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Corazza, Nora I.;Aquilano, Daniel R.;Scaglia, Hugo E. La concentracin del cortisol en saliva es ms representativa de la fraccin biodisponible que de la libre del cortisol circulante Bioqumica y Patologa Clnica, Vol. 71, Nm. 3, 2007, pp. 13-19 Asociacin Bioqumica Argentina Argentina
Disponible en: http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=65112133002

Bioqumica y Patologa Clnica ISSN (Versin impresa): 1515-6761 info@aba-online.org.ar Asociacin Bioqumica Argentina Argentina

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REVISTA BIOQUIMICA Y PATOLOGIA CLINICA VOL 71 N 3 2007 Trabajo: pgs 13 | 19

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La concentracin del cortisol en saliva es ms representativa de la fraccin biodisponible que de la libre del cortisol circulante
Nora I. Corazza1 Daniel R. Aquilano2 1 Hugo E. Scaglia
1 Bioqumico 2 Dr. en Bioqumica

RESUMEN
El objetivo del presente trabajo es determinar si el CS est en equilibrio con la fraccin del cortisol libre (CL) circulante. Se evalu el cortisol total (CT) en el suero de 14 normales extrados a las 8:00 y a las 23:00 y el CS a las 23:00. En las mismas muestras de suero se determin la capacidad de unin de la CBG al cortisol-H3. La distribucin del cortisol en las fracciones unida a la CBG (C-CBG), CL y biodisponible (C-bio) se calcularon por el programa TRANSPORT. La capacidad de unin de la CBG no fue diferente a las 8:00 y 23:00 (397.862.2 y 412.588.3 g, respectivamente). El CT a las 8:00 fue signicativamente mayor que el de las 23:00, indicando un ritmo circadiano normal (12833 y 42.522.2 ng/ml, respectivamente). A las 8:00 el C-CBG (12131 ng/ml), fue signicativamente mayor que a las 23:00 (4121), indicando que la disminucin del CT indujo estas diferencias. El CS a las 8:00 y las 23:00 fue de 8.73.7 y 1.150.36, ng/ml, respectivamente, que fueron similares al C-bio en esos mismos tiempos (6.82.7 y 1.61.0 ng/ml, respectivamente), pero signicativamente diferentes del CL (2.41.0 ng/ml a las 8:00 y 0.60.4 ng/ml a las 23:00). Si bien se ha postulado que el CS representa al CL circulante, este trabajo constituye la primera demostracin de que el CS se correlaciona mejor con el C-bio que con el CL. Palabras claves | cortisol salival, cortisol libre, esteroides biodisponibles, estroides en saliva

Lugar de Trabajo:
Instituto de Anlisis Bioqumicos de Endocrinologa Calle 59 Nmero 969 (1900) La Plata

Enviar Correspondencia a:
Hugo E Scaglia e-mail: iabe@speedy.com.ar

SUMMARY
The aim of the present study was to determine whether salivary cortisol (SC) correlates with circulating Free Cortisol (FC). Total Cortisol (TC) was mesaured in 14 normal individuals at 8:00 and 23:00, and SC at 23:00. In same serum samples the CBG binding capacity for 3H-C was determined. Distribution of C among its fractions CBG-bound (C-CBG), FC, and bioavailable (bioC), were calculated with the computer program TRANSPORT. CBG binding capacity was similar at 8:00 and 23:00 (397.862.2 and 412.588.3 g, respectively). TC at 8:00 was signicantly higher than that at 23:00, indicating a normal circadian rythm (12833 and 42.522.2 ng/ml, respectively). C-CBG was signicantly higher at 8:00 (12131 ng/ml) than at 23:00 (4121), indicating that the fall in TC induced these differences. SC at 8:00 and 23:00 were 8.73.7 and 1.150.36, ng/ml, respectively, similar to those of bio-C (6.82.7 and 1.61.0 ng/ml, respectively), although signicantly different from FC (2.41.0 ng/ml at 8:00, and 0.60.4 ng/ml at 23:00). Despite the notion that SC represents the circulating FC, this study is the rst demonstration that SC correlates better with bio-C than with FC. Keywords | slivary cortisol, free cortisol, bioavailable steroids, salivary steroids

