D J Archambault, J J Slaski, X Li, K Winterhalder. 2004. Soil & Sediment Contamination, 13: 53-63.

(versin traducida)

Una prueba biolgica rpida, sensible, basada en semillero para la determinacin de la toxicidad de substratos slidos y lquidos y de la tolerancia de la planta.
D. J. ARCHAMBAULT * J. J. SLASKI X. LI Tecnologas Ambientales. Consejo de Investigacin de Alberta. Vegreville, Alberta, Canad K. WINTERHALDER Departamento de biologa. Universidad de Laurentian. Sudbury, Ontario, Canad * Autor para enviar correspondencia. Direccin: Tecnologas Ambientales, Consejo De Investigacin De Alberta, P.O. Bag 4000, Vegreville, Alberta, T9C 1T4, Canad. e-mail: archambault@arc.ab.ca

Resumen
Hemos desarrollado una prueba biolgica rpida, sensible, basada en semillero que se puede utilizar para evaluar la toxicidad relativa de medios slidos y lquidos y para evaluar la tolerancia de la planta a los compuestos txicos. Usando este mtodo, es posible utilizar el % de germinacin, crecimiento de raz y tallo como parmetros. Para esta prueba biolgica, un substrato slido tal como suelo o arena lavada a los cidos se intercala entre dos capas de papel de filtro de microfibra dentro de un placa petri perforada que se sumerge dentro de un depsito ms grande. La adicin de agua destilada o de medio lquido al depsito hace que el lquido pase a travs de las perforaciones en el placa interior, a travs del substrato slido para formar una pelcula en la parte superior del papel de filtro que cubre el substrato. Las semillas se colocan en la pelcula de la solucin para la germinacin y el crecimiento subsecuente. A diferencia de la germinacin de semillas en suelo, el comienzo de la germinacin puede ser observada fcilmente. Una distincin se puede entonces hacer entre las semillas que no germinan y las que germinen pero cesen posteriormente su crecimiento, dando a la prueba biolgica de la toxicidad sensibilidad adicional. El crecimiento de la raz se puede supervisar a lo largo del tiempo o medir al final del experimento. Adems, los sntomas visuales de la tensin tales como hinchazn o coloracin se pueden observar a travs del experimento. Mientras que el crecimiento del tallo se encuentra a menudo que refleja mal la toxicidad de medios, nosotros hemos encontrado una buena respuesta en este parmetro. La prueba biolgica se ha utilizado para probar las toxicidades relativas de suelos contaminados en metales, soluciones de metal, suelos contaminados por hidrocarburos, lixiviados de suelo e hidrocarburos aerotransportados acumulados en tejidos de plantas . Palabras claves: Metales, hidrocarburos, lixiviados, agentes contaminadores aerotransportados, crecimiento de raz y tallo, germinacin. Metals, hydrocarbons, leachates, airborne pollutants, root and shoot growth, germination.

Introduccin
En aos recientes, un esfuerzo considerable se ha dirigido hacia la recuperacin y la desintoxicacin de sitios contaminados en Canad. El xito relativo de estos procesos se evala tpicamente usando una combinacin de pruebas qumicas y biolgicas (Visser y Danielson, 1995; Yeung et al., 1996). Se acepta generalmente que las pruebas toxicolgicas basadas en el funcionamiento de ciertos organismos de diferentes niveles trficos del suelo proporcionan estimaciones ms fiables del potencial de toxicidad que los anlisis qumicos. Esto es cierto porque la mera presencia de un txico no equivale a efectos biolgicos (Cairns y Pratt, 1989). Por otra parte, en muchos casos los substratos contaminados contienen varios compuestos que puedan interactuar sinrgicamente o antagnicamente, haciendo la evaluacin de toxicidad con anlisis qumicos difcil. Por estas razones las pruebas biolgicas se prefieren generalmente a los anlisis qumicos. Un nmero de pruebas biolgicas, incluyendo Microtox, de la inhibicin del crecimiento en algas, de la supervivencia de lombrices, de la germinacin de semillas y alargamiento de la raz y test probando la actividad biolgica del suelo, se han empleado en el pasado para evaluar la toxicidad de suelos contaminados (Visser y Danielson, 1995). Se ha encontrado un pobre acuerdo entre pruebas que usan plantas superiores y otros organismos no especficos del suelo (algas, daphnia, photobacteria) (Wang, 1991). Nosotros hemos desarrollado una prueba biolgica sensible, basada en semillero, en la cual una variedad amplia de especies de planta puede ser utilizada. Esta propuesta aumenta la utilidad predictiva de las pruebas porque los datos ecotoxicolgicos se pueden interpretar fcilmente en trminos de efectos integradores de factores biolgicos, qumicos y fsicos del suelo en el funcionamiento de plantas.

