ENZIMAS USADAS EN CLONAJE MOLECULAR

1- Enzimas de Restriccin 2.- Otras enzimas

B. Paz 2011-I ( Ing. Biotecnolgica)

MAPA DE RESTRICCION DEL pBR 322

OTRAS ENZIMAS USADAS EN CLONAJE MOLECULAR



Recomendaciones para su uso:

Nunca usar una de estas enzimas en una reaccin que contiene < 0.1 mg/ml de protena. En estos casos usar BSA Trabajan eficientemente slo cuando la concentracin de sustrato es la adecuada. Tratar siempre de trabajar a concentraciones cercanas a la Km. Usar el pH, Temperatura y los requerimientos inicos que les corresponde

RELACION DE ENZIMAS(I)


DNA POLIMERASAS:
DNA POLIMERASA I (Holoenzima) FRAGMENTO KLENOW DE LA DNA POL I DNA POLIMERASA DE T4 DNA POLIMERASA DE T7 Taq DNA POLIMERASA TRANSCRIPTASA REVERSA DNA POLIMERASA TRANSFERASA TERMINAL

RELACION DE ENZIMAS (II)



RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES: LIGASAS QUINASAS FOSFATASAS

RELACION DE ENZIMAS (III)



NUCLEASAS:
Nucleasa Bal 31 Nucleasa S1 Ribonucleasa A Ribonucleasa T1 Desoxirribonucleasa I Exonucleasa III

CARACTERISTICAS DE LAS DNA POLIMERASAS

Son usadas en varias etapas del clonaje molecular en donde se sintetiza DNA La mayora requiere de un molde y sintetizan un producto complementario Pueden tambin copiar RNA pero lo hacen con muy poca eficiencia Las ms usadas son : DNA pol I, fragmento Klenow, DNA pol T4, DNA pol T7, Taq polimerasa, Transcriptasa reversa y DNA pol transferasa terminal

COMPARACION DE LA ACCION DE LAS DNA POLIMERASAS

DNA pol
Polimeriza

pol I + + + + 109 1

F. K. + + 76 1

53
Exonucleasa 5 3 Exonucleasa 3 5 Actividad RNAasa H

Taq pol + + 94 1

R.T. + + + 84 y 170 1y2

P.M.(Kd) No Unid.

1.1 DNA POLIMERASA I (Holoenzima)

Caractersticas: 1. Tiene una sla cadena polipeptdica 2. P.M de 109,000 3. Actividad polimerizante 5 3 4. Actividad exonuclesica 53 y 35 5. Tiene actividad RNAasa H

DNA POLIMERASA I (Holoenzima)

USOS:  Marcacin de DNA mediante nick translation  Fue usada originalmente para copiar la cadena complementaria del cDNA en el clonaje del cDNA  Marcar el extremo 3 del DNA

1.2 FRAGMENTO KLENOW

(Fragmento largo de la DNA de la DNA polimerasa I)

1.

2.

3.

Caractersticas: En 1970 Klenow y Henningsen mediante tratamiento proteoltico limitado de la DNA pol I obtuvieron un fragmento largo (PM 76000) que mantena la actividad polimerizante y exonuclesica 35 Hoy da se le obtiene al tratarla con subtilisina o mediante clonaje Permite hacer algunos experimentos superando los problemas de la accin exonuclesica 53 de la DNA pol I

FRAGMENTO KLENOW (USOS I)

 1.

2.

3.

USOS: Llenar los terminales 3 creados por la digestin del DNA con las enzimas de restriccin. Generalmente FK trabaja con el mismo tampn que el usado para la RE. Marcar el terminal de un fragmento de DNA usando dNTPs marcados con P-32. Marca terminal en la cola 3 del DNA

FRAGMENTO KLENOW (Usos II)

Usos: 4.- Sintetizar la hebra complementaria del cDNA en experimentos de clonaje del cDNA 5.- Secuenciacin del DNA por el mtodo de Sanger (Mtodo del dideoxi) 6.- En PCR


1.3 DNA POLIMERASA DEL T4

CARACTERSTICAS: 1. A semejanza del FK la DNA polimerasa del bacterifago T4 tiene accin polimerizante 53 y accin exonuclesica 35, que es ms activa en el DNA de una hebra que el de doble hebra. 2. La actividad exonuclesica de la DNA pol del T4 es 200 veces ms activa que la del FK

DNA POLIMERASA DEL T4

 1.

2.