Revista ByPC. Incorporada al Latindex. ISSN 1515-6761 Cdigo Bibliogrco: RByPC Trabajo Recibido: 06-08-07 Aceptado: 24-09-07

INTRODUCCIN

La concentracin del Cortisol en saliva es ms representativa de la fraccin biodisponible que de la libre del Cortisol circulante

La saliva es producida por un grupo de glndulas excrinas, las glndulas salivares, situadas en la cavidad bucal. Es un lquido incoloro, acuoso y mucoso, compuesto bsicamente por agua, adems de diversas protenas, enzimas, glucoprotenas, glcidos y electrolitos. Tiene un pH comprendido entre 5,6 y 7. Es un udo hipertnico producto de tres pares de glndulas salivares: partidas: se sitan a nivel de las mejillas y vierten la saliva en la boca a travs del conducto de Stenon, submaxilares: a ambos lados del suelo de la boca, que vierten la saliva a travs del conducto de Wharton, y sublinguales: se sitan en la parte anterior y central del suelo de boca, vierten la saliva por los conductos de Rivinus y Bartholin. Otras glndulas que tambin segregan saliva son las glndulas palatinas, situadas en el paladar blando, as como otras glndulas ms pequeas situadas en la lengua y en las mucosas de la boca. La unidad bsica de las glndulas salivares est formada por acinos, conductos intercalares, conductos estriados y el conducto excretor. Los acinos glandulares estn rodeados por una red capilar, desde donde llegan los esteroides que luego sern evaluados en la saliva. La secrecin de la saliva se encuentra, en su mayor parte, bajo el control del sistema nervioso autnomo. En condiciones basales, la secrecin es de 0.5 ml/min pudiendo aumentar hasta 6-7 ml/min. Un adulto secreta de 600 a 1500 ml de saliva por da. Del total del volumen de saliva, las glndulas submandibulares segregan un 60%, las partidas un 25% y el resto las sublinguales. Los esteroides en general circulan unidos a protenas de poca capacidad y gran anidad, por ejemplo para el cortisol la CBG (Cortisol binding globulin), a protenas de gran capacidad y baja anidad como la albmina y una pequea parte libre, 1-3 %, de libre difusin por los capilares sanguneos. La fraccin unida a la albmina por su baja anidad tiene una velocidad de disociacin menor de 20 segundos, tiempo de trnsito de una molcula de un vaso aferente a un capilar, por lo cual esta fraccin ms la libre ha sido considerada como biodisponible. Por otro lado la unida a la CBG, por su alta anidad, la velocidad de disociacin es superior a los 20 segundos y est impedida de llegar a los rganos blancos por simple difusin. En el ao 1983 se demuestra que la fraccin de esteroides no conjugados, neutros y liposolubles no unida a protenas transportadoras de alta anidad y la libre, por ejemplo el cortisol, se difunde a travs de la ruta intracelular y son captados por el acino glandular para luego excretarse en saliva. Esa difusin es independiente del ujo salival (1). Contrariamente los esteroides conjugados, tal como el sulfato de DHEA, entran a la saliva va ultraltracin, por los espacios entre las clulas acinares y su concentracin en la saliva, dependiendo de la velocidad del ujo (2). En los ltimos aos numerosos estudios han validado el uso de la saliva para evaluar las hormonas esteroideas porque es un ultraltrado natural de la sangre y en consecuencia los esteroides no unidos a protenas de la circulacin san-