Mtodos y materiales
Descripcin del Dispositivo Un dispositivo simple fue diseado para facilitar los anlisis de la toxicidad de substratos slidos y lquidos y para la determinacin de la tolerancia en plantas. Papel de filtro qumicamente inerte, binder-free, con microfibra de borosilicato

(Fisher Scientific) fue colocado en el fondo perforado de un placa petri de plstico (9 centmetros de dimetro) (figura IA), y cubierto por una capa del substrato slido (suelo o arena lavada a los cidos) de 0.5 a 0.75 centmetros de espesor. Un segundo crculo del papel de filtro de microfibra fue utilizado para cubrir el substrato slido, y sobre l eran colocadas las semillas. Cada placa petri de plstico fue colocada dentro una placa ms grande del depsito, a la cual fueron agregados, 50 a 150 ml de, bien agua destilada, soluciones o lixiviados. Cuando los lquidos fueron agregados a los depsitos, pasaron a travs del substrato slido desde abajo, manteniendo el papel de filtro de la superficie humedecido con la solucin, produciendo una pelcula fina (~1 milmetro). Treinta a cincuenta semillas fueron colocadas en el papel de filtro en la pelcula del lquido en cada uno de cuatro o cinco placas (repeticiones). Para evitar la evaporacin excesiva de la solucin, el dispositivo entero fue cubierto hasta la aparicin de la radcula y de la hoja, en cuyo caso la cubierta fue substituida por una tapa que cubri solamente la porcin del depsito del dispositivo (figura 1B). Esto era especialmente importante en experimentos donde era limitado el volumen de llixiviado disponible. Para asegurar la uniformidad del abastecimiento de agua a las plantas de semillero en crecimiento, el nivel de la pelcula lquida que cubra el papel de filtro fue ajustado dos veces al da o segn fuera necesario. Determinacin de la toxicidad relativa de suelos contaminados con metales, de soluciones de metales y de tolerancia a metales en poblaciones de Tickle grass. Lotes de semillas de Tickle grass (Agrostis scabra) fueron recogidos de sitios contaminados acidificados en Sudbury, rea de Ontario y de sitios no contaminados fuera de Sudbury. Los sitios contaminados haban elevado los niveles de metales (el Cu total presentaba un rango de 210-270 g/g, el Ni de 290-1760 g/g) y un pH que se extenda de 3.4 a 4.4. Los sitios no contaminados tenan concentraciones relativamente bajas de metales (Cu total de 44-130 g/g, Ni de 65190 g/g) y niveles del pH entre 5.0 y 8.0. Para estos experimentos, dos lotes de la semilla fueron elegidas al azar de sitios contaminados, y dos fueron elegidos al azar de sitios no contaminados. Para los experimentos con suelos, fueron utilizados un suelo contaminado, un suelo no contaminado y una mezcla de 50:50 de stos. Los suelos fueron recogidos de una profundidad tpica de la zona de enraizamiento de entre 5 centmetros y 15 centmetros. Un suelo, conteniendo 780 g/g de Cu y 1110 g/g de Ni con un pH de 3.8, fue recogido de un sitio contaminado en Sudbury, y otro suelo que contena 44 g/g de Cu y el Ni de 65 g/g, con un pH de 4.4, fue recogido de un sitio no contaminado fuera de Sudbury. Una mezcla de 50:50 de estos dos suelos tambin fue utilizada (Cu de 320 g/g y Ni de 310 g/g, pH de 4.1). Para los experimentos usando soluciones del metal, las soluciones del cobre, del nquel y del aluminio fueron preparadas usando los metales solo o en la combinacin (Archambault y Winterhalder, 1995). Los tratamientos eran 10 M de Cu (como CuSO4), 10 M de Ni (como NiSO4), 1000 M de Al (como Al2(SO4)3) y un control (agua destilada). En algunos experimentos los metales fueron aadidos en solucin nutriente de Hoagland diluida a la cuarta parte. Todas las soluciones fueron ajustadas a pH 4.5 usando una solucin diluda de HCl. Cincuenta semillas fueron colocadas en cada placa petri.

