MULTIPLICACIN IN VITRO DE CLONES SUPERIORES DE CACAO OBTENIDOS POR EL PROGRAMA DE MEJORAMIENTO GENTICO DEL CATIE

Ing Agr. William Solano Snchez

Importancia econmica del cultivo

20 millones dependen directamente del cacao (EUFIC 2005). 70% de la produccin -2 hectreas de tierra (ICCO 2005).

Moniliasis Escoba de bruja Mazorca negra

Programa de Mejoramiento Gentico de Cacao CATIE (1996) Objetivos: Minimizar el impacto de las principales enfermedades Mejorar la productividad Resultados: Clones de alta productividad (700-998 kg/ha/ao) Tolerancia o resistencia a principales enfermedades
(Astorga 2001, Phillips-Mora et al. 2005)

Multiplicacin de los clones?

Mtodos de propagacin del cacao

Sexual Semilla Asexual Injertos Estacas
Limitante: Eficiencia variable Difusin de material lite entre pases

Sencillo y barato

Alta heterocigosis

Cultivo in vitro

Cultivo in vitro
Grupo de tcnicas mediante las cuales un explante (parte de un tejido vegetal: clula, tejido u rgano) se cultiva aspticamente en un medio de composicin qumica definida y se incuba en condiciones ambientales controladas para obtener nuevas plantas

Ventajas
Multiplicacin clonal

Conservacin de germoplasma Intercambio de material libre de enfermedades entre pases Suministro de material de calidad para reas nuevas y resiembra Manipulacin gentica

Cultivo in vitro en cacao

Archibald (1954) inici la investigacin de micropropagacin en cacao utilizando cambium. Cultivo de pices (Orchard et al. 1979, Passey y Jones 1983)
Maxwell y Blake 1984)

Explantes nodales y yemas axilares (Janick y Whipkey 1985,

Cultivo de microestacas (Hall y Collin 1975, Legrand et al. 1984, Lardet et al. 1998) Cultivo de embriones zigticos (Omokolo et al. 1997, Traore et al. 2003) Microinjerto de embriones somticos (Aguilar et al. 1992)

Embriognesis somtica
La embriognesis somtica es una tcnica biotecnolgica de propagacin vegetativa que permite obtener plantas a partir de clulas somticas (no sexuales) desde cualquier tipo de tejido.

TOTIPOTENCIA Capacidad de cualquier clula vegetal de regenerar una planta completa, cuando es expuesta a un ambiente y estmulos apropiados". La tcnica de embriognesis somtica fue reportada por primera vez por Reinert (1958) y Steward (1958) en zanahoria.

Embriognesis somtica de cacao

Fue descrita por Esan (1977) y luego por Pence et al. (1979) Embriones cigticos inmaduros (Kononowicz et al. 1984, AduAmpomah et al. 1988, Sondahl et al. 1988) No es propagacin clonal Hojas (Litz 1986) Nucela y Tegumento (Chatelet et al. 1992, Figueira y Janick 1993, Sondahl et al. 1993) Ptalos y estaminoides (Lpez-Baez et al. 1993, Li et al. 1998, Maximova et al. 2000) La tcnica ms exitosa

Embriognesis somtica de cacao a partir de piezas florales

Lpez-Baez et al. (1993) Alemanno et al. (1996) Li et al. (1998) Maximova et al. (2000) Furtek et al. (2000) Tan et al. (2000) Niemenak et al. (2000) Chanatsig (2004) Aspectos claves para el xito Factores qumicos como las bases minerales del medio, la fuente y concentracin de carbono y de reguladores de crecimiento

Fuerte efecto genotpico

Explantes utilizados
Estaminoides Estambres Ptalos Spalos

De 10.000 flores slo 10-150 producen frutos

Embriognesis somtica de cacao

Evaluacin de plantas de ES de cacao en campo

Lugar: Ecuador Genotipo: EET-95 injertado sobre CCN51

Qu estamos haciendo en CATIE en multiplicacin in vitro de cacao?