gunea difunden libremente en la saliva. Ha sido postulado que el cortisol en saliva est en equilibrio con el cortisol libre circulante y es independiente del ujo de produccin de saliva (3-5). Sin embargo no existen estudios realizados en muestras obtenidas en sangre perifrica y en saliva simultneamente que establezcan la correlacin de la concentracin del cortisol en saliva con las distintas fracciones circulantes del mismo. El objetivo del presente estudio fue determinar si el cortisol en saliva correlaciona con el libre (CL) o el biodisponible (Cbio) circulante. Para la realizacin de este trabajo desarrollamos las siguientes metodologas: 1) Un mtodo para determinar cortisol en suero y saliva por unin competitiva del esteroide con el cortisol tritiado a la CBG del suero de mujeres en el tercer mes de embarazo. 2) Determinar en cada muestra de sangre la mxima capacidad de unin de la CBG por el cortisol empleando el mtodo de Scatchard 3) Con el valor del cortisol, la capacidad de unin de la CBG y los niveles de albmina empleando el programa de Dunn, Nisula y Roadbard (6) calculamos la concentracin del cortisol unida a la CBG (C-CBG), a la albmina (C-Alb) y el CL. El Cbio result la suma de estas ltimas 2 fracciones. 4) Los valores de las distintas fracciones circulantes del cortisol se correlacionaron con las concentraciones en saliva en muestras obtenidas simultneamente. Los resultados del presente estudio proveen evidencias que el cortisol en saliva correlaciona mejor con el Cbio que con el CL circulante.

MATERIALES Y MTODOS
Se extrajo una muestra de sangre obtenindose el suero a las 09:00 y 23:00 hs en 14 personas normales, voluntarias de tomar parte en este estudio. Fueron incluidos en el protocolo aquellas personas que no tenan patologa endcrina ni no endcrina maniesta, ni que tomaran medicacin por lo menos 6 meses antes de intervenir en este protocolo por las siguientes caractersticas, entre otras, debido a que los anticonceptivos orales y la levotiroxina compiten con la protena transportadora; los antihistamnicos, inhibidores de la MAO, antidepresivos, parasimpaticolticos, ticos, modican la concentracin circulante del Cortisol. Enfermedades como parotiditis, deshidratacin y otras de causas psicgenas, modican el ujo salivar. Finalmente deben descartarse enfermedades que produzca hiposalivacin, como el sndrome de Sjegren, granulomatosis, amiloidosis, alcoholismo crnico, entre otras. Los resultados de bioqumica clnica general y determinaciones hormonales de los distintos ejes fueron normales en todos los casos. Antes de la extraccin de sangre de las 23 horas se colect una muestra de saliva segn las siguientes caractersticas: a) El paciente debe cenar a las 20 hs. o pasadas las 23 hs.