Figura 1. Dispositivo de la prueba biolgica usado para determinar la toxicidad del substrato y tolerancia de la planta. (A) Componentes del dispositivo de la prueba biolgica. (B) Dispositivo montado, con las plantas de semillero de trigo.

El experimento fue llevado a cabo en el laboratorio con temperaturas bajas de 22.5C y altas de 25.5C bajo aproximadamente 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Cinco rplicas fueron utilizadas. Al cabo de dos semanas, las races y las primeras hojas de todas las semillas germinadas fueron medidas, y el % de germinacin calculado para cada placa. Una semilla se dio como germinada cuando la radcula o la primera hoja (o coleoptile) se podan ver (a travs de un microscopio de diseccin) emerger a travs de la cubierta de la semilla. Las longitudes medias de la raz y de la hoja eran calculadas. De stos, los ndices de la tolerancia y/o los valores de la toxicidad del substrato podan ser calculados. Los ndices de tolerancia y los valores de toxicidad del substrato eran calculados como porcentajes de controles. Determinacin de la toxicidad relativa de suelos contaminados por hidrocarburos usando trigo y lechuga Fueron utilizadados para este estudio una tierra vegetal agrcola contaminada con petrleo crudo y salmuera (desecho 1), diesel invert mud residue (traduccin literal: un residuo de fango invertido de diesel) (desecho 2), y un flare pit sludge (traduccin literal: un lodo del hoyo de la llamarada) (desecho 3). Los materiales de desecho fueron lixiviados para reducir la conductividad elctrica y biorrecuperados por tres aos, dos aos y un ao para el desecho 1, 2 y 3, respectivamente. La biorrecuperacin fue llevada a cabo en un biorreactor en el cual la temperatura, la humedad y la aireacin podan ser controladas (Yeung y Johnson, 1996). El hidrocarburo total extrable era 2.1%, 0.66% y 6.6% para los desechos 1, 2 y 3, respectivamente. Dos experimentos replicados fueron realizados usando trigo (Triticum aestivum cv. AC Taber) y lechuga (Lactuca sativa cv. Iceberg). En este experimento, una capa de suelo de aproximadamente 0.5 centmetroa de grosor fue colocada en cada dispositivo y 150 ml de agua destilada fueron agregados a la placa depsito. Despus de varios minutos, cuando el agua entr en la cama del suelo, un ajuste fino del nivel de agua fue hecho para producir una pelcula fina (~1 milmetro) de la solucin en la superficie del papel de filtro que cubra la cama del suelo. Treinta semillas de cada especie fueron puestas en cada dispositivo. El nivel de la pelcula de la solucin que cubra el papel de filtro fue ajustado peridicamente segn fue necesario. Los placas petri que contenan las semillas fueron colocados en una cmara de cultivo con un fotoperiodo de 16 h de da y de 8 h deoscuridad. La temperatura en lacmara de cultivo fue mantenida constante a 23 3C. Cinco rplicas fueron utilizadas. La germinacin fue determinada 24 h despus del comienzo del experimento. El % de germinacin era calculado para cada placa. Despus de 5 das, el crecimiento de la raz y del tallo de las plantas del trigo fue medido. La longitud de las races de lechuga fue medida y el ndice de rea foliar (anchura x longitud) fue obtenida. La toxicidad de suelos fue expresada como ndice sumado que incluy efectos sobre todos los parmetros de la planta. Los sntomas visuales fueron anotados y fotografiados. Determinacin de la toxicidad relativa de los lixiviados obtenidos de suelos contaminados con hidrocarburos usando trigo y lechuga El proceso de lixiviacin fue llevado a cabo a temperatura ambiente (~23C). Cien ml de agua destilada fueron agregados a 30 g de suelo secado al aire en un matraz erlenmeyer de 250 ml. Las suspensiones fueron agitadas durante 24 h en 4.000 r.p.m. usando un agitador rotatorio (este dato aparece as en el texto original pero debe estar equivocado pues esta velocidad
de agitacin es incluso ms alta que la de centrifugacin que viene indicada despus; un valor real podra estar por ejemplo de entre 60 y 120 r.p.m.). Despus de la extraccin, la suspensin era centrifugada durante 10 minutos a 3.000 r.p.m. para sedimentar

