisis de molculas mltiples por medio de tcnicas de generacin de patrones al inmovilizar diversos bioreconocedores en un arreglo ordenado. De acuerdo a las dimensiones de la gua pueden clasificarse como: Sensor de ptica integrada: las dimensiones de la gua son comparables a la longitud de onda; se utiliza la ptica de ondas para describir la propagacin de la luz en la gua. Se considera adems que los dispositivos de ptica integrada incorporan diversas funciones en un solo sustrato, por lo cual, estos pueden contener ya la etapa de deteccin del biosensor o bien, un arreglo interferomtrico que permita detectar cambios de fase en la onda ptica. Sensor de reflexin total interna: las dimensiones son mucho mayores a la longitud de onda y la propagacin se puede describir mediante ptica de rayos.

Algunas configuraciones demostradas para deteccin de molculas mltiples con guas de onda planas se muestran en las siguientes figuras.

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3.4.3 Sensores de onda evanescente. Estos sensores se basan en la interaccin de las molculas con la luz que no queda confinada en la gua de onda y que penetra la regin de ndice de refraccin menor que rodea al ncleo de la gua (revestimiento, aire o elemento bioreconocedor inmovilizado en la superficie). Algunos de los mecanismos de transduccin que pueden utilizarse con estos sensores son: Conversin de frecuencia (excitacin de fluorescencia, SHG). Acoplamiento de onda evanescente en acopladores direccionales. Espectroscopa con onda evanescente.

Un ejemplo de un arreglo para sensado de fluorescencia se muestra en la figura anterior. Se trata de excitar el campo evanescente adems de recolectar la fluorescencia emitida en la regin que se deja expuesta para colocar los bioreconocedores y fluorforos.

El sensado utilizando acopladores direccionales se basa en alterar el acoplamiento entre las dos fibras o guas que forman el acoplador.
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Esto se logra inmovilizando el

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bioreconocedor en la regin de acoplamiento del dispositivo. Cuando la molcula es atrapada en la regin de sensado, se genera un cambio local de ndice de refraccin que, a su vez, genera cambios en el coeficiente de acoplamiento. Pueden monitorearse cambios en la cantidad de potencia ptica transferida de una gua a otra, la longitud de onda u otros parmetros.

Los sensores de espectroscopa con onda evanescente utilizan la interaccin de esta onda con la capa de sensado para obtener informacin espectroscpica del ligado de las molculas. La informacin puede ser en las bandas de absorcin en el IR (vibracional) o en las regiones UV-visible (electrnicas); puede tambin utilizarse transiciones espectroscpicas de Raman.

3.4.4 Otros tipos: interferomtricos, resonancia superficial de plasmones. Los sensores interferomtricos ms utilizados se basan en el interfermetro de MachZehnder. En estos casos, uno de los brazos del interfermetro se utiliza para inmovilizar el bioreconocedor. El cambio de fase generado por la liga entre la molcula y el

bioreconocedor se registra en el interferograma.

Los sensores SPR son quizs los ms utilizados para aplicaciones biolgicas y existen diversos dispositivos comerciales basados en este principio que pueden encontrarse en el mercado. En principio, esta tcnica es una extensin del sensado por onda evanescente, con la diferencia de que la gua de onda plana se reemplaza por una interfaz metaldielctrico.

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Plasmones superficiales: ondas electromagnticas que se propagan a lo largo de la interfaz entre un material metlico y uno dielctrico (e.g., una pelcula orgnica). La manera ms comn de excitar estas ondas es mediante reflexin total atenuada.

Principio de operacin: el arreglo ms comn utiliza un prisma para generar la excitacin de los plasmones. El ngulo al que se presenta la reflexin total entre la interfaz cambia cuando la molcula se liga con el bioreconocedor. La

informacin que se mide de la curva obtenida es el ngulo SPR, el valor mnimo de reflectividad y el ancho de las curvas de resonancia. Con esto puede obtenerse la parte real y la imaginaria del ndice de refraccin, as como el espesor de la capa sensora. Los experimentos con estos arreglos involucran medir el

desplazamiento del ngulo SPR en funcin del ligado de las molculas.

Algunas ventajas de SPR: no requieren etiquetas fluorescentes, anlisis en tiempo real, requieren cantidades pequeas para realizar el anlisis.

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