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(despus de la toma de muestra de la saliva). b) La recoleccin de la muestra se realiza por emisin espontnea debiendo recogerse como mnimo un volumen de 3 ml. en tubos de polipropileno, material inerte, irrompible, que puede ser esterilizado. c) Hay que evitar el cepillado de dientes previo a la toma de muestra de saliva, para evitar contaminacin de la misma con sangre, lo cual aumentara los valores reales del analito en saliva. En cuanto al efecto de la contaminacin de la saliva con sangre, se ha demostrado que hasta 2 g/l de Hemoglobina no afectara la determinacin. d) La muestra de saliva, se centrifuga, en centrfuga comn 20 min. a temperatura ambiente, para precipitar la mucina y otras protenas de la saliva. Para la determinacin del cortisol debe obtenerse un sobrenadante lmpido pudiendo repetirse varias veces la centrifugacin si fuera necesario. El sobrenadante de la saliva y el suero se conservan a -20C hasta el momento de realizar las diferentes determinaciones. En el sobrenadante de la saliva y en el suero de ambas extracciones de sangre se determin cortisol, y en ambas muestras de sangre la capacidad de unin de la CBG al cortisol. Se emplearon como controles para el mtodo de la capacidad de unin de la CBG una mezcla de sueros de hombres y embarazadas normales. Determinacin del cortisol por unin competitiva a la CBG del suero de mujeres embarazadas del tercer trimestre. A 100 l de suero y 1 ml de sobrenadante de saliva se extraen por duplicado con 10 veces su volumen con cloruro de metileno por agitacin durante 1 minuto. Se descarta la fase acuosa y el solvente se evapora a sequedad en un bao a 45 o C, pudiendo facilitar la evaporacin por pasaje de Nitrgeno. El extracto del suero y de la saliva se disuelve en 0.3 ml de buffer fosfato 0.1M. Se prepara una curva estndar de cortisol no marcado isotpicamente en concentraciones de 100 hasta 0.39 ng/tubo en diluciones al medio, realizadas en buffer fosfato 0.1M en un volumen de 0.3 ml. Se prepara una mezcla de suero de mujeres embarazadas del tercer trimestre para ser empleados sin puricacin previa, como fuente de CBG. Se titula este suero para emplearse a una dilucin que una aproximadamente el 50% de 0.1 ml de una solucin de cortisol tritiado (C3H) de 18.000 cpm, con una actividad especca (ae) de 70 Ci/mmol. Se agrega 0.1 ml de la dilucin apropiada del suero de embarazadas (CBG) a las diluciones de la curva estndar y a los extractos disueltos en el buffer de los sueros y del sobrenadante de la saliva y 0.1 ml de la solucin de C3H. Se prepara un 100% de unin con 0.3 ml de buffer y 0.1 ml de la solucin del C3H y de la CBG y un tubo de unin no especca con 0.4 ml de buffer y 0.1 ml de C3H. Se incuba a 45 oC durante 20 min y a 4 oC, 20 min. La fraccin unida de la libre se separa por agregado a todos los tubos 0.1 ml de Carbn

/Dextrn (1.25 y 0.125 gr %). Se incuban a 4 oC, 5 minutos se centrifuga y el sobrenadante se vuelca en 2.0 ml de lquido centelleo y se cuenta la radioactividad en un contador de Centelleo Lquido Packard con una eciencia del 70% para 3 H. La concentracin de Cortisol se calcula por interpolacin con la curva estndar corrigiendo por el volumen extrado. Determinacin de la mxima capacidad de unin de la CBG por el cortisol Se colocan en 8 tubos 0.1 ml de suero de la mezcla de hombres, mujeres embarazadas y de cada una de los sueros obtenidos a las 08:00 y 23:00 hs. Se agrega a los tubos 2 a 8 tubo 0.1 ml de cortisol no marcado isotpicamente en concentraciones de 50 a 0. 8 ng. A todos los tubos se agrega 0.1 ml de buffer fosfato 0.1M. Al tubo 1 se completa el volumen con el agregado de 0.1 de buffer. A todos los tubos se agregan 0.1 ml de solucin de C3H (ae: 70 Ci/mmol) de aproximadamente 10.500 dpm, equivalente a 0.235 ng de Cortisol. Paralelamente se preparan por triplicado las cuentas totales (0.3 ml de buffer y 0.1 ml de la solucin de C3H) y la unin no especca (0.2 ml de buffer y 0.1 ml de C3H). Se incuba a 18 o C durante 18 hs y la fraccin libre de la unida se separa por agregado a todos los tubos excepto a las cuentas totales, 0.1 ml de carbn/dextrn (1.25 y 0.125 gr%). Se incuban a 4 oC, 5 minutos, se centrifuga y el sobrenadante se vuelca en 2.0 ml de lquido centelleo y se cuenta la radioactividad en un contador de centelleo lquido Packard con una eciencia del 70% para 3H. La masa total en cada tubo ser la correspondiente a la del C 3H + la agregada en cada tubo. La radioactividad unida en cada tubo corresponder a la determinada en el sobrenadante del Carbn /Dextrn menos la de la unin especca. Con ese valor se determina el % de unin para cada concentracin de Cortisol agregado respecto al tubo 1, y se calcula la masa unida (B), la libre (F) y la relacin B/F para cada tubo. Se graca en un sistema X (B para concentracin de Cortisol) en funcin de Y (relacin B/F para cada concentracin de B). La interseccin en el eje X representa la mxima capacidad de unin de la CBG para nuestra ensayada, segn la ecuacin de Scatchard (7). Se realiza un procedimiento similar en forma individual para cada persona y para cada suero obtenido a las 08:00 y 23:00 horas, con la nica diferencia que las concentraciones de Cortisol no marcado fueron de 12,5, 25 y 50 ng. Distribucin del Cortisol circulante La distribucin del Cortisol circulante se realiz empleando el programa TRANSPORT cedido gentilmente por el Dr. Roadbard del NIH, USA y adaptado por el Dr. Juan Carlos Calvo a nuestro sistema de computacin (8,9). Este programa permite con el valor del Cortisol total y de la CBG calcular el cortisol unido a CBG, a la albmina y el libre. La suma del CAlb + CL corresponde al cortisol biodisponible (C-bio)