los slidos. La fraccin lquida fue decantada y filtrada posteriormente en caso de necesidad para quitar cualquier resto flotante. El procedimiento de lixiviacin fue repetido varias veces en cada suelo, produciendo lixiviados de diversa conductividad elctrica. La toxicidad de los lixiviados de suelo fue evaluada sustituyendo el suelo en cada dispositivo con arena inerte, lavada a los cidos como medio slido. La presencia de un medio slido permite un aporte relativamente lento de lixiviado a travs de este medio a las semillas y el mantenimiento de aportes adecuados de lixiviados sin "ahogar" las semillas. El uso de una cubierta sobre la placa depsito permiti que la prueba biolgica fuera realizada usando tan poco como 50 ml de lixiviado mientras que mantena una pelcula del lixiviado de aproximadamente 1 milmetro de espesor en la superficie del papel de filtro que soportaba las plantas de semillero. Cinco rplicas fueron utilizadas. La germinacin, el crecimiento de la raz y del tallo fue determinado segn lo descrito arriba para los experimentos realizados usando suelos contaminados con hidrocarburo. Determinacin de la acumulacin relativa de hidrocarburos aromticos policclicos (PAHs) transportados por el aire en los tejidos areos de plantas cultivadas Se estudi la acumulacin relativa de hidrocarburos aromticos policclicos transportados por el aire (PAHs) in/sobre cuatro especies cultivadas, incluyendo la colza (Brassica napus), cebada (Hordeum vulgare), guisante forrajero (Pisum sativum) y lechuga (Lactuca sativa). En estos experimentos, se produjeron PAHs en aire dejando pasar aire sobre naftaleno cristalino (Fisher Scientific) o la creosota lquida (conservante de madera que contiene el 90% PAHs) en un compartimiento de mezcla en el fondo de las cmaras de cultivo. Se calcularon unas concentraciones medias diarias de 3 3 PAHs de 2.5 mg/m y 7.5 mg/m para la naftalina y la creosota, respectivamente, considerando la prdida de masa de la sustancia por unidad de tiempo y la velocidad de flujo de aire que atraviesa el sistema. Plantas de 1 mes de edad fueron expuestas a naftalina y a creosota durante 18 das. Se utilizaron cinco rplicas. Tras la cosecha, las plantas fueron congeladas por inmersin en nitrgeno lquido hasta anlisis. Las partes areas (hojas, vstagos, semillas) fueron homogeneizadas en agua (1:5 peso/volumen) usando un molino Polytron y filtradas a travs de gasa para quitar los

restos de tejido vegetal. Los extractos de tejido vegetal fueron probados de toxicidad con plantas de semillero de lechuga midiendo el crecimiento de la raz con el procedimiento descrito arriba. La toxicidad fue equiparada con la acumulacin de PAHs. Estadstica Se calcularon las medias, las desviaciones estndar y los errores estndar para los parmetros medidos, as como los ndices de toxicidad\tolerancia computados de estos valores al compararlos con los valores del control. Los efectos del tratamiento fueron identificados usando ANOVAs y tests de rango mltiple computados en SPSS para VAX o SAS para PC.

Resultados y discusin
Germinacin Aqu (figura 2) y en otros casos (Archambault, 1989; Archambault y Winterhalder, 1995) hemos encontrado que la germinacin de plantas herbceas era un buen parmetro para establecer toxicidades. La germinacin pareci ser un buen marcador de la toxicidad de suelos contaminados por hidrocarburos y sal. Sin embargo, fueron observadas diferencias ente especies en la sensibilidad a esta clase de contaminantes. La lechuga fue un indicador ms sensible de toxicidad para varios tipos de contaminacin por hidrocarburos que el trigo. Por ejemplo, una inhibicin total de la germinacin de la lechuga fue encontrada en los suelos contaminados con 60.000-100.000 mg/kg de hidrocarburos extrables totales y de conductividad elctrica 15-40 mS/cm, mientras que bajo las mismas condiciones la germinacin del trigo fue inhibida solamente un 40% (figura 2). Usando la germinacin de la lechuga como prueba biolgica de toxicidad pudimos supervisar fiablemente el progreso en trabajos de recuperacin. Claramente, el xito de una prueba biolgica de toxicidad que hace uso de la germinacin como un factor de determinacin de la toxicidad depende de la seleccin de la especie.