USOS ADEMAS DE LOS SEALADOS PARA EL FK: Marcacin de fragmentos de DNA para pruebas de hibridizacin, pudiendo los fragmentos ser convertidos en pruebas especficas mediante el uso de enzimas de restriccin. Extensin de primers oligonucleotdicos mutagnicos que se han unido a moldes de DNA de una sola hebra.

1.4 DNA POLIMERASA DEL BACTERIOFAGO T7

 

CARACTERSTICAS Es la DNA polimerasa que se induce despus de la infeccin de E. coli por el bacterifago T7 Esta polimerasa se presenta como la unin de 2 protenas, la protena del gen 5 del T7 y la protena del hospedero tiorredoxina Tiene actividad polimerizante 53, carece de actividad exonuclesica 53; pero tiene una actividad exonuclesica 35 mil veces ms activa que la del fragmento Klenow.

1.5 Taq DNA POLIMERASA

CARACTERISTICAS(I):  Es una DNA polimerasa (PM 94000) termoestable purificada inicialmente del Thermus aquaticus (Chien et al. 1976) y posteriormente obtenida mediante ingeniera gentica (AmpliTaqTM Perkin Elmer Cetus)  Estas enzimas tienen actividad exonuclesica dependiente de la polimerizacin 53.

Taq DNA POLIMERASA

CARACTERISTICAS (II):  En la incorporacin de nucletidos la enzima trabaja mejor entre 75 a 80o C.  La actividad polimerizante se reduce a la mitad a 60o C. y en 1/10 a 37o C.  Requiere de iones Mg  Los tampones fosfato inhiben a la Taq polimerasa, debe usarse tampn Tris-HCl pH 8.3

AMIGOS

HERMANOS

Taq POLIMERASA
USOS 1. Para la secuenciacin del DNA 2. Amplificacin mediante PCR A causa de la significativa amplificacin que determina, puede utilizar cantidades muy pequeas de DNA. Con slo 100 ul de sangre podemos retirar suficiente DNA para PCR y para la deteccin de cualquier mutacin.

1.6 TRANSCRIPTASA REVERSA

CARACTERISTICAS (I):  Se conocen dos formas comercialmente disponibles de transcriptasa reversa (TR):
1.

2.

Una preparacin obtenida del virus de la mieloblastosis aviaria (AMV) Una enzima aislada de una cepa de E. coli que expresa una copia clonada del gen de la TR del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV)

TRANSCRIPTASA REVERSA
CARACTERSTICAS (II):  Ambas enzimas carecen de actividad exonuclesica 35  La aviaria (AMV) tiene 2 polipptidos que tienen tanto la actividad polimerizante y una poderosa actividad RNAasa H.  La murina (Mo-MLV) es una simple cadena polipeptdica (PM 84000), tiene actividad polimerizante y su actividad RNAasa H es ms dbil

TRANSCRIPTASA REVERSA
CARACTERISTICAS (III):  La aviaria trabaja eficientemente a 42o C., que es una temperatura normal para las aves; en tanto que la murina se inactiva rpidamente a esta temperatura.  Por lo anterior, los RNAs con una importante estructura secundaria se copian mejor con la enzima aviaria; sin embargo las preparaciones de AMV pueden estar contaminadas con una endonucleasa que corta el DNA

TRANSCRIPTASA REVERSA
CARACTERISTICAS (IV):  La enzima aviaria trabaja ms eficientemente a pH 8.3 que a pH 7.3 que es el ms adecuado para la murina  Es tan crtico lo del pH que la longitud del cDNA sintetizado por ambas enzimas se reduce cuando el pH es diferente en tan slo 0.2 unidades de pH del recomendado. Como el pH del tampn Tris, vara con la temperatura, se debe chequear el pH a la temperatura usada para la incubacin

TRANSCRIPTASA REVERSA
USOS: 1. Su principal empleo es en la transcripcin del mRNA en cDNA de doble cadena que puede ser insertada en los vectores procariticos; aunque tambin puede ser usada tanto con DNA de una hebra o RNA para pruebas usadas en hibridizacin. 2. Para secuenciar DNA por el mtodo del dideoxi cuando las otras polimerasas estn fallando. :

TRANSCRIPTASA REVERSA


PARA LA FABRICACION DE PRIMERS PARA LA T.R., SE PUEDE USAR:

Oligo dT ( 12 a 18 nucletidos) Oligonucletidos de secuencia al azar Oligonucletidos de secuencia definida LA Km DE LA T.R. PARA LOS dNTP ES MUY ALTA (rango milimolar); PARA PREVENIR LA TERMINACION PREMATURA DEL DNA QUE SE FORMA, SE DEBE USAR ALTAS CONCENTRACIONES DE dNTP

2. RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES

RNA POLIMERASAS DE LOS FAGOS SP6, T7 y T3. CARACTERSTICAS  Los fagos sealados sintetizan una RNA polimerasa DNA dependiente que reconocen e inician la sntesis de RNA sobre moldes de DNA de doble hebra, que llevan el promotor apropiado especfico del fago  Los genes de estas enzimas han sido clonados y se expresan en E.coli y levadura


RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES


1.