La concentracin del Cortisol en saliva es ms representativa de la fraccin biodisponible que de la libre del Cortisol circulante

RESULTADOS
La gura 1 muestra la curva de titulacin de la mezcla de sueros de mujeres embarazadas del tercer trimestre para la unin especca del C 3 H. La dilucin 1:8 tuvo una unin del 50% de 18.000 cpm del esteroide marcado. Esta dilucin se emple para los ensayos donde se valoraron los sueros y los sobrenadantes de la saliva empleados en este estudio. Figura 1. Titulacin de la CBG del suero de embarazo del 3er trimestre. La grca corresponde a la media DS obtenida por triplicado empleando una solucin donde en 0.1 ml tena entre 18.000 cpm .
100 90 80 70 60

Figura 2. Representacin grca de la Curva de Cortisol obtenida por unin competitiva del estndar con el Cortisol Tritiado por la CBG del suero de una mezcla de sueros de mujeres embarazadas del tercer trimestre. Cada punto representa la media DS de 5 ensayos del % de desplazamiento de la radioactividad (total menos unin no especca) respecto a la mxima unin del esteroide Tritiado. Las concentraciones del estndar fueron de 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781, 0.390 ng/tubo.
100 90 80 70 60

% de unin

50 40 30 20 10 0 0.1 0.5 1 5 10 50 100

% de unin

50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Cortisol ( ng/tubo)

Inversa de la dilucin de la mezcla de sueros de embarazo del 3 trimestre (CBG)

La gura 2 muestra la representacin grca de la Curva de Cortisol obtenida por unin competitiva del estndar con el Cortisol Tritiado por la CBG del suero de una mezcla de sueros de mujeres embarazadas del tercer trimestre en 5 ensayos consecutivos. Los valores del coeciente de variacin para 0.39 ng de cortisol fueron menores del 20 %, constituyendo la sensibilidad funcional del mtodo (10). Tomando la sensibilidad funcional como el lmite de deteccin del mtodo, los mnimos niveles aceptables estadsticamente fueron para el suero y saliva de 3.9 y 0.39 ng/ml, respectivamente. Los coecientes de variacin intra e interensayos fueron menores del 15% y del 20 %, respectivamente. La CBG une a la corticosterona y desoxicortisol con la misma anidad que al cortisol, La reaccin cruzada con estos glucocorticoides es igual, presenta un orden de magnitud de 10 veces menor con los andrgenos y progestgenos y prcticamente despreciables con el resto de los esteroides. Los niveles circulantes del cortisol son de alrededor de 150 ng/ml en horas temprana de la maana y de 40 ng/ml a las 23 horas, los de Corticosterona de 4.0 ng/ml y 1.5 ng/ml y los de Desoxicortisol de 5.0 ng/ml y 1.0 ng/ml a la maana y noche respectivamente. Estas concentraciones no inuyen signicativamente en la determinacin del Cortisol, por lo tanto este mtodo puede considerarse satisfactorio desde el punto de vista de la especicidad del mismo para la evaluacin del cortisol.