Genotipos utilizados

CATIE R4

CATIE R6

Genotipos utilizados
CARACTERSTICA ICS-95 Origen Reaccin a: M. roreri C. perniciosa P. palmivora Color del fruto Productividad T&T R CC-137 C. Rica MS EET-183 Ecuador MS CLONES UF-273 C. Rica R CATIE R4 C. Rica R CATIE R6 C. Rica R CATIE R7 C. Rica R

T S Rojo Med

? S Verde Alta

? MS Verde Alta

? S Rojo Med

? S Verde Alta

? MS Verde Alta

? MS Verde Alta

Colecta y desinfeccin de los explantes Maana / NaClO 5% por 20 min. Induccin de la embriognesis Medio PCG y NT1 / Oscuridad Cambio de medio cada 14 das Penn State Univ-NESTLE Expresin de la embriognesis

METODOLOGA

Medio SCG y NT2/ Oscuridad / Cambio de medio cada 14 das hasta la formacin de embriones Penn State Univ-NESTLE

A
PCG 2sem

PROTOCOLO PENN STATE UNIVERSITY SCG 2sem EDG 2sem PEC 4sem

Lopez et al. 1993, Li et al. 1998, Maximova et al. 2002

INDUCCIN

EXPRESIN

MADURACIN

CONVERSIN

B
NT1 3sem

PROTOCOLO NT2 3sem

NESTLE G-80 4sem ENR-6 4sem

Fontanel et al. 1993

Desarrollo de embriones Medio ED y G-80 - ENR6 Luz / Cambio de medio c/ 30 das Hasta la formacin de plantas Medio Liq.-Medio Sol.

Aclimatacin Invernadero Sustrato-Pellets

Resultados

Porcentaje Explantes con embriones (%)

10
1,42 59,20 15,29 1,14 12,20 2,59 26,58 0,47 0,55 2,92 1,86 0,00 0,84 0,83 1,31

20

30

40

50

60

70

0
0,00

Resultados

U F27 3 PC U FG 27 P 3 ET P U C FG 27 E ST 3 N U T F1 27 P ET E 3 ET N TI -1 83 ES E P T ET C G -1 83 PE E T P ET C G -1 ES 83 E T N ET T1 -1 P 83 E T C N C T -1 1 37 E PC ST C C G -1 37 P E T PC C C G -1 E 37 S T N C T1 C -1 P 37 ET N IC T1 S -9 E 5 ST P IC C S G -9 P 5 ET P C IC G S -9 E ST 5 N IC T1 S -9 PE 5 T N T1 ES T

Tratamiento

Emb por Expl

Exp c/ emb

Emb por 100 expl

Emb por 100 flores

UF-273 PCG EST EET-183 NT1 PET

2,6 0,2

59,2 % 26,6 %

154,9 6,5

774,6 32,6

UF-273 / PCG / EST

EET-183 / NT1 / PET

Clon: CATIE R7 Medios de cultivo : NT1 (Nestle) y PCG (Penn State University) Explantes : PET: Ptalo y EST: Estaminoide
Expl. con emb. 40 Porcentaje de explantes con embriones 35 30 25 20 0,8 15 10 5 0 R7 PCG PET R7 PCG EST R7 NT1 PET R7 NTI EST 0,6 0,4 0,2 0 Emb. por expl. 1,8 1,6 1,4 1,2 1 Porcentaje de embriones por explante

Resultados

Tratamiento CATIE R7 PCG PET CATIE R7 PCG EST CATIE R7 NT1 PET CATIE R7 NTI EST

Expl. con emb. 8,1 8,3 37,2 6,5

Emb. por expl. 0,1 0,3 1,7 0,2

# Emb por 100 expl 1,1 2,7 62,1 1,0

# Emb por 100 flores 5,3 13,3 310,6 4,9

80 70

Clon: CATIE R4 y CATIE R6 Portainjertos: UF613 y IMC-67 Medios de cultivo : NT1 (Nestle) y PCG (PSU) Explantes : PET: Ptalo y EST: Estaminoide
56

Resultados
72,9 53,2

Explantes embrin E x pla nte scon c on e m brin

60 50 40 30,5 30 20 10 0 PET PCG IMC-67 CATIE R4 EST PET NT1 EST PET PCG

4,1 0,7 0 0,7 EST

2,9

3,8 0,7 EST NT1 PET PCG IMC-67 EST

5,4

7,9 3,2 3,8

7,4

PET

PET NT1

EST

PET PCG

EST

PET NT1 UF-613

EST

UF-613

CATIE R6

Tratamientos Clon/Patrn/Medio/Explante 3) R4 IMC67 PCG EST 7) R4 UF-613 PCG EST 11) R6 IMC67 PCG EST 15) R6 UF-613 PCG EST