2.

3.

4.

USOS Sntesis de RNA de una hebra para ser usado como prueba para hibridizacin Sntesis de RNA para ser usado como mRNA funcional para traduccin in vitro Sntesis de RNA para ser usado para estudiar el splicing in vitro Para transcripcin de genes clonados en bacterias y levaduras

RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES

ACCION DE LAS RNA POL. DE SP6,T3 y T7
Actividad : Polimeriza el RNA en sentido 5 3 Sustrato : DNA de doble hebra conteniendo el promotor especfico. Ejemplo: 5 3 SP6 GATCATCATCATCGAT C PROMOTOR CTAGTAGTAGTAGCTAG Mg2* RNA pol de SP6 rATP,rGTP,rUTP y rCTP 5ppp G A U C A U C A U C A U C G A U C

3. DNA LIGASAS
 

Las DNA Ligasas son enzimas usadas para unir dos piezas de DNA Las ms usadas son:
DNA ligasa del bacterifago T4 DNA ligasa de E. coli

DNA LIGASA


3.1 DNA LIGASA DEL BACTERIOFAGO T4



Polipptido de 68 000 daltons de P.M. que cataliza la formacin de enlaces fosfodister entre el 3 hidroxilo y el 5 fosfato terminal en el DNA USOS: Unir molculas de DNA con terminales cohesivos -Esta accin es estimulada por PEG a bajas concentraciones y requiere de ATP y iones Mg Unir molculas de DNA con terminales romos - Es ms lenta que la accin anterior pero aumenta su velocidad en presencia de NaCl 200 mM

DNA LIGASA


3.2.- DNA LIGASA de E. coli

 

 

Cataliza la formacin de enlaces dister fosfricos en los terminales cohesivos del DNA Los estudios iniciales indicaron que no una terminales romos, pero se ha mostrado que en presencia de PEG puede hacerlo No une segmentos de RNA Es de menos uso que la DNA ligasa de T4

RNA LIGASA DE BACTERIFAGO T4



Caractersticas:
La RNA ligasa del bacterifago T4 cataliza la unin covalente de fragmentso de RNA o de DNA de una hebra. Usos: Como puede usar como sustratos mononucletidos (ejemplo pNp) se le puede usar para marcar el 3 terminal del RNA Sntesis de oligodesoxirribonucletidos

4. POLINUCLEOTIDO QUINASA DEL BACTERIOFAGO T4



CARACTERISTICAS:
Cataliza la transferencia del fosfato del ATP al extremo 5 terminal del DNA y RNA USOS: -Marcacin del extremo 5 terminal del DNA para la secuenciacin de DNA por el mtodo de Maxam-Gilbert -Forforilacin de linkers sintticos

5. FOSFATASAS ALCALINAS
 

CARACTERISTICAS Se usa con mayor frecuencia la fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) y la fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP). Catalizan el retiro del residuo 5 fosfato del DNA tanto del RNA, DNA y de rNTPs y dNTPs

FOSFATASAS ALCALINAS
USOS: Retiro de los fosfato 5 del DNA y RNA antes de sustituirlo por fosfato marcado con P-32 Retiro de los 5 fosfato del DNA para prevenir su unin.

6. NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31



CARACTERISTICAS:
BAL 31 es predominantemente una exonucleasa 3 que retira mononucletidos de ambos extremos 3 de las dos hebras del DNA.El DNA de una hebra que va dejando es degradado por su accin endonuclesica La reaccin es estrictamente dependiente de calcio y por lo tanto puede ser detenida en cualquier momento por la adicin de agentes quelantes del Ca como el EGTA

NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31



USOS:  Remocin de nucletidos del extremo terminal del DNA en una manera controlada.  Mapear sitios de restriccin en el DNA  Mapear estructura secundaria del DNA( lugares de unin entre B-DNA y Z-DNAy sitios de modificaciones covalentes y no covalentes en el DNA e doble hebra)  Remocin de nucletidos de RNA de doble hebra

NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31



DETERMINACION DE LA VELOCIDAD DE REMOCION DE LOS NUCLETIDOS:


 

2Vmx . Mn

V = ---------------------------

( Km + (S)) Donde : Vmax de la reaccin Mn el P.M, promedio de un mononucletido (S) Moles/L de DNA en el tiempo O

NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31



OBSERVACION IMPORTANTE:
Cuando los productos de la digestin de Bal 31 sern ligados, se debe tener muy en cuenta que la actividad exonuclesica 3 de la enzima es 20 veces ms eficiente que la actividad endonuclesica. Lo anterior determina que el tratamiento con DNA polimerasa de T4 o el fragmento Klenow deben ser usados para digerir las colas de una hebra que van quedando. Almacenar la enzima a cero grados, no congelada.