La gura 3 muestra la grca de Scatchard para la cuanticacin de la mxima capacidad de unin de la CBG para el cortisol en un a mezcla de sueros de hombres normales y de mujeres embarazadas del tercer trimestre. Los valores obtenidos de 520 y 1140 g/litro son coincidentes con los reportados previamente (8) Estas mezclas de sueros fueron empleadas en cada ensayo como controles internos. La gura 4 muestra la mxima capacidad de unin de la CBG de los sueros de cada persona obtenidos a la 08:00 y 23:00 individualmente. La tabla I muestra la mxima unin de la CBG y la distribucin del cortisol circulantes en las distintas fracciones; unido a la CBG, a la albmina y libre en las muestras individuales de sangre obtenidas a las 08:00 y 23:00 horas en las 14 personas normales. La tabla muestra tambin las concentraciones de Cortisol obtenidas en la saliva de las 23 horas. Los valores de CBG obtenidos a las 08:00 y 23:00 fueron de 397.662.2 g/litro y 412.588.3 g/litro, respectivamente, los cuales no resultaron estadsticamente diferentes (p> 0.5). El Cortisol total a las 08:00 horas fue signicativamente mayor (p< 0.01) que a las 23:00 horas, 128.633.1 ng/ml y 42.522.2 ng/ ml respectivamente. Como puede verse en la tabla dado las diferencias del cortisol entre la muestra matinal y vespertina y la no diferencia en la CBG el C-CBG, C-Alb y el CL resultaron estadsticamente superiores en la muestra matinal (p< 0.01 en todos los casos). La concentracin del cortisol en la saliva de la 23:00 horas fue de 1.150.36 ng/ml (3.31.0 nM). Estos niveles resultaron signicativamente a los reportados en la saliva de las 08:00 horas de 8.703.70ng/ml (25.010.6 nM) (11)

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Figura 3. Representacin del grco de Scatchard obtenido para una mezcla de hombres y mujeres normales embarazadas del tercer trimestre. En ambos casos las concentraciones de Cortisol fueron de 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.6 y 0.8 ng. La interseccin en el eje de las X representa la mxima unin de la CBG para ambos casos, los cuales corregidas por la dilucin corresponde a 520 g/litro y 1149 g/litro para hombres y mujeres respectivamente.
100

Tabla I. Distribucin del Cortisol circulante a las 8 y 23 horasobtenidas con el programa TRANSPORT (8) conociendo los niveles de Albmina (Alb) CBG y Cortisol total. Tambin se muestran los niveles de Cortisol determinadosen saliva obtenida a las 23 horas.
8 horas Cortisol en suero CBG Total (g/litro) (ng/ml) 400 350 440 440 480 310 510 390 280 405 350 415 380 420 397.8 62.2 176.3 73.4 147.8 87.1 121.9 125.0 150.0 200.0 120.0 125.0 95.0 120.0 119.0 140.0 128.6 33.1 Unido CBG Alb Libre (ng/ml(ng/ml)(ng/ml) 166.9 69.9 140.7 83.8 117.4 116.5 144.6 186.9 110.7 119.2 90.2 114.7 113.1 133.5 5.9 2.2 4.7 2.1 2.9 5.3 3.4 8.3 5.8 3.6 3.0 3.4 3.7 4.0 3.5 1.3 2.4 1.2 1.6 3.2 2.0 4.8 3.5 2.2 1.8 1.9 2.2 2.5 2.4 1.0 Total CBG (g/litro) (ng/ml) 350 500 325 560 360 405 605 410 360 350 415 420 295 420 412.5 88.3 24.9 21.2 21.4 25.0 26.2 60.0 29.0 81.0 75.0 25.0 66.0 35.0 38.0 68.0 42.5 22.2 23 horas Cortisol en suero Unido CBG Alb Libre (ng/ml(ng/ml) (ng/ml) 24.0 20.6 20.5 24.3 25.2 57.7 28.4 77.8 71.6 24.0 63.5 33.9 36.1 65.6 40.9 21.2 0.6 0.4 0.5 0.4 0.6 1.4 0.4 2.0 2.1 0.6 1.6 0.7 1.2 1.5 1.0 0.6 0.3 0.2 0.4 0.3 0.4 0.9 0.2 1.2 1.3 0.4 0.9 0.4 0.7 0.9 0.6 0.4 Cortisol saliva (ng/ml) 0.85 0.70 0.80 0.85 1.00 1.40 0.80 1.70 1.80 1.90 1.40 1.20 1.50 1.10 1.15 0.36