Figura 2. Germinacin de trigo y lechuga en respuesta a la contaminacin por hidrocarburos en el suelo expresado como % del control. (NR: No recuperado; Control: Tierra vegetal agrcola). Las fechas representan la poca de muestreo durante el proceso de biorrecuperacin. Las barras representan medias errores estndar. Las barras sin letras comunes son significativamente diferentes a p 0.05. N = 5. Los ensayos de germinacin se han utilizado raramente para probar la tolerancia a metales y no seran tiles en pruebas biolgicas de toxicidad que hacen uso de especies poco sensibles. Diversos estudios han demostrado que los metales no afectaron a la germinacin. ste era el caso en un estudio de Nosko et al. (1988) en la germinacin de picea blanca en disoluciones de aluminio. Del mismo modo, Scherbatskoy et al. (1987) mostraron que la germinacin de la semilla de diversos rboles forestales no fue afectada por altas concentraciones de aluminio, de cadmio, de cobre, de plomo o de cinc. Whitby y Hutchinson (1974) mostraron que la germinacin de semillas no fue afectada por los metales cuando fueron germinadas en cultivo en disolucin del suelo. El crecimiento de plantas de semillero en la superficie del papel de filtro permite la determinacin inequvoca de los procesos tempranos de la germinacin, no posible cuando las semillas se sumergen en substrato slido, opaco. Poda tambin ser observada la detencin en la aparicin de la radcula que poda ocurrir enseguidad de la germinacin. La diferenciacin entre las semillas no germinadas y sas que sufran de la detencin del crecimiento de la radcula introdujo otro nivel de sensibilidad a esta prueba biolgica.

Crecimiento de la raz El alargamiento de la raz de trigo y de lechuga era un parmetro ms sensible que la germinacin en la evaluacin de la toxicidad de los suelos contaminados por hidrocarburos (figura 3). Usando este parmetro fisiolgico era posible revelar diferencias entre tratamientos, incluyendo residuos altamente contaminados, no recuperados. Mientras que las semillas de trigo tenan un ndice de la germinacin de 50-60% en suelos altamente contaminados, el alargamiento de la radcula ces pronto despus de la aparicin. De forma nteresante, el alargamiento de la raz de la lechuga crecida en suelos o lixiviados de suelo de diverso grado de avance en su recuperacin se asemej a lo observado en trigo.

Figura 3. Crecimiento de la raz de trigo y lechuga en respuesta a la contaminacin por hidrocarburos en el suelo expresado como % del control. (NR: No recuperado; Control: Tierra vegetal agrcola). Las fechas representan la poca de muestreo durante el proceso de biorrecuperacin. Las barras representan medias errores estndar. Las barras sin letras comunes son significativamente diferentes a p 0.05. N = 5. Se utiliz una prueba biolgica basada en planta de semillero usando los extractos con agua de la biomasa area de lechuga, guisante, colza y cebada para estimar la acumulacin relativa de PAHs o los subproductos txicos de PAHs en tejidos de planta expuestos a PAHs aerotransportados por 18 das. Se asumi que la capacidad de una planta marcador (lechuga) de crecer en los extractos de agua obtenidos de tejidos homogeneizados reflej la cantidad de PAHs interceptada por las plantas durante el perodo de exposicin. Se esperaba que concentraciones ms altas de PAHs en tejidos dieran lugar a una inhibicin ms alta del crecimiento de la raz de la planta marcador. Los extractos de lechuga, guisante, colza y cebada fumigados con naftalina causaron reducciones del 65, 60, 55 y del 40% en la longitud total de las races de la planta marcador, respectivamente (figura 4). Los extractos de tejido obtenidos de las plantas fumigadas con creosota eran ms txicos, puesto que la longitud total de la raz de las plantas del marcador era solamente 2-15% de los controles. La toxicidad realzada de la creosota poda ser debido a las diferencias cuantitativas y cualitativas entre las fuentes de PAHs.

Figura 4. Inhibicin del crecimiento de races de lechuga por los extractos obtenidos a partir de cuatro especies de plantas cultivadas expuestas por 18 das a naftalina o a creosota aerotransportada. Las barras representan medias errores estndar. Las barras sin letras comunes son significativamente diferentes a p 0.05. N = 5.