Explantes con embriones (%) 30,5 56,0 53,2 72,9

Nmero de embriones por explante 1,57 3,47 3,61 4,89

Nmero de embriones por cada 100 explantes 47,89 194,32 192,05 356,48

Proyeccin de nmero de embriones por cada 100 flores 239,43 971,60 960,26 1782,41

Resultados

CATIE R4

CATIE R6

Resultados Multiplicacin de la ES 2aria

Embriones iniciales Embriones producidos Agregados embriognicos

UF-273

Totales Promedio por Petri Totales Promedio por Petri

606 24,2 99 7,6

40b 1,6b 216a 22,8a

8b 0,3b 17a 1,5a

EET-183

Efecto del tamao inicial del embrin

Interaccin Medio x Tamao Clon EET183: Total C recim iento Crecimiento (mm) C recim iento Crecimiento (mm)
15.26 12.19

Interaccin M edio x Tamao Clon UF273 Total

12.09

10.25

8.93

8.30

5.76

6.36

2.59 0-2 2-4 4-6 +6

4.42 0-2 2-4 4-6 +6

EET- 183 0-2mm

Tamao inicial
TAM INICIAL
G-80 PEC

Tamao inicial
TAM INICIAL
G-80 PEC

UF- 273

2-4mm

4-6mm

+6mm

1. Efecto del tamao inicial del embrin

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
43,0 37 25 19,0 18 38

Resultados 41
38,0

41

44 30

Porce ntaje

26

G80 UF-273

PEC

G80 EET-183

PEC

Malformado

Muerto

Normal

Comparacin del medio lquido y medio slido

Medio / Densidad Embriones con hojas verdaderas Embriones con races Embriones Secundarios

Slido 10 Slido 20 Slido 40 Lquido 10 Lquido 20 Lquido 40

16,0 ab 17,5 ab 6,25 ab 32,5 a 10,0 ab 6,25 ab

62,0 ab 45,0 bc 23,8 d 80,0 a 27,5 cd 5,0 e

8,0 b 40,0 ab 8,75 b 95,0 a 5,0 b 2,5 b

Comparacin del medio lquido y medio slido

Malformados 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10 20 Slido 40 10 20 Lquido 40 Muertos Normales

Porcentaje

CATIE-R4 / UF-613

80 70 Sobrevivencia (%)

72

Aclimatacin
60 52 42 52 52

60 50 40 30 20 10 0

Pellets

Mezcla 1 Mes 2 Meses 3 Meses

UF-273

PELLETS

SUSTRATO

Conclusiones
Se determin una interaccin directa entre el medio de cultivo y el tipo de explante. UF-273, CC-137, CATIE R4 y CATIE R6 EET-183, ICS-95 y CATIE R7 PCG Estaminoide NT1 Ptalo

El patrn sobre el cual est injertado el clon afecta significativamente la respuesta in vitro de ese clon. Patrn UF-613 mejor que IMC-67

Conclusiones
MULTIPLICACION Los embriones de la ES Secundaria tienen mejor morfologa En EET-183 se encontr callo friable DESARROLLO Existe diferencia en el desarrollo de plantas al utilizar diferentes medios de cultivo y tamaos iniciales de embriones El cultivo en medio lquido (RITA) en alta densidad favorece el porcentaje de embriones normales, con respecto al medio slido. ACLIMATACION La aclimatacin de plantas fue posible con buen resultado en dos tipos diferentes de sustrato.

Recomendaciones
Llevar a campo las plantas aclimatadas para evaluar el comportamiento agronmico de las plantas producidas in vitro y determinar la posible existencia o no de variantes somaclonales.

Los resultados obtenidos sirven de base para mejorar el proceso de multiplicacin de plantas de cacao por medio de la embriognesis somtica, lo que abre la posibilidad en el futuro de establecer un protocolo eficiente de multiplicacin masiva de los clones seleccionados por el Programa de Mejoramiento Gentico del CATIE

MUCHAS GRACIAS