No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Media DS

Pool Hombres Pool Embarazadas

10

Mxima Unin 52 ng/0.1 ml Unido / libre (B / F)

1

121.8 4.4 31.2 1.7

114 ng/0.1 ml

0.1 0 10 20 40 60 80 100 120 140

Figura 5. Media DS de los niveles circulantes a las 23 horas del Cortisol Biodisponible (Cortisol unido a la albmina + libre) y del Cortisol libre comparativamente a los del Cortisol en saliva tomada simultneamente.
2.5

Unido (B) ng/0.1 ml de suero

Figura 4. Capacidad mxima de unin de la CBG al cortisol en las muestras de sangre individuales obtenidas a las 08:00 y 23:00 horas. Los valores se obtuvieron intercalando la pendiente al eje de las X , corrigindolos por la dilucin del suero utilizada. Las concentraciones de Cortisol empleadas fueron 12.5, 25 y 50 ng.
100

2.0

Cortisol (ng / ml)

1.5

1.0

0.5
B mximo de la CBG en suero de las 8 horas B mx: g/litro 1 negro: 400 2 marrn: 350 3 verde: 440 4 turquesa: 440 5 azul: 480 6 violeta: 480 7 verde obscuro: 510 8 gris: 390 9 gris obscuro: 360 10 rojo: 405 11 verde claro: 350 12 amarillo: 415 13 celeste: 380 14 violeta claro: 420 B mximo de la CBG en suero de las 23horas B mx: g/litro 1 negro: 400 2 marrn: 500 3 verde: 325 4 turquesa: 560 5 azul: 360 6 violeta: 405 7 verde obscuro: 605 8 gris: 410 9 gris obscuro: 280 10 rojo: 350 11 verde claro: 415 12 amarillo: 420 13 celeste: 295 14 violeta claro: 420

1000

0.0

Biodisponible circulante

Saliva circulante

Libre

100

10

10

B/F

B/F

DISCUSIN
Los resultados presentados en este trabajo demuestran que la determinacin de cortisol en suero y en saliva por unin competitiva con el C 3H a la CBG del suero sin puricar de embarazadas del tercer trimestre, cumple con los requisitos de control de calidad, sensibilidad analtica y funcional, especicad, y reproducibilidad. Los valores obtenidos en el suero de sangre extrada a las 08:00 y 23:00 hs y los de la saliva a las 23:00 hs son coincidentes con los reportados previamente en la literatura empleando otros mtodos de valoracin, como enzima inmunoensayo, radio inmunoensayo o de mayor sensibilidad cono las de quimioluminiscencia o luminiscencia (12). Muchas son las ventajas en la utilizacin de la saliva como

0.1

10

20

30

40

50

60

70

0.1 0 10 20 30 40 50 60 70

Unido (ng/0.1 ml de suero)

Unido (ng/0.1 ml de suero)

La gura 5 muestra la correlacin entre los niveles circulantes del C-bio y CL con el cortisol en saliva en muestras obtenidas simultneamente a las 23:00 horas. La media DS del C-bio fue de 1.601.0 ng/ml la cual no diere signicativamente del de saliva, 1.150.36 ng/ml, (p> 0.5) Ambas concentraciones resultaron signicativamente mayores (p> 0.01) que la del CL, 0.600.36 ng/ml.