Figura 5. (a) Fotografa de semilla germinada de trigo que sufre de la detencin del crecimiento de la radcula posterior a su emergencia. (b) Fotografa de las races curvadas hacia arriba de lechuga que parecen evitar la disolucin.

Figura 6. Crecimiento de la parte area de trigo en respuesta a la contaminacin por hidrocarburos en suelo expresado como % del control. (NR: No recuperado; Control: Tierra vegetal agrcola). Las fechas representan la poca de muestreo durante el proceso de biorrecuperacin. Las barras representan medias errores estndar. Las barras sin letras comunes son significativamente diferentes a p 0.05. N = 5. En nuestras pruebas biolgicas usando suelos y disolucin contaminada con metales, las reducciones en el crecimiento de la raz eran fcilmente mendibles. Otros sntomas, tales como malformacin de la raz, curvatura y empardecimiento, eran tambin fcilmente observables (figura 5a, b). Crecimiento de la parte area El alargamiento de la parte area del trigo que crece sobre suelos contaminados por hidrocarburos (figura 6) era un parmetro igualmente sensible para medir toxicidad, al igual que el alargamiento de la raz. El patrn de cambios en longitud de la parte area bajo diversos tratamientos era similar al encontrado en races de trigo, incluyendo los experimentos conducidos usando lixiviados del suelo. La ventaja principal de usar el alargamiento de la parte area de una herbcea en la prueba biolgica (figura 7) viene del hecho de que las medidas de la parte area son rpidas, exactas y cmodas de realizar. Se pierden estas ventajas cuando se utiliza el crecimiento de la parte area de la lechuga porque las medidas de hojas pequeas, ovales no se pueden realizar con exactitud y las medidas son demasiado laboriosas.

Mientras que la inhibicin del crecimiento de la parte area puede estar ligado directamente al crecimiento de la raz, puede ser un parmetro til en s mismo porque la parte area se pueden desarrollar incluso en ausencia del crecimiento de la raz, al igual que el caso en la hierba (ray grass) expuesta a altas concentraciones de metales (Wong y Bradshaw, 1981).

Figura 7. Tallos de trigo mostrando diferencias en crecimiento inducidas por el substrato. Los desechos fueron muestreadas despus de 1 (1996), 2 (1997) y 3 (1998) aos de recuperacin y comparadas con el suelo control (tierra vegetal agrcola).
Resolucin de la toxicidad entre los substratos El mtodo descrito aqu es ms probable que sea utilizado en una situacin comparativa, en la cual es la toxicidad relativa ms que la toxicidad absoluta lo que interese. La toxicidad absoluta de un substrato puede ser mayor que la que sera observada usando esta prueba. En ciertos casos, puede ser que el contacto directo entre una raz y un slido sea la fuente de la toxicidad, y esta tcnica no sera aplicable a tal situacin. Los efectos de los exudados de la raz y otras influencias de la raz en la solubilidad de toxicos no pueden ser considerados completamente usando esta prueba biolgica. Con la prueba biolgica descrita aqu, como en otras pruebas biolgicas descritas en la literatura, es posible aumentar el grado de resolucin o de separacin entre substratos de toxicidades similares. Esto se puede conseguir produciendo diluciones de los substratos txicos con la adicin de varias proporciones de substratos control (no txicos). Disminuyendo gradualmente la toxicidad de los substratos, las tasas de germinacin aumentan (posiblemente a partir de cero) y los parmetros de la planta comienzan a ser ms fcilmente medibles. Otros sntomas visuales distintos de baja o falta de germinacin se pueden comparar entre tratamientos. Observaciones finales 1) Nuestra prueba biolgica basada en planta de semillero permiti la determinacin de la toxicidad de substratos slidos y lquidos mientras que proporcionaba un seguimiento continuo segn se desarrollaban los sntomas de la planta. 2) Este dispositivo se puede utilizar para probar la tolerancia de las plantas a los substratos slidos o lquidos midiendo la germinacin y alargamiento de raz y parte area. 3) La prueba biolgica se puede tambin utilizar para obtener medidas semi-cuantitativas de la acumulacin de sustancias txicas en/sobre rganos de la planta. 4) Los datos obtenidos de experimentos de laboratorio estn generalmente de acuerdo con los anlisis del ciclo vital de la planta a largo plazo (Sawatsky y Li, 1999).

Referencias
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