ACCION DE LA NUCLEASA BAL 31

       

5 ----------------------------- 3 3 ----------------------------- 5 ---------------------------------- ------------- (10 A 20% )

NUCLEASA S1


CARACTERISTICAS:


La nucleasa S1 degrada DNA y RNA de hebra simple para dar nucletidos 5 fosfato ( dN rN) Los DNA y RNA de doble hebra y los hbridos DNA-RNA son relativamente resistentes a la enzima; pero esto se supera cuando se usan concentraciones grandes de la enzima

PROTECCION DEL ADN CON NUCLEASA S1

RIBONUCLEASA A DE PANCREAS DE BOVINO



CARACTERISTICAS:


RNAasa A es una endorribonucleasa que ataca especificamente RNA de una hebra en el extremo 3 de sus nucletidos pirimidnicos, rompiendo la unin del fosfato al nucletido adyacente Sus productos son nucletidos pirimidnicos 3 fosfato y oligonucletidos con terminal nucleotdico pirimidnico 3 fosfato
5pApGpGpCpCpApGpUpAp3 > 5pApGpGp + Cp + Cp  + ApGpUp + Ap 3

RIBONUCLEASA A DE PANCREAS DE BOVINO



La RNAasa A es activa en ausencia de cofactores y cationes divalentes; pero es inhibida por el inhibidor placentario de la RNAasa o por los complejos vanadil ribonuclesidos. USOS  Retiro de regiones no hibridizadas de RNA en los hbridos DNA-RNA

RIBONUCLEASA T1 ( Aspergillus oryzae)



CARACTERISTICAS


RNAasa T1 es una endorribonucleasa que ataca especificamente ataca los grupos 3 fosfato de los nucletidos de guanina y rompe el enlace 5 fosfato al nucletido adyacente. Los productos finales son guanosina 3 fosfato y oligonucletidos con terminal en guanosina3 fosfato. 5pApGpGpCpUpGpApC 3 > 5pApGp + Gp + CpUpGp


+ ApC 3

RIBONUCLEASA T1 ( Aspergillus oryzae)



USOS:


Retiro de regiones de RNA de los hbridos DNA-RNA

DESOXIRRIBONUCLEASA I (DE PNCREAS DE BOVINO)



CARACTERISTICAS:


DNAasa I es una endonucleasa que hidroliza DNA de doble hebra o de hebra simple preferencialmente en los lugares adyacentes a nucletidos pirimidnicos En presencia de iones Mg la DNAasa I ataca cada cadena de DNA independientemente En presencia de iones manganeso la DNAasa I ataca ambas cadenas de DNA a aproximadamente el mismo lugar dando fragmentos de DNA que son romos o que sobresalen solamente en uno o dos nucletidos (Melgar E.y Goldthwait D.A. J. Biol. Chem 243:4409, 1968 )

DESOXIRRIBONUCLEASA I (DE PNCREAS DE BOVINO)



USOS:
 

Introduciendo huecos al azar en el DNA de doble hebra en preparaciones para nick translation. Introduciendo un solo hueco en DNAs circulares en preparaciones para mutaciones mediadas por bisulfito Generando clones al azar para secuenciacin en vectores del bacterifago M13 Anlisis de complejos protena-DNA (DNAasa footprinting)

EXONUCLEASA III ( E. coli )



CARACTERISTICAS


La exonucleasa III cataliza el retiro de mononucletidos 5 del extremo 3 terminal del DNA de doble hebra, no tiene actividad sobre DNAs de una hebra Tiene como otras actividades aadidas una actividad endonucleasa especfica para DNAs apurnicos y RNAasa H 5 p----------------------------------OH 3




3OH------------------------------P 5

EXONUCLEASA III (E. coli )

ACTIVIDAD:


5 p----------------------------------OH 3

3OH------------------------------P 5
5P---------------------OH 3 3OH--------------------P 5 + 5pN OH