La concentracin del Cortisol en saliva es ms representativa de la fraccin biodisponible que de la libre del Cortisol circulante

diagnstico, entre otras, que la saliva puede ser recolectada por procedimientos no invasivos, puede ser recolectada en sitios remotos y luego enviada al laboratorio, no se necesitan personal entrenado para su recoleccin, una vez recolectada es estable a temperatura ambiente por perodos prolongados de tiempo. Entre las desventajas podemos mencionar la falta de familiaridad con este medio, adems la interpretacin de los resultados es an difcil porque a pesar de que los patrones diurnos nocturnos generalmente muestran un gran paralelismo con los valores en suero, los rangos absolutos en diferentes estudios muestran una gran variabilidad (13). Los escasos niveles del cortisol en la saliva han requerido para su correcta evaluacin en tcnicas directas que sean de gran sensibilidad o emplear anticuerpos en el radioinmunoensayo a mayores diluciones para aumentar la sensibilidad del mtodo (11). En el mtodo propuesto en este trabajo, dada la extraccin con solventes del esteroide nos permiti aumentar el volumen de la muestra de saliva para tener una concentracin valorable en el rango de los niveles con sensibilidad analtica apropiada. La determinacin de la mxima capacidad de unin de la CBG al cortisol ha sido previamente descripta empleando como soporte Concanavalina A Sefarosa para separar la fraccin unida de la libre (8). En este trabajo empleamos carbn / Dextrn obteniendo resultados similares a los descriptos previamente (8) tanto en hombres como mujeres. La distribucin del cortisol en las distintas fracciones circulantes empleando el programa TRANSPORT result que el % del CL, Cbio y C-CBG respecto al cortisol total tuvo un rango en el suero de las 08:00 hs de 1.31 a 2.91; 3.6 a 7.7 y de 89.39 a 97.99, respectivamente y en el de las 23:00 hs de 0.90 a 1.86; 2.0 a 5.0 y de 89.74 a 97.32, respectivamente. Las concentraciones del C-CBG, Cbio y CL disminuyeron signicativamente (p< 0.01) a las 23:00 hs respecto a las 08:00 hs. Los valores obtenidos para esos dos tiempos de extraccin de las muestras de sangre fueron para el C-CBG 42.522.2 ng/ml y 121.831.2 ng/ml, para el Cbio 1.60.9 ng/ml y 6.8 1.9 ng/ml y para el CL 0.60.4 ng/ml y 2.41.0 ng/ml. La CBG no se modic signicativamente mientras que disminuy signicativamente los niveles circulantes del cortisol entre el suero obtenido a la 08:00 y 23:00hs, 128.633.1 ng/ml y 42.522.2 ng/ml, respectivamente. Estos resultados indican que la distribucin porcentual del cortisol en sus distintas fracciones no se modican a expensan de los cambios en la concentracin del glucocorticoide. La concentracin en saliva del cortisol result superior en todos los casos al CL circulante con un rango de 1.2 a 4 veces. Estos resultados demuestran que el cortisol en saliva no representa al CL circulante, como ha sido sugerido (3, 11, 14-17). Los niveles del cortisol en saliva se correlacionaron con el Cbio, demostrando que los niveles en saliva corresponden a la fraccin del cortisol circulante no unida a la CBG, considerada como biolgicamente activa. Ha sido comunicado que el cortisol en saliva correlaciona con

el Cortisol Libre Urinario (18) tanto en normales como en pacientes con Sndrome de Cushing. En un futuro investigaremos la correlacin entre el cortisol en saliva, su distribucin en suero y el cortisol libre en orina de las 23 horas. En sntesis podemos concluir que el cortisol en saliva es un mtodo relativamente simple, no invasivo y conable para la determinacin de la funcin glucocorticoidea adrenal y permite su evaluacin en horas de la noche factible de ser utilizado como screening en endocrinologa clnica para el diagnstico de los sndromes de Cushing y de Addison as como para la evaluacin de algunas patologas psiquitricas, para medicina del deporte y otras.

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